CN101050457A - 利用甲壳素－戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甲壳素－戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的制备方法，它包括甲壳素载体的精制、交联试剂的配制、甲壳素－戊二醛的交联、壳聚糖酶的提取及固定等步骤；即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定。本发明克服了单独采用吸附或交联法所产生的载体吸附力弱、易解吸脱落以及酶易失活的缺点；同时与其它酶固定化方法相比较，具有半衰期长，固定化体系受外界环境影响小等特点。

Description

利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法
技术领域
本发明涉及一种酶固定化方法，特别是一种利用甲壳素为酶固定载体、戊二醛为交联剂对游离壳聚糖酶进行固定的酶固定交联吸附方法。
背景技术
酶固定化方法可分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4种。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法；交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法；上述方法单独使用存在所产生的载体吸附力弱、易解吸脱落以及酶易失活的缺点，同时具有半衰期短，固定化体系受外界环境影响大等不足。
甲壳素(chitin)又称甲壳质、几丁质、壳多糖，是N-乙酰氨基葡萄糖单位(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)通过β-1，4-糖苷键连接而成的直链多糖([GlcNAc]n，n为聚合度，为白色片状固体，无毒，无味，耐酸碱，耐腐蚀，耐高温，耐日光，性能十分稳定，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。它大量存在于低等动物特别是节肢动物的甲壳中，是自然界中储备量仅次于纤维素的第二大天然可再生资源。由于甲壳素独特结构特点及丰富的自然储备，八十年代以来在生化领域将其作为固定化细胞和酶的载体加以开发应用。甲壳素所具有的氨基被戊二醛活化后，可作为固定化壳聚糖酶的载体。同时由于戊二醛对物质有很强的穿透力，利用它对甲壳素进行处理后，甲壳素的表面形成有机多孔结构，有利于酶的吸附。而且戊二醛为活泼的双功能试剂，它不仅与酶蛋白的氨基、羧基反应，还能活化甲壳素所具有的氨基。同其他的吸附剂相比较，采用戊二醛能使壳聚糖酶残余活力达到最大。甲壳素-戊二醛交联吸附作为一种独特的固定化方法，在固定化酶方面可加以开发应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定酶的方法，以获得贮藏和操作稳定性良好的固定化壳聚糖酶。
本发明的目的是这样实现的：
一种利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法，特点是利用甲壳素为酶固定的载体，戊二醛为交联试剂固定游离壳聚糖酶，即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定，其具体步骤如下：
a、固定化载体甲壳素的精制
将分子量为2.0-2.5×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过20-60目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜，第二天抽滤，加入3-7mol/L HCl浸泡18-30hr，抽滤，加入0.1-2mol/L NaOH，煮沸1-3hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.005-0.1mol/LNaOH溶液在30-60℃浸泡2-6hr，抽滤；加入0.005-0.1mol/L醋酸溶液于30-60℃浸泡1-4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，60-90℃下干燥，得到精制的甲壳素。
b、交联试剂的配制
选用保存在4℃以下，生产时间为10-30d以内的戊二醛分析纯试剂配制交联剂，使用的有效时间为2-5个月；将浓度为2-6％的戊二醛试剂与壳聚糖酶适宜pH值5.0-7.0醋酸缓冲液混合，配成交联试剂。
c、甲壳素的交联
称取0.1-0.5g的精制甲壳素为载体，加入上述得到的交联试剂1-5ml，室温下浸泡并搅拌1-5hr，静置过夜，离心去上清液；将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素；交联后的载体浸泡在pH值5.0-7.0的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用。
d、游离壳聚糖酶的提取
(1)摇瓶发酵培养产酶
将培养好的假单胞菌(Pseudomonas)CUY8种子接入摇瓶发酵培养；发酵培养基为：接种量5-12％，葡萄糖2-6％，壳聚糖0.5-4％，NaCl 0.1-2％，FeCl210-30×10-5g/mL，MgCl2 10-35×10-5g/mL，酵母膏0.1-0.7％，(NH4)2HPO40.8％，pH值6.0-8.0，温度30-40℃，100-150r/min条件下振荡培养1-4d。
(2)游离壳聚糖酶的制备
经10-50％丙酮沉淀后的壳聚糖酶通过Sephadex G-25柱层析浓缩后，再经Sephadex G-100柱层析进一步纯化收集壳聚糖酶蛋白，将酶蛋白溶解在1-4ml的0.01-0.1mol/L的乙酸缓冲液后，冰浴抽真空，浓缩真空干燥后保藏备用。
e、游离壳聚糖酶的固定化
将步骤(c)的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.1-0.5g交联甲壳素载体，加入含有1-10mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔0.5-3hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。
本发明采用吸附交联方法，克服了单独采用吸附或交联法所产生的载体吸附力弱、易解吸脱落以及酶易失活的缺点；同时与其它酶固定化方法相比较，具有半衰期长，固定化体系受外界环境影响小等特点。
附图说明
图1是片状甲壳素未经戊二醛交联的扫描电镜图(750倍)
图2是精制甲壳素经戊二醛交联后的扫描电镜图(750倍)
图3是精制甲壳素经戊二醛交联后的扫描电镜图(1500倍)
具体实施方式
实施例1
1.固定化载体甲壳素的精制
将分子量为2.0×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过30目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜。第二天抽滤，加入4mol/L HCl浸泡18hr，抽滤，加入0.5mol/L NaOH，煮沸2hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.005mol/L NaOH溶液在50℃浸泡6hr，抽滤；加入0.005mol/L醋酸溶液于50℃浸泡4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，70℃下干燥，得到精制的甲壳素。
2.甲壳素的交联
称取0.2g的精制甲壳素为载体，加入交联试剂1ml，室温下浸泡并搅拌2hr，静置过夜，离心去上清液。将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素。交联后的载体浸泡在pH值5.8的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用。
3.游离壳聚糖酶的固定化
将备用的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.2g交联甲壳素载体，加入含有3mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔1hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。
实施例2
1.固定化载体甲壳素的精制
将分子量为2.5×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过50目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜。第二天抽滤，加入5mol/L HCl浸泡30hr，抽滤，加入1mol/L NaOH，煮沸2hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.01mol/L NaOH溶液在40℃浸泡5hr，抽滤；加入0.01mol/L醋酸溶液于40℃浸泡4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，90℃下干燥，得到精制的甲壳素。
2.甲壳素的交联
称取0.5g的精制甲壳素，加入交联试剂5ml，室温下浸泡并搅拌5hr，静置过夜，离心去上清液。将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素。交联后的载体浸泡在pH值6.0的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用。
3.游离壳聚糖酶的固定化
将备用的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.5g交联甲壳素载体，加入含有5mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔2hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。
经扫描电镜观察，利用本发明获得的甲壳素载体经戊二醛交联后呈现明显的多孔结构。
实验证实，利用本发明制得的固定化壳聚糖酶与游离壳聚糖酶的酶特性比较如下：
  最适pH   最稳定pH   最适温度(℃)   最稳定温度(℃) Km值(mg/ml)   半衰期(天)
  游离壳聚糖酶固定化壳聚糖酶   5.04.0   5.54.5   5565   3545   1.91914.713   1845
另外，固定化壳聚糖酶的酶反应操作次数超过12次，其残余的相对酶活力仍在80％以上。
由以上实验结果可知，本发明固定化壳聚糖酶可延长酶的利用时间和次数。

Claims (1)

1.一种利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法，其特征在于它是利用甲壳素为酶固定的载体，戊二醛为交联试剂固定游离壳聚糖酶，即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定，其具体步骤如下：
a、固定化载体甲壳素的精制
将分子量为2.0-2.5×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过20-60目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜，第二天抽滤，加入3-7mol/L HCl浸泡18-30hr，抽滤，加入0.1-2mol/L NaOH，煮沸1-3hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.005-0.1mol/LNaOH溶液在30-60℃浸泡2-6hr，抽滤；加入0.005-0.1mol/L醋酸溶液于30-60℃浸泡1-4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，60-90℃下干燥，得到精制的甲壳素；
b、交联试剂的配制
选用保存在4℃以下，生产时间为10-30d以内的戊二醛分析纯试剂配制交联剂，使用的有效时间为2-5个月；将浓度为2-6％的戊二醛试剂与壳聚糖酶适宜pH值5.0-7.0醋酸缓冲液混合，配成交联试剂；
c、甲壳素的交联
称取0.1-0.5g的精制甲壳素为载体，加入上述得到的交联试剂1-5ml，室温下浸泡并搅拌1-5hr，静置过夜，离心去上清液；将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素；交联后的载体浸泡在pH值5.0-7.0的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用；
d、游离壳聚糖酶的提取
(1)摇瓶发酵培养产酶
将培养好的假单胞菌(Pseudomonas)CUY8种子接入摇瓶发酵培养；发酵培养基为：接种量5-12％，葡萄糖2-6％，壳聚糖0.5-4％，NaCl 0.1-2％，FeCl210-30×10-5g/mL，MgCl210-35×10-5g/mL，酵母膏0.1-0.7％，(NH4)2HPO40.8％，pH值6.0-8.0，温度30-40℃，100-150r/min条件下振荡培养1-4d；
(2)游离壳聚糖酶的制备
经10-50％丙酮沉淀后的壳聚糖酶通过Sephadex G-25柱层析浓缩后，再经Sephadex G-100柱层析进一步纯化收集壳聚糖酶蛋白，将酶蛋白溶解在1-4ml的0.01-0.1mol/L的乙酸缓冲液后，冰浴抽真空，浓缩真空干燥后保藏备用；
e、游离壳聚糖酶的固定化
将步骤(c)的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.1-0.5g交联甲壳素载体，加入含有1-10mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔0.5-3hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。
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