CN101041090A - 羊膜片材及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
羊膜片材及其制备方法与应用，涉及一种治疗干眼使用的用于栓塞泪道的材料，解决了目前泪道栓子制备工艺复杂，价格昂贵，难以推广的问题，它包括支持物和羊膜，二者同样大小、紧密贴附，在支持物上制有两个大小一致的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合，其制备方法分为：支持物制备、羊膜准备及制备羊膜片材三大步骤；本发明便于临床使用，使得泪道栓塞的治疗方法更普便的应用于广大干眼患者，具有较大的产业化前景。由于羊膜的主要成分为多种胶原，植入后泪道后在体液/泪液胶原酶作用下逐渐降解，其质地柔软，不会对泪道壁造成损伤，留有的尖端不会给患者造成异物感，且可以随时裂隙灯下夹取尖端取出。
Description
技术领域：
本发明涉及一种治疗干眼时使用的羊膜片材及其制备方法与应用。
背景技术：
现今，干眼的发生率逐年增加。干眼，是指由于泪液的量或质的异常引起的泪膜不稳定和眼表面损害，从而导致眼不适症状的一类疾病。美国的调查显示，在65～84岁的人群中，有14.6％，即430万的人口患干眼病。在我国至今虽无明确的干眼流行病学调查结果，但基于我国的卫生条件和环境状态，其发病率可能会比美国更高。对此类眼病患者治疗的主要方法为：①补充泪液，即泪液成分的替代治疗，包括人工泪液及自家血清的应用；②保存泪液，如配戴湿房镜、行泪道栓塞等。
对于顽固性的干眼症，泪道栓塞仍是目前临床上的最好方法。泪道是眼泪从眼表排出至鼻腔的解剖通道，通过对其阻塞，更多的在眼表保留了自身的泪液而起到治疗的作用。最初封闭泪道的方法是使用热性泪点烧灼，该方法简单而有效，但是会引起疤痕，而且有疼痛，同时不可逆转。近年来出现了用于阻塞泪道的泪道/泪点栓子，植入泪道后，其机械阻塞作用减少了泪液的排出，现用于临床的主要有两种：永久型及可降解型。前者由硅胶制成，植入后，泪道栓塞的作用是永久的；后者为胶原制成，植入后一定时期可降解而使泪道再通，主要用于短期试验性治疗。泪道/泪点栓子的出现使得泪道栓塞术成为可逆手术，可随时取出，但泪道栓子的制备工艺复杂，至今临床中尚未出现国产的泪道栓子，国外进口的栓子价格昂贵，难以推广。
羊膜是从细胞滋养层演化而来，是人类两层胎膜的内层，羊膜自身无血管和神经、***，其基质层主要为多种胶原组成，其抗原性较低。它是一种临床广泛使用的生物移植材料，获取较为容易。目前羊膜移植和羊膜覆盖手术已广泛应用于眼科领域，治疗碱烧伤、翼状胬肉、青光眼等疾病，因其抗原性低、自身含有多种生长因子等有效成分，取得了很好的治疗效果。经检索未发现有将其用于泪道栓塞的相关文献和记载，可能因其为柔软的膜状，难以操作。
发明内容：
本发明创造发明的目的是提供可替代泪道栓子，起到同样阻塞泪道作用的羊膜片材，该羊膜片材制备方法简单，使用方便，适用于治疗干眼，使得广大干眼患者得以实现泪道栓塞的治疗。
本实用发明创造的发明目的是通过下述技术方案实现的：
羊膜片材，包括支持物和羊膜，二者同样大小、紧密贴附，所述的羊膜为单层羊膜，在支持物上制有两个大小一致的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合。
所述的羊膜为复层羊膜，即羊膜层数为至少2层，复层羊膜由单层羊膜层间涂纤维蛋白胶粘合而成，或多层羊膜直接贴附后冻干而成，所述的支持物上制有单孔。
所述的支持物为(3～8)×(8～15)mm的方形或圆形或其它形状。
所述的孔为圆形、方形、三角形、多边形或其它不规则形状。
所述的孔的直径为2～5mm。
支持物采用硝酸纤维素滤纸、生物尼龙膜或外科手术贴纸。
羊膜片材的制备方法，步骤如下：
(1)、支持物制备：取用(3～8)×(8～15)mm的方形或圆形或其它形状的硝酸纤维素滤纸、生物尼龙膜或外科手术贴纸作为支持物，根据需要在支持物上制有两个大小一致的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合或在支持物上制有单孔，备用；
(2)、羊膜准备：选用健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查按照国家相关标准排除乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)巨细胞病毒、***及免疫缺陷病毒(HIV)感染。从剖腹产或顺产无菌接生获得胎盘后即在无菌下操作，作如下灭菌处理：用生理盐水冲洗干净胎盘表面的血迹；用含抗生素的无菌生理盐水浸泡胎盘5～10分钟；
(3)、制备羊膜片材：将羊膜从绒毛膜分离出来，用灭菌载玻片侧面或无菌纱布尽量刮去海绵层，然后上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上；按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存。
其中步骤(3)制备羊膜片材还可采用以下两种技术方案：
①羊膜经剥离、清洗后，上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上，真空条件下连同支持物一同冻干，剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材在室温下行真空/充氮气包装，最后γ射线照射，4℃或室温保存。
②羊膜经剥离、清洗后，转入含有0.25％胰蛋白酶及/或0.02～0.1％EDTA的生理盐水容器内，37℃消化45分钟～1h，取出后轻轻刮去上皮和浆液渗出，生理盐水反复冲洗干净，上皮面向上平铺于打孔的硝酸纤维纸上，上皮面均匀涂布医用纤维蛋白粘合剂，贴附第二层羊膜(上皮面向上)，轻压10分钟，同时去除多余得纤维蛋白粘合剂，待粘贴紧密后，按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存；或置入冻干机冻干、密封、灭菌、4℃或室温保存。
本发明的另一个发明目的是将羊膜片材作为治疗干眼的泪道栓子的应用。
羊膜是从细胞滋养层演化而来，是人类两层胎膜的内层，是人体中最厚的基底膜。新鲜羊膜有5层结构：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层、海绵层。临床使用前，处理羊膜的过程中，纤维母细胞层和海绵层被剥离，又由于在处理和保存过程中，上皮细胞层脱失和死亡，保存的羊膜只有基底膜和致密层。因羊膜自身无血管和神经、***，其抗原性较低，羊膜移植被用于整形等各种手术替代损伤的各种基底膜。
近年来，羊膜的作用机制被充分的揭示：①基底膜作用，为干细胞提供“肥沃的土壤”，提供光滑面以利于细胞生长；②其中各种蛋白成份能促进上皮分化、增生；③增强蛋白粘附性，促进上皮增生修复；④羊膜含有的蛋白酶抑制蛋白酶而发挥其抑炎作用；⑤羊膜含有抑制细胞因子表达和细胞调亡的成份；⑥可避免炎症细胞因子诱发的角膜基质细胞和胶原纤维的过度增生，从而抑制局部炎症，促进表面愈合而不留瘢痕。
现今临床眼科中对羊膜的使用集中在以下几方面：
角膜重建，角膜缘干细胞缺乏、角膜溃疡及穿孔、大泡性角膜病变； 结膜重建，翼状胬肉手术、眼表肿瘤切除后缺损结膜重建、睑球粘连手术；其它手术包括青光眼手术巩膜瓣下植入、青光眼术后缺损滤过泡修复、义眼座植入术。简单的说，临床中用到的羊膜可以理解为“带有一定促细胞修复、抗炎、抗瘢痕活性成分的人源性胶原膜”，以往的应用被其“膜状”的性质所限制。
经检索，未发现有将其塞入泪道治疗干眼的报道，原因是由于羊膜的膜状性质及以往临床使用思路的限制。
本发明将羊膜附以全新的概念，并通过创新的片材设计实现羊膜通过栓塞泪道治疗干眼的全新用途，造福广大干眼患者。
本发明羊膜片材使得泪道栓塞的治疗方法更普便的应用于广大干眼患者，且具有较大的产业化前景。采用了上述结构设计便于临床使用，另羊膜的主要成分为多种胶原，植入后泪道后在体液/泪液胶原酶作用下逐渐降解，另其质地柔软，不会对泪道壁造成损伤，留有的尖端不会给患者造成异物感，且可以随时裂隙灯下夹取尖端取出。此外，羊膜可通透水分，使得阻塞段以下的泪道不会干燥硬化。
附图说明：
图1是羊膜片材的结构示意图；
图2是支持物的结构示意图；
图3是支持物另一种结构示意图；
图4是单层羊膜片材的侧视图；
图5是复层羊膜片材的侧视图。
具体实施方式：
实施例1：一种用于栓塞泪道的羊膜片材，包括支持物1和羊膜2，二者同样大小、紧密贴附，其中羊膜2选用单层羊膜，羊膜2为新鲜羊膜、低温冷冻或冻干的羊膜及羊膜经脱细胞处理后制得的膜，在支持物1上制有两个大小一致的孔3、4，当支持物1沿长轴对折时孔3与孔4重合，孔3、4的直径在为3mm，其形状为圆形，支持物1采用硝酸纤维素滤纸，其大小为5×10mm的方形。
羊膜片材的制备方法如下：
支持物制备：取用5×10mm的方形硝酸纤维素滤纸作为支持物，在支持物上制有两个直径为3mm的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合，备用。
羊膜准备：选用健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查按照国家相关标准排除乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)巨细胞病毒、***及免疫缺陷病毒(HIV)感染。从剖腹产或顺产无菌接生获得胎盘后即在无菌下操作，作如下灭菌处理：用生理盐水冲洗干净胎盘表面的血迹；用含抗生素的无菌生理盐水浸泡胎盘5～10分钟(抗生素混合液的浓度为含50ug/ml青霉素、50ug/ml链霉素、100ug/ml新霉素和2.5ug/ml二性霉素B或1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B)。
制备羊膜片材：
将羊膜从绒毛膜分离出来，用灭菌载玻片侧面或无菌纱布尽量刮去海绵层，然后上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上；按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存。
实施例2：一种用于栓塞泪道的羊膜片材，包括支持物1和羊膜2，二者同样大小、紧密贴附，其中本实施例中羊膜羊膜层数为2层，如图5所示，即在支持物1上贴附2层羊膜2，羊膜2为新鲜羊膜、低温冷冻或冻干的羊膜及羊膜经脱细胞处理后制得的膜，在支持物1上制有孔3，孔3的直径在5mm，其圆形，支持物1采用生物尼龙膜，其大小为8×8mm的方形。
羊膜片材的制备方法如下：
支持物制备：取用8×8mm的方形生物尼龙膜作为支持物，在支持物上制有一个直径为5mm的孔，备用。
羊膜准备：选用健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查按照国家相关标准排除乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)巨细胞病毒、***及免疫缺陷病毒(HIV)感染。从剖腹产或顺产无菌接生获得胎盘后即在无菌下操作，作如下灭菌处理：用生理盐水冲洗干净胎盘表面的血迹；用含抗生素的无菌生理盐水浸泡胎盘5～10分钟(抗生素混合液的浓度为含50ug/ml青霉素、50ug/ml链霉素、100ug/ml新霉素和2.5ug/ml二性霉素B或1000U/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B)。
制备羊膜片材：
羊膜经剥离、清洗后，转入含有0.25％胰蛋白酶及/或0.02～0.1％EDTA(0.02％EDTA1h优选)的生理盐水容器内，37℃消化45分钟～1h，取出后轻轻刮去上皮和浆液渗出，生理盐水反复冲洗干净，上皮面向上平铺于打孔的硝酸纤维纸上，上皮面均匀涂布医用纤维蛋白粘合剂，贴附第二层羊膜(上皮面向上)，轻压10分钟，同时去除多余得纤维蛋白粘合剂，待粘贴紧密后，按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存；或置入冻干机冻干、密封、灭菌、4℃或室温保存。
实施例3：一种用于栓塞泪道的羊膜片材，包括支持物1和羊膜2，二者同样大小、紧密贴附，其中羊膜2选用单层羊膜，羊膜2为新鲜羊膜、低温冷冻或冻干的羊膜及羊膜经脱细胞处理后制得的膜，在支持物1上制有两个大小一致的孔3、4，当支持物1沿长轴对折时孔3与孔4重合，孔3、4的直径在为4mm，其形状为圆形，支持物1采用外科手术贴纸，其大小为8×15mm的方形。
羊膜片材的制备方法，步骤如下：
支持物制备：取用8×15mm的方形的外科手术贴纸作为支持物，在支持物上制有两个直径为4mm的圆孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合，备用。
羊膜准备：选用健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查按照国家相关标准排除乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)巨细胞病毒、***及免疫缺陷病毒(HIV)感染。从剖腹产或顺产无菌接生获得胎盘后即在无菌下操作，作如下灭菌处理：用生理盐水冲洗干净胎盘表面的血迹；用含抗生素的无菌生理盐水浸泡胎盘5～10分钟。
制备羊膜片材：羊膜经剥离、清洗后，上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上，真空条件下连同支持物一同冻干，剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材在室温下行真空/充氮气包装，最后γ射线照射，4℃或室温保存。
其中在支持物设置的孔可根据需要制成圆形、方形、三角形、多边形等，不仅限于实施例中列举的形状。
本发明羊膜片材的使用效果：通过简单的操作就可以完成栓塞泪道，栓塞效果确切，维持时间约3～6个月，可以随时取出。
适应症同泪道栓子植入的适应症。
具体操作流程如下：处置室内，患者平卧床上——常规消毒皮肤——表麻——扩张泪小点——取羊膜片材，复水2～10分钟后，(折叠)平铺于下泪点局部——泪道冲洗通过支持物圆孔针抵住羊膜，将其塞入泪道至仅留片材尖端，支持物自然留于眼外——裂隙灯检查调整位置——术毕。熟练的医生/护士可以在5分钟内完成双眼的泪道栓塞，配合好的患者可以直接在裂隙灯显微镜下进行。
对使用羊膜栓塞泪道可行性的理论分析：
1、植入简便易行：载体支持物的特殊设计保证了向泪道内植入的简便易行，甘油保存或干燥的羊膜片材经复水之后使得羊膜与支持物易于分离，近透明的羊膜外观保证片材放置的位置，留有的孔使得泪道冲洗针可经其把羊膜向泪道内塞入。
2、体积计算：羊膜的厚度为0.020～0.050mm，填塞入泪道后成约3mm长的圆锥形体，总体积为5×10×0.02，其最大直径约为0.8～1.0mm，泪道直径约为0.2～0.8mm，理论上双层羊膜填塞可成功阻塞泪道。
3、并发症分析：羊膜为已经在临床广泛使用的医用移植片材，以往的应用虽然限于其膜状，未进行过泪道内植入，但以往的临床中广泛地将其植入人体皆表现出很好的生物相容性，另外羊膜本身有一定的透水及透氧性，因此不会发生局部炎症、下段泪小管硬化等并发症。
4、羊膜主要成分为多种胶原，以往眼表及其它手术植入表现出可被组织逐渐吸收的性质，一般3个月左右可以被吸收；泪液内有一定的胶原酶等成分，可以缓慢的将羊膜代谢、降解，因此植入泪道后，理论上可以被逐渐降解，使泪道再通，降解时间应在3个月之上，使其更加适用于围手术期干眼、季节性干眼等。
5、独特的片材设计使得羊膜被植入泪道后会留有一尖端在泪点处，羊膜柔软的性质使得不会给患者造成异物感，同时保证一旦发生泪溢等反应时随时取出植入的羊膜使泪道再通。
临床应用该种羊膜片材进行泪道栓塞取得了意想不到的满意效果：
经门诊随机选择自愿接受羊膜栓塞泪道治疗的中度干眼患者35名，其中女性患者26例(52眼)，男性患者9例(18眼)，年龄20～65岁，平均50.4±8.9岁。植入前常规行BUT(泪膜破裂时间)、Schirmer I测试、角膜荧光染色及干眼仪检测，按上述植入方法向患者泪道内植入羊膜。所有患者术后随访半年，询问患者自觉症状，查裂隙灯行BUT、Schirmer I测试、角膜荧光染色及干眼仪检测。应用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析处理。植入3个月后每两周对患者进行泪道再通测试，记录再通时间(结膜囊内滴入氯霉素眼水，5分钟内是否口苦感判定泪道是否再通)。
结果：植入过程非常简便快捷，在处置室即可完成，配合好的患者可以在5分钟内完成双眼泪道的羊膜栓塞。植入后所有患者自觉眼干涩、异物感等症状皆有不同程度的改善，有3名患者有内眦部轻度异物感，均于3～5天后消失。植入后5天BUT、Schirmer I测试及干眼仪检测结果与植入前结果相比较改善明显(具体数据见表1、表2)，有显著统计学差异。泪道再通约在植入后6个月时发生，即羊膜栓塞泪道可保证约6个月的泪道阻塞效果。
表1治疗前后5天泪液量和泪膜稳定性的比较
| Schirmer I测试(mm)* | BUT(s)** | |
| 治疗前 | 3.10±2.05 | 2.25±1.09 |
| 治疗后 | 7.60±3.17 | 5.19±1.90 |
*t＝2.37 P＜0.05 **t＝3.45 P＜0.01
表2植入羊膜前后干眼仪检测结果比较
| 干眼仪 | 接受治疗眼的数目 | |
| 治疗前 | 治疗后 | |
| IIIIIIIVV | 0229390 | 2491720 |
x2＝73.04 P＜0.005
本发明附以羊膜全新的概念，并通过创新的片材设计扩大了羊膜在眼科中的应用，使广大的干眼患者得以接受泪道栓塞的治疗，经济及社会效益巨大，并具有较好的产业化前景。
Claims (10)
1、羊膜片材，其特征在于：包括支持物和羊膜，二者同样大小、紧密贴附，所述的羊膜为单层羊膜，在支持物上制有两个大小一致的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合。
2、根据权利要求1所述的羊膜片材，其特征在于：所述的羊膜为复层羊膜，即羊膜层数为至少2层，复层羊膜由单层羊膜层间涂纤维蛋白胶粘合而成，或多层羊膜直接贴附后冻干而成，所述的支持物上制有单孔。
3、根据权利要求1或2所述的羊膜片材，其特征在于：所述的支持物为(3～8)×(8～15)mm的方形。
4、根据权利要求1或2所述的羊膜片材，其特征在于：所述的孔为圆形、方形、三角形、多边形。
5、根据权利要求4所述的羊膜片材，其特征在于：所述的圆孔的直径为2～5mm。
6、根据权利要求1所述的羊膜片材，其特征在于：支持物采用硝酸纤维素滤纸、生物尼龙膜或外科手术贴纸。
7、羊膜片材的制备方法，步骤如下：
(1)、支持物制备：取用(3～8)×(8～15)mm的方形或圆形或其它形状的硝酸纤维素滤纸、生物尼龙膜或外科手术贴纸作为支持物，根据需要在支持物上制有两个大小一致的孔，支持物沿长轴对折可使两孔对合或在支持物上制有单孔，备用；
(2)、羊膜准备：选用健康剖宫产产妇的胎盘组织，产前血清学检查按照国家相关标准排除乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)巨细胞病毒、***及免疫缺陷病毒(HIV)感染。从剖腹产或顺产无菌接生获得胎盘后即在无菌下操作，作如下灭菌处理：用生理盐水冲洗干净胎盘表面的血迹；用含抗生素的无菌生理盐水浸泡胎盘5～10分钟；
(3)、制备羊膜片材：将羊膜从绒毛膜分离出来，用灭菌载玻片侧面或无菌纱布尽量刮去海绵层，然后上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上；按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存。
8、根据权利要求7所述的羊膜片材的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)为制备羊膜片材：羊膜经剥离、清洗后，上皮面朝上平铺并固定于准备好的支持物上，真空条件下连同支持物一同冻干，剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材在室温下行真空/充氮气包装，最后γ射线照射，4℃或室温保存。
9、根据权利要求7所述的羊膜片材的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)为制备羊膜片材：羊膜经剥离、清洗后，转入含有0.25％胰蛋白酶及/或0.02～0.1％EDTA的生理盐水容器内，37℃消化45分钟～1h，取出后轻轻刮去上皮和浆液渗出，生理盐水反复冲洗干净，上皮面向上平铺于打孔的硝酸纤维纸上，上皮面均匀涂布医用纤维蛋白粘合剂，贴附第二层羊膜(上皮面向上)，轻压10分钟，同时去除多余得纤维蛋白粘合剂，待粘贴紧密后，按要求剪切成型即得羊膜片材，将羊膜片材置入灭菌纯甘油中密封，4℃以下低温保存；或置入冻干机冻干、密封、灭菌、4℃或室温保存。
10、羊膜片材作为治疗干眼的泪道栓子的应用。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070926 |