CN100588706C - 纯化弹性蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纯化弹性蛋白酶的方法，包括以下步骤：①搅拌下将胰脏粉投入到纯化水中得到混合液；②将混合液静置分层或离心分离得到上清液、或过滤得到滤液，对上清液或滤液进行超滤，再对超滤后的液体进行洗涤、再超滤，得到浓缩液；③将浓缩液通过树脂层析柱而上柱；④对树脂层析柱分步洗涤，分布收集洗涤液；⑤对树脂层析柱进行洗脱，收集洗脱液；⑥将洗脱液除菌过滤，得到除菌过滤液；⑦对除菌过滤液进行超滤，再对超滤后的液体进行洗涤、再超滤，得到浓缩的除菌过滤液；⑧将浓缩的除菌过滤液冷冻干燥，即得。采用本发明的纯化方法后，弹性蛋白酶的重金属含量≤25ppm符合标准，而且产品的收率≥15万单位/kg胰脏粉。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白酶药品技术领域，具体涉及一种纯化弹性蛋白酶的方法。
背景技术
弹性蛋白酶又称胰肽酶E，易溶于水和稀盐溶液，广泛存在于哺乳动物的胰脏中，在某些微生物(如绿脓杆菌等)和一些植物中也存在少量的弹性蛋白酶。弹性蛋白酶对动脉壁中的弹性蛋白是一种肽链内切酶，具有专一的水解作用，能水解弹性蛋白、胶原蛋白和糖蛋白等，增强脂蛋白酯酶活性，阻止胆固醇在体内合成并促进其转化为胆酸，降低血浆胆固醇、LDL、VLDL和三酰甘油，升高HDL，阻止脂质向动脉壁沉积，分解陈旧的弹性蛋白并促进新的弹性蛋白合成，维持血管弹性，抑制肾小球基底膜肥厚，降低肾脏微量蛋白的***。临床上常用于治疗或预防II型和IV型高脂血症(尤其适用于II型)、动脉粥样硬化、脂肪肝、糖尿病性肾病变和心绞痛等。
已有技术中一般采用丙酮沉淀等工艺来制备弹性蛋白酶，具体步骤如下：①获得弹性蛋白酶的提取液：绞碎新鲜或冷冻的胰脏后，采用丙酮沉淀法得到弹性蛋白酶的提取液；②吸附于树脂：将步骤①所得的弹性蛋白酶的提取液用蒸馏水稀释至合适的浓度后，吸附于用pH值为4.5且浓度为0.1M/L的乙酸铵缓冲液平衡过的Diaion Wklos弱酸性树脂层析柱上，而且吸附于树脂层析柱后用蒸馏水洗涤树脂层析柱至洗涤液无色；③洗脱：用pH值为7.5且浓度为1M/L的乙酸铵缓冲液洗脱步骤②中经过洗涤的树脂层析柱，分步收集洗脱液；④沉淀干燥洗脱液：用丙酮沉淀步骤③中所得洗脱液生成沉淀物，干燥沉淀物得到粉状弹性蛋白酶。
采用上述方法来获得弹性蛋白酶，不但操作烦琐，污染环境，而且重金属含量较高且有的还超标，产品质量也得不到保障。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种能够去除弹性蛋白酶中的重金属的纯化弹性蛋白酶的方法。
本发明采用的技术方案包括以下步骤：①搅拌下将胰脏粉投入到纯化水中得到混合液，调节其pH值为3.0至6.0；②将步骤①得到的混合液静置分层或离心分离得到上清液、或过滤得到滤液，对所得到的上清液或滤液用超滤膜进行超滤，再用洗涤液对超滤后留下的液体进行洗涤、同时用超滤膜进行超滤，得到浓缩液；当浓缩液的导电率≤3000μs/cm、pH值为4.0至6.0时结束洗涤和超滤；③将步骤②得到的浓缩液通过平衡液平衡过的树脂层析柱，并保留在树脂层析柱上而上柱；④对上柱后的树脂层析柱用洗涤液分步洗涤，同时分布收集流过树脂层析柱的洗涤液，将所收集的流过树脂层析柱的洗涤液稀释后的样品(稀释的目的在于使液体的浓度达到光度计能读出的范围，通常稀释5～15倍)，用分光光度计发出波长为280nm的光波对其进行检测，当分光光度计的读数≤0.8时结束洗涤；⑤对步骤④的用洗涤液洗涤后的树脂层析柱用洗脱液进行洗脱，同时收集流过树脂层析柱的洗脱液；⑥将步骤⑤的流过树脂层析柱的洗脱液用除菌膜除菌过滤，得到除菌过滤液；⑦对除菌过滤液用超滤膜进行超滤，再用纯化水对超滤后留下的液体进行洗涤、同时用超滤膜进行超滤，得到浓缩的除菌过滤液；当浓缩的除菌过滤液的导电率≤3000μs/cm时结束洗涤和超滤；⑧将步骤⑦得到的浓缩的除菌过滤液冷冻干燥，即得到粉状弹性蛋白酶。
上述步骤①中所述的胰脏粉为猪胰脏粉，且其与纯化水按质量比为1∶10至1∶30的比例相互混合。
上述步骤①中调节所述混合液pH值所用的试剂为无机酸或无机碱。
上述步骤②和步骤⑦中所述的超滤膜的截留分子量均为3000～10000道尔顿。
上述步骤③中所述的树脂层析柱中的树脂为阳离子交换树脂，优选CM-纤维素。
上述步骤③所述的平衡液是pH值为5至7、浓度为0.01～0.05M/L的乙酸铵溶液或其它缓冲液。
上述步骤⑤中所述的洗脱液的pH值和/或浓度大于步骤③中所述的平衡液。
上述步骤⑤中所述的洗脱液是pH值为7至9、浓度为0.5～0.7M/L的乙酸铵溶液或浓度为0.01～0.05M/L其它缓冲液。
上述步骤⑥中所述的除菌膜的孔径为0.22μm。
上述步骤⑧还包括将所述浓缩的除菌过滤液在冷冻干燥前按5～40克/百万单位弹性蛋白酶的量加入赋型剂。所述的赋型剂为右旋糖酐、甘露醇或蔗糖。
本发明的积极效果：(1)采用本发明的纯化方法后，弹性蛋白酶的重金属含量≤25ppm符合标准，而且产品的收率≥15万单位/kg胰脏粉。(2)本发明的方法不采用有机溶剂，没有污染，操作简便，成本低廉，产品外观美观。
具体实施方式
(实施例1)
①将2kg的市售猪胰脏粉搅拌溶解在50kg纯化水中，用冰醋酸调节其pH值至4.0，继续搅拌2小时得到混合液；
②静置步骤①所得的混合液，使其分层并收集上清液；用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩上述上清液，再用0.01M/L的乙酸铵溶液超滤洗涤，直至溶液电导率至2000μs/cm为止，得到浓缩液1L。
③将步骤②得到的浓缩液流入树脂层析柱中，并保留在树脂层析柱上而上柱。本实施例的树脂层析柱中的树脂为CM纤维素，使用前先用pH值为5.5、浓度为0.05M/L的乙酸铵溶液平衡。
④上柱完毕后，用平衡液以与浓缩液流入树脂层析柱相同的流速洗涤所述树脂层析柱，并分步收集洗涤液，直至分步所收集的洗涤液稀释10倍后的样品在波长为280nm下的分光光度计的读数小于0.8。
⑤洗涤完毕后，用pH值为8、浓度为0.6M/L的乙酸铵溶液洗脱上述树脂层析柱，并收集洗脱液。
⑥将步骤⑤中所得的洗脱液用孔径为0.22μm的除菌膜除菌过滤，得到除菌过滤液。
⑦除菌过滤液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜浓缩，并用纯化水洗涤至溶液的电导率为2000μs/cm，得到浓缩的除菌过滤液。
⑧按10克/百万单位弹性蛋白酶的量向步骤⑦所得浓缩的除菌过滤液中加入右旋糖酐，真空冷冻干燥即得粉状弹性蛋白酶。
经测定，本实施例得到的弹性蛋白酶的重金属含量≤25ppm，产品的收率≥15万单位/kg胰脏粉。
(实施例2)
①将2kg的市售猪胰脏粉搅拌溶解在60kg纯化水中，用盐酸调节其pH值至3.0，继续搅拌2小时得到混合液；
②离心步骤①所得的混合液，使其分层并收集上清夜；用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜超滤浓缩上述上清液，再用纯化水超滤洗涤，直至溶液电导率至3000μs/cm为止，得到浓缩液1L。
③将步骤②得到的浓缩液流入树脂层析柱中，并保留在树脂层析柱上而上柱。本实施例的树脂层析柱中的树脂为CM纤维素，使用前先用pH值为7、浓度为0.05M/L的乙酸铵溶液平衡。
④上柱完毕后，用平衡液以与浓缩液流入树脂层析柱相同的流速洗涤所述树脂层析柱，并分步收集洗涤液，直至分步所收集的洗涤液稀释5倍后的样品在波长为280nm下的分光光度计的读数小于0.8。
⑤洗涤完毕后，用pH值为9、浓度为0.5M/L的乙酸铵溶液洗脱上述树脂层析柱，并收集洗脱液。
⑥将步骤⑤中所得的洗脱液用孔径为0.22μm的除菌膜除菌过滤，得到除菌过滤液。
⑦除菌过滤液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜浓缩，并用纯化水洗涤至溶液的电导率为2500μs/cm，得到浓缩的除菌过滤液。
⑧按10克/百万单位弹性蛋白酶的量向步骤⑦所得浓缩的除菌过滤液中加入甘露醇，真空冷冻干燥即得粉状弹性蛋白酶。
经测定，本实施例得到的弹性蛋白酶的重金属含量≤25ppm，产品的收率≥15万单位/kg胰脏粉。
(实施例3)
①将2kg的市售猪胰脏粉搅拌溶解在20kg纯化水中，用氨水调节其pH值至6.0，继续搅拌2小时得到混合液；
②用滤布过滤步骤①所得的混合液，收集滤液；用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜超滤浓缩上述滤液，再用纯化水超滤洗涤，直至溶液电导率至1600μs/cm为止，得到浓缩液1L。
③将步骤②得到的浓缩液流入树脂层析柱中，并保留在树脂层析柱上而上柱。本实施例的树脂层析柱中的树脂为CM纤维素，使用前先用pH值为7、浓度为0.05M/L的乙酸铵溶液平衡。
④上柱完毕后，用平衡液以与浓缩液流入树脂层析柱相同的流速洗涤所述树脂层析柱，并分步收集洗涤液，直至分步所收集的洗涤液稀释15倍后的样品在波长为280nm下的分光光度计的读数小于0.8。
⑤洗涤完毕后，用pH值为7、浓度为0.7M/L的乙酸铵溶液洗脱上述树脂层析柱，并收集洗脱液。
⑥将步骤⑤中所得的洗脱液用孔径为0.22μm的除菌膜除菌过滤，得到除菌过滤液。
⑦除菌过滤液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜浓缩，并用纯化水洗涤至溶液的电导率为2500μs/cm，得到浓缩的除菌过滤液。
⑧按10克/百万单位弹性蛋白酶的量向步骤⑦所得浓缩的除菌过滤液中加入蔗糖，真空冷冻干燥即得粉状弹性蛋白酶。
经测定，本实施例得到弹性蛋白酶的重金属含量≤25ppm，产品的收率≥15万单位/kg胰脏粉。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (7)
1、一种纯化弹性蛋白酶的方法，具有以下步骤：
①搅拌下将胰脏粉投入到纯化水中得到混合液，调节其pH值为3.0至6.0；
②将步骤①得到的混合液静置分层或离心分离得到上清液、或过滤得到滤液，对所得到的上清液或滤液用超滤膜进行超滤，再用洗涤液对超滤后留下的液体进行洗涤、同时用超滤膜进行超滤，得到浓缩液；当浓缩液的导电率≤3000μs/cm、pH值为4.0至6.0时结束洗涤和超滤；所述洗涤液为0.01M/L的乙酸铵溶液或者纯化水；
③将步骤②得到的浓缩液通过平衡液平衡过的树脂层析柱，并保留在树脂层析柱上而上柱，所述的平衡液是pH值为5至7、浓度为0.01～0.05M/L的乙酸铵溶液；所述的树脂层析柱中的树脂为CM-纤维素阳离子交换树脂；
④对上柱后的树脂层析柱用洗涤液分步洗涤，同时分布收集流过树脂层析柱的洗涤液，将所收集的流过树脂层析柱的洗涤液稀释后的样品，用分光光度计发出波长为280nm的光波对其进行检测，当分光光度计的读数≤0.8时结束洗涤；所述的洗涤液为步骤③中的平衡液；
⑤对步骤④的用洗涤液洗涤后的树脂层析柱用洗脱液进行洗脱，同时收集流过树脂层析柱的洗脱液，所述的洗脱液是pH值为7至9、浓度为0.5～0.7M/L的乙酸铵溶液；
⑥将步骤⑤的流过树脂层析柱的洗脱液用除菌膜除菌过滤，得到除菌过滤液；
⑦对除菌过滤液用超滤膜进行超滤，再用纯化水对超滤后留下的液体进行洗涤、同时用超滤膜进行超滤，得到浓缩的除菌过滤液；当浓缩的除菌过滤液的导电率≤3000μs/cm时结束洗涤和超滤；
⑧将步骤⑦得到的浓缩的除菌过滤液冷冻干燥，即得到粉状弹性蛋白酶。
2、根据权利要求1所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：步骤①中所述的胰脏粉为猪胰脏粉，且其与纯化水按质量比为1∶10至1∶30的比例相互混合。
3、根据权利要求1所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：步骤①中调节所述混合液pH值所用的试剂为无机酸或无机碱。
4、根据权利要求1所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：步骤②和步骤⑦中所述的超滤膜的截留分子量均为3000～10000道尔顿。
5、根据权利要求1所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：步骤⑥中所述的除菌膜的孔径为0.22μm。
6、根据权利要求1所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：步骤⑧还包括将所述浓缩的除菌过滤液在冷冻干燥前按5～40克/百万单位弹性蛋白酶的量加入赋型剂。
7、根据权利要求6所述的纯化弹性蛋白酶的方法，其特征在于：所述的赋型剂为右旋糖酐、甘露醇或蔗糖。
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