CN100494376C

CN100494376C - 一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN100494376C
Application number: CNB2005100217207A
Authority: CN
Inventors: 魏于全; 杨莉
Original assignee: Sichuan Enduoshi Bioengineering Technology Co Ltd; Sichuan University
Current assignee: Guizhou Bailing Group Pharmacy Co., Ltd.
Priority date: 2005-09-23
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2025-09-23
Also published as: CN1935999A

Abstract

本发明提供了一种将IL-2基因信号肽序列的3’端与人内皮抑素编码序列的5’端连接而成的新的重组人内皮抑素(endostatin)基因。并用该重组基因构建入腺病毒，将这种重组腺病毒制备成抗肿瘤注射剂。使用本发明提供的抗肿瘤注射剂，可以在体内抑制肿瘤的生长及转移，并且能使机体持续表达高水平的人内皮抑素并保持完整的生物活性，可以弥补蛋白输注的药物昂贵、体内稳定性差等局限，能降低用药成本、提高患者的生活质量，具有很好的市场前景。

Description

一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及到一种含重组人内皮抑素基因的腺病毒及其制备方法和用途。

背景技术

1971年，Folkman首次提出了肿瘤的生长及转移具有血管依赖性的观点。近几十年的研究不断证实了这一观点，肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤血管生成密切相关，血管生成是肿瘤生长与转移的一个重要控制点(Skobe et al.，1997；Dameron et al.，1994；Volpert et al.，1997；Bertolini et al.，2000；Holmgren et al.，1995)。肿瘤的抗血管生成治疗已成为肿瘤治疗的一个新的研究方向。

内皮抑素(endostatin)是O’Reilly等人于1997年发现的最为著名的内源性血管生成抑制因子，它是胶原XVIII的C-末端片段(来源于人的内皮抑素蛋白包含183个氨基酸，分子量大约为20kDa)。研究表明，内皮抑素蛋白在体外可以有效地抑制内皮细胞的生长及迁移，在体内可以抑制多种肿瘤模型的生长及转移。关于它抑制血管生成的作用机制研究也较多，现已发现内皮抑素可以通过以下几种途径抑制内皮细胞生长—与整合素V₁(integrin V₁)结合(Hamano et al.，2003)、抑制VEGF与受体的结合(Kim et al.，2002)、抑制Cyclin D1(Hanai et al.，2002)等。

目前认为血管生成抑制因子这一大类蛋白在治疗上存在多方面的局限：首先，由于其药代动力学特点，体外表达的蛋白分子不稳定，决定了蛋白输注是一个长期、反复、足量给药的过程，大用量和短期多次输注给病人带来了很大的不便；另外，蛋白纯化过程复杂费时、产量较低，成本高，临床应用限制较大。

作为第一个进入临床试验的内源性的血管生成抑制因子，EntreMed公司在美国已完成I期临床试验，正在进行II期临床试验。I期临床结果表明，人内皮抑素重组蛋白具有良好的耐受性，最大用药量(600mg/m²/天)也未显示明显的毒性，但静脉血中有效浓度持续时间十分短暂(仅为10.7小时)(Eder JP et al，2002；Herbst RS et al.，2002；Thomas JP et al.，2003)。如何在临床应用中长时间维持内皮抑素有效的血药浓度是其运用中的一个重要问题。

发明内容

本发明的一个方面是提供一种重组人内皮抑素(endostatin)基因，其特征在于：它是将IL-2基因信号肽序列的3’端与人内皮抑素编码序列的5’端连接而成，具有SEQID NO.1的核苷酸序列(见表1)。

表1 重组人内皮抑素基因(SEQ ID NO.1)

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAA

TTCGGCCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGC

CCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAG

GCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAG

GACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCA

AGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGC

TGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCA

CCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCG

AGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCT

CGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACA

TCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAG

本发明还提供了一种制备上述重组人内皮抑素基因的方法，该方法包括以下步骤：

a、合成下列PCR引物：

5’弓物(SEQ ID NO.2)：5’CGG ATC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT GTC TTG CAT TGC ACT AAG TCT TGC ACT TGT CAC GAA TTC GGC CCA CAGCCA CCG CGA CTT CCA GCC3’，其中下划线部分为IL-2基因信号肽序列；

3’引物(SEQ ID NO.3)：5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC3’；

b、将人内皮抑素编码序列和克隆载体构建成重组载体；

c、以该重组载体为模板，用步骤a合成的PCR引物扩增含IL-2基因信号肽的重组人内皮抑素基因。

本发明的第二个方面是提供了一种由上述的重组人内皮抑素基因所编码的重组人内皮抑素多肽。

进一步的，上述的重组人内皮抑素多肽是本发明重组人内皮抑素基因在真核细胞中表达得到的。

同时，本发明还提供了上述重组人内皮抑素多肽在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。

本发明的第三个方面是提供一种含有上述的重组人内皮抑素基因的重组载体，这些能携带本发明重组人内皮抑素基因的各种载体是本领域已知的，如：重组噬菌体、质粒和其他的经加工后可以含有本发明重组人内皮抑素基因序列的原核和真核载体。

优选的，所述载体是腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒。

更优选的，所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒。

本发明还提供了上述的重组载体在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。

本发明的第四个方面是提供了含有上述的重组人内皮抑素基因或上述的重组载体的宿主细胞。可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞，例如细菌、酵母、或者是动物细胞。

进一步的，上述的宿主细胞是真核细胞。

更进一步的，上述的所述宿主细胞是293细胞。

同时本发明还提供了上述的宿主细胞在制备含有重组人内皮抑素基因的重组载体中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种抗肿瘤注射剂，该注射剂是由上述的重组人内皮抑素多肽添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

本发明的第六个方面是提供一种抗肿瘤注射剂，该注射剂是由上述的重组载体添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

进一步的，上述的抗肿瘤注射剂是上述重组人内皮抑素腺病毒添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

再进一步的，每毫升的上述抗肿瘤注射剂含有1×10⁹-9×10¹¹IU重组人内皮抑素腺病毒和10-25mg蔗糖，pH值为7.5-8.5。

更进一步的，上述的重组人内皮抑素腺病毒是复制缺陷型的腺病毒。

根据本发明的第一个方面，以RT-PCR方法从人正常肝组织的总RNA中扩增人内皮抑素cDNA；然后将人内皮抑素编码序列和克隆载体pUC18构建成pUC18-endo；分别合成序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的PCR引物；以pUC18-endo为模板，用上述的PCR引物扩增本发明含IL-2基因信号肽的重组人内皮抑素基因。

根据本发明的第二个方面，能将本发明提供的重组人内皮抑素基因构建入各种常用的真核和原核载体以进行进一步的应用。

根据本发明的第三个方面，可通过下列方法制备本发明重组载体：将克隆到的重组人内皮抑素基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体，再与包含腺病毒基因组的质粒pAdenoVator ΔE1E3共转化大肠杆菌BJ5183，筛选出重组子，再转染293细胞，筛选出重组腺病毒。

根据本发明的第四个方面，可将本发明重组载体转入宿主细胞以扩增该重组载体或者用于大量分泌表达重组人内皮抑素多肽。

根据本发明的第五个方面，可将本发明提供的重组人内皮抑素多肽添加药学上可以接受的辅助性成分制备成注射剂，该注射剂能够抑制肿瘤的生长及转移。

根据本发明的第六个方面，可将本发明提供的重组载体添加药学上可以接受的辅助性成分制备成注射剂，该注射剂能够抑制肿瘤的生长及转移。而该注射剂可以通过以下方法制备得到：无菌条件下取注射用水，再加入原料重组人内皮抑素腺病毒1×10⁹-9×10¹¹IU/ml和蔗糖10～25mg/ml，在无菌条件下混合均匀，加缓冲液调节pH值至7.5-8.5后无菌过滤分装成注射剂，低温保存。

特别需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的重组基因、重组多肽、重组载体和抗肿瘤注射剂的具体技术方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术完成。

本发明重组人内皮抑素基因能够实现重组人内皮抑素多肽的分泌表达，含有该重组人内皮抑素基因的重组腺病毒能在感染真核细胞后使其大量稳定的分泌表达高活性的重组人内皮抑素多肽，在体外可以有效地抑制内皮细胞的生长及迁移。由本发明重组腺病毒制备成的抗肿瘤注射剂，在体内转染进肿瘤细胞后能够使机体长时间持续表达高水平的人内皮抑素并保持完整的生物活性，能有效抑制多种肿瘤的生长及转移。本发明抗肿瘤注射剂可以弥补蛋白输注的药物昂贵、体内稳定性差等缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻患者经济负担并提高患者的生活质量，具有很好的市场前景。

附图说明

图1 RT-PCR产物的电泳图谱(1％ Agarose电泳)，其中：M为1kb DNA ladder(GBICO)，C表示阴性对照，1表示加1ul模板RNA，2表示加2ul模板RNA。

图2 PCR产物的电泳图谱(1％ Agarose电泳)，其中：M为100bp DNA ladder(GBICO)，1：pUC18-endo为模板

图3 pAd-endo的酶切鉴定结果(Pac I)(1％Agarose电泳)，其中M为分子量标准；1、3、4、6、10、11、15分别为筛选出的单克隆的编号

图4 PCR扩增鉴定重组腺病毒(P1+P2)(1％ Agarose电泳)其中，M为100bp PCR MolecularRuler(Bio-Rad)，C为阳性对照(pAd-endo)，1-6分别表示1-6号空斑。

图5 PCR扩增鉴定重组腺病毒(P3+P4)(1％ Agarose电泳)，其中：M表示100bp PCRMolecular Ruler(Bio-Rad)；C1表示阴性对照(pAdenoVator-endo)；C2表示阳性对照(pAd-endo)；1-6分别表示1-6号空斑

图6 不同细胞株的Western Blot鉴定结果，其中：细胞系(cell line)A549为人肺癌细胞株A549、HeLa为人***细胞株HeLa、HepG2为人肝癌细胞株HepG2、COS-7为非洲绿猴肾细胞COS-7，M为分子量标准。

图7 体外内皮细胞(HU-VEC)抑制实验，其中NS为对照组，ADE为重组样品组，ADC为空载病毒组(Ad-Null)。

图8 (图中的纵坐标和横坐标应该为中文)肿瘤生长的抑制曲线，其中：NS为空白对照组，ADC为腺病毒空载体组(Ad-Null)(1×10⁹IU/只)、ADE1为重组人内皮抑素腺病毒组(5×10⁸IU/只)、：ADE2为重组人内皮抑素腺病毒组(1×10⁹IU/只)、ADE3为重组人内皮抑素腺病毒组(5×10⁹IU/只)。

图9 对照组、空载体组及Ad-E2组的荷瘤小鼠(A)及剥离出的肿瘤(B)照片，其中：a为对照组，b为空载体组，c为：ADE2(重组人内皮抑素腺病毒组1×10⁹IU/只)。

图10 肺部转移肿瘤计数结果，其中：NS为空白对照组，ADC为腺病毒空载体组(Ad-Null)(1×10⁹IU/只)、ADE1为重组人内皮抑素腺病毒组(5×10⁸IU/只)、ADE2为重组人内皮抑素腺病毒组(1×10⁹IU/只)、ADE3为重组人内皮抑素腺病毒组(5×10⁹IU/只)。

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

具体实施方式

实施例1 人内皮抑素基因的制备

本实施例用RT-PCR方法从人肝脏的总RNA中扩增人内皮抑素cDNA片段。

根据人内皮抑素基因序列设计并合成RT-PCR引物，为了能将PCR产物直接***克隆载体—pUC18(购自Invitrogen公司)，在5’引物和3’引物中均设计入BamH I酶切位点，引物序列如下：

5’引物：5’CGG GAT CCA CAG CCA CCG CGA CTT CCA GCC 3’

3’引物：5’GCG GAT CCTACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’

RT-PCR条件如下：

RT-PCR反应混合物在50℃变性30分钟后，按下列条件进行反应：

逆转录反应：94℃变性30秒；50℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应10个循环。

PCR反应：94℃变性30秒；52℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应25个循环。然后68℃再延伸12分钟。

反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，结果表明扩增出与预期片段大小一致的570bp左右的DNA片段(见图1)。经测序，表明所得到重组质粒中的目的基因与发表的人内皮抑素基因序列完全一致。

实施例2 含人IL-2基因信号肽编码的人内皮抑素基因的制备

参考人IL-2的cDNA序列(GI：28178860)，设计并合成PCR引物如下：

5’引物：5’CGG ATC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT GTC TTG CAT TGCACT AAG TCT TGC ACT TGT CAC GAA TTC GGC CCA CAG CCA CCG CGA CTTCCA GCC 3’

3’引物：5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’

在5’引物和3’引物中均设计入BamH I酶切位点，直接***穿梭载体pAdenovator-CMV5；其中5’引物的斜体部分为人IL-2的信号肽序列。

然后以pUC18-endo为模板扩增含IL-2基因信号肽的人内皮抑素DNA片段，PCR条件如下：

94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸30秒。反应30个循环。然后72℃再延伸12分钟。

反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(结果见图2)，得到了预计大小(630bp左右)的DNA片段。按产品操作手册将其***穿梭质粒pAdenoVator-CMV5(购自Qbiogene公司)，测序结果表明所得到含IL-2基因信号肽的人内皮抑素DNA片段与预计的完全一致。

实施例3 重组腺病毒的构建及筛选

1、将克隆到的包含人IL-2信号肽的人内皮抑素基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体后，再与包含腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorΔE1E3(购自Qbiogene公司)用常规的电穿孔方法共转化大肠杆菌BJ5183(购自Qbiogene公司)，筛选重组子—pAd-endo，进行鉴定。结果表明分别筛选到了具有两种重组位点的重组子pAd-endo(1)和pAd-endo(3)(见图3)。其中同源重组位点位于左臂的切出3.0kb的片段，重组位点位于复制子的切出大小为4.5kb的片段。

2、使用常规共转染方法将线性化的重组质粒pAd-endo与脂质体Lipofectamine(购自Invitrogen公司)共转染293细胞(购自ATCC)，筛选重组腺病毒Ad-E。14天后，挑取6个边界清晰，与其它空斑分隔较开的空斑，进行扩增。

3、抽提腺病毒DNA，通过PCR扩增人内皮抑素DNA片段鉴定是否为重组腺病毒，同时鉴定腺病毒特征性的E2B区片段。

其中，扩增人内皮抑素DNA片段的引物为：

5’引物(P1)：5’CGG GAT CCA TGT ACA GGA TGC AAC TCC TG 3’

3’引物(P2)：5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’

扩增腺病毒特异性的E2B区的引物为：

5’引物(P3)：5’TCG TTT CTC AGC AGC TGT TG 3’

3’引物(P4)：5’CAT CTG AAC TCA AAG GGT GG 3’

经鉴定，挑取的空斑均***人内皮抑素(630bp左右的条带，见图4)；挑取的空斑均扩增出腺病毒E2B阳性条带(860bp左右，见图5)。

4、用筛选到的病毒感染A549细胞，取培养上清用常规ELISA方法鉴定人内皮抑素的表达情况，表达结果见表2。

表2 各空斑内皮抑素的表达情况

从测定结果看来，pAd-endo(1)各个克隆的表达均略高于pAd-endo(3)，说明同源重组位点位于左臂的更有利于内皮抑素基因的表达。选择表达最高的空斑Ad-E(1)-6#，命名为Ad-E。

实施例4 重组腺病毒的扩增和纯化

将Ad-E病毒种子液逐级扩增，最终感染5×10⁶个293细胞，培养48～72小时直至出现完全CPE，离心收集细胞，细胞沉淀重悬于100ml含5％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基，-20℃/37℃反复冻融三次，离心去细胞碎片，上清即为病毒裂解液，备用。

采用常规两步CsCl密度梯度超离心法纯化Ad-E，第一步采用不连续CsCl梯度去除大部分的细胞碎片以及缺陷的病毒颗粒(即不具备感染活性的病毒颗粒)，第二步采用连续CsCl密度梯度彻底将具备感染活性的病毒颗粒与缺陷的病毒颗粒区分开，最后再通过透析脱盐，去除CsCl，得到重组人内皮抑素腺病毒—Ad-E。

实施例5 重组腺病毒Ad-E对不同细胞的感染活性及Western Blot鉴定

分别将人肺癌细胞株A549、人***细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、非洲绿猴肾细胞COS-7(购自ATCC)接种于6孔板，将实施例4所得的重组人内皮抑素腺病毒以不同的MOI值(multiplicity of infection，感染复数)：0，5，10，20，40，80进行感染，培养48小时后，取上清液用试剂盒(购自Chemicon)检测内皮抑素的表达情况，结果见表3。

表3 不同细胞感染不同量的Ad-E的表达情况

结果表明，重组腺病毒Ad-E能感染包括肺癌、肝癌、子宫内膜癌等多种细胞类型，表达并分泌人内皮抑素，说明Ad-E具有较广谱的感染范围及较高的表达活性。

同时以羊抗人内皮抑素抗体(1:250)(购自R&D Systems)为一抗、HRP-Protein A(购自Bio-Rad)为二抗(1:3000)，用常规Western Blot法进一步鉴定表达产物是否与预计的相同。

结果表明结果见图6，四种不同的细胞株中均特异地表达人内皮抑素蛋白，杂交条带与预计的一致(20kDa左右)。

实施例6 重组人内皮抑素腺病毒抗肿瘤注射剂的制备

在无菌条件下取500ml注射用水，加入实施例4所得的重组人内皮抑素腺病毒Ad-E(1×10¹³IU)、Tris0.484g、MgCl₂0.076g、蔗糖16g，混合均匀，再加注射用水至总体积1000ml，同时用HCl调节pH值至8.0。无菌过滤后分装成1ml/支的重组腺病毒Ad-E注射剂，于—20℃保存。

以下通过试验例的方式对本发明的有益效果做进一步详述，但不应理解为是对本发明的限制。

实验例1 重组腺病毒Ad-E的体外活性测定——抑制血管内皮细胞的增殖

1、实验方法

从新鲜胎儿脐带(由四川大学第二医院提供)中分离培养HU-VEC细胞，按5000个/孔接种于明胶包被的96孔板，分别加入20μl倍半稀释的Ad-E和Ad-Null(空载腺病毒)的感染上清液，再加入80μl M199培养液(含5％FBS，3ng/ml bFGF)培养；培养72小时后每孔加入MTT至终浓度0.5mg/ml，37℃孵育4小时；吸出上清，加入二甲亚砜(DMSO)100μl，室温振摇5-10分钟后，在酶标仪上读取A550nm值。

按下列公式计算内皮抑素对HU-VEC细胞增殖的抑制率：

2、实验结果

结果表明(见图7)内皮抑素浓度与抑制率之间存在剂量依从性，在1:8稀释浓度时内皮细胞抑制率达到50％(ED50)；Ad-Null(ADC)感染上清则无抑制效应。这说明了Ad-E表达的内皮抑素在体外的确可以显著地抑制血管内皮细胞的增殖。

实验例2.重组腺病毒Ad-E抗肿瘤注射剂的体内活性测定——抑制肿瘤的生长及转移

1、实验方法

本实验采用肺癌模型对实施例6制备的抗肿瘤注射剂抑制肿瘤生长及转移的效果进行测定。

选取50只生长健壮的雌性裸鼠(6-8周龄裸鼠(16-20g)，购自四川大学华西实验动物中心)，每只接种8×10⁶A549/100μl于腋下，直至肿瘤直径长至2～3mm，随机分为5组，分别为空白对照组(NS)、腺病毒空载体组(Ad-Null)(1×10⁹IU/只)、重组人内皮抑素腺病毒组ADE-1(5×10⁸IU/只)、ADE-2(1×10⁹IU/只)、ADE-3(5×10⁹IU/只)。每组分别于肿瘤内多点注射Ad-E注射剂或对照试剂，共四次(治疗第0、5、10，15天)。每隔3天用游标卡尺测量肿瘤长、宽，肿瘤体积按以下方法计算：体积(mm³)＝0.52×长(length)×宽²(width²)。肿瘤生长抑制用方差分析，P<0.05则认为有统计学意义。

观察四个月结束后，取肿瘤组织及器官，称取肿瘤重量及肺湿重，计数肺转移结节。

2、实验结果

a、实验期间各组均未观察到明显的毒副反应。在给药两周内治疗组Ad-E肿瘤生长减慢甚至缩小，而Ad-Null及对照组肿瘤生长较快，且没有明显差异；观察四个月后治疗组中肿瘤抑制率均大于40％(P<0.05)(见图8)。图9显示了三个不同组——对照组、空载体组及Ad-E2治疗组的荷瘤小鼠及肿瘤的情况对比。

b、同时，对照组中有全身***及肝、脾、肺转移。治疗组间肿瘤体积无显著性差异，但对照组肺转移率(>70％)明显高于治疗组(<40％)(P<0.05)；对照组肺湿重及肺转移结节数多于治疗组(P<0.05)。肺转移数与治疗剂量呈负相关(图10)，其中ADE3组发生肺转移及转移结节数最少(P<0.05)。

以上结果表明，在人肺癌模型中Ad-E能有效抑制肿瘤的生长及转移。

综上，由本发明重组人内皮抑素基因构建的重组腺病毒能感染多种肿瘤细胞，并大量稳定地分泌表达高活性的重组人内皮抑素多肽，在体外可以有效地抑制内皮细胞的生长及迁移。由本发明重组腺病毒制备的抗肿瘤注射剂，能使机体持续高水平的表达具有完整生物活性的重组人内皮抑素多肽，从而能在体内抑制肿瘤的生长及转移。在以上实例中每5天注射一次都能有很好的抗肿瘤效果，这增大给药时间的间隔、弥补了蛋白输注人内皮抑素药物体内稳定性差、有效浓度持续时间十分短暂(仅为10多个小时)的局限，能大大减少给药量、降低用药成本、减轻患者负担，同时还提高了患者的生活质量，具有很好的市场前景。

同时由本领域常识可知，若有不同的要求，本发明的抗肿瘤注射剂中重组腺病毒的用量可以在一个较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径等很容易地加以确定。

以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。

一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

成都恩多施生物工程技术有限公司

<120>一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途

<130>3408

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>615

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>重组人内皮抑素基因

<400>1

<210>2

<211>93

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>5’引物

<400>2

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>3’引物

<400>3

Claims

1、一种重组人内皮抑素基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2、一种重组内皮抑素多肽，其特征在于：它是由权利要求1所述的重组人内皮抑素基因编码。

3、根据权利要求2所述的重组内皮抑素多肽，其特征在于：它是由权利要求1所述的重组人内皮抑素基因编码并在真核细胞中表达得到。

4、一种重组载体，其特征在于含有如权利要求1所述的重组人内皮抑素基因。

5、根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述的载体为腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒。

6、根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。

7、一种含有权利要求1所述重组人内皮抑素基因的宿主细胞。

8、一种含有权利要求4至6任一项所述重组载体的宿主细胞。

9、根据权利要求7或8所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为真核细胞。

10、一种抗肿瘤注射剂，其特征在于：它是由权利要求2或3所述的重组人内皮抑素多肽添加药学上可以接受的辅料制备而成的。

11、一种抗肿瘤注射剂，其特征在于：它是由权利要求4至6任一项所述的重组载体添加药学上可以接受的辅料制备而成的注射剂。

12、根据权利要求11所述的抗肿瘤注射剂，其特征在于：每毫升含有1×10⁹-9×10¹¹IU重组人内皮抑素腺病毒和10-25mg蔗糖，pH值为7.5-8.5。

13、一种制备权利要求1所述的重组人内皮抑素基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、分别合成如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR引物；

b、将人内皮抑素编码序列和克隆载体pUC18构建成pUC18-endo；

c、以pUC18-endo为模板，用步骤a合成的PCR引物扩增含IL-2基因信号肽的重组人内皮抑素基因。

14、一种制备权利要求6所述重组载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、将权利要求1所述重组人内皮抑素基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体；

b、将步骤a所得载体与包含腺病毒基因组的质粒pAdenoVatorΔE1E3共转化大肠杆菌，筛选出重组子；

c、将b步骤所得重组子再转染293细胞，扩增制备重组腺病毒。

15、一种制备权利要求12所述的抗肿瘤注射剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、在无菌条件下取注射用水，再按以下配比加入原料：重组人内皮抑素腺病毒1×10⁹-9×10¹¹IU/ml、蔗糖10～25mg/ml；

b、在无菌条件下将步骤a产物混合均匀，加缓冲液调节pH值至7.5-8.5；

c、将步骤b产物无菌过滤后分装成注射剂，低温保存。

16、权利要求2或3所述的重组人内皮抑素多肽在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。

17、权利要求4至6任一项所述的重组载体在制备抗肿瘤药物组合物中的应用。

18、权利要求8或9所述的宿主细胞在制备含重组人内皮抑素基因的重组载体中的应用。