CN100526458C - α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和用途。本发明首先从青霉(Penicillium sp.)F63(CGMCC No.1669)中分离纯化出α-半乳糖苷酶，再分离、克隆得到编码该酶的基因(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)。此外，本发明还公开了制备该α-半乳糖苷酶的方法，包括：构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养该重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。通过核苷酸和氨基酸序列比较，该α-半乳糖苷酶为一新的α-半乳糖苷酶。试验证实，本发明α-半乳糖苷酶能够较好的水解大豆中棉子糖和水苏糖，可应用于饲料和食品工业。

Description

α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种编码糖苷酶的基因及其编码的蛋白，尤其涉及一种从青霉(Penicillium sp.)中分离、克隆的编码α-半乳糖苷酶的基因；本发明还涉及含有本发明基因的重组表达载体和含有本发明基因的宿主细胞以及它们的制备方法，此外，本发明还涉及重组α-半乳糖苷酶的制备以及该α-半乳糖苷酶的用途。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)即蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能够专一性催化糖链非还原末端α-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含α-半乳糖苷键的寡糖，而且还能够催化含该键的多糖。棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖是豆类植物中广泛存在的低聚寡糖，在α-半乳糖苷酶的作用下，这些寡糖可以被分解为D-半乳糖和其他相应的单糖和寡糖。

α-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。在微生物中，细菌、放线菌、丝状真菌、酵母等都能合成α-半乳糖苷酶。目前，已分离筛选出许多产α-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物α-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的α-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用(den Herder I.F.，et al.Mol.Gen.Genet.233，404-410)。因此产α-半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。

在制糖工业中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜黏度增加而阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜，使糖产量降低。应用α-半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(Ganter C.，et al.Journal of Biotechnology.8(4)：301-310)。同时酶法制糖可使蔗糖的粒状结晶的均匀性、色泽和纯度得到改善。

在大豆及其制品中，含有1％的棉子糖、4％的水苏糖和微量的毛蕊花糖。这些寡糖阻碍人类对豆类的消化吸收，能够产生胀气等疾病，而人胃肠道不分泌α-半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入α-半乳糖苷酶，可以分解这些寡糖，增加人类对豆类营养的吸收(Prashanth S J and Mulimani V H.，Process Biochemistry.40：1199-1205)。

纠尔豆胶是一种食品，含有38-40％的α-半乳糖，半乳糖是以残基形式连接于甘露糖为主链的甘露聚糖上。半乳糖侧链的存在对半乳甘露聚糖的特性影响很大。α-D-半乳糖基侧链的多少及位置，决定其在水中的溶解度和胶凝能力。纠尔豆胶与刺槐胶相比，其胶凝能力较弱，如用α-半乳糖苷酶来进行改性处理，适量除去侧链的半乳糖残基而不使甘露聚糖主链断裂，可提高水溶性，也极大提高纠尔豆胶的胶凝能力，提高其商品性(Luonteri E.，et al.Enzyme Microb.Technol.22(3)，192-198)。

豆粕是非常优秀的植物性蛋白质饲料原料，一般在日粮中的用量为25～30％。但在豆粕中含有5～6％的单胃动物不能消化的α-半乳糖苷类的低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，这些寡糖一方面会引起动物的肠胃胀气疾病，另一方面会增加食糜的粘度，从而降低了动物对营养物质的消化与吸收。而在豆科饲料中添加α-半乳糖苷酶能够增加饲料中低聚寡糖的消化，减少此类低聚寡糖的抗营养作用，减轻或消除单胃动物的消化紊乱，从而提高饲料中营养物质的利用率和代谢能(Ghazi S.，et al.British Poultry Science.44(3)：410-418)。现有的α-半乳糖苷酶对于大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖的分解能力尚差强人意，所以提供一种新的能够有效分解大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖的α-半乳糖苷酶具有重要的意义。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的α-半乳糖苷酶Agl1，该α-半乳糖苷酶能够有效分解大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖，例如棉子糖、水苏糖等。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种α-半乳糖苷酶Agl1，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或

(b)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或***而获得的仍具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物。

优选的，本发明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；更优选的，本发明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述α-半乳糖苷酶的基因。

本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种编码α-半乳糖苷酶的基因，该基因具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列：

(a)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或

(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白；或

(c)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的核苷酸序列；或

(d)编码具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或***而获得。

优选的，本发明编码α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；本发明编码α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明所要解决的第三个技术问题是构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及获取含有该重组表达载体的重组菌株。

本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将将SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列***到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Agl1。

本发明所构建的重组酵母表达质粒可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞可为毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)或乳酸酵母细胞(Hansenula polymorpha)。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Agl1。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种制备所述的α-半乳糖苷酶的方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术途径来实现的：

优选的，一种制备本发明α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。

上述制备α-半乳糖苷酶的方法中，优选的，所述的重组表达质粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重组菌株为GS115/Agl1。

本文中，所述的“多个”通常意味着2～60个，优选为2～15个，这些取决于α-半乳糖苷酶的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“***”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基；所述的“严谨条件”是指杂交液为5～6×SSC，42～75℃杂交过夜，室温至37℃用2×SSC洗涤一至两次，优选的，所述的“严谨条件”为杂交液为6×SSC，68℃杂交过夜，37℃用2×SSC洗涤两次。

本发明整体技术方案的详细描述：

1、α-半乳糖苷酶的分离纯化和测序：本发明首先通过超滤、FPLC等技术从青霉(Penicillium sp.)F63分离纯化青霉电泳纯的α-半乳糖苷酶；将所分离的电泳纯的α-半乳糖苷酶利用ESI-MS/MS质谱仪进行测序。

2、α-半乳糖苷酶基因的克隆：提取青霉F63基因组DNA，根据内肽序列设计简并引物扩增α-半乳糖苷酶的部分核苷酸序列，再通过反向PCR克隆到编码α-半乳糖苷酶基因全长。

3、α-半乳糖苷酶cDNA序列的获得：提取青霉菌丝体RNA，采用RT-PCR的方式扩增得到α-半乳糖苷酶的cDNA序列。

4、重组α-半乳糖苷酶的酶的制备：将α-半乳糖苷酶基因连入真核表达载体pPIC9，获得重组质粒。利用电击法转入毕赤酵母GS115。诱导毕赤酵母宿主菌表达外源基因，制备重组α-半乳糖苷酶。

5、重组α-半乳糖苷酶酶学性质鉴定：通过酶活测定检测重组α-半乳糖苷酶的基本酶学性质。

附图说明

图1纯化的α-半乳糖苷酶Agl1的SDS-PAGE分析(A)和Native-PAGE分析(B)(5-14％梯度)。

(A)SDS-PAGE.1：分子量标准；2：纯化的酶。

(B)Native gradient PAGE。1：分子量标准；2：纯化的α-半乳糖苷酶(注：箭头所指的位置为纯化的α-半乳糖苷酶)。

图2嵌套反向PCR扩增产物电泳分析。

1.分子量标准；2-4.PCR产物。

图3α-半乳糖苷酶cDNA扩增产物电泳分析。

1.分子量标准；2.NEGATIVE CK；3Agl1 CDNA。

图4Agl1在毕赤酵母中表达的α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析。

1.分子量标准蛋白重量；2.GS115和质粒pPIC9；3.甲醇诱导前的发酵上清；4-9所表达的重组α-半乳糖苷酶在不同诱导时间的发酵上清。

图5重组α-半乳糖苷酶Agl-R的SDS-PAGE分析。

1.分子量标准；2.发酵培养上清；3.通过HiTrap Q Sepharose的重组α-半乳糖苷酶；4.纯化的重组α-半乳糖苷酶。

图6本发明重组α-半乳糖苷酶的最适pH值。

图7本发明重组α-半乳糖苷酶pH稳定性。

图8本发明重组α-半乳糖苷酶反应温度。

图9本发明重组α-半乳糖苷酶热稳定性。

以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：Penicillium F63(CGMCC No.1669；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2006年4月5日；北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、蜜二糖、棉子糖、水苏糖及瓜尔豆均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)青霉培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂。

(2)诱导产酶培养基(0.4％ K₂HPO₄，0.28％(wt/vol)(NH₄)₂8O₄，0.12％(wt/vol)CaCl₂，0.12％(wt/vol)尿素，0.12％(wt/vol)MgSO₄，0.02％(wt/vol)甘露糖，0.02％(wt/vol)酵母提取物和3％(wt/vol)豆粕)

(3)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 青霉菌α-半乳糖苷酶的分离纯化

青霉(Penicillium)F63被接种在产酶培养基中诱导表达α-半乳糖苷酶。诱导7天后离心菌体获得培养基上清，将培养基上清用20-95％的(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀物重悬在20mM、pH8.0的Tris—HCl中，透析过夜。

透析后的样品用超滤管浓缩。2mL的样品上预先用20mM、pH8.0的Tris—HCl平衡的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱(Amersham Pharmacia Biotech)。用NaCl盐梯度洗脱结合在柱子上的蛋白，在0.3M的盐梯度下，含有α-半乳糖苷酶组分的蛋白被洗脱下来。

500uL浓缩的含α-半乳糖苷酶组分的样品上Sephacryl S-200 HR分子筛(Amersham Pharmacia Biotech)，分子筛用含0.3M NaCl的20mM、pH8.0的Tris—HCl溶液洗脱，收集仅含α-半乳糖苷酶的组分。

对纯化过程中的离子交换层析，凝胶层析各步分别进行了酶活性测定及蛋白浓度测定，结果见表1。纯化完成后，比活性从粗酶液的9.6U/mg提高到纯酶的106.4U/mg，纯化倍数为11倍，得率10.1％。SDS-PAGE结果表明，纯化后的α-半乳糖苷酶蛋白仅有一条单一的条带，分子量约为82kD(图1)。

表1 α-半乳糖苷酶Agl1纯化结果

注：蛋白浓度用考马斯亮兰G250法测定。

实施例2 α-半乳糖苷酶蛋白的测序。

将实施例1中分子筛纯化后的α-半乳糖苷酶浓缩，SDS—PAGE电泳，电泳纯的α-半乳糖苷酶单一条带进行胶内酶切。用质谱仪对肽段进行测序，获得6段内肽，这6段内肽的氨基酸序列分别为LFVLDDGWFK、QSEGYTVSEFQYK、VNPLVLTGDMWR、DNAGLGDWLPNP、LEGLDENALYK和PEVQDFLLK。经序列比对后，发现其中有4段内肽与已知的α-半乳糖苷酶有较高的同源性，另外两端内肽没有找到与之同源的α-半乳糖苷酶序列。其中LFVLDDGWFK与黑曲霉、构巢曲霉、木霉、犁头霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为100％、88％、100％和88％；QSEGYTVSEFQYK与黑曲霉、构巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为66％、66％和76％；VNPLVLTGDMWR与黑曲霉、构巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为58％、75％和75％；DNAGLGDWLPNP与黑曲霉、构巢曲霉、木霉、犁头霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为91％、84％、83％和76％。没有找到与另外两段内肽LEGLDENALYK和PEVQDFLLK同源的α-半乳糖苷酶序列。说明实施例1中从青霉(Penicillium)F63中分离、纯化的α-半乳糖苷酶是一种新的α-半乳糖苷酶。

实施例3 青霉菌α-半乳糖苷酶编码基因Agl1的克隆

提取青霉菌(Penicillium sp)F63基因组DNA：取30℃培养7天后的青霉F63菌液60000rpm离心10min。取100mg菌丝体加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500μL提取液混合液，于37℃温育60min，10000rpm离心10min去沉淀。上清液用等体积酚、酚∶氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。12000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。

根据测序的α-半乳糖苷酶的内肽序列设计合成简并引物P1，P2(P1：5’-(T/C)T(A/G/C/T)GA(T/C)GA(T/C)GGCTGGTTT-3’；P2：5’-C(G/T)CCACAT(A/G)TC(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GT-3’)。以青霉菌F63总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到一约800bp片段，将该片段回收后测序。

根据测序得到的核甘酸序列设计反向PCR引物P3，P4(P3：5’-GCCGGGGCTCATTGCTCTCGC-3’；P4：5’—CGTCTGGGAACCGCTCAGGG-3’)。用限制性内切酶SalI酶切青霉F63基因组DNA，然后用T₄DNA连接酶使酶切片段自身环化，以此自身环化的DNA片段作为PCR反应的模板进行反向PCR扩增。通过反向PCR得到一个长3200bp的基因片段(图2)。扩增得到产物回收后测序。

实施例4 α-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析

提取青霉菌菌丝体的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计引物(Prgal1，5’-AAAGGTATGTATTTCCCGG-3’；Prgal2，5’-CTATTGCTTTTCCAACATCA-3’)扩增该单链cDNA，获得α-半乳糖苷酶的cDNA序列(图3)，扩增得到产物回收后测序。

通过比较α-半乳糖苷酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因没有内含子，GTG为其翻译起始密码子。该基因为2205bp，编码一个含有714个氨基酸的成熟α-半乳糖苷酶，以及一个含有21个氨基酸的信号肽。其中，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶的cDNA序列；SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为本发明成熟α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶的DNA序列；SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶信号肽的核苷酸序列；SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列为本发明α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列为本发明α-半乳糖苷酶信号肽的氨基酸序列。所测出的基因Agl1的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的α-半乳糖苷酶基因序列进行同源比较，最高同源性为69％，氨基酸序列最高同源性也为69.5％，证明从青霉菌(Penicillium sp)F63中分离克隆得到的编码α-半乳糖苷酶的基因为新基因。

实施例5 重组α-半乳糖苷酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码α-半乳糖苷酶的基因Agl1(SEQ ID NO：1)双酶切(SnaBI+NotI)，切出编码成熟α-半乳糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有青霉菌α-半乳糖苷酶基因Agl1的重组质粒pPIC-Agl1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Agl1。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于200mL YPD培养液中，30℃ 250rpm振然过夜培养，然后接种于发酵基本培养基于3L发酵罐中发酵。经过基础培养、碳源饲喂和诱导培养三个阶段共156h，重组α-半乳糖苷酶的表达量达到111U/mL。SDS-PAGE结果(图4)表明，重组α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的α-半乳糖苷酶经过HiTrap Q Sepharose FPLC之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上(图5)，说明本纯化方法是高效的。

实施例6 重组α-半乳糖苷酶的活性分析。

比色法：将PNPGal溶于0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，使其终浓度为20mM。将10uL酶液，90uL的去离子水和100uL20mM的PNPGal混合，摇匀。37℃温育5min后，反应液中加入2.8mL1M的Na₂CO₃溶液来终止反应。在405nm处测其OD值，并计算酶活。酶活(U/mL)单位定义：在pH4.5、37℃下每分钟分解PNPGal释放1μmol p-硝基酚所需的酶量被定义为一个酶活单位。

实施例7 重组α-半乳糖苷酶Agl1的最适pH及pH稳定性测定

将实施例5纯化的重组α-半乳糖苷酶Agl1在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0～7.5的乙酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～9.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的重组α-半乳糖苷酶Agl1在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果表明(图6)：重组α-半乳糖苷酶Agl1的最适pH为5.0，在pH4.2～7.0范围内，酶活性维持在75％以上，而在pH3.0以下，基本检测不到酶活性。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于常温下处理12h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明，本发明重组α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5之间保持最适pH下酶活的75％以上(图7)，说明本发明重组α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5有较好的稳定性。

实施例8 重组α-半乳糖苷酶Agl1酶反应最适温度及热稳定性

最适温度的测定在乙酸-磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明，重组α-半乳糖苷酶Agl1最适温度为45℃。在37℃～48℃范围内，酶活性维持在75％以上(图8)。

酶的热稳定性试验表明，在40℃下保温60min，剩余酶活性为61.1％。45℃下保温10min，剩余酶活性为8.4％。50℃保温2min，剩余酶活性为15.4％(图9)。试验结果说明，本发明重组α-半乳糖苷酶在40℃以下是稳定的。

实施例9 不同化学试剂对α-半乳糖苷酶Agl1酶活性的影响试验

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度为1mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明，只有Hg²⁺完全抑制本发明α-半乳糖苷酶活性，SDS、Cu²⁺对本发明α-半乳糖苷酶Agl1有明显的抑制作用。其余化学试剂对本发明α-半乳糖苷酶Agl1的酶促反应无显著影响(表2)。

表2 各种金属离子和化学试剂对α-半乳糖苷酶活性的影响

实施例10 本发明α-半乳糖苷酶Agl1的底物特异性试验

将蜜二糖、棉子糖和水苏糖用乙酸-磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲液溶解，浓度为1.0mg/mL。而瓜儿豆胶的浓度为3.0mg/mL。在酶反应最适温度和最适pH值下，用离子色谱CARBOPAC PA10测定实施例5所纯化的重组α-半乳糖苷酶对不同底物的作用。结果表明，本发明重组α-半乳糖苷酶Agl1对瓜儿豆胶没有活性。酶对底物的降解次序为蜜二糖(80.7％)>棉子糖(67.5％)>水苏糖(64.8％)(表3)。

表3 α-半乳糖苷酶Agl1对不同底物的作用

试验结果表明，本发明α-半乳糖苷酶能够有效的将蜜二糖、棉子糖或水苏糖酶解为D-半乳糖。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用

<130>p0897

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2142

<212>DNA

<213>Penicillium sp.

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2142)

<400>1

<210>2

<211>713

<212>PRT

<213>Penicillium sp.

<400>2

<210>3

<211>3216

<212>DNA

<213>Penicillium sp.

<400>3

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>Penicillium sp.

<400>4

<210>5

<211>234

<212>PRT

<213>Penicillium sp.

<400>5

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>Penicillium sp.

<400>6

Claims (8)

1.一种α-半乳糖苷酶，其特征在于：其是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，其特征在于：其是SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的重组酵母表达质粒。

4.按照权利要求3的重组酵母表达质粒，其特征是：所述的重组酵母表达质粒是pPIC9-Agl1；其中，所述Agl1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。

5.含有权利要求3或4所述重组酵母表达质粒的重组酵母菌株。

6.按照权利要求5的重组酵母菌株，其特征是：所述的重组酵母菌株是GS115/Agl1；其中，所述的Agl1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。

7.一种制备权利要求1所述的α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：

构建含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的重组酵母表达质粒；培养用该重组酵母表达质粒所转化的酵母细胞，得重组酵母菌株；培养重组酵母菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。

8.按照权利要求7的方法，其特征是：所述的重组酵母表达质粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重组酵母菌株为GS115/Agl1；其中，所述的Agl1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。

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