CN100575360C - 一种高活性的人肝再生增强因子及其制备方法 - Google Patents
一种高活性的人肝再生增强因子及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明主要涉及一种高活性的人肝再生增强因子。具体而言,本发明涉及一种不成熟形式(或称截短型)的人肝再生增强因子,其可用于预防和/或治疗肝损伤,尤其涉及利用中、低剂量的所述人肝再生增强因子来预防和/或治疗肝损伤。本发明还涉及所述人肝再生增强因子的制备方法及其编码核酸等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,主要涉及一种高活性的人肝再生增强因子及其制药用途。具体而言,本发明涉及一种不成熟形式(截短型)的人肝再生增强因子,其可用于预防和/或治疗肝损伤,尤其涉及利用中、低剂量的所述人肝再生增强因子来预防和/或治疗肝损伤或制备相应药物。本发明还涉及所述人肝再生增强因子的制备方法及其编码核酸等。
背景技术
肝脏是人体的重要器官,肝损伤会对健康构成了重大危害,严重时甚至导致肝硬化和肝功能衰竭,其中急性肝功能衰竭不但起病急、预后差,而且病死率高。某些病毒,如在我国的人群中普遍发病率高的乙型肝炎病毒等,通过致肝细胞病变可以造成肝损伤。还有研究表明,针对某些病毒(如丙型肝炎病毒(HCV))的免疫反应也是引起肝损伤的主要原因。淋巴细胞(尤其是细胞毒T淋巴细胞)非但不能完全有效地清除HCV,反而在清除HCV感染的肝细胞的过程中会造成肝细胞的免疫性损伤,引起肝细胞调亡,由此甚至可以导致肝硬化和肝细胞性肝癌(例如可参见,Nelson等,J.Immunol.,158:1473-1481(1997);Wong等,J.Immunol.,160:1479-1488(1998);Ruggieri等,Virology,229:68-76(1997))。此外,众所周知,肝毒性化学物质也会引起肝损伤。已知一些药物通过氧化作用,尤其是产生的氧自由基,可以造成肝损伤,导致肝脏细胞溶解和肝坏死。例如镇痛药醋氨酚(即扑热息痛,化学名为4-(N-乙酰基氨基)酚)就是一种具有肝损伤作用的物质,在大剂量服用时会引起人的肝坏死。又如,长期服用利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等抗生素,以及更年期长期服用***等也会造成严重的肝细胞坏死,导致急性或慢性肝炎、黄疸和肝纤维化等肝损伤。肝损伤是由肝脏细胞的病变、坏死而造成的,因此,促进肝细胞增殖,使肝细胞再生,是预防和治疗肝损伤、恢复肝脏功能的关键。
1994年,Hagiya等首先在大鼠的肝再生过程中获得了一个全长1.2kb的cDNA,包含375bp的开发读框,编码125个氨基酸的小分子蛋白,将其命名为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,缩写为ALR)。该鼠肝再生增强因子活性不受热、酸、碱、1g/L SDS、10g/Lβ巯基乙醇、8M脲处理影响,不为Dnase、RNase、神经氨酸糖苷酶破坏,但可被蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等降解,分子量为15Kd左右。人们对ALR刺激肝细胞再生的机制还没有完全清楚,有报道认为,ALR通过跟胞外蛋白的受体结合激发胞内的MAPK途径发挥作用。纯化的ALR可促进小鼠及大鼠肝叶切除后的肝细胞DNA合成,从而对脾、肺、肾、心、脑等脏器细胞无刺激生长作用,表明其活性存在肝组织特异性。但是对于人来说,鼠肝再生增强因子作为外源物质,其上的表位会诱导人免疫***对其产生免疫反应,难以直接应用于预防和治疗人的肝损伤。
在大鼠ALR分子克隆的基础上,1999年刘杞等利用同源引物PCR技术获得了人肝再生增强因子(缩写为hALR)的基因组序列(Genbank号为AF146394),据预测为375bp的开放读框,但该研究没有研究其活性。此外,在专利申请WO9748797A、WO9702346A、EP0668291A也公开了各种来源的ALR,但遗憾的是,都没有具体研究其活性。之后Lisowsky发现hALR基因有3种不同的剪切形式,由125个氨基酸组成的hALR仅为不成熟形式;而由204个氨基酸组成的全长hALR的形式为成熟形式,分子量为23kDa,主要分布于肝脏、肾脏,在组织中所占的比率最高,并且具有最强的生物学活性。受此认识的影响,此后的研究集中于全长hALR,如中国专利CN1233839C、CN1795924A,没有触及不成熟形式的人肝再生增强因子。另外,中国专利CN1532285A涉及ALR的同源二聚体蛋白,而CN1727479A涉及ALR作为免疫抑制剂的用途,也没有涉及不成熟形式的人肝再生增强因子,更没有涉及hALR治疗肝损伤的剂量。
本发明人经过艰苦的研究,令人意外地发现了不成熟形式的人肝再生增强因子不但能够在我们构建的表达***中高效表达、稳定保持,而且该人肝再生增强因子治疗肝损伤的活性并不比全长hALR低,克服了存在于现有技术中的偏见。更令人意外的是,不成熟形式的人肝再生增强因子的治疗效果并不常规地与剂量呈正相关,竟然能以现有技术所未启示过的中、低剂量来取得好的效果,而高剂量的使用甚至有害,由此形成该人肝再生增强因子的新的药物应用。另外,至今未见报道有人肝再生增强因子冻干制剂的报道,本发明人经过长期的摸索,发现聚乙二醇不适于作为该冻干剂的辅料,并得出了前人无法预计的制剂配方。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的偏见、突破常规药物剂量,提供了一种不成熟形式(截短型)的人肝再生增强因子,其能以中低剂量治疗肝损伤,以及该人肝再生增强因子的药物组合物及其在制备治疗或预防肝损伤的药物中的应用。本发明的目的还在于提供编码所述人肝再生增强因子的核酸分子及其载体、宿主细胞和利用基因工程技术制备所述人肝再生增强因子的方法。
具体而言,在第一个方面,本发明提供了一种不成熟形式的人肝再生增强因子,其氨基酸序列
a)如序列表中的序列1所示;或
b)是对序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列,并且所述人肝再生增强因子能以中低剂量治疗肝损伤。优选本发明第一个方面的人肝再生增强因子的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。本发明人经过艰苦的研究,令人意外地发现了本发明的第一个方面的人肝再生增强因子尽管是不成熟形式,但是其仍旧能稳定保持并表现出不比全长hALR低的治疗或预防肝损伤的活性;更令人意外的是,本发明的第一个方面的人肝再生增强因子在对损伤的肝细胞进行高剂量的使用时,不但无效,反而有害,需要以中低剂量来取得好的效果。当然拥有这样性质的好处是明显的:只要中低剂量就能取得好疗效,就可以减少药物使用量,降低病人治疗成本,并且相应减轻病人用药时的痛苦。
本发明的第一个方面的人肝再生增强因子的氨基酸序列可以是在序列表中的序列1所示的序列的基础上添加、缺失或取代一个或几个(优选一个至五个,更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列,并且所述人肝再生增强因子仍旧能以中低剂量治疗肝损伤。本领域技术人员知晓,通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体,可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽,这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京:科学出版社,2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中,优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸,从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。目前已经存在大量检验中低剂量治疗肝损伤能力的实验方法,必要时也可根据本发明实施例所述的具体实验方法从经添加、缺失或取代的氨基酸序列中选出具有上述功能的人肝再生增强因子。本发明人发现对于小鼠损伤的肝细胞,高剂量的本发明的第一个方面的人肝再生增强因子不但无效,反而有害,因此对于小鼠,小鼠的用量应当低于2mg/Kg体重,优选为12-1200μg/Kg体重,更优选为24-600μg/Kg体重,更优选为36-240μg/Kg体重,特别优选为40-200μg/Kg体重,如40μg/Kg体重、200μg/Kg体重等。根据的本领域普通技术人员所公知的实验动物与人的等效剂量换算关系(通常可参见FDA、SFDA等药品管理机构的指导意见,也可参见“黄继汉等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学,2004Sep;9(9):1069-1072”)可从实验动物的剂量推导出人的剂量。具体而言,对于本发明具体实施方式中所用的实验动物小鼠而言,根据上述文献,其与成人的换算关系一般为12∶1,因此对于成人,换算出的成人的用量应当低于167μg/Kg体重,优选为1-100μg/Kg体重,更优选为2-50μg/Kg体重,更优选为3-20μg/Kg体重,特别优选为3.3-16.7μg/Kg体重,如3.3μg/Kg体重、16.7μg/Kg体重等。
本文中所用的“中低剂量”或“中、低剂量”,如不特别指明(即在没有加人或动物种类的限定时),指的是成人每Kg体重接受的大于0并且低于167μg的量(即指的是大于0并且低于167μg/Kg体重)。本领域普通技术人员完全有能力根据本文所提供的实验方法或相关临床实验来进一步得出更优选的中低剂量范围。本发明优选的中低剂量为1-100μg/Kg体重,更优选为2-50μg/Kg体重,更优选为3-20μg/Kg体重,特别优选为3.3-16.7μg/Kg体重,如3.3μg/Kg体重、16.7μg/Kg体重等。
当特别指明是小鼠时,小鼠的中低剂量指大于0并且低于2mg/Kg体重,优选为12-1200μg/Kg体重,更优选为24-600μg/Kg体重,更优选为36-240μg/Kg体重,特别优选为40-200μg/Kg体重,如40μg/Kg体重、200μg/Kg体重等。因此,在本发明一个并不优选的方面,本发明提供了一种非人动物使用的不成熟形式的人肝再生增强因子,其氨基酸序列
a)如序列表中的序列1所示;或
b)是对序列表中的序列1所示的序列添加、缺大或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列,并且所述人肝再生增强因子能以非人动物的中低剂量治疗肝损伤。其中,非人动物优选是小鼠。另外,该方面的人肝再生增强因子的氨基酸序列可以如序列表中的序列1所示。
为了便于描述,在下文中,术语“人肝再生增强因子”、“肝再生增强因子”及其缩写“ALR”、“hALR”可以根据上下文意义而相互交替使用,如果没有前提条件的说明,则指的是本发明第一个方面的人肝再生增强因子。
在第二个方面,本发明提供了一种核酸分子,其编码本发明第一个方面所述的人肝再生增强因子。本发明的核酸分子,可以是DNA形式,也可以是RNA形式,优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA,DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术,如PCR方法、重组法或人工合成的方法,本领域技术人员可以很容易获得本发明的人肝再生增强因子的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得,就可以将其克隆入载体,再转化或转染入相应的细胞,然后通过常规的宿主细胞进行增殖,从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。该优选序列优化了在大肠杆菌的表达。
在第三个方面,本发明提供了一种载体,其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”,有时仅称“载体”,在此可以交互替换使用,是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之,只要能在宿主细胞中稳定复制,任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因,如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因;酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因,酵母菌的缺陷选择标志,如His,Leu,Trp等;真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。本发明的载体优选为原核载体,在实施方式中,其为pET-ALR,即在pET28a质粒上克隆有序列表中的序列2所示核苷酸序列的表达质粒。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术,构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞,以便获得所需要的人肝再生增强因子。
在第四个方面,本发明提供了一种宿主细胞,其特征在于,所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体,或者所述细胞已用本发明第二个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞,也可以是真核细胞,如,细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后,即构成工程化细胞或细胞株,可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞,并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中,所用方法包括但不限于:氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞,电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞,脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本发明的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。该优选宿主细胞能高效表达人肝再生增强因子。
在第五个方面,本发明提供了制备本发明第一个方面所述人肝再生增强因子的方法,其包括,用本发明第四个方面所述的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的人肝再生增强因子,然后分离纯化所述人肝再生增强因子。换句话说,本发明第五个方面提供了制备人肝再生增强因子的方法,其包括,用宿主细胞表达所述人肝再生增强因子,然后分离纯化所述人肝再生增强因子;
其中,所述宿主细胞含有包含核酸分子的载体,或者所述细胞已用核酸分子转化或转染,其中所述核酸分子编码所述人肝再生增强因子;
而且其中,所述人肝再生增强因子的氨基酸序列
a)如序列表中的序列1所示;或
b)是对序列表中的序列1所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列,并且所述人肝再生增强因子能以中低剂量治疗肝损伤。
在一个优选的方面,人肝再生增强因子的氨基酸序列如序列表中的序列1所示;和/或,所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白,包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要,可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性,进行分离纯化。方法包括但不限于:裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌),离心,盐析,分子筛色谱(又称为分子尺寸排阻色谱),离子交换色谱,吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析),反向色谱,高效液相色谱,毛细管电泳,制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等,这些方法均是本领域技术人员所熟知的。为了能够高效地获得人肝再生增强因子,优选在本发明制备方法的方面的方法中,宿主细胞为含有载体pET28-ALR的大肠杆菌BL21(DE3),其中载体pET28-ALR含有权利要求4所述的核酸分子。该优选实施方式能够使人肝再生增强因子表达量占菌体蛋白总量的25%以上。其中,pET28-ALR如本申请具体实施方式所定义。
另外,为了稳定地获得高纯度的人肝再生增强因子,优选在本发明制备方法的方面的方法中,分离纯化所述人肝再生增强因子的步骤包括:其中分离纯化所述人肝再生增强因子的步骤包括:宿主细胞裂解变性后,按顺序用阳离子交换色谱复性,用分子尺寸排阻色谱纯化,用肠激酶酶切,用阴离子交换色谱纯化。尽管这一制备步骤的步骤组合是本发明人经过长期研究摸索出来的,但是其中每个单独的变性、复性、纯化、酶切等步骤是本领域普通技术人员所熟知的,而且许多已经商品化了。例如,阳离子交换色谱有SPSepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose XL、SP Sepharose HP、SP Sephadex C25、CM Sephadex C25等;分子尺寸排阻色谱有Sephacry S200HR、Sephedex G-25、Sephedex G-100等;阴离子交换色谱有Q-Sepharose FastFlow、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Q SepharoseXL等。优选其中阳离子交换色谱是Sepharose FF,包括SP Sepharose FF、CM Sepharose FF;和/或,分子尺寸排阻色谱是Sephedex G-25;和/或,阴离子交换色谱是Q-Sepharose Fast Flow。也优选其中肠激酶酶切后进一步包括分离去除含His部分的融合蛋白片段的步骤,如将酶切产物过Sepharose FF柱和NTA柱,去除未酶切完全的产物。在本发明的具体实施方式中,分离纯化所述人肝再生增强因子的步骤包括如下步骤:
1)宿主细胞裂解变性后,裂解液用Sepharose FF柱复性,其中采用尿素浓度梯度复性缓冲液过柱复性,然后依次分别用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脱液洗脱;
2)将上述洗脱液过Sephedex G-25柱去除咪唑及盐离子;
4)将上一步的流出液过Q-Sepharose Fast Flow柱纯化,用0至1mol/LNaCl梯度洗脱,收集含人肝再生增强因子的洗脱峰。
附图说明
图1为构建的ALR表达载体示意图。
图2为ALR表达菌株培养液的SDS-PAGE电泳图,其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为66kD,45kD,35kD,25kD,18.4kD,14.4kD);泳道1上样的是用IPTG诱导前的培养液;泳道2上样的是用IPTG诱导后的培养液。
图3为经纯化的ALR蛋白的SDS-PAGE电泳图,其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为从上至下依次为66kD,45kD,35kD,25kD,18.4kD,14.4kD);泳道C2,B2和A2分别上样的是三个不同批次得到的经纯化的ALR蛋白。
图4为经纯化的ALR蛋白的蛋白肽指纹图谱。
图5为经纯化的ALR蛋白的质谱图谱。
图6为ALR正常对照组小鼠的肝组织的组织学HE染色图,左图为放大100倍,右图为放大400倍,它们显示为正常肝组织结构。
图7为阴性治疗组小鼠的肝组织的组织学HE染色图,左图为放大100倍,右图为放大400倍,它们显示出中央静脉周围大块坏死。
图8为阳性治疗组小鼠的肝组织的组织学HF染色图,左图为放大100倍,右图为放大400倍,它们显示出中央静脉周围坏死,但有少量肝细胞出现。
图9为造模+ALR低剂量组小鼠的肝组织的组织学HE染色图,左图为放大100倍,右图为放大400倍,它们显示出显示出亚大块出血坏死尚存在,但有少量正常肝细胞出现。
为了便于理解,本发明引用了公开文献,这些文献是为了更清楚地描述本发明,其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是,这些描述仅仅是示例性的描述,并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述,本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
具体实施方式
以下实施例所述实验方法,没有具体说明的,按照《分子克隆实验指南》(2002年,第三版,科学出版社)、《细胞实验指南》(2001年,科学出版社)等实验手册所述的方法进行,或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。
实施例1.ALR表达载体的构建与表达
当前许多常规的基因克隆技术已经商业化,因此为了有利于ALR在大肠杆菌中的表达,我们委托上海生工公司人工合成了适合大肠杆菌表达的如序列2所示的ALR基因。通过PCR技术在以上合成的序列两端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点以及肠激酶切点。具体PCR扩增过程如下:
上游引物:ttgGAATTCGACGACGACGACAAGATGCGTACCCAGCAGAAA;
下游引物:ttgCTCGAGTTAGTCGCAAGAACCGTC;
PCR体系:H2O 34μL,10×PCR缓冲液5μL,25mM MgSO4 2μL,2mM dNTP 5μL,上游引物(稀释成50uM浓度)1μL,下游引物(稀释成50uM浓度)1μL,合成的ALR基因(稀释成10ng/uL浓度)1μL,KOD PLUSDNA聚合酶(Toyoba)1μL,总体积50μL;
PCR条件:首先94℃变性5分钟,然后25个循环(每个循环为94℃30秒,50℃30秒,68℃30秒),最后68℃2分钟。
然后,在琼脂糖凝胶上电泳PCR扩增产物,割胶回收约500bp大小的核酸片断。用EcoRI和XhoI分别双酶切该回收的PCR产物和pET28a+质粒(可购自Invitrogen公司),将酶切后的PCR产物和pET28a质粒用T4连接酶连接(构建成ALR表达载体pET28-ALR,如图1所示)后转化大肠杆菌DH5α细胞(可购自ATCC)。取转化的大肠杆菌DH5α细胞抽提质粒,经测序检测序列克隆有ALR正确序列后,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(可购自ATCC)中,由此得到ALR表达菌株。
取ALR表达菌株接种到LB液体培养基100mL中,在37℃振摇培养6小时后,加入10uL的1mol/LIPTG进行诱导,于37℃继续培养4小时。诱导前后各取菌液50μL,用12%SDS-PAGE电泳。电泳结果如图2所示,诱导后在15kD左右的位置上有明显的ALR表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的25%以上,表明我们选用的核酸序列(序列2)、表达载体(pET28-ALR)和宿主菌(大肠杆菌BL21(DE3))已经构成了原核高效表达***。
实施例2.ALR蛋白的分离纯化
对实施例1中诱导培养的菌体进行分离纯化操作,收获纯化的ALR蛋白以供进一步实验使用。具体步骤如下:
1)用10mL 50mM浓度的Tris-HCl(pH 8.0)裂解液重悬1克菌体,冰上超声破碎。低温高速(4摄氏度,10,000转/分钟)离心20分钟,收集沉淀。
2)沉淀用3倍体积(30mL)的含2M尿素的裂解液彻底洗涤,低温高速(4度,12,000转/分钟)离心10分钟,弃上清,用3倍体积的含8M尿素的裂解液彻底溶解,低温高速(4度,12,000转/分钟)离心弃去沉淀。
3)包涵体裂解液用CM Sepharose FF柱(购自GE公司)纯化,采用尿素浓度梯度复性缓冲液缓慢过柱洗涤,依次分别用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脱液以5倍柱体积洗脱。
4)过Sephedex G-25柱(购自GE公司)脱去洗脱液中咪唑及盐离子。
5)根据厂商说明书的指导,在20℃,20mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.6的条件下,用1μl的rEK(重组肠激酶,可购自上海生工公司)跟hALR反应8小时。然后,过Sepharose FF柱将用rEK切下的含His部分的融合蛋白片段分离,再将流出液进一步流经鳌合有Ni的NTA柱(购自Merck公司)以防止混入未酶切完全的蛋白。
6)将上一步的流出液1ml过Q-Sepharose Fast Flow(购自GE公司)柱纯化,条件是以50mM Tris-HCl缓冲液平衡,用0至1mol/L NaCl梯度洗脱,收集含hALR的洗脱峰。
然后以下文中的实验检验该洗脱峰。
经过以上步骤的纯化,得到的纯化的ALR蛋白电泳结果如图3所示,在C2,B2和A2三个不同批次纯化试验得到的结果中,纯化的ALR蛋白纯度均在90%以上。另外,通过对该纯化的ALR蛋白进行蛋白肽指纹图谱分析(其结果如图4所示)、质谱测定(其结果如图5所示)和蛋白测序分析等理化性质的鉴定,表明纯化得到的ALR蛋白与预期的不成熟形式的人肝再生增强因子相符。
实施例3.ALR蛋白体外活性鉴定
取生长状态良好的人肝细胞株SMMC7721(购自中国科学院细胞库),按1×105个细胞/ml、100μl/孔的量接种于细胞培养板,在37℃以5%CO2的条件培养24小时,然后换含0.2%FSC的RPMI 1640的培养基培养12小时。然后,吸弃培养液,分别加入以上实施例所得的ALR(其用RPMI 1640的培养基稀释成不同浓度),加入量为100μl/孔,同时设置空白对照孔,其中加入不含ALR的RPMI 1640的培养基100μl/孔。每个药物浓度及对照孔设置复孔,培养24小时后加入10μl/孔的MTT溶液,继续培养4小时后,吸弃培养上清液,加入100μl/孔的DMSO,培养板振荡15分钟后,在550nm波长下测定各孔的光密度(O.D.),O.D.值越大表明孔中的细胞浓度越大,即ALR刺激细胞增殖的作用越大。测定结果参见表3-1,与空白对照相比,我们得到的ALR在体外具有显著的刺激肝脏来源的细胞增殖的作用,并且在体外刺激效应在一定范围内与剂量呈正相关关系。
表3-1.不同ALR浓度刺激下的O.D.值
ALR浓度 | OD<sub>550</sub> | 刺激指数SI |
20μg/ml | 2.65±0.33* | 107% |
10μg/ml | 2.17±0.41* | 69% |
5μg/ml | 1.87±0.34 | 46% |
2.5μg/ml | 1.69±0.10 | 32% |
1.25μg/ml | 1.38±0.84 | 7% |
0.625μg/ml | 1.32±0.01 | 3% |
0.31μg/ml | 1.38±0.03 | 7% |
0.16μg/ml | 1.48±0.08 | 15% |
空白对照 | 1.28±0.01 | 0 |
其中,*表示P<0.05
实施例4.ALR对肝损伤保护作用的动物实验
一,ALR对小鼠急性肝损伤的保护作用
1,实验方法
取体重、年龄相仿的昆明种小鼠(购自交通大学医学院实验动物中心)24只,随机分为6组,每组4只,分别为:(1)造模+生理盐水组(缩写为NS,即阴性治疗组):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药生理盐水;(2)造模+威佳促肝素组(缩写为WJ,即阳性治疗组):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药威佳(即促肝细胞生长素,产自威海赛洛金药业有限公司),给药剂量为20μg/Kg体重:(3)造模+ALR高剂量组(缩写为ALR高):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为2mg/Kg体重;(4)造模+ALR中剂量组(缩写为ALR中):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为200μg/Kg体重;(5)造模+ALR低剂量组(缩写为ALR低):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为40μg/Kg体重;(6)ALR正常对照组(即未造模组):不用CCl4造成小鼠急性肝损伤,但在其他组治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为2mg/Kg体重。具体实验过程如下:
除了ALR正常对照组之外,其他组的小鼠经腹腔注射含10%(体积百分比)CCl4的橄榄油,给药剂量为10ml/Kg体重;ALR正常对照组注射等体积生理盐水。4小时后,对以上六组的小鼠进行治疗,即分别按照以上分组情况对每只小鼠经腹腔注射生理盐水、威佳或ALR,共给药4次,每次给药体积均为200μl,每12小时给药1次。最后1次给药8小时后,对小鼠眶静脉取血,分离血清后使用全自动生化仪检测ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)的水平;同时留取小鼠肝组织,浸泡于10%中性***溶液,进行组织学HE染色观察肝组织损伤和保护情况。
2,实验结果
用不同试剂和剂量对急性肝损伤的小鼠治疗后,各组的ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)水平如表4-1所示。对小鼠肝组织进行组织学HE染色后,用光学显微镜观察的结果如图6-9所示。
以上结果表明:
(1)相对于未使用CCl4的未造模组,使用CCl4后仅采用生理盐水治疗的阴性治疗组的ALT、AST水平上升超过了20倍,两者具有非常显著差异(p<0.01),组织学HE染色图也表明会对肝细胞造成损害,这表明CCl4能成功地造成小鼠的急性肝损伤。
(2)与阴性治疗组相比,ALR在中、低剂量(200、40μg/Kg)使用时可显著抑制急性肝损伤,具体表现为可显著降低两种转氨酶ALT、AST在血清中的含量,而且观察到的肝组织损伤程度较轻,说明本发明的ALR对小鼠化学性肝细胞损伤具有保护作用。经统计学分析,造模+ALR中剂量组跟阴性对照相比ALT水平的降低有显著差异(P<0.05),造模+ALR低剂量组跟阴性对照相比ALT水平的降低有显著差异(P<0.01),造模+ALR低剂量组跟阴性对照相比AST水平的降低有显著差异(P<0.05),ALR的治疗效果优于常用的药物威佳。
(3)最为令人吃惊的是,动物实验表明,尽管高剂量的ALR对正常肝组织没有损伤作用,但是对损伤的肝细胞,高剂量的ALR(2mg/Kg)不仅没有保护作用,相反具有一定的协同损伤作用。造模+ALR高剂量组跟阴性治疗组相比甚至可以升高AST水平,且升高幅度在统计学上有差异(P<0.05),说明高剂量的ALR对于受损伤的肝细胞有一定的破坏作用,这提示使用剂量应控制在中、低剂量范围内。
表4-1.各组小鼠急性肝损伤经治疗后转氨酶的水平
NS(n=4) | ALR高(n=3) | ALR由(n=4) | ALR低(n=4) | WJ(n=4) | ALR正常对照组(n=4) | |
ALT(U/L) | 441.7±108 | 845**±740 | 284.7*±38.6 | 215**±62 | 408±116 | 18.5±5.5 |
AST(U/L) | 824±90.5 | 1360±277 | 719±258 | 478*±246 | 761±229 | 31±3.9 |
其中,*表示P<0.05;**表示P<0.01
二,ALR对小鼠急性肝损伤导致的致死效应的保护作用
取体重、年龄相仿的昆明种小鼠25只,随机分为5,每组5,分别为:(1)造模+生理盐水组(缩写为NS,即阴性治疗组):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药生理盐水;(2)造模+威佳组(缩写为WJ,即阳性治疗组):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药威佳(即肝细胞生长因子,购自),给药剂量为20μg/Kg体重:(3)造模+ALR高剂量组(缩写为ALR高):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为2mg/Kg体重;(4)造模+ALR中剂量组(缩写为ALR中):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为200μg/Kg体重;(5)造模+ALR低剂量组(缩写为ALR低):应用CCl4造成小鼠的急性肝损伤,在治疗时给药上述实施例得到的ALR,给药剂量为40μg/Kg体重。具体实验过程如下:
首先,小鼠经腹腔注射含50%(体积百分比)CCl4的橄榄油,给药剂量为8ml/Kg体重。1小时后,对以上五组的小鼠进行治疗,即分别按照以上分组情况对每只小鼠经腹腔注射生理盐水、威佳或ALR,给药体积均为200μl。然后,每天观察小鼠存活情况,结果如表4-2。该结果表明,中、低剂量的ALR具有对小鼠急性肝细胞坏死的保护作用,而且保护效果优于生理盐水、威佳,更为令人吃惊的是,也优于高剂量的ALR,提示了ALR(尤其是中、低剂量的ALR)具有通过减轻小鼠肝衰竭从而降低死亡率的作用。
表4-2.各组小鼠经治疗后的致死性损伤保护作用(存活率)
造模后天数 | NS | ALR高 | ALR由 | ALR低 | WJ |
第1天 | 60% | 60% | 80% | 80% | 80% |
第2天 | 60% | 60% | 80% | 80% | 60% |
第3天 | 40% | 60% | 80% | 80% | 60% |
第4天 | 40% | 60% | 80% | 80% | 60% |
第5天 | 40% | 60% | 80% | 80% | 60% |
第6天 | 40% | 60% | 80% | 80% | 60% |
第7天 | 40% | 60% | 80% | 80% | 60% |
序列表
<110>上海友恒生物科技有限公司
<120>一种高活性的人肝再生增强因子及其制备方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>125
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro
1 5 10 15
Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr
20 25 30
Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp
35 40 45
Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu
50 55 60
Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro Asp Thr
65 70 75 80
Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His Asn Glu
85 90 95
Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys Val Asp
100 105 110
Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp
115 120 125
<210>2
<211>378
<212>DNA
<213>智人
<400>2
atgcgtaccc agcagaaacg tgacaccaaa ttccgtgaag actgcccgcc ggaccgtgaa 60
gaactgggtc gtcactcttg ggctgttctg cacaccctgg ctgcttacta cccggacctg 120
ccgaccccgg aacagcagca ggacatggct cagttcatcc acctgttctc taaattctac 180
ccgtgcgaag aatgcgctga agacctgcgt aaacgtctgt gccgtaacca cccggacacc 240
cgtacccgtg cttgcttcac ccagtggctg tgccacctgc acaacgaagt taaccgtaaa 300
ctgggtaaac cggacttcga ctgctctaaa gttgacgaac gttggcgtga cggttggaaa 360
gacggttctt gcgactaa 378
Claims (1)
1,制备编码氨基酸序列如序列表中的序列1所示的人肝再生增强因子的方法,其包括,用宿主细胞表达氨基酸序列如序列表中的序列1所示的人肝再生增强因子,然后分离纯化所述人肝再生增强因子,
其中分离纯化所述人肝再生增强因子的步骤包括:宿主细胞裂解变性后,按顺序用阳离子交换色谱复性,用分子尺寸排阻色谱纯化,用肠激酶酶切,用阴离子交换色谱纯化,
其中宿主细胞为含有载体pET28-ALR的大肠杆菌BL21(DE3),其中载体pET28-ALR含有核苷酸序列如序列表中的序列2所示的核酸分子,
而且,所述方法包括如下步骤:
1)宿主细胞裂解变性后,裂解液用Sepharose FF柱复性,其中采用尿素浓度梯度复性缓冲液过柱复性,然后依次分别用含50mM、250mM和500mM咪唑的洗脱液洗脱;
2)将上述洗脱液过Sephedex G-25柱去除咪唑及盐离子;
3)用肠激酶酶切,然后将酶切产物过Sepharose FF柱和NTA柱,去除未酶切完全的产物;和
4)上一步的流出液过Q-Sepharose Fast Flow柱纯化,用0至1mol/L NaCl梯度洗脱,收集含人肝再生增强因子的洗脱峰。
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- 2007-05-22 CN CN200710107892A patent/CN100575360C/zh active Active
Non-Patent Citations (7)
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AY550027. NCBI. 2004 |
AY550027. NCBI. 2004;大肠杆菌mRNA 编码区长度、形成二级结构倾向与密码子偏好性的关系. 王侃,刘次全,曹槐,陈雪峰.微生物学报,第46卷第6期. 2006 * |
人Hepcidin融合表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达及制备研究. 张怀.中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士),第2005卷第7期. 2005 |
人Hepcidin融合表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达及制备研究. 张怀.中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士),第2005卷第7期. 2005 * |
大肠杆菌mRNA 编码区长度、形成二级结构倾向与密码子偏好性的关系. 王侃,刘次全,曹槐,陈雪峰.微生物学报,第46卷第6期. 2006 |
序列AAS55642. NCBI. 2004 |
序列AAS55642. NCBI. 2004 * |
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