CN101048501A - 通过壳聚糖存储dna的方法，以及利用该方法的产物 - Google Patents

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Abstract

如果人、动物、植物或细菌的DNA或含有DNA的生物样品如血液与水溶性壳聚糖充分混合，并且利用以液态或以固态使用固体介质如纸存储，有可能在室温下长时间稳定地存储DNA，并且其也可用于此后的基因分析。该DNA存储方法简单且合算，并且通过应用该方法制备的产物如DNA卡片和PCR试剂盒可存储、运载以及收集多个DNA样品，且其也对自动分析非常有效。此外，该DNA ID卡可起DNA库的作用，其存储个人的DNA，并且通过存储个人的遗传信息，其对个人鉴定和医疗是有用的。

Description

通过壳聚糖存储DNA的方法，以及利用该方法的产物
[技术领域]
本发明涉及存储DNA的方法，分析通过上述方法存储的DNA的方法以及利用该方法的产物。更详细地，本发明涉及用于长期在室温下存储稳定状态的DNA的方法，分析通过上述方法存储的DNA的方法以及如由纸制成的DNA卡片或由塑料制成的DNA卡片的DNAID卡，其利用上述的存储和分析方法产生。
[背景技术]
生物体携带的所有基因的总体称为基因组。据报道人基因组由30亿个碱基组成并且具有约30,000个基因。最近，解码全部人类基因组碱基序列的人类基因组计划已完成，因此获得通过利用基因提供疑难疾病诊断和治疗的划时代的改进。可以说，已开始了个人化医学和预测性医学的时代。
生命现象由三种主体决定：(1)基因组DNA的遗传信息，(2)基因转录本和(3)表达的蛋白质。为了了解和分析生命现象，和开发用于疾病诊断和治疗的方法，重要的是精确分析上述的三种主体。个体中基因的总数称为基因或基因组，并且因此个体中转录的基因的总数(即mDNA)和表达的蛋白质的总数分别称为转录本组(transcriptome)和蛋白质组。最近，对所述全部信息自动分析的研究进展积极。对于分析的自动化，微阵列或生物芯片尤其有用，并且其代表性的实例包括DNA芯片和蛋白质芯片。
作为用于基因组DNA遗传信息定性和定量分析的常规方法，可提及杂交分析、序列分析、DNA微阵列或芯片等等，经PCR、PCR-RFLP、克隆和文库产生、Southern印迹法等等(Sambrook，J.& Russell，D.W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，(2001))。
当检验人DNA时，有可能了解人的健康状态并且给出该人是否感染各种疾病如癌症或传染病的诊断，以及预测遗传疾病今后发作和传递至该人后代的可能性。另外，DNA检测为证实人的身份以及亲缘关系如亲子关系的最精确的方法。其在证实家系或家谱中也有用。据此，DNA检测已必然用作法医学的方法以及用于辨别捐赠骨髓，其他内脏等等时的适配性。此外，通过分析单核苷酸多态性(SNP)，有助于预测疾病今后的发作，对药物的反应等等的可能性。
由于认识到存储DNA对于将来DNA检测的必要性，每个国家已迅速地建立了DNA库，并且由于存储有关旅客保险或事故保险的DNA，存储美国武装部队的DNA等等的原因，DNA库中样品数目趋于大量增加。然而，在国家组织或商业组织存储个人的DNA，可能存在如个人遗传信息滥用的问题。而且，为了通过现有技术长期安全地存储DNA，需要冰箱和特定试剂，因此存储DNA的成本由此很大。
事实上，当从细胞分离和纯化的DNA处于室温下时可能存在DNA被脱氧核糖核酸酶(DNAse)迅速降解或片段化的问题。因此，用于基因研究中存储DNA的方法很重要。目前，对于广泛使用的存储或运载DNA的方法，可提及通过纯化分离自体液如血液、细胞或组织的DNA而以液态存储DNA的方法；存储在冰箱中的方法；冻干存储的方法；存储在2-丙醇中的方法等等。然而，就成本和损耗而言这些方法存在许多缺点。以液态存储纯化的DNA的方法很容易用于立即使用该DNA，但DNA在长期存储时存在着很容易破坏的问题。存储在冰箱中的方法和冻干的方法在使用该样品的过程中存在DNA可能受反复冻融而破坏的问题。此外，使用如乙醇的试剂存储的方法以及其他方法在预处理和后处理过程中也麻烦。而且，上述过程中最重要的问题为DNA必须首先从体液如血液纯化而用于存储。
上述用于存储DNA的方法需要专门的昂贵的设备如超低温冰箱、液氮等等。因此，由于从经济的角度该方法可能增加负担，其是不利的，该方法在再使用存储的DNA用于分析时需要预处理和后处理的过程，并且该方法可能在重复的冷冻和融解过程中破坏DNA。
除上述方法外，，最近引入了一些用于在室温下存储质粒DNA的商业化产品如FTA卡或Whatman plc生产的卡制品等等。然而，该方法其有效性有限，并且建议在-15℃或-20℃而不是在室温存储DNA，因此其比原来的方法没有大的优点，反而不利的是成本的增加。
因此，在分子遗传学和医学领域中一个重要的目标为开发通过形成与DNA的稳定结合，在室温下以稳定状态存储DNA，并且进一步利用DNA直接应用于研究和分析，而用于保护DNA免受脱氧核糖核酸酶分解的可能的方法。存储的理想方法应当包括：(1)在室温下稳定存储而没有DNA降解的方法；(2)方法应该简单；(3)方法应该经济合算；(4)DNA存储不应该仅用于分离的和纯化的DNA本身，也用于包含体液如血液和不同DNA的样品，而对该DNA无破坏；(5)不同的DNA样品应该存储在有限的空间；(6)个体应当能存储个人的DNA；和(7)此后对各种基因的分析不应该存在任何问题，并且这些遗传检测应该有助于实际的诊断或研究。然而，满足这些条件的方法或产品至今还未引进，并且未发现用于与人遗传信息在一起存储的个人DNA的产品的报道。
壳聚糖为生物产生的聚合物，其在稳定性、生物降解性和在生物体的适合性方面优良，并且广泛用于医学领域。当壳聚糖用酸处理后，其形成水溶性的壳聚糖盐，变成具有强的正电荷，因此最近几年中已指出壳聚糖盐作为药物、蛋白质和DNA的优秀的投递方法。尤其，水溶性的壳聚糖与作为阴离子物质的DNA形成强结合，用于DNA的保护。因此，该水溶性的壳聚糖可用作用于投递基因的介质物质。
壳聚糖为葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的共聚物并且获自壳多糖。壳多糖在甲壳动物如蟹或虾中很多，并且为次于纤维素的最丰富的天然聚合物物质。壳聚糖为通过将壳多糖经过强碱脱乙酰作用而获得的阳离子聚合物的通称(Errington N.，Harding S.E.，Varum R.M.，Ilium L.，Int.J.Biol.Macromol.，15，1123-1127(1993))。
壳聚糖不溶于中性或碱性pH，而在与酸类如谷氨酸、盐酸、乳酸等等反应时形成壳聚糖盐或阳离子壳聚糖。壳聚糖盐溶于水，并且其溶解度与脱乙酰作用的程度和pH成比例。就水溶性壳聚糖来说，其通过将质子添加至胺基而成为带正电荷的。此外，水溶性壳聚糖可制成冻干状态。
水溶性壳聚糖具有形成带有强正电荷的膜或凝胶的特性。在这方面，壳聚糖用于污水、重金属和饮用水以及抗真菌物质的净化器中。其也用作饮料、保健食品和化妆品的原料。此外，壳聚糖用作药学领域的重要方法。例如，壳聚糖广泛用于疫苗的投递、DNA的投递、促进经纯化产生的蛋白质、肽和药物的投递和和受控的药物释放***的投递，凝胶、膜、润湿剂、涂层剂、微球体、微胶囊、生物粘合剂和粘膜等等的投递(Illum L.，Pharmaceutical Research，15，1326-1331(1998))。
壳聚糖非常安全并且不呈现由免疫引起的副作用。当壳聚糖吸收进入生物体时，其在用于糖蛋白的合成后由溶菌酶降解为N-乙酰葡糖胺，且随后残留的生成物以二氧化碳的形式排放(Chandy T.，SharmaCP.，Biomat.Art.Cells Art.Org.，18，1-24(1990))。
本发明的水溶性壳聚糖或阳离子壳聚糖最重要的特性为其与为阴离子物质的DNA形成强的结合，使得其可用作DNA的保护和投递方法，即作为基因投递材料。在利用质粒DNA的实验中，据报道壳聚糖作为稳定储存的而不经DNA核酸酶如DNase I和DNase II分解的DNA而起作用，且当壳聚糖和质粒DNA的复合物注射入体外培养的细胞时，其触发投递基因的表达(Lee M.，Nah J-W.，Kwon Y.，Koh J.J.，Jo K.S.，Kim S.W.，Pharmaceutical Research，18(4)，427-531(2001))。基因投递效果由(1)壳聚糖的分子量和(2)壳聚糖对DNA的比率，尤其阴离子DNA的含磷分子对阳离子壳聚糖的含氮分子的氮/磷比率确定(Borchard G.，Advanced Drug Delivering Reviews，52，145-150(2001))。
据报道当质粒DNA置于室温时，该质粒DNA在数小时内分解；然而当质粒DNA保持与壳聚糖的复合物形式时，有可能存储该质粒DNA 3个月或更长时间(Leong K.W.，Mao H.Q.，Turong-Lee V.L.，Roy K.，Walsh S.M.，August J.T.，J.controlled ReI.，53，183-193(1998))。同时，已有报道，当壳聚糖和质粒DNA的复合物以冻干状态存储时基因投递效果可持续至4周后(Mao H.Q.，Turong-Lee V.L.，August J.T.，Leong K.W.，Proc.Intl.Symp.Control.ReI.Bioact.Mater.，24，671-772(1997))。
然而，至今还没有报道用壳聚糖稳定存储哺乳动物大基因组DNA的可能性研究或用壳聚糖在室温下长期稳定存储DNA的可能性研究。而且，还未制备利用壳聚糖产生的存储DNA的产物。并且，还没有报道利用壳聚糖-结合的DNA和以壳聚糖和体液而不是和DNA本身，如血液的混合形式存储DNA进行基因表达分析的可能性。此外，除了本发明的产品外，还未发布用于利用壳聚糖存储、运载和分析人类或动物的基因组DNA的产品。
[公开内容]
[技术问题]
本发明的一个方面为其提供了利用水溶性壳聚糖在室温下以稳定状态存储和运载DNA样品的方法。
本发明的另一方面为其提供了水溶性壳聚糖和稳定DNA的复合物，其可用于各种DNA检测方法中。
根据本发明的壳聚糖存储DNA的方法，本发明的另外一方面为其提供了具有合适特性和浓度的壳聚糖溶液，其可与DNA形成稳定的结合而可能在室温下长期运载和存储DNA，方便研究和分析DNA并且方便应用。
本发明更进一步的方面为其提供了用于制备包含壳聚糖的纸型卡片(DNA卡片)的方法，其可以液态存储结合的壳聚糖和DNA并且最小空间中存在大量DNA样品，提供了用于进行遗传分析的方法如PCR、PCR-RFLP、克隆、序列分析和Southern印迹、微阵列检测等等，并且提供了用于从其结合状态分离壳聚糖和DNA的方法。在这种情况下，DNA卡片可主要分为1型和2型：1型在包含壳聚糖的纸型卡片上存储DNA本身，而2型在包含壳聚糖和细胞裂解缓冲液的纸型卡片上存储包含DNA的生物样品，如血液而不是DNA本身。两种情况中，目的为在室温下长期以稳定状态存储DNA以及如有必要进行此后的各种遗传分析。
本发明的另一个方面为其提供了DNA标识卡(DNA ID卡)，其中个体的DNA样品以与壳聚糖的混合物形式存储，并且通过进行检测如用于个人鉴定的遗传检测，HLA基因分型检测等等而获得的个体的遗传信息在塑料卡的磁条上或芯片上保存。塑料DNA ID卡可用于存储个人信息如各种***和现金卡、重要机构的入场卡、生物护照、军事力量等等，或用于共享器官移植如骨髓移植的遗传信息。
[技术解决方法]
本发明中，研究了用于存储动大的动物和植物基因组DNA的新方法，并且因此证实当水溶性壳聚糖与DNA混合时，形成稳定的结合而保护DNA免受脱氧核糖核酸酶分解并且可在室温下以稳定状态长期存储，并且因此完成本发明。
通过本发明的方法和产品所要达到的状况如下：
1)DNA应当以在室温下不降解的稳定状态存储；
2)此处的DNA样品应当包括人类、动物、植物和细菌基因组DNA和cDNA，以及质粒DNA；
3)该方法应当是简单的并且应当不需要使用专用设备或仪器；
4)成本应当是合算的；
5)DNA存储应当不仅用于分离的和纯化的DNA本身，而且用于包含体液如血液以及各种DNA的生物样品而不破坏DNA；
6)DNA样品应当利用简单的介质如纸或卡片存储；
7)大量DNA样品应当存储在有限的空间中；
8)个人应当可以存储个人的DNA；
9)关于通过上述方法和产物存储以及运输的DNA样品，各种遗传分析如PCR、PCR-RFLP、杂交、序列分析、SNP分析等等应当甚至在长时期后精确和简单地进行，并且应当有助于研究及各种临床检查；和
10)，DNA ID卡应当起存储个人的DNA的DNA库的作用，并且此外还一起存储该人的遗传信息。
以下，本发明将根据附图详细描述。
图1为举例说明本发明的DNA和水溶性壳聚糖结合产物的制造和分析过程的方块图。在检查制造DNA和水溶性壳聚糖结合产物的方法时，参考图1，首先，建立DNA和水溶性壳聚糖结合的最佳条件，并且分析DNA和壳聚糖混合物对DNA核酸酶的保护效果和迁移率转变(S101)。随后，对于液态的DNA和壳聚糖混合物，进行PCR测定和存储DNA效果的分析(S102)。利用上述结果，制造1型DNA卡，并且进行PCR测定和存储DNA效果的分析(S103)。以同样的方式，制造2型DNA卡，并且进行PCR测定和存储DNA效果的分析(S104)。分析以在上述制造的1型和2型DNA卡上长期存储的样品为基础的遗传分析的可能性(S105)。随后，制造包含壳聚糖的一体型PCR试剂盒，并且分析其可用性(S106)。随后，制造塑料的DNA ID卡(S107)。
本发明中，为了与DNA形成稳定的复合物以保护DNA免受脱氧核糖核酸酶分解，并且在室温下以稳定状态存储DNA，使用了具有合适特性和浓度的水溶性壳聚糖溶液、包含所述溶液的纸型卡片或PCR试剂盒和塑料型DNA ID卡等等。
优选本发明中所用的壳聚糖具有10至500kD的分子量。具有小于10kD分子量的壳聚糖在与DNA形成稳定的结合中存在问题，以及具有超过500kD分子量的壳聚糖可能干扰分析利用DNA的基因表达。此外，优选60％或以上脱乙酰作用程度的壳聚糖，并且当脱乙酰作用程度小于60％时出现壳聚糖的水溶性问题，因此其难以与DNA形成稳定的结合。制备的壳聚糖水溶液的浓度，按照重量体积比(w/v)为0.02％至1％，并且优选0.1％。混合壳聚糖水溶液和DNA水溶液时的混合比率按照壳聚糖水溶液中的壳聚糖对DNA水溶液中的DNA的重量比，为1∶0.5或以上，并且优选1∶0.5至1∶3(实施例1和2)。
本发明的DNA/壳聚糖结合产物在室温至-70℃的较宽的温度范围存储，并且存储在无水分的暗处。
同时，以与本发明的水溶性壳聚糖结合的形式存储的DNA即使存在脱氧核糖核酸酶的降解也是稳定地储存的，因此可用于遗传分析(参见实施例2)。
根据本发明，可以在与壳聚糖的混合物中存储的DNA包括人类、动物或植物、细菌的基因组DNA和质粒DNA，并且优选包括cDNA。可以在与壳聚糖的混合物中存储的DNA的大小的差异，可以从几十个至几亿个碱基。
同时，本发明与水溶性壳聚糖结合的DNA的液体混合物稳定储存，并且通过进行检测如聚合酶链式反应(PCR)、克隆、印迹、序列分析等等而很容易证实本发明存储DNA的方法的有效性。
根据本发明，可通过将合适浓度的壳聚糖和尿酸混合(详细地，0.1％至1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液混合物与浓度为0.5mM至20mM尿酸的体积比为1-1)，并且将该混合物吸附于用于印迹的纸上，且随后干燥而制备用于DNA存储(1型DNA卡)的卡片。利用上述卡片，大量DNA可在室温下长期存储且携载于最小空间中。至于制备用于存储DNA的卡片所用的纸，可使用商业上可用的用于色谱法的各种纸或用于印迹的纸，并且纸的厚度优选约0.3mm至1.2mm。用于存储DNA的卡片的存储合适的温度是室温，但允许降温至-20℃和-70℃，并且在室温下存储6个月或以上是可能的。
当本发明中进行PCR时，其中DNA和壳聚糖的混合物为液体的情况中，混合物本身用作模板，而当混合物为卡片形式的情况中，切割卡片的片段并且用作模板以进行PCR扩增、克隆和测序分析的常规方法。因此，证实了DNA储存得足构稳定，可以利用本发明的方法存储的DNA执行遗传分析方法(实施例5)。
根据本发明，可通过将合适的壳聚糖溶液与包括Tris、EDTA、SDS和尿酸(详细地，Tris(8mM)、EDTA(0.5mM)、SDS(0.1％w/v)和尿酸(2mM))的细胞裂解缓冲液的混合物吸附至用于印迹的纸上，且随后干燥而制备用于存储DNA的卡片(2型DNA卡)。利用上述卡片，DNA可以在包含DNA的生物样品如血液的状态在室温下长期存储和携载(实施例6)。
同时，利用本发明的DNA卡存储的DNA稳定储存，并且此后可进行如PCR、PCR-RFLP、克隆、序列分析等等的检测(实施例7至10)。
此外，为了进行Southern印迹法，DNA和壳聚糖的复合物应当分离以使DNA能移至琼脂糖凝胶上。因此，通过利用对DNA无破坏并且不影响Southern印迹法结果的基于硫酸盐的阳离子盐分离DNA。上述基于硫酸盐的阳离子盐的实例包括十二烷基磺酸钠(SDS)、辛基硫酸钠(SOS)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(实施例9)。
本发明中作为利用壳聚糖的DNA存储方法的应用，制备PCR试剂盒，其中Taq聚合酶、引物、dNTP和缓冲液等等加至具有壳聚糖的一个管(所有的在一个管中)，并且样品如DNA或血清加至该管以引起PCR反应。特征在于，该PCR试剂盒可用于DNA存储和PCR测定(实施例11)。
此外，本发明提供了DNA ID卡，其中个体的DNA样品以与壳聚糖混合形式存储，并且通过进行遗传检测，或HLA基因分型检测而获得的个体的遗传信息在塑料卡的磁条上或芯片上保存(实施例12和13)。塑料DNA ID卡可用作个人的DNA库以及用于个人身份、个人器官移植、个人临床诊断等等的个人遗传信息库。
[附图说明]
图1为显示本发明的DNA和水溶性壳聚糖复合产物的产生和分析过程的方块图。
图2为DNA/壳聚糖复合物在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳照片，其通过将分离自正常成熟单核细胞的基因组DNA以1μg/μl的浓度与不同浓度的水溶性壳聚糖溶液以各种比率混合而获得((泳道1：分子量大小标记(1kb)，泳道2：仅DNA，泳道3：0.02％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.2，泳道4：0.02％(w/v)的壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.4，泳道5：0.02％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.6，泳道6：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶1，泳道7：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2，泳道8：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶3，泳道9：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2.5，泳道10：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶5，泳道11：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶7.5)。
图3为DNA/壳聚糖复合物在0.8％琼脂糖凝胶上的电泳照片，其通过将4.0kb大小的质粒DNA(pCMV-β-半乳糖苷酶)以1μg/μl的浓度与不同浓度的水溶性壳聚糖溶液以各种比率混合而获得(泳道1：分子量大小标记(1kb)，泳道2：仅DNA，泳道3：0.02％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.2，泳道4：0.02％(w/v)的壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.4，泳道5：0.02％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶0.6，泳道6：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶1，泳道7：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2，泳道8：0.1％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶3，泳道9：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶2.5，泳道10：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶5，泳道11：0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液∶DNA水溶液＝1∶7.5)。
图4为在1％的琼脂糖凝胶上比较和分析通过用脱氧核糖核酸酶(DNAse I)处理结合到壳聚糖的人淋巴细胞基因组DNA和未结合壳聚糖的DNA的DNA裂解程度的照片(泳道1：分子量大小标记(1kb梯度)，泳道2：仅DNA，泳道3：壳聚糖/DNA复合物，20分钟后，泳道4：壳聚糖/DNA复合物，40分钟后，泳道5：壳聚糖/DNA复合物，60分钟后，泳道6：未结合壳聚糖的DNA，20分钟后，泳道7：未结合壳聚糖的DNA，40分钟后，泳道8：未结合壳聚糖的DNA，60分钟后)。
图5为表示分别以DNA/壳聚糖复合物和未结合壳聚糖的人白细胞基因组DNA为模板进行针对β-肌动蛋白基因的PCR，而在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳的结果的照片，所述复合物模板通过将0.1％(w/v)壳聚糖溶液和1μg/μl浓度的人白细胞基因组DNA水溶液以1∶1的体积比混合而获得(泳道1：分子量大小标记(100bp)，泳道2：阴性对照，泳道3：阳性对照(直接分析白细胞基因组DNA)，泳道4：在将基因组DNA滴至DNA卡(1型)上并且随后在室温下存储一年后的分析，泳道5：在将血液滴至DNA卡(2型)上并且随后在室温下存储一年后的分析，泳道6：在血液吸收于用于印迹的纸上并且随后在室温下存储一年后的分析，和泳道7：在白细胞基因组DNA吸收于用于印迹的纸上并且随后在室温下存储一年后的分析)。
图6为表示以DNA/壳聚糖复合物和未结合壳聚糖的DNA为模板进行β-肌动蛋白基因PCR而在0.8％的琼脂糖凝胶上进行的电泳结果的照片，所述复合物通过将0.1％(w/v)壳聚糖溶液和1μg/μl浓度的人白细胞基因组DNA水溶液以1∶1的体积比混合而获得，和所述未结合的DNA两者以不同的温度和时间存储(泳道1：分子量大小标记(100bp)，泳道2：阴性对照，泳道3：阳性对照(分离和纯化自血液，且因此随后立即进行PCR的DNA)，泳道4：只有在-70℃存储三个月的DNA，泳道5：只有在室温下存储一周的DNA，泳道6：只有在室温下存储一个月的DNA，泳道7：在室温下存储三周的DNA/壳聚糖复合物，泳道8：在室温下存储三个月的DNA/壳聚糖复合物，泳道9：在室温下存储一年的DNA/壳聚糖复合物，泳道10：DNA滴于此上的1型DNA卡片，其在室温下存储三周，和泳道11：DNA滴于此上的1型DNA卡片，其在室温下存储三个月)。
图7为表示通过PCR比较和分析每种DNA卡片结果的琼脂糖凝胶电泳照片，其通过将壳聚糖吸附至不同种类的印迹纸并且干燥以制备1型DNA卡片，用移液管将正常成人的白细胞DNA滴至此，并且在室温下存储6个月而制备(泳道1：分子量大小标记(100bp)，泳道2：阴性对照，泳道3：阳性对照(直接分离和纯化自血液的DNA)，泳道4：在0.3mm厚的印迹纸上用0.02％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道5：在0.9mm厚的印迹纸上用0.02％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道6：在0.3mm厚的印迹纸上用0.1％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道7：在0.9mm厚的印迹纸上用0.1％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道8：在0.3mm厚的印迹纸上用0.25％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道9：在0.9mm厚的印迹纸上用0.25％壳聚糖溶液处理的DNA卡片，泳道10：0.3mm厚的印迹纸上未处理的DNA卡片，和泳道11：0.9mm厚的印迹纸上未处理的DNA卡片)。
图8显示对于人基因组DNA样品PCR后利用RFLP测定法的基因分型检测结果，样品利用本发明的水溶性壳聚糖和1型DNA卡片存储((a)：阳性对照，直接分离和纯化自成人白细胞的DNA样品，(b)：分离和纯化自成人白细胞，并且与本发明的壳聚糖溶液混合，且在室温下存储三月的DNA样品，(c)：分离和纯化自成人白细胞，转至本发明的1型DNA卡片以存储，并且在室温下存储一年的DNA样品)(泳道1和12：100bp大小分子量标记，泳道11：25bp大小分子量标记，泳道2和3：对载脂蛋白E(Apo E)基因的测定，泳道4和5：对血管紧张素原(AGT)基因的测定，泳道6和7：对血管紧张肽转化酶(ACE)基因的测定，泳道8：对血管紧张素1受体(AT1R)基因的测定，泳道9和10：对内皮氧化氮合酶(eNOS)基因的测定，和泳道13和14：对MTHFR基因的测定)。
图9显示利用PCR-RFLP测定对本发明的2型DNA卡片的样品基因分型检测的结果，样品在吸收于其上时存储((a)：阳性对照，直接分离和纯化自成人白细胞的DNA样品，(b)：通过将成人血液吸附于本发明的2型DNA卡片上并且在室温下存储三个月而制备的DNA样品，(c)：通过将成人血液吸附于本发明的2型DNA卡片上并且在室温下存储的DNA样品)(泳道1和8：100bp分子量大小标记，泳道7和15：25bp分子量大小标记，泳道2和3：血管紧张素原基因，泳道4和5：血管紧张肽转化酶(ACE)基因，泳道6：血管紧张素受体1(AT1R)基因，：泳道9和10：内皮氧化氮合酶(eNOS)基因，泳道11和12：MTHFR基因，和泳道13和14：载脂蛋白E(Apo E)基因)。
图10为表示通过自动碱基序列测定搜索APC(结肠腺瘤息肉病)基因结果的图，以成人结肠组织的基因组DNA为模板对其进行PCR，其与根据本发明方法的水溶性壳聚糖溶液混合，并且在室温下存储一个月，并克隆其产物。
图11为表示通过自动碱基序列测定搜索p53基因结果的图，以肺癌组织的基因组DNA为模板对其进行PCR，模板根据该方法滴至本发明的DNA卡片上并且在室温下存储三个月，且克隆其产物。
图12为表示利用SDS从壳聚糖和DNA的复合物分离壳聚糖和DNA的结果的琼脂糖凝胶电泳照片(泳道1：分子量大小标记(100bp)，泳道2-仅DNA，泳道3：0.1％(w/v)壳聚糖溶液/DNA水溶液(1μg/μl)，泳道4：0.1％(w/v)壳聚糖溶液/DNA水溶液的复合物(1μg/μl)，其用0.1％(w/v)SDS处理，泳道5：0.1％(w/v)壳聚糖溶液/DNA水溶液(1μg/μl)，其用1％(w/v)SDS处理，和泳道6：0.1％(w/v)壳聚糖溶液/DNA水溶液的复合物(1μg/μl)，其用5％(w/v)SDS处理)。
图13为以DNA/壳聚糖复合物为模板对K-ras基因进行Southern印迹的照片，根据本发明的方法，通过将胰腺癌组织的基因组DNA水溶液(1μg/μl)和0.1％(w/v)壳聚糖溶液以1∶1的体积比混合，并且在室温下存储三个月而获得复合物(泳道1：胰腺癌组织的DNA，其在室温下存储一个月，泳道2：胰腺癌组织DNA/壳聚糖溶液的复合物，其在室温下存储一个月，泳道3：获自正常人外周血白细胞的DNA，其在-70℃存储一个月，和泳道4：获自正常人外周血白细胞的DNA，其在室温下存储一个月)。
图14为显示制备塑料DNA ID卡的过程的流程图，其利用本发明的DNA卡片制备。
图15为一个简图，显示利用STR检测的15个组合鉴定个人基因型，并且制备个人基因型分布图，以及编码个人基因型数据的过程的简图。其为本发明塑料DNA ID卡一个实例的简图。
图16为显示在制备本发明的DNA ID卡过程中1型或2型DNA卡片整合入PVC卡内部的简图。
图17为本发明塑料DNA ID卡的一个实例的简图。
图18为本发明塑料DNA ID卡编码信息的一个实例的简图。
图19显示了比较eNOS基因PCR扩增的结果，其为老年疾病基因的一种，当血液和gDNA存储于塑料DNA ID卡上时在高温和高压下制备的塑料DNA ID卡(对于血液)上进行PCR扩增(泳道1和7：分子量大小标记(100bp)，泳道2：DNA ID卡，其上滴有血液(对于血液)，泳道3：DNA ID卡，其上滴有gDNA(对于血液)，泳道4：DNAID卡(对于血液)，其上滴有血液，并且塑料护封，泳道5：DNA ID卡(对于血液)，其上滴有gDNA，并且塑料护封，和泳道6：阴性对照)。
图20显示了利用塑料DNA ID卡进行eNOS基因PCR扩增的结果，其为老年疾病基因的一种，卡为在实验室中用高温在无人工压力下处理的卡以及实际上在高温和高压下通过改变放样品的时间而制备的卡(泳道1：用于DNA的DNA ID卡，其中在室温下装载DNA，泳道2：DNA ID卡，其中在180℃烧30分钟后装载DNA，泳道3：DNA ID卡，其中在180℃烧1小时后装载DNA，泳道4：DNA ID卡，其在室温下装载DNA后在180℃处理1小时，泳道5：DNA ID卡，其在DNA装载后在180℃处理30分钟，泳道6：DNA ID卡，其在DNA装载后在180℃处理1小时，泳道7：用于血液的DNA ID卡，其在高压(125bar)和高温(180℃)下产生，且随后装载血液，泳道8：用于血液的DNA ID卡，其在高压(125bar)和高温(180℃)下产生，且随后装载DNA，泳道9：用于血液的DNA ID卡，其装载血液，且随后在高压(125bar)和高温(180℃)下制备，泳道10：用于血液的DNA ID卡，其装载DNA，且随后在高压(125bar)和高温(180℃)下制备)。
图21显示了利用在高温和高压下制备的塑料DNA ID卡，对eNOS基因PCR扩增的结果，具体地，为用于DNA和用于血液的卡片段，其通过改变滴量而分别滴有150nμg/μlgDNA和血液，随后存储(泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照(血液的gDNA)，泳道3：DNA ID卡(对于DNA)，其中在室温下装载gDNA(5μl)，泳道4：DNA ID卡(对于DNA)，其中装载gDNA(10μl)，泳道5：DNA ID卡(对于DNA)，其中装载gDNA(50μl)，泳道6：DNA ID卡(对于DNA)，其中装载血液(10μl)，泳道7：DNA ID卡(对于DNA)，其中装载血液(50μl)，泳道8：DNA ID卡(对于DNA)，其中装载血液(100μl)。
图22显示利用存储于在高温和高压下制备的DNA ID卡上的样品，进行内皮氧化氮合酶(eNOS)基因PCR扩增的结果，其为一种老年疾病基因，其中该卡片的一些片段用洗涤缓冲液处理而作为PCR扩增的预处理过程，而其它的未处理(泳道1和10：100bp分子量大小标记，泳道2：阴性对照，泳道3：通过用洗涤缓冲液在室温下处理其中存储DNA四天后的收集卡制备的卡片段，泳道4：通过用洗涤缓冲液在室温下处理其中存储DNA并且包含BPB(溴酚蓝)的收集卡四天后制备的卡片段，泳道5：通过置于室温下四天后用洗涤缓冲液处理其中存储DNA的塑料DNA ID卡制备的卡片段，泳道6：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于3mm纸上，用高压灭菌器灭菌，置于室温下四天，并且用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道7：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于收集卡上，置于室温下四天，并且用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道8：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于BPB收集卡，用高压灭菌器灭菌，置于室温下四天，并且用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道9：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于塑料DNA ID卡上，用高压灭菌器灭菌，置于室温下四天，并且用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道11：通过在室温下存储其中DNA作为血液状态存储四天的收集卡，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道12：通过在室温下存储其中DNA作为血液状态存储四天的BPB收集卡，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道13：通过在室温下存储其中DNA作为血液状态存储四天的塑料DNA ID卡，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道14：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于3mm纸上，用高压灭菌器灭菌，置于室温下四天，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道15：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于收集卡上，置于室温下四天，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道16：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于BPB收集卡上，置于室温下四天，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段，泳道17：通过将0.1％壳聚糖/DNA复合物滴于塑料DNA ID卡上，置于室温下四天，且不用洗涤缓冲液处理而制备的卡片段)。
[最佳方式]
本发明将用以下的实施例进一步说明。然而，本发明的范围不限于此。
实施例1：DNA和壳聚糖的复合物通过琼脂糖凝胶电泳的迁移率转变测定
为了产生在与DNA混合时形成稳定复合物的壳聚糖的合适的特性、浓度和混合条件，不同浓度的水溶性壳聚糖与从正常成人血液的单核细胞分离的全部DNA以不同的比率混合，且随后通过琼脂糖凝胶电泳进行结合到壳聚糖的DNA迁移率转变的测定。此外，对小鼠肝组织的基因组DNA和4.0kb大小的质粒DNA(pCMV-β-半乳糖苷酶)以同样的方法进行结合到壳聚糖的DNA的迁移率转变测定。用于实验的方法和结果如下。
A.DNA分离和制备
分离来自正常成人白细胞的细胞的全部DNA，根据已知方法(Sambrook J & Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，Cold Spring Harbor Press.2001：7.1-7.88)利用三蒸水进行实验。
外周静脉血收集于含有柠檬酸钠的试管中(vaccutainer CTAD管，目录No 367946，Becton & Dickinson，USA)，并且通过离心分离单核细胞的血浆和白细胞层(buffy coat layer)。单核细胞DNA，大多数为淋巴细胞，利用QIAamp DNA血液minikit(Qiagen，Germany)以下列方法分离。
20μl蛋白激酶K(QIAGEN蛋白酶)放入1.5毫升微量离心管，此外按顺序添加200μl白细胞层和200μl缓冲液AL，并且通过涡流15秒混合。在56℃静置10分钟并且离心以收集粘至管帽的溶液。此外添加200μl乙醇，通过涡流15秒混合，并且所有溶液添加至QIAamp离心柱，且在8,000rpm离心一分钟。随后，2ml收集管***柱中，此外添加500μl缓冲液AW1，并且在8,000rpm再离心一分钟。丢弃由此获得的滤液，且提供新的试管，并且进一步在最高转速离心一分钟。再次***新的1.5ml微量离心管，向其中添加200μl蒸馏水或缓冲液AE，在室温静置一分钟，且随后在8,000rpm离心一分钟以洗脱DNA。利用分光光度计测量由此分离的DNA的浓度，并且比较A260/A280比率以测定分离的DNA的纯度。在这时候，DNA纯度应当为依据分光光度计的测量A260/280为1.6至1.8。根据上述方法，从200μl人血液平均可获得6μg纯的DNA。
B.壳聚糖的制备
如果水溶性壳聚糖为脱乙酰程度为60％或以上并且分子量为10kD至500kD的产物时，其可用于本发明的应用，具体地用于与DNA形成稳定的复合物。与这些相当的许多水溶性壳聚糖产物为市场上可买到的。这其中，本发明中平均脱乙酰率为90.1％并且平均分子量为约300kD的水溶性壳聚糖产物购自Jakwang公司(Ansungsi，Republic ofKorea)，并且溶于灭菌的三蒸水。除了该壳聚糖，也可使用其他具有相似特性的水溶性壳聚糖。
C.用于制备壳聚糖和DNA复合物的方法
水溶性壳聚糖溶于灭菌的三蒸水，并且以0.02％至0.05％、0.1％、0.25％、0.5％和1％重量体积比(w/v)的不同浓度制备而用于检测。这里，DNA用灭菌的三蒸水稀释至500nμg/μl和1μg/μl，随后使用。
1.5ml的离心管中，DNA溶液和上述不同浓度的壳聚糖溶液以不同的体积比混合，并且在室温静置15分钟以诱导复合物的形成。
D.通过琼脂糖凝胶电泳测定DNA和壳聚糖的复合物的迁移率转变
通过将1μg/μl浓度的从正常成人单核细胞分离的基因组DNA和质粒DNA和不同浓度的水溶性壳聚糖溶液以不同比率混合而获得的DNA/壳聚糖复合物根据上述方法上样至0.8％琼脂糖凝胶，并且在100V进行电泳。结果分别在图2和3中显示。结果表明当仅有不与壳聚糖混合的DNA进行电泳时，DNA正常移动并且在18s和28s观察到rDNA条带，而DNA水溶液(1μg/μl)与0.02％、0.1％或0.25％的壳聚糖溶液分别以1∶0.2、1∶1或1∶2.5或以上的体积比混合时(在这时候，混合物中壳聚糖和DNA的重量比为1∶1或以上)，DNA完全结合壳聚糖使得其不在琼脂糖凝胶上移动。因此，在下列实验中其用作标准，其中壳聚糖和DNA复合物的组成为0.1％壳聚糖溶液与1μg/μl浓度的DNA溶液以1∶1的体积比混合(在这时候，混合物中壳聚糖和DNA的重量比为1∶1)。然而，此仅为组成的一个实例，并且取决于所用壳聚糖产品的特性，合适的组成可有些不同。
实施例2壳聚糖的脱氧核糖核酸酶保护测定
为了确定水溶性壳聚糖是否可以保护DNA免受脱氧核糖核酸酶(DNAse)酶解，并且建立生合适的条件，用壳聚糖溶液处理的DNA和未处理的DNA分别用脱氧核糖核酸酶处理，并且通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。
方法和结果如下。用人淋巴细胞的基因组DNA和小鼠肝组织的基因组DNA重复进行相同的实验。
八个试管分成两组。一组中，壳聚糖(20g)溶于蒸馏水并且与DNA(10g)在微量离心管(1.5ml)中混合以产生复合物。另一组中，仅DNA(10g)添加至试管而无壳聚糖。第一组和第二组的每个试管，添加以1单位/l浓度溶解的5μl脱氧核糖核酸酶(DNAse I)，且随后添加蒸馏水至100μl终体积。随后，保存用于在37℃温箱中分别反应0分钟、20分钟、40分钟和60分钟。反应结束后马上添加25μl终止溶液并且充分混合以灭活DNAse I。向其中反应被灭活的四个试管中的每一个添加110μl TE缓冲液(10mm Tris，0.1mm EDTA)并混合，并且随后在60℃反应过夜。随后，添加150μl苯酚/氯仿和通过涡流一分钟混合，并且在室温下离心5至8分钟。随后，取上清并且放入新的微量离心管，且抽提。此外添加300μl无水EtOH和15μl 3MNH4OAC，并且预先在冰柜中-70℃静置20至30分钟。随后，产物在4℃12,000rpm离心20分钟，通过吸力丢弃液体。沉淀物用70％乙醇再次洗涤，并且干燥，溶于20μl蒸馏水，其无DNAse。分别从由此获得的全部八个试管取产物10μl(约1μg DNA)，并且在1％琼脂糖凝胶上电泳。结果显示在图4中。
从图4发现未用壳聚糖用处理的DNA在用DNAse I处理后40分钟差不多裂解，而用壳聚糖处理的DNA在用DNAse处理后40分钟不裂解，大多数保留在孔中。这些结果表明根据本发明的方法如果壳聚糖和DNA即使以1∶0.5的重量比混合，其也有效抑制DNA经脱氧核糖核酸酶的裂解，并且本发明的方法对DNA存储是有效的。
实施例3：对DNA和壳聚糖复合物的基因扩增可能性的研究
利用根据实施例1和2制备的水溶性壳聚糖和DNA的液体复合物进行PCR以确定是否适当地扩增了靶基因，并且由此确定本发明的DNA存储方法是否对基因分析没有不良影响，并且在PCR中建立合适的条件以使用通过本发明的DNA存储方法存储的DNA。对于人白细胞基因组DNA，用每种？肌动蛋白基因进行PCR。方法和结果如下。
利用100ng对象DNA作为模板通过分别添加10pmol靶基因的正向引物和反向引物，并且进一步添加2.5mM脱氧核苷酸(dNTP)，1单位Taq聚合酶和10x聚合酶缓冲液(500mM KCl，100mM Tris-Cl，15mM MgCl2，0.1％明胶)进行PCR反应。利用GeneAmp 2700热循环仪(Perkin-Elmer Biosystems，Inc.，USA)进行PCR，首先在第一个95℃条件下5分钟，然后四十次的在95℃条件下30秒，55℃30秒以及72℃30秒，并且最后在72℃7分钟以产生PCR产物。
通过将0.1％壳聚糖和DNA(1μg/μl)以1∶1的体积比混合而制备的人和小鼠基因组DNA模板和不与壳聚糖混合的DNA的模板，对β-肌动蛋白基因进行PCR。1.5％琼脂糖凝胶上的电泳结果显示于图5中。与壳聚糖混合的两者显示相同的程度的661bp大小β-肌动蛋白基因的强DNA条带。这表明本发明的壳聚糖混合的介质对PCR没有不良影响，并且可有效用于查找基因表达。
实施例4：在室温下长时间存储的DNA和壳聚糖复合物的PCR扩增实验
根据上述结果，发现水溶性壳聚糖几乎完全结合DNA，并且稳定地保护DNA免受脱氧核糖核酸酶侵蚀。本实施例中，确定当水溶性壳聚糖和DNA的复合物在室温下以液态长时间存储时，存储的DNA是否保持没有裂解以使得可以进行基因扩增和分析。其通过如下的PCR分析进行。
1μl 0.1％的水溶性壳聚糖溶液(w/v)和1μl正常成人血液(500ng/μl)单核细胞的基因组DNA混合而形成复合物，并且进一步添加8μl蒸馏水以调节终体积至10μl。由此，在离心管中制备24个样品并且在室温下存储。没有用壳聚糖处理的1μl相同的白细胞DNA调节至终体积10μl以制备9个样品。三个样品存储在-70℃，而剩下的六个样品在室温下存储。对于与水溶性壳聚糖混合并且在室温下存储于试管中的DNA，根据实施例3的方法对三个DNA样品分别在一周、两周、三周、四周、三个月、六个月、九个月和一年的时间点进行PCR反应，分别确定是否适当地扩增了靶基因。没有与壳聚糖混合的DNA样品中，对于三个存储在-70℃的样品，在三个月后进行PCR，并且对于存储在室温下的三个DNA样品，分别在三个月和一年后进行PCR。图6为表示进行PCR后β-肌动蛋白基因在0.8％琼脂糖凝胶上电泳结果的照片。
根据图6，发现当DNA不结合壳聚糖(裸露的)而在室温下于微量离心管中存储三个月和一年时，作为持家基因的β-肌动蛋白从不表达。相反，当DNA样品结合壳聚糖在室温下作为液体存储于试管中一周至一年时，明显检测到β-肌动蛋白基因。发现对于不结合壳聚糖而根据常规方法存储在-70℃的DNA样品，扩增的β-肌动蛋白的量与结合壳聚糖而根据本发明的方法在室温下存储的DNA样品的量类似。
所述结果表明当根据本发明方法的结合水溶性壳聚糖时以液体存储DNA的方法可稳定地保存DNA至少一年，存储的DNA在用于PCR分析中没有问题，而且该方法可与常规的低温冰箱存储方法类似而稳定地存储DNA。本实施例中的存储温度可从室温至-70℃。其优选在不潮湿的暗处存储。
实施例5：DNA卡片(1型)的制备，其中壳聚糖吸附于纸上，以及因此的基因扩增可能性研究
为了在室温下最小空间中存储和运载多个样品DNA并且有助于自动分析，已开发了其中壳聚糖吸收于合适纸上的卡片，其称为DNA卡片。DNA卡片种类不同，并且其中用途为存储DNA本身的纸卡片称为1型DNA卡片。
为了选择水溶性壳聚糖溶液的最有效浓度和纸的合适厚度，进行下列实验。
用于印迹的不同种类的纸浸于0.02％、0.1％或0.25％(w/v)浓度的水溶性壳聚糖溶液中足够长的时间，然后干燥以产生DNA卡片。在这时候，纸选自可从不同公司如Whatman plc.(UK)或Schleicher &Schuell GmbH(德国)购买，并且具有合适厚度的用于印迹的纸。本发明中，从Whatman plc.购买和使用0.3mm、0.9mm和1.2mm厚用于印迹的纸。用于与壳聚糖一起存储DNA的DNA卡片的种类和大小可根据用途而不同地制备。壳聚糖吸附其上的印迹纸切割成与24-孔、96-孔和384-孔板(多孔板)(8.1cm-12.3cm)的相同大小，其通常充分使用，并且像板一样将孔和分隔区印刷和标记于纸上。每一孔上用移液管滴下DNA样品，并且在室温下存储一周至一年以上。因此，一个DNA卡片可存储24至96，至384个DNA样品的部分。
产生水溶性壳聚糖-浸没的DNA卡片的方法如下。
在高温下高压锅中灭菌来自Whatman plc.用于印迹的0.3mm厚的纸，然后干燥。随后，预先制备的0.1％(w/v)浓度的水溶性壳聚糖溶液和2mM尿酸溶液以1∶1的体积比混合，并且该纸浸没足够的时间，随后干燥而产生1型DNA卡片。
其中点样人基因组DNA并且长时间存储的人基因组DNA滴于如上制备的1型DNA卡片上，并且存储一段时期。利用穿孔机、钳子或小镊子从存储的DNA卡片取直径为约1mm至2mm的卡片碎片，并且加至试管用于进行PCR。用该卡片碎片为模板，根据实施例3的方法进行β-肌动蛋白基因的PCR。该PCR反应的方法如下。
1.利用穿孔机等等从其中存储DNA的壳聚糖浸没的纸卡片取直径为约1.2mm的碎片并且加至试管用于PCR。
2.添加200μl TE缓冲液(10mM Tris-Cl，0.1mMEDTA，pH＝8.0)，混合，并且随后置于室温下5分钟。此后，利用移液管完全除去TE缓冲液。
3.第二个步骤重复两次。
4.在室温下干燥1小时或在56℃干燥10分钟。
5.合适组成的PCR样品添加至经上述步骤处理的卡片碎片并且根据实施例3的方法PCR扩增β-肌动蛋白基因。
图7显示琼脂糖凝胶电泳实验照片的结果，其显示通过PCR的比较和分析结果。发现对于所有通过浸在0.1％壳聚糖溶液中而制备的DNA卡片，靶基因表达强，而且纸越厚如0.9mm或1.2mm，则产生PCR产物越多。此外，当吸附于本发明的DNA卡片上而存储时，β-肌动蛋白基因即使在室温下在长时间如三个月至一年后在PCR中也能强烈扩增，与存储在-70℃的情况类似。所述结果表明当存储在本发明的DNA卡片中时，多种不同的DNA样品可甚至在室温下长时间稳定储存，并且可在长时间后分析。因此，发现本发明的DNA卡片可用于简单地在室温下长时间存储和运载多种不同的DNA样品，并且此外也可用于各种基因分析如PCR或碱基测序，如本实施例及其后的实施例所示。
实施例6：DNA卡片(2型)的制备，其中壳聚糖和细胞裂解缓冲液吸附于纸上，以及因此基因扩增可能性的研究
该2型DNA卡片通过将壳聚糖和细胞裂解缓冲液吸附于用于印迹的不同种类的纸并且干燥而产生。该2型DNA卡片设计成用于存储样品如包含细胞的体液如血液，并且随后通过PCR扩增而用于基因分析。人血液滴于该2型DNA卡片上，并且一段时间后通过PCR比较和分析其性能。
如实施例5中制备的用于印迹的纸卡片浸在水溶性壳聚糖溶液和细胞裂解缓冲液中足够的时间并且干燥以产生DNA卡片。在这时候，从Whatman plc.购买和使用0.3mm、0.9mm和1.2mm厚的用于印迹的纸。产生用于以血液存储的2型DNA卡片的方法如下。
在高温下灭菌和干燥来自Whatman plc.用于印迹的0.3mm厚的纸。随后，之前产生的0.1％(w/v)浓度的水溶性壳聚糖和细胞裂解缓冲液(0.5mMEDTA，8mMTris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)以1∶1的体积比混合，并且该纸浸没足够的时间，随后干燥而产生2型DNA卡片。
如实施例5中那样，从上述DNA卡片取直径为约1mm至2mm的卡片碎片，并且加至试管用于进行PCR。用该卡片碎片为模板，进行β-肌动蛋白基因的PCR。该PCR反应的方法如下。
1.利用穿孔机等等从其中存储DNA的壳聚糖-浸没的纸卡片取直径为约1.2mm的碎片并且被加至试管用于PCR。
2.添加200μl洗涤液(GG纯化试剂；0.5mM EDTA，8mMTris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)，混合且置于室温下5分钟。随后，利用移液管完全除去洗涤液。
3.第二个步骤重复三次。
4.随后，添加200μl TE缓冲液(10mMTris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)，混合且置于室温下5分钟。随后，利用移液管完全除去TE缓冲液。
5.第四个步骤重复两或三次。
6.其在室温下干燥1小时或在56℃干燥10分钟。
7.合适组成的PCR样品添加至经上述步骤处理的卡片碎片并且根据与实施例2中相同的方法PCR扩增β-肌动蛋白基因。
作为实验结果，发现对于所有2型DNA卡片，靶基因强表达，而且纸越厚如0.9mm或1.2mm，则产生越多的PCR产物。此外，当吸附于本发明的DNA卡片上而存储时，β-肌动蛋白基因甚至在室温下在长时间如三个月至一年后在PCR中强扩增。所述结果表明当存储于本发明的DNA卡片中时，DNA样品如血液可在不需要分离和纯化DNA的条件下在室温下长时间稳定储存，并且可在长时间后分析。因此，发现本发明的DNA卡片可用于简单地在室温下长时间存储和运载DNA样品如血液，并且此外也可用于各种基因分析如PCR等等。
实施例7：对长时间存储的DNA和壳聚糖复合物克隆靶基因以及碱基测序可能性的研究
根据实施例4，对作为液体在室温下长时间存储的壳聚糖/DNA复合物进行PCR，并且克隆获得的产物。随后，通过自动碱基测序确定根据本发明的方法存储的DNA是否可稳定地保存并且在存储后使用。
用成人结肠组织的基因组DNA样品为模板，其根据本发明的方法与0.1％水溶性壳聚糖混合而在室温下存储三个月，对腺瘤息肉结肠(APC)基因进行PCR。产物克隆入质粒载体中，且随后再次通过碱基测序查找。方法如下。
重要的是调节基因的PCR产物至合适的浓度以用作测序反应中的模板。本发明中，使用10ng APC基因。APC基因的每一外显子PCR产物，3.2pmol的正向或反向引物之一和8μl反应混合物(Terminatorready反应混合物；Perkin-Elmer，USA)添加至PCR试管，并且添加灭菌的蒸馏水至20μl终体积且充分混合。利用GeneAmp 2700热循环仪对混合物进行循环测序反应，96℃10秒、50℃5秒以及60℃6分钟25次。获得的反应产物用乙醇沉淀并且离心以除去游离引物和反应混合物(terminator ready反应混合物)中的荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)，并且干燥。由此-获得的DNA与甲酰胺：25mM EDTA(pH8.0)：蓝葡聚糖和10μl上样缓冲液的混合物混合，并且在沸水中变性5分钟。随后，样品置于冰上，并且变性的DNA样品加至平板的每个孔，其之前已用5.5％长程凝胶(BMA，catalogue No.，USA)浇铸。电泳进行2至4个小时并且利用ABI Prism 377自动测序仪(Perkin-Elmer Biosystems，USA)的软件进行碱基测序。
对APC基因的自动碱基测序结果显示在图10中。
如测序的结果，发现正常APC基因正确扩增，且因此本发明方法的DNA和壳聚糖液体复合物很稳定地储存DNA，甚至在室温下长时间存储后可进行克隆和碱基测序，表明其也可用于检测基因突变和查找癌症。
实施例8：长时间存储在DNA卡片中的DNA的基因克隆和碱基测序可能性的研究
确定了对于在室温下长时间吸附于DNA卡片上而存储的DNA样品是否可以通过PCR和自动碱基测序而恰当地对获得的产物进行克隆。
用人肺癌组织的基因组DNA样品为模板，其滴在根据实施例5制备的DNA卡片上而存储三个月，对p53肿瘤抑制基因进行PCR。产物克隆入质粒载体中，且随后再次通过自动碱基测序查找。方法与实施例7的相同。结果在图11中显示。
结果发现突变的p53基因正确扩增(图11)，而且当利用根据本发明的方法制备的DNA卡片存储DNA时，保存DNA以允许在甚至很长时间后克隆和自动碱基测序，至此其也可用于检测基因突变和查找癌症。
实施例9：用DNA/壳聚糖复合物为模板的Southern印迹
在通过根据本发明的方法存储的DNA和壳聚糖复合物的杂交分析如Southern印迹等等分析特定基因的存在和量中，结合壳聚糖的DNA在琼脂糖凝胶电泳中不移动，所以其难以进行印迹分析。因此，对于印迹分析，DNA样品应当除去壳聚糖而使用。因此本发明中，已建立了除去壳聚糖而不破坏结合壳聚糖的DNA的方法。
如上所述，水溶性壳聚糖为阳离子盐并且结合DNA，所以壳聚糖可通过用强阳离子盐如SDS(十二烷基磺酸钠)、SOS(辛基硫酸钠)和CTAB(溴化十六烷基三甲铵)的硫酸盐处理而与DNA分离。在这种情况下，阳离子盐应当是便宜的并且对印迹分析没有影响且不破坏DNA。因此本发明中，使用SDS(Sigma Co.，USA)，其是便宜的并且对DNA和探针之间的杂交反应没有影响。
根据本发明的方法通过将壳聚糖溶液和胰腺癌组织DNA混合而获得的DNA/壳聚糖复合物在室温下存储三个月。随后，5至10μg该DNA/壳聚糖复合物与5％(w/v)SDS混合，并且在琼脂糖凝胶上电泳用于Southern印迹。通过已知的方法(Sambrook J & Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)对K-ras基因进行Southern印迹。结果分别在图12和图13中显示。
从图12发现在具有5％SDS的电泳的情况下DNA和壳聚糖分离并且DNA在凝胶上移动。
此外，图13显示Southern印迹的结果，对于不结合壳聚糖存储在-70℃的和以壳聚糖/DNA形式存储六个月的两种DNA，K-ras基因都强表达。因此，建立利用根据本发明的DNA存储方法长时间存储的DNA进行Southern印迹的方法。此外发现根据本发明的方法存储的DNA可用于杂交分析。
实施例10：对长时间存储在DNA卡片中的DNA PCR-RFLP分析可能性的研究
对利用本发明的1型DNA卡片存储的人基因组DNA样品进行PCR，并且随后检测利用RFLP(限制性片段长度多态性)分析是否可以对其进行基因分型检测。1型DNA卡片的PCR后利用RFLP分析的基因分型结果显示在图8中。此外，研究了是否可以利用PCR-RFLP分析对作为血液存储在本发明的2型DNA卡片中的人样品进行基因分型。结果在图9中显示。为了证明本发明的DNA卡片事实上可用于基因诊断中，与心血管疾病的发作有关的基因通过PCR扩增，并且用下列特定的限制性酶处理。通过电泳分析结果。结果发现查找多个基因分型没有问题。
本实施例将在下文中详细描述。
利用本发明的1型DNA卡片和型DNA卡片以及塑料DNA ID卡，分别在PCR试管中利用下表所示的反应溶液制备下列六个与老年疾病有关的基因。
[表1]
    组成   eNOS1/2   MTHFR1/2     AGT1/2     ACE1     ACE2     AT1R   APOE1/2
    D.W.   20.8   20.8     19.3     19.1     17.6     20.3   17.8
    10xbuffer   3   3     3     3     3     3   3
    25mMMgCl2   2   2     2.5     2     2     3   2
    2.5mMdNTPs   1   1     2     1.2     1.2     1.5   1
    F(10pmole)   1   1     1     1     1     0.5   1
    R(10pmole)   1   1     1     1     1     0.5   1
    DMSO   -   -     -     1.5     3     -   3
    GenePol5U/l   0.2   0.2     0.2     0.2     0.2     0.2   0.2
    模板DNA   1   1     1     1     1     1   1
    终体积(ul)   30   30     30     30     30     30   30
如上制备的包含反应溶液的PCR试管加至PE2700热循环仪(Perkin Elmer，USA)，并且根据如下的每种基因扩增。
1.对于eNOS1/2、MTHFR1/2、AGT1/2、AT1R、ACE1基因：
95℃/5分钟，35个循环(95℃/30秒，58℃/30秒，72℃/40秒)，72℃/10分钟
2.对于ACE2和APOE1/2基因：95℃/5分钟，35个循环(95℃/30秒，65℃/30秒，72℃/40秒)，72℃/10分钟
由此-获得的每种基因的PCR产物通过在含有EtBr的1.2％琼脂糖凝胶上电泳而证实。每种基因产物的大小显示在下列表2中。
[表2]
    基因     位置     大小(bp)
    Apo E     C112R     330
    R158C     330
    AGT     M235T     303
    T174M     354
    ACE     D/I     319/597
    D/D     335/无扩增
    ATIB     A1166C     404
    eNOS     G10-T     676
    E298D     371
    MTHFB     A222V     198
    A429E     128
为了用由此-获得的PCR产物进行RFLP，首先除了ACE基因外的其他五个基因(eNOS、MTHFR、AGT、AT1R和APOE)的PCR产物利用DNA Clean & Concentrator试剂盒(Zymo Research Corporation，CA USA)如下纯化。
1.对于PCR产物(约25μl)，DNA结合溶液双倍体积加入，即50μl。
2.对于预先提供的Zymo spin柱，添加上述1的所有混合物并且在13,000rpm离心30秒。
3.用移液管除去收集于收集管中的溶液。
4. 200μl洗涤缓冲液加至该柱并且在13,000rpm离心30秒(重复两次)。
5.剩下的洗涤缓冲液通过在空管中13,000rpm离心40秒而完全除去。
6.移去收集管，并且对于新柱提供干净的1.5ml微量离心管，并且随后对此添加20μl灭菌的三蒸水，在13,000rpm离心40秒用于洗脱。或者，可使用加热至大约65℃的灭菌的三蒸水。
对于在上述方法中纯化和获得的PCR产物，在对应每种限制性酶的条件下准备对应下表中每种基因的限制性酶。随后，其保留于37℃水浴反应4至6个小时，且随后通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳查找每种基因的风险率。
[表3]
    基因     位置     酶
    APOE     C112R     AfIIII
    R158C     HaeII
    AGT     M235T     LweI
    T174M     NcoI
    ATIB     A1166C     DdeI
    ecNOS     G10-T     HincII
    E298D     Eco24I
    MTHFB     A222V     HinfI
    A429E     MboII
实施例11：含有壳聚糖的PCR试剂盒的制备
作为利用本发明壳聚糖的DNA存储方法的应用，生产PCR试剂盒，其中Taq聚合酶、引物、dNTP和缓冲液等等加至具有壳聚糖的一个管(所有的在一个管中)，并且样品如DNA或血清加至该管以产生PCR反应。特有地，该PCR试剂盒可用于DNA存储和PCR测定。
本实施例中利用获自B型肝炎患者血液的DNA，用本发明的PCR试剂盒找到B型肝炎病毒的存在。该试剂盒也可通过诊断癌症相关基因的而应用于癌症诊断，或B型病毒肝炎病原体或人***状瘤病毒感染、性传播感染、其他的细菌感染等等的诊断。
该试剂盒的用法如下。
1至3ng DNA模板加至包含10μl 5GG一步PCR缓冲液TM和热启动型Taq聚合酶(AmpliTaq Gold，PerkinElmer，USA)，2.0μl 10mMdNTP混合物，1.0μl靶基因的每种正向引物和反向引物(5pmol)和0.1％浓度壳聚糖的一体试管。蒸馏水添加入试剂盒中至总体积50μl，并且充分混合，随后进行PCR。首先，在50℃进行反转录反应30分钟，在95℃进行变性15分钟，随后进行94℃一分钟，53℃40秒和72℃一分钟总共25至40个循环，然后以72℃反应10分钟结束PCR扩增。因此，利用本发明的PCR试剂盒发现B型肝炎病毒DNA的存在(未附数据)。
实施例12：塑料DNA ID卡的产生
图14为显示利用本发明的DNA卡片制备塑料DNA ID卡的过程的流程图。如图14的流程图进行操作过程以开发塑料的DNA ID卡。
1.接收传送的个人样品如血液或口腔细胞，DNA卡片等等，以及个人照片数据(S201)。
2.从样品分离基因组DNA以及血型检定的检测(S202)。
3.利用提取的基因组DNA测定HLA基因分型，STR个人鉴定基因的检测以及结果分析(S203)。图15为显示利用15个STR检测组合鉴定个人基因型，制备个人基因型分布型以及编码个人基因型数据的简图。
4.***纸DNA卡片以与塑料卡附着，通过加热和压力制备DNAID卡的框(S205)。图16为显示在制备本发明的DNA ID卡过程中将1型或2型DNA卡片结合入PVC卡片的简图。如图16所示，PVC软层位于最低端，并且1型DNA卡片或2型DNA卡片位于其上。随后，PVC核心层位于其上，其具有纸DNA卡片大小的孔(由于纸卡片的厚度以及纸和PVC由相互不同的材料制成，必须准备该卡片大小的孔，所以其没有通过加热一起整合。具体地，纸卡片插于该孔上)。其上存在PVC核心层，其具有另外的两个小孔(用于将DNA或血液注射入该DNA纸卡片，由于卡片通过加热的整合几乎未留下空隙，所以其应当位于纸卡片上)。最后，PVC软层位于其上。随后，在高压(100至140bar)和160至180℃的高温下进行加热8至30分钟以整合。在这时候，纸DNA卡片的位置与磁条的位置相对，并且也与照片副本的位置相对。图17为本发明塑料DNA ID卡的一个实施例的简图。
5.将个人DNA或血液滴于该塑料DNA ID卡和用于存储的卡片上，其在S204中产生(S205)。通过利用针而将DNA或血液通过渗透PVC软层的PVC核心层的孔注射入该纸DNA卡片而将DNA或血液滴于该塑料DNA ID卡上。注射后，通过hologram，胶棒等等封住由针产生的孔。
6.编码在磁条或塑料DNA ID卡的芯片上分析的数据(S206)。磁条通常由三个磁道组成。其上可写英语的道为第一个磁道，其具有78比特可用。第二个磁道具有38比特可用，并且第三道具有107比特可用。因此，如图17所示，简要的个人信息编码于第一个磁道上，患者的特定疾病代码编码于第二个磁道上(实施例：C61-***癌或N40-良性***肥大)，并且STR或HLA分型的结果编码于第三个磁道上。然而，在连接到库等等的情况下，塑料DNA ID卡的编码方法为基因信息仅登记在主服务器中，并且以库所要求的方式编码，且个人基因信息等等的数据利用POS***从该主服务器传输。该方法用于最大化本发明塑料DNA ID卡的另外的有效性(S206)。图18为将信息编码于本发明DNA ID卡上的一个实施例的简图。
7.个人照片的副本和简要的人员信息通过浮雕方法刻在塑料DNA ID卡上(S207)。
8.个人数据输入超级计算机(用于服务器)，特定的个人ID代码分配于塑料DNA ID卡，并且设置个人密码(S208)。
9.POS***的组建和操作以允许个人利用ID和密码根据安全性维护的条件获取信息，如有必要其由每个人、医院、每个机构或库等等记录在国内外的塑料DNA ID卡中(S209)。
图15为本发明塑料DNA ID卡的一个实施例的简图。卡片正面记录个人照片和姓名，简要的人员信息(至医院在急诊时可立即操作的水平)和地址。卡片背面存在磁条，其中编码个人基因信息，并且其设计成能保留签名和DNA存储的位置。
实施例13：整合入塑料DNA ID卡中而存储的纸DNA卡片碎片的基因扩增实验
通过PCR扩增eNOS基因，一种老年疾病基因，确定了基因是否可从存储于1型或2型纸DNA卡片中的DNA扩增，纸DNA卡片整合入塑料DNA ID卡，其在高温和高压下预先制备。该方法以与上述实施例10同样的方法进行。
1型DNA卡片和2型DNA卡片分别整合入已在高温和高压下准备的塑料DNA ID卡，以使人基因组DNA和血液以浸入其中的各纸卡中而存储。随后利用这些塑料DNA ID卡，通过PCR扩增一种老年疾病基因eNOS基因而用于比较。结果在图19中显示。通过该实验发现当用于血液吸收的2型DNA卡片用于本发明中时，血液样品必须滴下，而且在PCR扩增中塑料DNA ID卡的塑料护封必须首先除去。
图20显示了利用实验室中高温而无人工压力处理的和事实上在高温和无压力下制备的塑料DNA ID卡，一种老年疾病基因eNOS基因PCR扩增的结果，用以比较其中样品在卡片制备之前添加的情况和其中样品在卡片制备之后添加的情况。通过该实验，获得的结果表明最好样品滴于预先制备的塑料DNA ID卡上，而不管所要存储的样品为DNA或血液。
用于滴有DNA的1型DNA卡片和用于滴有血液的2型DNA卡片分别附着于塑料卡上，其在高温和高压下制备以制备DNA ID卡。为了找到滴至各卡片的合适样品的浓度和量，在基因组DNA的情况下利用如上制备的卡片碎片，DNA样品以不同的体积中150ng/μl的浓度滴下，并且在PCR中扩增和分析eNOS基因。结果在图21中显示。通过该实验发现其不适于将血液装载于1型DNA卡片上(用于DNA)并且当滴下DNA时至少可滴下大约1.5μg。
通过PCR扩增老年疾病基因eNOS基因而比较和分析用洗涤缓冲液处理卡片碎片作为预处理过程的情况和在存储高温和高压下制备的塑料DNA卡片中的样品在PCR扩增中未处理的情况之间的差异。结果在图22中显示。结果是，在利用塑料DNA ID卡的PCR中当卡片碎片不用洗涤缓冲液预先处理时PCR扩增更好地完成。
[工业实用性]
根据本发明利用水溶性壳聚糖存储DNA的方法在DNA存储效力上是优秀的，并且与常规方法相反，使得在室温下长时间稳定地存储DNA成为可能。利用该方法，不仅可以在室温下长时间稳定地存储和运载小的质粒DNA，还可以储存大型植物和动物的基因组DNA和cDNA以及真菌、细菌和病毒的基因组DNA。根据本方法存储的DNA可用于所有的基因分析如PCR和RFLP、克隆、碱基测序、Southern印迹等等。此外，其可广泛用于PCR试剂盒等中，并且其是简单的和经济的。尤其本发明的1型DNA卡片在室温下长时间存储和运载多个DNA样品中非常有用，并且2型DNA卡片可在室温下长时间存储包含DNA的各种生物样品如血液而不破坏DNA。此外，对于存储在这些DNA卡片中的样品，可甚至在很长时间后正确和简单地进行各种基因分析如PCR和PCR-RFLP、杂交、碱基测序、SNP分析等等，其在基础研究以及各种临床治疗中非常有用。此外，本发明的DNA ID卡可起DNA库的作用，其存储个人的DNA，并且通过存储个人的基因信息，其对个人鉴定和医疗如器官移植等等也有用。

Claims (25)

1.以壳聚糖/DNA复合物形式存储DNA的方法，其中所述复合物通过将DNA溶液和水溶性壳聚糖溶液混合而制备，该水溶性壳聚糖具有60％或以上的脱乙酰程度，以及10kD至500kD的分子量。
2.根据权利要求1的方法，其中DNA包括动物、植物、真菌、细菌和病毒的基因组DNA、cDNA或质粒DNA，并且其大小从几十个至几十亿个碱基对。
3.根据权利要求1的方法，其中水溶性壳聚糖的水溶液浓度为0.02％(w/v)至1％(w/v)并且该混合物中水溶性壳聚糖对DNA的重量比为1∶0.5或以上。
4.根据权利要求1的方法，其中水溶性壳聚糖的水溶液浓度为0.02％(w/v)至0.25％(w/v)，DNA溶液的浓度为1μg/μl或更低，并且该混合物中水溶性壳聚糖对DNA的重量比为1∶0.5至1∶3。
5.根据权利要求1的方法，其中该DNA和壳聚糖的复合物在-70℃至室温下存储。
6.根据权利要求1至5任何一项的方法，其中该结合壳聚糖的DNA的复合物以液态存储。
7.存储DNA的纸型DNA卡片，其中该DNA卡片通过将其浸于包括水溶性壳聚糖和尿酸的组合物并且干燥而制备，并且通过将DNA溶液滴于该卡片上随着DNA与水溶性壳聚糖结合而存储DNA。
8.存储DNA的纸型DNA卡片，其中该DNA卡片通过将其浸于包括水溶性壳聚糖和含有尿酸的细胞裂解缓冲液的组合物并且干燥而制备，并且通过将含有DNA的生物样品滴于该卡片上随着DNA与水溶性壳聚糖结合而存储DNA。
9.根据权利要求7或8的纸型DNA卡片，其中该纸用于印迹或色谱法并且其厚度为0.3至1.2mm。
10.根据权利要求7或8的纸型DNA卡片，其中该卡片用6、24、96或384个孔标记，每个孔具有12.3cm-8.1cm直径的大小，并且在每个孔上滴下和存储DNA或血液样品。
11.根据权利要求7的纸型DNA卡片，其中组合物通过将0.1％至1％(w/v)的水溶性壳聚糖与0.5mM至20mM的尿酸以1∶1的体积比混合而制备。
12.根据权利要求8的纸型DNA卡片，其中该细胞裂解缓冲液包括Tris(8mM)，EDTA(0.5mM)，SDS(0.1％w/v)和尿酸(2mM)。
13.在DNA卡片上进行PCR分析的方法，包括步骤：
a)将权利要求7中的DNA卡片的碎片加至PCR试管；
b)将TE缓冲液(10mM Tris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)加至该试管，并且混合后在室温下静止5分钟，随后利用移液管弃去TE缓冲液；
c)重复b)步骤两次；
d)在室温下干燥该试管1小时或在56℃下干燥10分钟；和
e)将PCR样品加至该试管并且通过PCR扩增。
14.在DNA卡片上进行PCR分析的方法，包括步骤：
a)将权利要求8中的DNA卡片的碎片加至PCR试管；
b)将洗涤缓冲液(GG纯化试剂；0.5mM EDTA，8mM Tris-Cl，2mM尿酸，1％(w/v)SDS)加至该试管并且混合后在室温下静止5分钟，随后利用移液管弃去洗涤缓冲液；
c)重复b)步骤三次；
d)将TE缓冲液(10mM Tris-Cl，0.1mM EDTA，pH＝8.0)加至该试管并且混合后在室温下静止5分钟，随后利用移液管弃去TE缓冲液；
e)重复d)步骤两或三次；
f)在室温下干燥该试管1小时或在56℃下干燥10分钟；和
g)将PCR样品加至该试管并且通过PCR扩增。
15.分析方法，其中根据权利要求6的存储方法存储的DNA或存储在权利要求7或8的DNA卡片上的DNA用于PCR-RFLP、克隆、文库合成、序列分析或Southern印迹。
16.分析DNA的方法，其中分离自根据权利要求6的存储方法以液态存储的壳聚糖/DNA复合物的DNA或分离自利用基于硫酸盐的阳离子盐存储于权利要求7或8的DNA卡片上的壳聚糖/DNA复合物的DNA用于基因分析。
17.权利要求16的分析DNA的方法，其中基于硫酸盐的阳离子盐包括SDS(十二烷基硫酸钠)、SOS(辛基硫酸钠)和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。
18.包括含有寡d(T)、引物、Taq DNA聚合酶、反应缓冲溶液、dNTP和水溶性壳聚糖的试管的PCR试剂盒，其中该试管另外包含DNA或血清样品，并且该试管用于进行PCR。
19.DNA ID卡，其中壳聚糖和个人DNA的混合物根据权利要求1的DNA存储方法存储于其部分上，并且个人的遗传信息保存在磁条或嵌入的芯片上。
20.根据权利要求19的DNA ID卡，其中该DNA ID卡的基本材料为塑料。
21.制备DNA ID卡的方法，包括步骤：
a)将权利要求7或8中的DNA纸卡片堆积于PVC软层上；
b)在DNA纸卡片上堆积第一个PVC核心层，其具有与DNA纸卡片相同大小的孔；
c)在第一个PVC核心层的孔上堆积第二个PVC核心层，其具有小于第一个PVC核心层的孔的两个孔，；
d)将PVC软层堆积于第二个PVC核心层上；和
e)向堆积的层加热和加压以用于彼此热粘附。
22.根据权利要求20的DNA ID卡，包括：
第一个PVC软层；DNA纸卡片；第一个PVC核心层，具有与DNA纸卡片相同大小的孔；第二个PVC核心层，具有孔，DNA或含有DNA的生物样品通过该孔滴于DNA纸卡片上；和第二个PVC软层，
其中磁条位于DNA纸卡片上与存储DNA或生物样品侧的对侧。
23.根据权利要求22的DNA ID卡，其中个人的信息、疾病代码、STR或HLA分型编码于磁条上。
24.根据权利要求19的DNA ID卡，其中滴于DNA ID卡上的gDNA量为1.5μg或更多。
25.分析方法，其中权利要求19的DNA ID卡的碎片无需洗涤缓冲液处理而用于PCR扩增。
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