CN110904138A

CN110904138A - 一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体、构建方法及应用

Info

Publication number: CN110904138A
Application number: CN201811079282.3A
Authority: CN
Inventors: 邓春泉; 吴配配; 李因来; 周旭一
Original assignee: Hangzhou Biogenome Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Biogenome Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-17
Filing date: 2018-09-17
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明属于蛋白工程技术领域，尤其是涉及一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体、构建方法及应用。本发明所提供的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法所制备得到的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体可以较好地提高目的蛋白表达量及提高目的蛋白的可溶性，目的蛋白可溶性表达将为蛋白分离纯化、蛋白活性研究奠定基础，在基因工程、蛋白质工程等生物学领域中将存在广泛的应用。

Description

一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体、构建方法及应用

技术领域

本发明属于蛋白工程技术领域，尤其是涉及一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体、构建方法及应用。

背景技术

大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达***，也是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的表达 ***。但是由于各种原因，大肠杆菌表达***也有自身局限性，当所表达的蛋白是复杂的真核来源的蛋白时，大肠杆菌往往不能将翻译出的多肽链正确折叠而不能形成具有天然构象蛋白质，而是形成不溶性的无功能的包涵体。包涵体中的多肽链折叠错误，必须通过复杂的变性与复性过程才能形成有活性的蛋白，但成功率低。探索重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达具有较高的学术价值与广泛的应用前景。

目前已经找到了一些提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，如改造工程菌、优化诱导表达条件(诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度等)、分子伴侣共表达、添加融合标签等。其中较常用的办法是使用融合表达策略，即将融合标签和靶蛋白连接成为一个融合蛋白进行表达，融合标签的使用即可促进与之相连的靶蛋白可溶性表达，还便于目的蛋白的纯化。根据融合标签的功能可分为两类：一类是促进蛋白可溶性表达的标签，如麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(Trx)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、二硫键形成蛋白A(DsbA)、谷胱甘肽转移酶 (GST)等；另一类是纯化(检测)标签，如多聚精氨酸标签(Arg-tag)、多聚组氨酸标签(His-tag)、 c-myc-tag、S-tag、链霉素亲和结合标签、FLAG等。但由于蛋白质种类繁多，目前还没有找到可以提高蛋白可溶性表达的通用型融合标签。

MsyB是大肠杆菌中的一种酸性蛋白，过去被认为具有抑制蛋白外运功能缺失突变的作用，最近研究证明MsyB还是一种非常有效的蛋白可溶性标签，其显著的特征包括有助于重组蛋白高可效溶性表达，分子量相对较小(124个氨基酸)，是大肠杆菌内源蛋白等，这些特征为它在生物技术领域的应用开辟了十分广阔的前景。

发明内容

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体，所述Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体命名为BL21-pHis-Msyb，且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)，保藏编号为：CGMCC No.16044。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法，所述Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法包括如下步骤：以大肠杆菌BL2(DE3)基因组为模板，以 SQE ID NO.2、SQE ID NO.3为引物进行PCR扩增，得到基因序列为SQE IDNO.1的Msyb基因片段；将pET20进行双酶切，并通过柔和连接子连接双酶切后的pET20和Msyb基因片段，得到连接产物；将连接产物热激转化DH5α感受态细胞并筛选重组克隆，得到Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体；

上述基因序列分别为：

SQE ID NO.1：

SEQ ID NO.2：

taagaaggagatatacatatgCACCACCACCACCACCACATGACCATGTACGCAACGCTT

SEQ ID NO.3：

acggagctcgaattcggatccACCACCAGAACCACCACGTTCATCCCACTCATCAGCT。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述柔和连接子为GGSGG，柔和连接子的分子量小，极性且亲水。

优选地，所述大肠杆菌BL2(DE3)基因组的GenBank登录号GI为802133627。

优选地，以NdeI和BamHI对pET20进行双酶切。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体在表达融合蛋白方面的应用。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种根据前面所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体在表达融合蛋白方面的应用。

优选地，将目的基因克隆至Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的多克隆位点上，再经异丙基硫代半乳糖苷诱导将目的蛋白与融合标签融合表达形成表达融合蛋白。

优选地，所述表达融合蛋白经Ni²⁺-NTA柱亲和纯化获得。

本发明提供一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体、构建方法及应用，所提供的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法所制备得到的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体可以较好地提高目的蛋白表达量及提高目的蛋白的可溶性，目的蛋白可溶性表达将为蛋白分离纯化、蛋白活性研究奠定基础，在基因工程、蛋白质工程等生物学领域中将存在广泛的应用。

附图说明

图1为BL21-pHis-Msyb融合标签大肠杆菌异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性表达载体构建的示意图；

其中：

AP为氨苄抗性基因；

f1origin为复制起点；

MCS多克隆位点包括NdeI、BamHI、EcoRI、SacI、SalI、HindIII、NotI、XhoI限制性酶切位点。

图2为所构建的载体BL21-pHis-Msyb双酶切鉴定结果；

其中：M：DNA marker DL2000；1：BL21-pHis-Msyb双酶切电泳图。

图3为BL21-pHis-Msyb-cTnI表达载体构建示意图；

其中：cTnI为人肌钙蛋白I基因。

图4为所构建的载体BL21-pHis-Msyb-cTnI双酶切鉴定结果；

其中：M：DNA marker DL2000；1：pHis-Msyb-cTnI双酶切电泳图。

图5为BL21-pHis-Msyb表达载体与pET20表达载体对人cTnI蛋白表达结果的差异；

其中：M：蛋白分子量标准(分子量分别为97.2kD、66.4kD、44.3kD、29.0kD、20.1kD)； 1：pET20-cTnI诱导后上清；2：pET20-cTnI诱导后沉淀；3：pHis-Msyb-cTnI诱导后上清；4： pHis-Msyb-cTnI诱导后沉淀。

图6为BL21-pHis-Msyb载体表达人cTnI经亲和层析纯化后电泳图；

其中：M：蛋白分子量标准(分子量分别为97.2kD、66.4kD、44.3kD、29.0kD、20.1kD)； 1：纯化后人cTnI。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例中未明确说明的具体实验条件，为常规实验条件，如《分子克隆实验手册》中所述实验条件，或参照试剂盒生产厂家推荐的实验方法。

下面在介绍实施例前，对实施例中所用的部分生物试剂原料做简要介绍：

pET20质粒，购至Novagen公司；

E.coli DH5α，基因克隆宿主菌，上海生工生物技术有限公司产品；

E.coli BL21(DE3)，蛋白表达宿主菌，上海生工生物技术有限公司产品；

实施例中相关基因测序及引物合成由南京金斯瑞生物技术公司完成；

NdeI(FD0583)BamHI(FD0054)XhoI(FD 0694)，Thermo Fisher Scientific产品；

PCR扩增酶(2×ES Taq MasterMix，杭州诺扬生物技术有限公司，CW0690A/5×1ml)，

质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA回收试剂盒、DNA胶回收试剂盒，宝生生物工程(大连) 有限公司产品；

ClonExpress II One Step Cloning Kit(C112-01/02)，南京诺唯赞生物技术有限公司产品；

氨苄抗生素(Amp)，上海生工生物技术有限公司产品；

DNA分子质量标准、蛋白分子质量标准，宝生生物工程(大连)有限公司产品。

实施例1：融合标签大肠杆菌异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性表达载体构建

大肠杆菌BL21(DE3)以1‰接种量接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，用宝生生物质粒DNA小量抽提试剂盒提取基因组。参考大肠杆菌基因组序列的GenBank登录号 GI：802133627设计Msyb引物SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物纯化回收得Msyb基因片段SEQ ID NO.1。将质粒pET20用NdeI和BamHI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒回收酶切产物，将SEQ ID NO.1与pET20酶切产物用ClonExpress II One StepCloning Kit进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，在含100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基上筛选重组克隆，质粒经PCR、酶切和测序验证正确后，命名为BL21-pHis-Msyb。

SQE ID NO.1：

(1)引物序列如下：

SEQ ID NO.2：

taagaaggagatatacatatgCACCACCACCACCACCACATGACCATGTACGCAACGCTT

SEQ ID NO.3：

acggagctcgaattcggatccACCACCAGAACCACCACGTTCATCCCACTCATCAGCT

(2)PCR产物扩增和目的DNA片段回收

PCR扩增体系参照说明书进行。

PCR扩增程序：95℃变性5min，循环条件：95℃30s，54℃30s，72℃25s，共30个循环，最后在72℃延伸10min。使用基因扩增仪为杭州博日Life ECO基因扩增仪TC-96/G/H(b)。

PCR扩增产物回收：用宝生生物工程(大连)有限公司DNA回收试剂盒参照说明书进行。

(3)pET20双酶切及酶切产物回收

50ul酶切体系，NdeI 4ul、BamHI 4ul、pET20质粒4ug、酶切缓冲液5ul、用ddH₂O补足至 50ul，37℃酶切3h，1％琼脂糖凝胶电泳，用宝生生物工程(大连)有限公司DNA胶回收试剂盒回收。

(4)连接、转换及筛选

Msyb基因片段及pET20酶切产物浓度用超微量分光光度计NanoDrop 2000进行测定，二者以3:1摩尔比用ClonExpress II One Step Cloning Kit进行连接，连接条件为37℃30min，连接产物冰浴5min，加入100ul DH5α感受态细胞，冰浴30min，立即42℃水浴热击90s，冰浴2min，涂布于含100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜进行重组克隆筛选，挑取阳性克隆接种至含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养5h，用宝生生物质粒 DNA小量抽提试剂盒提取质粒，以SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3为引物进行PCR扩增，扩增条件：95℃变性5min，循环条件：95℃30s，54℃30s，72℃25s，共28个循环，最后在72℃延伸10min，抽提质粒双酶切体系及条件同(3)pET20双酶切，PCR及双酶切鉴定均阳性质粒送至南京金斯瑞生物技术公司进行基因测序，经PCR、双酶切和测序验证完全正确后，命名为 BL21-pHis-Msyb，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，且于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.16044。

参照图1，图1为BL21-pHis-Msyb融合标签大肠杆菌异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性表达载体构建的示意图；

其中：

AP为氨苄抗性基因；

f1 origin为复制起点；

参照图2，图2为所构建的载体BL21-pHis-Msyb双酶切鉴定结果；

其中：M：DNA marker DL2000；1：BL21-pHis-Msyb双酶切电泳图，约3700bp条带为pET20 载体框架，约450bp条带为Mysb基因。

实施例2：人cTnI基因与Msyb的融合表达

2.1人cTnI-Msyb表达载体构建

以人cTnI基因为模板(南京金斯瑞生物技术公司合成，如SEQ ID NO.4)，以SEQ IDNO.5 与SEQ ID NO.6为引物进行PCR扩增，扩增条件：95℃变性5min，循环条件：95℃30s，55℃30s， 72℃25s，共28个循环，最后在72℃延伸10min，1％琼脂糖凝胶电泳，用宝生生物工程(大连) 有限公司DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。

SEQ ID NO.4：

SEQ ID NO.5：

ggtggttctggtggtggatccATGGCGGATGGGAGCAGC

SEQ ID NO.6：

gtggtggtggtggtgctcgagTCAGCTCTCAAACTTTTTCTTGCG

取BL21-pHis-Msyb 4ug，50ul酶切体系，BamH 4ul、XhoI 4ul、酶切缓冲液5ul、用ddH₂O 补足至50ul，37℃酶切3h，1％琼脂糖凝胶电泳，用宝生生物工程(大连)有限公司DNA胶回收试剂盒进行纯化酶切载体。

cTnI基因及BL21-pHis-Msyb酶切载体以3:1摩尔比用ClonExpress II One StepCloning Kit 进行连接，连接条件为37℃30min，连接产物冰浴5min，加入100ul DH5α感受态细胞，冰浴 30min，立即42℃水浴热击90s，冰浴2min，涂布于含100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆接种至含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、250rpm 培养5h后提取质粒，以SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6为引物进行PCR扩增，扩增条件：95℃ 变性5min，循环条件：95℃30s，55℃30s，72℃25s，共28个循环，最后在72℃延伸10min，扩增阳性质粒用BamHI与XhoI双酶切，同时送至南京金斯瑞生物技术公司进行基因测序，PCR 扩增、双酶切和基因测序验证完全正确后，命名为BL21-pHis-Msyb-cTnI。

参照图3，图3为BL21-pHis-Msyb-cTnI表达载体构建示意图；

其中：cTnI为人肌钙蛋白I基因。

参照图4，图4为所构建的载体BL21-pHis-Msyb-cTnI双酶切鉴定结果；

其中：M：DNA marker DL2000；1：pHis-Msyb-cTnI双酶切电泳图，约4200bp条带为BL21-pHis-Msyb载体框架，约630bp条带为cTnI基因。

2.2人cTnI-Msyb蛋白表达与纯化

将BL21-pHis-Msyb-cTnI表达载体通过热击法(冰浴30min，立即42℃水浴热击90s，冰浴 2min)转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含100ug/ml氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，37℃倒置培养过夜，挑选单菌落接种至含氨苄抗生素的LB液体培养基，37℃、250rpm培养7h后保藏菌种。

复苏菌种BL21-pHis-Msyb-cTnI，取-80℃冰箱保藏的菌种以1‰接种至50ml LB(氨苄抗生素)培养基摇瓶，37℃200rpm培养过夜。

按1％的接种量接种于1L LB(氨苄抗生素)培养基摇瓶，37℃250rpm培养约3h至OD600＝0.5-0.6，加入终浓度1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃250rpm诱导4h。

离心收集菌体及破碎大肠杆菌细胞，菌体分装于离心杯，8000rpm，离心10min，弃上清，菌体用50mM Tris、0.3NaCL pH 8.0的缓冲液重悬，加入终浓度1mM PMSF进行冰浴超声破碎，超声破碎条件为：超声4s，间隔6s，超声总时间30min，超声功率150W，破碎液12000rpm，4℃ 离心30min，SDS-PAGE显示有可溶cTnI-Msyb在上清，见图5中编号3泳道。

参照图5，图5为BL21-pHis-Msyb表达载体与pET20表达载体对人cTnI蛋白表达结果的差异；

其中：M：蛋白分子量标准(分子量分别为97.2kD、66.4kD、44.3kD、29.0kD、20.1kD)； 1：pET20-cTnI诱导后上清；2：pET20-cTnI诱导后沉淀；3：pHis-Msyb-cTnI诱导后上清；4：pHis-Msyb-cTnI诱导后沉淀。可知pET20表达人cTnI蛋白为包涵体形式，BL21-pHis-Msyb表达人cTnI蛋白为可溶性形式。

纯化：取上清过Ni²⁺-NTA柱纯化目的蛋白，上样缓冲液为50mM Tris、0.3M NaCL pH8.0，平衡缓冲液为50mM Tris、0.3M NaCL、50mM咪唑pH 8.0，洗脱缓冲液为50mM Tris、0.3M NaCL、500mM咪唑pH 8.0，将洗脱的目的蛋白在透析缓冲液中透析24h，12h换液一次，透析缓冲液为50mM Tris、0.2M NaCL、2mM EDTA pH 8.0，透析后SDS-PAGE显示cTnI-Msyb蛋白纯化均大于90％，见图6中编号1泳道。

参照图6，图6为BL21-pHis-Msyb载体表达人cTnI经亲和层析纯化后电泳图；

2.3人cTnI活性检测

将纯化的cTnI-Msyb用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，稀释50000倍后用贝克曼ACCESS2 化学发光免疫分析仪进行活性检测，检测浓度10.21ng/ml，蛋白活性率为68.07％(原始0.7mg/ml)。

通过以上实验说明，利用BL21-pHis-Msyb载体表达重组蛋白，可实现目的蛋白可溶性表达，此可广泛应用于重组蛋白可溶性表达的研究。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体，其特征在于，所述Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体命名为BL21-pHis-Msyb，且保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)，保藏编号为：CGMCC No.16044。

2.一种Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，所述Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法包括如下步骤：以大肠杆菌BL2(DE3)基因组为模板，以SQE ID NO.2、SQE ID NO.3为引物进行PCR扩增，得到基因序列为SQE ID NO.1的Msyb基因片段；将pET20进行双酶切，并通过柔和连接子连接双酶切后的pET20和Msyb基因片段，得到连接产物；将连接产物热激转化DH5α感受态细胞并筛选重组克隆，得到Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体；

上述基因序列分别为：

SQE ID NO.1：

SEQ ID NO.2：

taagaaggagatatacatatgCACCACCACCACCACCACATGACCATGTACGCAACGCTTSEQ ID NO.3：

acggagctcgaattcggatccACCACCAGAACCACCACGTTCATCCCACTCATCAGCT。

3.根据权利要求2所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，所述柔和连接子为GGSGG。

4.根据权利要求2所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌BL2(DE3)基因组的GenBank登录号GI为802133627。

5.根据权利要求2所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，以NdeI和BamHI对pET20进行双酶切。

6.一种根据权利要求1所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体在表达融合蛋白方面的应用。

7.根据权利要求6所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体在表达融合蛋白方面的应用，其特征在于，将目的基因克隆至Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体的多克隆位点上，再经异丙基硫代半乳糖苷诱导将目的蛋白与融合标签融合表达形成表达融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的Msyb融合标签的大肠杆菌可溶性蛋白表达载体在表达融合蛋白方面的应用，其特征在于，所述表达融合蛋白经Ni²⁺-NTA柱亲和纯化获得。