CN101033470A - 携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因及应用 - Google Patents

Abstract

携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因的构建及应用，属于植物基因工程领域。本发明利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps；构建了融合基因lstp－fps；并将融合基因转入青蒿中，使转基因青蒿表现出提高青蒿素的能力。

Description

携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说是用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps；构建lstp-fps融合基因及其在转基因青蒿中的应用。

背景技术：

近年的统计资料表明：世界有100多个国家和地区的20多亿人生活在疟疾流行区，每年约有2.7亿人患这种疾病，其中有近300万人死于疟疾。正因为疟疾的危害如此严重，世界卫生组织1957年就开始实施了一项“全球消灭疟疾计划”，但至今成效不显。其原因是从60年代起疟原虫对氯喹等主要抗疟药产生抗性，使这些药失去了抗疟药效。为此世界上许多国家都投入了大量人力物力去研究开发新的抗疟药物。青蒿素类药及其衍生物是我国科学工作者发掘祖国医药学宝库研究开发的一类抗疟新药，具有自主知识产权，目前广泛应用于疟疾的治疗。全世界每年青蒿素的需求量为150吨左右，而产量仅为15吨左右，明显供不应求，目前售价已达到约225美元/g。开展青蒿素的研究具有很好的经济效益和社会效益。

目前提高我国青蒿产品的科技含量，提升青蒿产业地位已势在必行，这有赖于科技的源头的创新，现代生物技术在生产优质青蒿素药源方面可以起到决定性作用。优质药源的严重匮乏是目前青蒿素生产上面临的最大问题。近几年来，寻找及扩大天然药物青蒿素药源是一个十分活跃的研究领域，取得了很大的进展，主要包括以下三个方面：(1)利用传统育种技术培育高含量青蒿素的青蒿栽培品种；(2)青蒿素的化学全合成或半合成；(3)利用现代生物技术提高青蒿中青蒿素含量。在这些研究领域中，培育高含量青蒿素的青蒿栽培品种所需周期太长，效率很低，青蒿素的含量不可能得到大幅度提高，此外，从天然青蒿中提取，产量受资源、环境和季节的限制，且生产成本高、产量低、难以满足市场需求；青蒿素虽已能人工合成，但成本高、难度大，也未能投入生产。

相比之下，利用基因工程技术遗传改良青蒿，开展青蒿素代谢工程研究，生产青蒿素就具有很大的优势：(1)在生物技术研究领域中，研究人员对青蒿离体培养和青蒿遗传转化的成功，为利用生物技术生产青蒿素奠定了良好的理论和实践基础；(2)利用基因工程技术在基因水平上快速、高效地遗传改良青蒿，获得目标药用成分含量大为提高且具遗传稳定性的转基因药用植物(包括幼苗、毛状根、细胞系等)已经有不少成功报道，实现了我国在植物次生代谢工程研究领域的重大突破。(3)由于目前已阐明了青蒿素生物合成代谢途径中的重要步骤并且相关的限速酶基因已经克隆使得实现青蒿素的代谢工程成为可能。青蒿素属于倍半萜衍生物，青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。植物类异戊二烯的生物合成至少存在两条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径。此两条途径生成的异戊烯基焦磷酸(IPP)和其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)在牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)的催化下，通过亲电反应机制形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，GPP在法呢基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，FPS)催化下形成法呢基焦磷酸(FDP)。FDP进一步转化为青蒿素等萜类物质。FPS对青蒿素的合成具有重要作用，是青蒿素代谢工程的重要靶点。但在转FPS的青蒿毛状根中，青蒿素的含量仅提高了2-3倍，效果不佳。有的研究者提出青蒿素的合成可能在质体中进行，通过提高质体中青蒿素生物合成途径上的关键酶活性有可能提高青蒿素的含量。

目前国内外青蒿的相关研究大多集中在青蒿素的分离提取工艺、半合成或全合成、药理作用、组织培养等研究上，而利用转基因技术把青蒿素生物合成的关键酶基因和其他重要相关基因转入青蒿中高效表达、稳定遗传，从而获得青蒿素含量还未见报道。因而，基因工程技术是提供青蒿素优质药源的理想和可持续的途径，有望实现青蒿素的代谢工程，为我国青蒿素产业提供优质的青蒿素药源，有利于以青蒿素产业为契机，拉动我国中药产业升位。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种利用基因工程技术遗传改良青蒿的方法，该方法将携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶基因在青蒿质体中高效表达，从而提高青蒿中青蒿素的合成能力。

在本发明的另一方面，还提供了一种植物表达载体，它包含上述青蒿携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶基因核苷酸的编码区。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述植物表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是青蒿。

本发明克服了现有技术中的缺点，分别克隆了青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps，并构建了融合基因。将该融合基因转入植物基因组中，可以提高法呢基焦磷酸合成酶在质体中的活性，从而促进代谢途径向着青蒿素的合成的方向进行，对提高青蒿素的含量有非常重要的意义。

本发明是通过以下技术方案实现的：

利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps构建lstp-fps融合基因，序列为SEQ ID NO.1。

所涉及的青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入SpeI酶切位点，下游引物加入AatII酶切位点：

上游引物：5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’

下游引物：5’-cccgacgtctcttgctagaggacttg-3’

所设计的青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入AatII酶切位点，并去掉了fps编码区的起始密码子ATG，下游引物引入BsteII酶切位点：

上游引物：5’-cccgacgtcagtagtaccgatctgaaa-3’

下游引物：5’-cccggtgacctacttttgcctcttgtaaa-3’

Lstp-fps融合基因的构建步骤如下：

(1)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增lstp，回收产物并进行TA克隆；

(2)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增fps，回收产物并进行TA克隆；

(3)分别用AatII/Spe I、AatII/Bste II双酶切含有lstp的TA克隆质粒和含有fps基因的TA克隆质粒，回收lstp片段和fps片段；

(4)用Spe I/Bste II双酶切pCAMBIA1304质粒，回收大的载体片段；pCAMBIA1304(质粒购买于澳大利亚CAMBIA公司)。

(5)混合上述lstp片段、fps片段和pCAMBIA1304载体片段，在T4连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1304载体上的lstp-fps融合基因的构建。

本发明还可以利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp带动青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps在转基因青蒿细胞的质体中进行表达，用于提高青蒿素的含量。操作过程如下：

使用融合基因转化青蒿：

1、将携带lstp-fps融合基因的pCAMBIA1304重组质粒导入农杆菌LBA4404或者EHA105，获得工程菌，命名为LBA4404-lstp-fps或EHA105-lstp-fps，可用于对青蒿的转化。

2、根癌农杆菌遗传转化青蒿：用YEP液体培养基培养带有lstp-fps融合基因的农杆菌，至OD₆₀₀为0.3左右离心收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体；取青蒿无菌苗的叶片，在上述菌液中浸染10min，然后共培养2天；然后转入除菌培养基上除菌培养。随后添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因青蒿丛生芽；待丛生芽长到1cm左右时，分别切下单个的丛生芽，接种在无植物生长调节物的MS固体培养基上，添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因青蒿丛生芽继代培养；在该培养基上生长正常的青蒿丛生芽即为转基因青蒿。转基因青蒿炼苗1周后，即可移栽。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp的克隆

以青蒿总RNA为模板利用RT-PCT方法扩增了72bp的lstp，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)RT-PCR扩增目的片段

根据GenBank已发表的青蒿芳樟醇合成酶转运肽的核苷酸序列设计特异引物，在上游引物引入Spe I酶切位点，下游引物中引入AatII酶切位点。

上游引物：5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’

下游引物：5’-cccgacgtctcttgctagaggacttg-3’

提取青蒿总RNA(上海华舜生物工程有限公司的RNA提取试剂盒)，以RNA为模板，反转录成cDNA(TaKaRa RNA PCR 3.0Kit)，利用上述引物以cDNA为模板进行PCR扩增，制备lstp片段。

PCR反应体系：10×PCR buffer 5ul，dNTP 1ul，MgCl₂ 3ul，引物各1ul，cDNA摸板1ul，Taq酶0.5ul，加水补起50ul。PCR条件为94℃3分钟，随之以94℃30秒、61℃30秒、和72℃1分钟进行29个循环，最后以72℃延伸8分钟。1％琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，4℃保存。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

1％琼脂糖电泳分离后，回收(赛百胜PCR产物回收试剂盒)PCR产物，取适量回收产物与PMD 18-T easy Vector载体于16℃过夜连接(TaKaRa PMD 18-T Vector kit)后转入DH5α感受态细胞，LB+氨苄青霉素(100mg/l)固体培养基上抗性筛选阳性克隆，PCR鉴定后送测序(赛百胜生物技术公司)。

实施例2：青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps克隆

根据GenBank已发表的青蒿fps基因cDNA的序列信息(GenBank accession number：AF112881)设计特异引物，在5’端引入AatII酶切位点，并去掉了fps编码区的起始密码子ATG，下游引物引入BsteII酶切位点。PCR产物的大小应该是1042bp。

上游引物：5’-cccgacgtcagtagtaccgatctgaaa-3’

下游引物：5’-cccggtgaccctacttttgcctcttgtaaa-3’

提取青蒿总RNA(上海华舜生物工程有限公司的RNA提取试剂盒)，以RNA为模板，反转录成cDNA(TaKaRa RNAPCR 3.0Kit)，利用上述引物以cDNA为模板进行PCR扩增，制备fps片段。然后进行TA克隆。PCR反应条件为94℃3分钟，随之以94℃30秒、61℃30秒、和72℃2分钟进行29个循环，最后以72℃延伸8分钟。PCR反应体系，目的片段的回收，克隆和测序，同实施例1。

实施例3：利用pCAMBIA1304载体构建lstp-fps融合基因

从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA1304，用Spe I/Bste II双酶切回收大的载体片段。

从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用AatII/Spe I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收lstp片段。

从实施例2所制备的TA克隆中提取质粒，用AatII/Bste II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收fps片段。

将上述三个片段在连接酶催化下于16℃过夜连接，完成pCAMBIA1304载体上的lstp-fps融合基因构建。连接体系为：T4DNALigase 1ul、T4DNA Ligase Buffer 1ul、pCAMBIA1304载体回收片段5ul、lstp回收片段1.5ul、fps回收片段1.5ul。将连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

提取阳性菌落的质粒，用Spe I/BsteII双酶切产生两个片段，一个是约13kB的pCAMBIA1304载体片段，另一个是1102bp的lstp-fps融合基因。

以携带lstp-fps融合基因的pCAMBIA1304重组质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的lstp-fps。扩增片段大小是1108bp。所用引物如下：

上游：5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’

下游：5’-cccggtgaccctacttttgcctcttgtaaa-3’

经过酶切和PCR鉴定的阳性菌落，送交测序公司测序。

从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404或者EHA105，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例4：转基因青蒿的制备

用lstp-fps融合基因转化青蒿的步骤如下：

(1)根癌农杆菌LBA4404-lstp-fps、EHA105-lstp-fps使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养(添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L)，28℃，200rpm振荡培养两次；

(2)第二次活化OD₆₀₀＝0.6时，室温下4000rpm离心10分钟；

(3)弃上清，菌体用MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.3左右；称转化液；可用于青蒿的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化根癌农杆菌；

(4)取无菌青蒿顶芽、侧芽、茎、叶片等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm2左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，浸染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。

(5)共培养结束后转移至添加2.0mg/L BA+0.2mg/L NAA的MS固体培养基(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因青蒿丛生芽)中培养，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。40天后，获得新生的青蒿丛生芽。

(6)待从青蒿转化外植体上诱导出的丛生芽长到1cm左右是，分别切下单个的丛生芽，接种在无植物生长调节物的MS固体培养基上(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的；添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因青蒿丛生芽)继代培养；在该培养基上生长正常的青蒿丛生芽即为转基因青蒿。以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除干净。然后仅在添加0.25mg/LNAA的MS固体培养基上生根即可。转基因青蒿炼苗1周后，即可移栽。

实施例5：转基因青蒿的分子检测

青蒿基因组DNA的提取，方法如下：

1)剪取每棵转化植株的一个叶片，分别放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。

2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其间经常颠倒混匀；

3)12000rpm，室温离心10分钟；

4)取上清液，加500ul饱和酚[Tris-HCl(pH8.0)饱和，吸取下层]，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；

5)12000rpm，室温离心10min；

6)吸上清(约250微升)，加2倍体积的无水乙醇(-20℃储存)，充分混匀，室温静置至DNA析出；

7)8000rpm，4℃离心5分钟；

8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全。

9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小时。

10)加40ul氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

11)12000rpm，室温离心10分钟。

12)吸取上清(约35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM             Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(v/v)        巯基乙醇

500mM             NaCl

20mM              EDTA

1.5％(w/v)        SDS

转基因青蒿的PCR检测，方法如下：

以总DNA为模板，引物为：

上游：5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’

下游：5’-cccggtgaccctacttttgcctcttgtaaa-3’

进行PCR反应，在琼脂糖电泳上进行检测，出现1102bp的lstp-fps融合基因条带，以野生型青蒿的总DNA为阴性对照进行PCR反应，未出现融合基因条带，证明目的基因的片段已经整合到植物基因组中。

实施例6：野生型青蒿和转基因青蒿中青蒿素含量比较

青蒿素提取：将烘干的青蒿叶研成细粉，准确称取0.125g细粉置于提取瓶中，加入10ml30～60℃石油醚，在超声波浴中提取30min，过滤，减压回收溶剂，将残渣用1ml甲醇重新溶解，12000r/min下离心10min以沉淀不溶部分，上清液用于测定青蒿素含量。

高压液相检测样品及标准品的制备：取青蒿素甲醇溶液200μl于10ml试管中，加入800μl甲醇、4ml 0.2％NaOH溶液，混匀，在50℃水浴中反应30min，冷却至室温，取0.5ml反应液于1.5ml塑料离心管中，加入100μl甲醇、400μl 0.05mol/L醋酸，混匀，过C18预分离小柱纯化。按照同样方法制备用于高压液相分析的青蒿素标准品溶液，标准品浓度分别为每10ml溶液中含青蒿素标准品0、40、80、120、160、200、240μg。

高压液相检测条件：色谱柱为C18柱，150mm×416mm，流动相为0.01mol/L磷酸缓冲液∶甲醇(55∶45)，pH7.0，流速1ml/min，紫外检测器检测波长设在258m，注射体积10μl。在上述条件下，青蒿素出峰时间大约在4min。

测定结果表明：转基因青蒿中青蒿素含量明显比野生型青蒿中青蒿素含量要高。

序列表：

<110>西南大学

<120>携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因的构建及应用

<160>1

<170>patentIn version 3.1

<210>1

<211>1108

<212>DNA

<213>青蒿

<220>

<221>gene

<222>(1)...(1108)

<223>

<400>1

ACTAGTATGG CATCAATTAG CTTATTTCCA TATTCAATTC TAAAACAAAC AAGTCCTCTA    60

GCAAGAGACG TCAGTAGTAC CGATCTGAAA TCAAAGTTTT TGAAAGTGTA TGATACACTT   120

AAATCAGAGC TTATTAACGA TCCCGCCTTC GAATTTGACG ATGATTCCCG TCAATGGATT   180

GAAAAGATGC TTGACTACAA TGTACCTGGA GGAAAGCTGA ACCGGGGATT ATCTGTTGTC   240

GACAGTTATC AGCTGCTTAA AGGAGGAGAA TTGTCTGATG ACGAGATTTT TCTTTCATCT   300

GCCCTTGGTT GGTGTATTGA ATGGCTTCAA GCATACTTTC TTGTGCTTGA TGATATCATG   360

GACGAGTCTC ATACACGCAG AGGGCAACCC TGTTGGTTTA GATTACCCAA GGTTGGTATG   420

ATTGCTGCGA ACGATGGAAT TCTTCTTCGT AACCATGTCC CGAGAATTCT TAAGAAACAT   480

TTCCGAGGAA AGCCTTACTA TGTGGATCTT GTGGACCTGT TCAACGAGGT TGAATTCCAA   540

ACAGCCTCTG GTCAGATGAT TGATTTGATC ACTACACTTG TTGGAGAGAA AGATCTCTCT   600

AAGTATTCAT TGTCTATTCA CCGCCGAATT GTTCAATACA AAACAGCTTA CTACTCATTT   660

TACCTTCCAG TTGCCTGTGC ACTCCTTATG TTTGGAGAGG ATCTTGACAA GCACGTTGAA   720

GTGAAGAACG TGCTCGTTGA AATGGGTACC TATTTTCAAG TTCAGGACGA TTATCTAGAC   780

TGTTTTGGTG CTCCCGAGGT GATTGGAAAG ATTGGAACCG ATATTGAAGA CTTTAAGTGC   840

TCCTGGTTAG TTGTCAAAGC ATTGGAACTT CCCAATGAGG AACAAAAGAA AACCCTGCAT   900

GAGAACTATG GGAAAAAAGA CCCCGCGTCT GTTGCTAAAG TGAAGGAAGT ATACCACACT   960

CTCAATCTTC AGGCTGTATT CGAAGATTAC GAGGCAACAA GTTACAAGAA GCTGATCACC  1020

TCGATTGAAA ATCACCCAAG CAAAGCAGTC CAAGCGGTGT TGAAATCCTT CTTGGGTAAA  1080

ATTTACAAGA GGCAAAAGTA GGGTGACC                                     1108

Claims (5)

1.携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因，其特征在于，利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps，构建融合基因lstp-fps，基因序列为SEQID NO.1。

2.根据权利要求1所述的携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因，其特征在于，所设计的青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入SpeI酶切位点，下游引物引入AatII酶切位点：

上游引物：5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’

下游引物：5’-cccgacgtctcttgctagaggacttg-3’。

3.根据权利要求1所述的携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因，其特征在于，所设计的青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入AatII酶切位点，并去掉了fps编码区的起始密码子ATG，下游引物引入BsteII酶切位点：

上游引物：5’-cccgacgtcagtagtaccgatctgaaa-3’

下游引物：5’-cccggtgaccctacttttgcctcttgtaaa-3’。

4.根据权利要求1所述的携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因，其特征在于，lstp-fps融合基因的构建，具体操作步骤如下：

(1)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增lstp，回收产物并进行TA克隆；

(2)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增fps，回收产物并进行TA克隆；

(3)分别用Spe I/AatII、AatII/BsteII双酶切含有lstp的TA克隆质粒和含有fps基因的TA克隆质粒，回收lstp片段和fps片段；

(4)用Spe I/Bste II双酶切pCAMBIA1304质粒，回收大的载体片段；

(5)混合上述lstp片段、fps片段和pCAMBIA1304载体片段，在T4连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1304载体上的lstp-fps融合基因的构建。

5.携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因的应用，其特征在于，利用lstp-fps融合基因转化青蒿，获得青蒿素含量提高的青蒿再生植株。