CN100480381C - 硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖 - Google Patents

Abstract

本发明提供分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的3种酶、该酶的制备方法、该酶的活化因子、硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖及其分解物、新型微生物。

Description

硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖

技术领域

本发明涉及对于生产用于分解褐藻类含有的多种硫酸化多糖的酶有用的新型细菌、在糖链学(glycotechnology)领域有用的分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖(sulfated glucuronofucan)的酶、该酶的制备方法、活化该酶的各种因子、以及作为糖链学用试剂有用的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖(sulfated glucuronofucanoligosaccharide)及它们的制备方法。

背景技术

褐藻类含有多种硫酸化多糖。例如，已知①仅由岩藻糖和硫酸基构成的硫酸化岩藻聚糖，②含有葡糖醛酸、甘露糖、岩藻糖和硫酸基的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，例如WO97/26896号公报记载的含硫酸化岩藻糖的多糖-U(构成糖及其摩尔比为岩藻糖:甘露糖:半乳糖:糖醛酸:硫酸基＝约10:7:4:5:20，以下称为U-岩藻依聚糖)，③由岩藻糖、半乳糖构成的硫酸化岩藻半乳聚糖，例如PCT/JP00/00965号说明书中记载的硫酸化岩藻半乳聚糖(构成糖及其摩尔比为岩藻糖:半乳糖＝1:1～6，以下称为G-岩藻依聚糖)等含有硫酸化岩藻糖的多糖。

这些多糖总称为岩藻依聚糖或岩藻多糖，其结构大多根据作为来源的海藻而不同。例如，已知分别由墨角藻、海带、冲绳海蕴、海蕴或裙带菜提取的硫酸化多糖具有不同的结构。而且，这些含有硫酸化岩藻糖的多糖由于几乎均为高分子的阴离子，因此在各种纯化步骤中理化性状相同，难以分离。因此，多数情况下不分别分离褐藻类的含有硫酸化岩藻糖的多糖，直接考察生物活性。例如，有报道指出硫酸化岩藻聚糖级分具有很强的抗凝血活性，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级分对癌细胞具有诱导细胞程序死亡的活性。但是，难以确定具有所发现的生物活性的物质是哪一种含有硫酸化岩藻糖的多糖。

作为药物开发这种具有生理活性的硫酸化多糖时，必须确定其化学结构。因此，分解具有生理活性的硫酸化多糖的酶变得很必要。另外，即使是由上述硫酸化多糖得到低聚糖的场合，也有必要获得分解上述各种硫酸化多糖的酶。

但是，分解褐藻类的硫酸化多糖的酶没有市售，而且褐藻类的硫酸化多糖大多根据海藻的种类而不同，因此确定1种硫酸化多糖的结构时，特异地分解该硫酸化多糖的分解酶是必要的。例如，为了得到分解特定的硫酸化多糖的酶，大多是筛选利用该硫酸化多糖作为资源的微生物。这时，分离利用特定的硫酸化多糖作为资源的微生物，进行鉴定，研究培养条件，能够有效生产硫酸化多糖分解酶，但是分离、鉴定需要很长的时间。另外，1种微生物利用1种以上硫酸化多糖作为资源的实例较少，至于跨越若干目或科的利用褐藻类的硫酸化多糖作为资源的微生物更是几乎不知道。

因此，期望使用已经鉴定的分离菌生产硫酸化多糖分解酶，或者由一种菌株生产几种硫酸化多糖分解酶。

另外，在最近关于冲绳海蕴的硫酸化多糖的研究中，报道了该多糖抑制胃溃疡病因微生物幽门螺杆菌对胃粘膜的附着，可以使用该多糖和成纤维细胞增殖因子的复合体作为成纤维细胞增殖促进剂，通过口服给予该多糖能够预防细菌和病毒等引起的感染等。因此，对于与冲绳海蕴有关的生理活性以及来源于冲绳海蕴的硫酸化多糖的化学结构的关系进行研究。例如，对于该多糖有2篇报道，一篇是Glycoconjugate Journal，第16卷，19-26页(1999)记载的岩藻糖:葡糖醛酸:硫酸基:乙酰基的摩尔比为6.1:1.0:2.9:1且分子量为约56000的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，另一篇是应用糖质科学，第43卷，143-148页(1996)记载的岩藻糖:葡糖醛酸:木糖:硫酸基:乙酰基的摩尔比为3～4:0.8～1.2:0.1～0.3:0.8～1.2:0.5～1且分子量为约50万～60万的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。但是，现在也只不过是通过物理化学分析明确了其平均结构。

另外，为了开发药品等有必要得到结构保持均一的低聚糖，但是由例如来源于冲绳海蕴的硫酸化多糖得到结构保持均一的低聚糖很困难。

根据上述情况，需求分解多种来源于褐藻类的硫酸化多糖的微生物，特异地分解来源于冲绳海蕴的硫酸化多糖即硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的酶，以及利用酶制备的结构均一的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。

发明目的

本发明的目的在于提供分解多种来源于褐藻类的硫酸化多糖的新型微生物、对糖链学有用的分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的3种酶、该酶的制备方法、以及使该酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用得到的低分子化物及其制备方法、以及硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解酶的活化因子。

发明概述

本发明人进行了悉心研究，结果成功地分离了具有利用来源于多种褐藻类的多种硫酸化多糖作为资源的能力的细菌，命名为Fucophilus属。另外，也发现属于Fucophilus属的细菌的1个菌株即Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株生产3种硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解酶，即岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及内切-α-L-岩藻糖苷酶。另外，还发现了这些酶的制备方法。而且，还发现氯化钠、钙盐以及蛋白质对于有效利用这些酶有用。另外，还发现了可以用作糖链学用试剂的利用酶制备的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、结构均一的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖及其制备方法，从而完成了本发明。

也就是说，本发明的第1项发明涉及岩藻依聚糖脱乙酰酶，其特征在于具有下述理化性质。该酶能够作用于硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，水解乙酰基，使乙酸游离，最适pH在约6～9.1的范围，最适温度在约23～45℃的范围。

本发明的第2项发明涉及α-D-葡糖醛酸酶，其特征在于具有下述理化性质。该酶能够作用于脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，水解α-D-葡糖醛酸键，使D-葡糖醛酸游离，最适pH在约5.8～7.8的范围，最适温度在约14～29℃的范围。

本发明的第3项发明涉及内切-α-L-岩藻糖苷酶，其特征在于具有下述理化性质。该酶能够作用于脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，内切地水解α-L-岩藻糖苷键，生成还原性末端具有L-岩藻糖的低聚糖，最适pH在约4.5～7.5的范围，最适温度在约23～42℃的范围。

在本发明的第1～第3项发明中，岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶或内切-α-L-岩藻糖苷酶能够通过培养具有该酶的生产能力的微生物，并由其培养物采集该酶进行制备。

本发明的第4项发明涉及脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，使本发明的第1项发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上乙酰基得到的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

本发明的第5项发明涉及通过本发明的第4项发明的方法得到的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐。

本发明的第6项发明涉及脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，使本发明的第2项发明的α-D-葡糖醛酸酶对脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，采集除去了至少1分子以上葡糖醛酸残基得到的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

本发明的第6项发明中，脱葡糖醛酸化可以在氯化钠、钙盐和/或蛋白质共存的条件下进行。

本发明的第7项发明涉及通过本发明的第6项发明的方法得到的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐。

本发明的第8项发明涉及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备方法，其特征在于，使岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，并采集。这时，可以使岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶同时作用，也可以按照岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶、内切-α-L-岩藻糖苷酶的顺序使之作用。

本发明的第9项发明涉及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备方法，其特征在于，使α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶对通过碱处理脱乙酰化得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，并采集。这时，可以使α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶同时作用，也可以首先使α-D-葡糖醛酸酶作用后，再使内切-α-L-岩藻糖苷酶作用。

本发明的第8和第9项发明中，可以在氯化钠、钙盐和/或蛋白质共存的条件下进行。

本发明的第10项发明涉及通过本发明的第8～第9项发明的方法得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖或其盐。

本发明的第11项发明涉及具有选自下述通式(I)～(III)的化学结构的糖化合物或其盐。

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO。另外，n为0或1以上的整数)。

本发明的第12项发明涉及硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，其特征在于具有下述理化性质。该硫酸化多糖可以例举作为构成糖含有岩藻糖和葡糖醛酸，其摩尔比为35～44:10，并以下述通式(VIII)表示的硫酸化糖作为构成糖的必需成分的硫酸化多糖。

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO)。

本发明的第12项发明中，上述通式(VIII)中的n优选在1～5000的范围。

本发明的第13项发明涉及具有利用来源于褐藻类的多种硫酸化多糖作为资源的能力的Fucophilus属细菌。

本发明的第13项发明中，该Fucophilus属细菌包括电子传递链具有甲萘醌，且GC含量为约50％的细菌。另外，还包括具有16S核糖体DNA的细菌，所述16S核糖体DNA具有与序列表中序列号3记载的16S核糖体DNA的碱基序列具有90％以上同源性的碱基序列。没有特别的限定，可以例举Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株(FERMP-17517)。

附图说明

图1是表示本发明得到的岩藻依聚糖脱乙酰酶的pH和相对活性(％)的关系的图。

图2是表示本发明得到的岩藻依聚糖脱乙酰酶的温度(℃)和相对活性(％)的关系的图。

图3是表示本发明得到的α-D-葡糖醛酸酶的pH和相对活性(％)的关系的图。

图4是表示本发明得到的α-D-葡糖醛酸酶的温度(℃)和相对活性(％)的关系的图。

图5是表示本发明得到的内切-α-L-岩藻糖苷酶的pH和相对活性(％)的关系的图。

图6是表示本发明得到的内切-α-L-岩藻糖苷酶的温度(℃)和相对活性(％)的关系的图。

图7是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)的¹H-NMR波谱的图。

图8是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)的¹³C-NMR波谱的图。

图9是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)的质谱的图。

图10是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(2)的质谱的图。

图11是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的¹H-NMR波谱的图。

图12是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的¹³C-NMR波谱的图。

图13是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的质谱的图。

图14是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(4)的质谱的图。

图15是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(5)的¹H-NMR波谱的图。

图16是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(5)的¹³C-NMR波谱的图。

图17是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(5)的质谱的图。

图18是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(6)的质谱的图。

图19是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(7)的¹H-NMR波谱的图。

图20是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(7)的¹³C-NMR波谱的图。

图21是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(7)的质谱的图。

图22是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(8)的质谱的图。

图23是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(3)的¹H-NMR波谱的图。

图24是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(3)的¹³C-NMR波谱的图。

图25是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(3)的质谱的图。

图26是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(5)的¹H-NMR波谱的图。

图27是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(5)的¹³C-NMR波谱的图。

图28是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化物——低聚糖2-(5)的质谱的图。

图29是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(3)的¹H-NMR波谱的图。

图30是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(3)的¹³C-NMR波谱的图。

图31是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(3)的质谱的图。

图32是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(4)的¹H-NMR波谱的图。

图33是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(4)的¹³C-NMR波谱的图。

图34是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(4)的质谱的图。

图35是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(5)的¹H-NMR波谱的图。

图36是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(5)的¹³C-NMR波谱的图。

图37是表示本发明得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化物——低聚糖3-(5)的质谱的图。

发明详述

以下，具体说明本发明。

本说明书中属于Fucophilus属的细菌只要是能够利用来源于褐藻类的多种硫酸化多糖作为资源的细菌即可，例如适于使用能够分别利用1种以上来源于龙目(Kjellmaniella crassifolia Miyabe)、海带(Laminaria japonica Areschoug)、裙带菜(Undariapinnatifida(Harvey)Suringar)、海蕴(Nemacystus decipiens(Suringar)Kuckuck)、冲绳海蕴(Cladosiphon okamuranusTokida)、黑巨藻(Lessonia nigrescens)、墨角藻(Fucusvesiculosus)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)等褐藻类的硫酸化多糖作为资源的细菌。本发明中，所谓“利用......作为资源”是指生物将添加到培养基中的物质直接或者低分子化后摄取到生物体内的过程，或者通过代谢转变为其他物质的过程。本说明书中，能够生产将来源于上述褐藻类的硫酸化多糖低分子化的酶的微生物包含在能够利用来源于褐藻类的硫酸化多糖作为资源的微生物中。本发明的Fucophilus属细胞是不可能仅仅通过以前的细菌学分类方法鉴定的细菌，有必要将分子遗传学上分类的方法，例如基于与16S核糖体DNA(rDNA，编码核糖体RNA的DNA)的碱基序列的同源性进行分类的方法与以前的方法组合使用。也就是说，本发明的Fucophilus属细菌包括细菌学上分类于Fucophilus属的细菌，以及其16S rDNA碱基序列与本说明书中公开的Fucophilus属细菌的16S rDNA碱基序列具有约90％以上的同源性的细菌。16S rDNA的碱基序列的同源性解析例如可以利用互联网上的国际生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)主页上能够利用的AdvancedBLAST search。

作为上述Fucophilus属细菌没有特别的限定，例如适于使用本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株。该Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株是本发明人由海参消化管内容物新检索得到的细菌，其细菌学性质如下所述。

a.形态学性质

本细菌是直径1.2～1.6μm的球菌。

孢子的有无           无

革兰氏染色性         阴性

b.生理学性质

(1)繁殖温度          在25℃下繁殖。

(2)对氧的态度        好氧性

(3)过氧化氢酶        阳性

(4)氧化酶            阴性

(5)盐类需求性：

在0％食盐培养基上的繁殖    阴性

在1％食盐培养基上的繁殖    阴性

在海水培养基上的繁殖       阳性

(6)醌类              甲萘醌7

(7)菌体内DNA的GC含量           52％

(8)OF-试验          不生成酸

(9)菌落的色调       不生成特征性菌落色素

(10)运动性          阴性

(11)滑行性          阴性

(12)鞭毛            无

本菌株按照Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，第9卷(1994)记载的基本分类属于第4组(革兰氏阴性好氧性杆菌和球菌)。但是本菌株在电子传递链上具有甲萘醌7且GC含量为52％，在这点上与属于第4组的细菌不同。因此，为了确定本菌株的16S rDNA的碱基序列，使用具有序列表中序列号1和2记载的碱基序列的引物以及TaKaRa PCR Amplification Kit，扩增16S rDNA区域，按照常规方法解析该扩增片断的碱基序列。该16S rDNA的碱基序列如序列表中序列号3所示。对于序列表中序列号3的碱基序列，比较与已知细菌的同源性，结果不存在与16S rDNA的整个区域(约1500个碱基)显示约90％以上同源性的已知菌株。因此，本发明人断定本菌株是不属于已知属的新属的细菌，并将本菌株命名为Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株。另外，上述Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株根据布达佩斯条约于平成11年8月18日(原保藏日)以保藏号FERM BP-7495保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心〔日本国茨城县つくば市东1丁目1番地l中央第6(邮便番号305-8566)〕。

实际上，没有特别的限定，例如以来源于龙目(Kjellmaniellacrassifolia Miyabe)、海带(Laminaria japonica Areschoug)、裙带菜(Undaria pinnatifida(Harvey)Suringar)、黑巨藻(Lessonianigrescens)、黑菜(Ecklonia maxima)等属于海带目(Laminariales)的褐藻类，或海蕴(Nemacystus decipiens(Suringar)Kuckuck)、冲绳海蕴(Ciadosiphon okamuranusTokida)等属于索藻目(Chordariales)的褐藻类，或墨角藻(Fucusvesiculosus)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)等属于岩藻目(Fucales)的褐藻类的各种硫酸化多糖作为基质培养上述Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株，则培养基中的各种硫酸化多糖被利用，而且如果将该菌体提取液与各种硫酸化多糖混合，则明显可见硫酸化多糖的低分子化。

本发明的Fucophilus fucoidanolyticus 1234株是具有下述能力的微生物，即利用来源于上述褐藻类的多种硫酸化多糖作为资源的能力、分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的能力以及生产本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的能力。

本说明书中，硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖是主要含有岩藻糖和葡糖醛酸作为构成糖且摩尔比为35～44:10的硫酸化多糖，已知具有乙酰基。作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，例如岩藻糖和葡糖醛酸及乙酰基的摩尔比为4:1:0.5的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。另外，平均分子量例如按照HPLC凝胶过滤法为约100万(分子量分布为约10万～200万)。

本说明书中，硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的结构如下述通式(VIII)所示。上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖包括下述通式中n为1以上的整数，例如1～5000的范围，更优选1～1000的范围的物质。另外，只要在上述范围内，具有下述通式(VIII)连续重复的结构的物质以及具有中间存在其它结构非连续地含有下述通式(VIII)的结构的物质均包括在上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖中。

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO。)

另外，上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分子量、糖组成以及硫酸基含量根据该硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的原料的收获期、该原料的干燥方法、该原料的保存方法、提取硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖时的加热条件或pH条件等而不同。例如有时用酸水解该硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。因此，本说明书中记载的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分子量、分子量分布、糖组成或硫酸基含量只不过是其中1个例子，根据该硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的提取处理条件能够容易地改变其分子量、分子量分布、糖组成或硫酸基含量。例如，如果采用pH6.0、95℃、2小时的提取方法由冲绳海蕴进行提取，则能够得到具有上述糖组成和分子量的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。也就是说，根据制备方法的条件，可以制备任意分子量、分子量分布、糖组成或硫酸基含量的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。例如，上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的主要构成糖每4个岩藻糖就含有约2个硫酸基残基，一般情况下通过酯键结合在糖上的硫酸基在化学上不稳定，容易被酸、碱或热切断。例如，如果在酸性或碱性条件下进行加热处理，其硫酸含量或乙酰基含量则会减少。也就是说，能够由硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖有意图地进行脱硫酸或脱乙酰化。另外，脱硫酸或脱乙酰化时，如果调整酸或碱的种类或浓度、加热处理时的温度或时间，则能够调整切断的硫酸基或乙酰基的量。没有特别的限定，例如用约0.5～1N氢氧化钠溶液在25℃处理24小时得到的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖适于用作本发明的α-D-葡糖醛酸酶或内切-α-L-岩藻糖苷酶的底物。

因此，本说明书的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖只要是具有上述特征的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或者用本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解酶进行低分子化得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，包括所有来源于褐藻类的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。其来源没有特别的限定，例如冲绳海蕴、石海蕴(Sphaerotrichia divaricata(Agardh)Kylin)、顶毛藻(Eudesme viescens(Carmichael)J.Agardh)、面条藻(Tinocladia crassa(Suringar)Kylin)等索藻科(Chordariaceae)的褐藻类中硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的含量高，适于作为原料。

例如来源于冲绳海蕴的硫酸化多糖的主链由L-岩藻糖构成，该L-岩藻糖与一般的糖相比对酸不稳定，因此认为在pH3.0或利用0.2N盐酸进行提取时，会发生硫酸化多糖的低分子化。也就是说，来源于冲绳海蕴的硫酸化多糖也和其它以硫酸化L-岩藻糖为主要构成糖的多糖同样，通过加热或酸处理容易低分子化。

本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖在分子中具有硫酸基和/或羧酸基，该基团与各种碱反应形成盐。本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖成盐的状态稳定，通常以钠和/或钾和/或钙等盐的形态提供。这些物质的盐可以通过利用Dowex 50W等阳离子交换树脂，获得游离的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。另外，这些物质也可以根据需要进行公知惯用的盐交换，交换成所需的各种盐。

作为本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的盐，可以使用药学上允许的盐，例如钠、钾等碱金属，钙、镁、锌等碱土金属、铵等的盐。

制备本发明使用的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖时，首先得到褐藻类的水溶性级分提取液。这时，为了防止硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的低分子化，优选在pH4～9、温度100℃以下得到水溶性级分提取液。另外，上述提取液中的氨基酸或低分子性色素等可以通过超滤有效除去。而且，对于除去疏水性物质，活性炭处理等也是有效的。这样可以得到来源于褐藻类的硫酸化多糖级分。另外，如果采用阴离子交换柱分离该级分，则可以得到更高纯度的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

采用上述方法得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖显示育发效果。因此，作为例如育发剂的构成成分是有用的。

而且，按照上述方法得到的硫酸化多糖级分或用阴离子交换柱纯化得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖均可以用作本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及内切-α-L-岩藻糖苷酶的底物。另外，也可以用作纯化本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶时的活性测定用底物，或者制备本发明的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖时的原料。

本说明书中，硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖是指由硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖生成的低聚糖。基本上含有硫酸基、葡糖醛酸基、岩藻糖基、乙酰基，但是仅仅由硫酸基和岩藻糖基构成的场合、来源为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的场合也称为硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。

本说明书中，岩藻依聚糖脱乙酰酶是指对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，水解乙酰基，使醋酸游离的酶。本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的理化性质如下所述。

(I)作用：对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，水解乙酰基，使醋酸游离。

(II)最适pH：该酶的最适pH为约6～9.1的范围(图1)。

也就是说，图1是表示该酶反应时的pH和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示pH。

(III)最适温度：该酶的最适温度为约23～45℃的范围(图2)。

也就是说，图2是表示该酶反应时的温度和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度(℃)。

(IV)分子量：采用凝胶过滤法测定时，为约3万～5万。

本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的确认可以通过测定荧光标识了具有乙酰基的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖及其还原性末端的化合物的分解活性进行。通过使用这些荧光标识低聚糖，能够构筑微量、高灵敏度的活性测定体系。另外，使岩藻依聚糖脱乙酰酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖作用后，分离反应产物中含有的醋酸和脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，分别测定醋酸量和乙酰基的量，另外进行反应产物的质量分析，也能够确认岩藻依聚糖脱乙酰酶活性。本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的活性可以用其生产菌的无细胞提取液进行测定，也可以用通过各种柱色谱纯化后的酶液进行测定。

在1种实施方式中，本发明的脱乙酰酶可以在氯化钠和/或蛋白质的存在下活化。这些因子单独或者两者组合均有效。首先对氯化钠进行说明，可以使用试剂级氯化钠、食盐、海水、人工海水等，只要含有氯化钠任何物质均可使用。本发明的脱乙酰酶的反应液中添加的氯化钠浓度优选为0.1mM～1M的范围，更优选1mM～600mM的范围。

其次说明蛋白质，为了活化本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶在反应液中添加的蛋白质只要不分解本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶且不抑制其反应，任何蛋白质均可。优选使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的菌体提取的蛋白质等。本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的反应液中添加的蛋白质浓度优选为0.001～10mg/ml的范围，更优选0.01～1mg/ml的范围。

本说明书中，α-D-葡糖醛酸酶是指对脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，水解葡糖醛酸和岩藻糖之间的α-D-葡糖醛酸键，使D-葡糖醛酸游离的酶。本发明的α-D-葡糖醛酸酶的理化性质如下所述。

(I)作用：对脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，水解α-D-葡糖醛酸键，使D-葡糖醛酸游离。

(II)最适pH：该酶的最适pH为约5.8～7.8的范围(图3)。

也就是说，图3是表示该酶反应时的pH和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示pH。

(III)最适温度：该酶的最适温度为约14～29℃的范围(图4)。

也就是说，图4是表示该酶反应时的温度和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度(℃)。

(IV)分子量：采用凝胶过滤法测定时，为约12～18万。

本发明的α-D-葡糖醛酸酶的确认可以通过测定脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分解活性进行。另外，使用2-氨基吡啶荧光标识了硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖及其还原末端得到的化合物也可以作为该酶的底物，通过使用这些荧光标识低聚糖，能够构筑微量、高灵敏度的活性测定体系。使α-D-葡糖醛酸酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖作用后，分离反应产物中含有的葡糖醛酸和硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，分别测定总糖量和总糖醛酸量，另外进行反应产物的质量分析，也能够确认α-D-葡糖醛酸酶活性。本发明的α-D-葡糖醛酸酶的活性可以用其生产菌的无细胞提取液进行测定，也可以用通过各种柱色谱纯化后的酶液进行测定。

在1种实施方式中，本发明的α-D-葡糖醛酸酶可以在氯化钠、钙离子和/或蛋白质的存在下活化。这些因子单独或者2种或3种组合均有效。首先对氯化钠进行说明，可以使用试剂级氯化钠、食盐、海水、人工海水等，只要含有氯化钠任何物质均可使用。本发明的α-D-葡糖醛酸酶的反应液中添加的氯化钠浓度优选为0.1mM～1M的范围，更优选1mM～600mM的范围。

其次说明钙离子，只要产生钙离子任何物质均可。优选使用可溶性的钙盐，例如氯化钙、醋酸钙等。另外，即使是难溶性的钙盐，例如碳酸钙、磷酸钙、枸橼酸钙、硫酸钙等，由于在硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖等硫酸化多糖溶解的状态下缓慢产生钙离子，因此也可以用于本发明的α-D-葡糖醛酸酶的活化。另外，硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的硫酸基或羧基的反荷离子含有钙盐时，由于底物本身可以作为钙离子的发生源，因此为了活化添加的钙离子源能够相应减少。根据情况，即使不添加钙盐，该酶也发生作用。本发明的α-D-葡糖醛酸酶的反应液中添加的钙离子浓度优选为0.1～200mM的范围，更优选1～100mM的范围。

其次说明蛋白质，为了活化本发明的α-D-葡糖醛酸酶在反应液中添加的蛋白质只要不分解本发明的α-D-葡糖醛酸酶且不抑制其反应，任何蛋白质均可。优选使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234的菌体提取的蛋白质等。本发明的α-D-葡糖醛酸酶的反应液中添加的蛋白质浓度优选为0.001～10mg/ml的范围，更优选0.01～1mg/ml的范围。

本说明书中，内切-α-L-岩藻糖苷酶是指对脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，内切地水解α-L-岩藻糖苷键，生成还原性末端具有L-岩藻糖的低聚糖的酶。本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶对天然的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖几乎不发生作用，但是对于预先用岩藻依聚糖脱乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶处理过的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，或者对于岩藻依聚糖脱乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存条件下的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖能很好地发挥作用。但是，即使是天然的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的场合，如果由于例如其它来源于海洋细菌的酶或物理、化学原因等任何理由除去了乙酰基和葡糖醛酸，则也适于用作本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的底物。

本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的理化性质如下所述。

(I)作用：对脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用，内切地水解α-L-岩藻糖苷键，生成还原性末端具有L-岩藻糖的低聚糖。

(II)最适pH：该酶的最适pH为约4.5～7.4的范围(图5)。

也就是说，图5是表示该酶反应时的pH和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示pH。

(III)最适温度：该酶的最适温度为约23～42℃的范围(图6)。

也就是说，图6是表示该酶反应时的温度和相对活性的关系的图，纵轴表示相对活性(％)，横轴表示温度(℃)。

(IV)分子量：采用凝胶过滤法测定时，为约15万～20万。

本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的确认可以通过测定脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分解活性进行。另外，使用2-氨基吡啶荧光标识了用本发明的α-D-葡糖醛酸酶处理硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖得到的低聚糖及其还原末端而成的化合物也可以作为该酶的底物，通过使用该荧光标识低聚糖，能够构筑微量、高灵敏度的活性测定体系。例如，使用8Fuc-4S-PA(下述)作为底物使之反应，采用HPLC分析反应产物，能够测定内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性。本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性可以用其生产菌的无细胞提取液进行测定，也可以用通过各种柱色谱纯化后的酶液进行测定。

在1种实施方式中，本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶可以在氯化钠、钙离子和/或蛋白质的存在下活化。这些因子单独或者2种或3种组合均具有活化作用。首先对氯化钠进行说明，可以使用试剂级氯化钠、食盐、海水、人工海水等，只要含有氯化钠任何物质均可使用。本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的反应液中添加的氯化钠浓度优选为0.1mM～1M的范围，更优选1mM～600mM的范围。

其次说明钙离子，只要产生钙离子任何物质均可。优选使用可溶性的钙盐，例如氯化钙、醋酸钙等。另外，即使是难溶性的钙盐，例如碳酸钙、磷酸钙、枸橼酸钙、硫酸钙等，由于在硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖等硫酸化多糖溶解的状态下缓慢产生钙离子，因此也可以用于本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的活化。另外，硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的硫酸基或羧基的反荷离子含有钙盐时，由于底物本身可以作为钙离子的发生源，因此为了活化添加的钙离子源能够相应减少。根据情况，即使不添加钙盐，该酶也发生作用。本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的反应液中添加的钙离子浓度优选为0.1～200mM的范围，更优选1～100mM的范围。

其次说明蛋白质，为了活化本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶在反应液中添加的蛋白质只要不分解本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶且不抑制其反应，任何蛋白质均可。优选使用牛血清白蛋白等。另外，也可以使用例如由本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的菌体提取的蛋白质等。本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的反应液中添加的蛋白质浓度优选为0.001～10mg/ml的范围，更优选0.01～1mg/ml的范围。

作为制备本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶以及内切-α-L-岩藻糖苷酶时使用的微生物，只要是产生将上述硫酸化多糖级分或硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化的酶的微生物即可，并没有特别的限定，例如适于使用Fucophilus属细菌。上述Fucophilus属细菌包括所有根据细菌学性质分类为同一属的细菌，或者基于16S rDNA的碱基序列的同源性分类为同一属的细菌，只要是产生与本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶或内切-α-L-岩藻糖苷酶同样分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的酶的微生物，包括所有的微生物。

培养产生本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的微生物时，加入到培养基中的营养源只要是利用所使用的微生物，在其存在下生产该酶的物质即可，作为碳源，可以利用例如硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、冲绳海蕴等海藻、海藻酸、昆布糖、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麦芽糖、淀粉等，作为氮源，例如酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、肉膏、脱脂大豆、硫酸铵、氯化铵、尿素、尿酸等较为合适。此外，也可以加入钠、钾、镁、钙、锌等的氯化物、磷酸盐、硫酸盐等。另外，该微生物的培养基也可以是海水或市售的人工海水的培养基。

另外，培养条件和培养基组成等当然是根据使用的微生物进行设定，以便使本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的产量达到最大。例如，优选培养温度为15～30℃，培养基的pH为5～9，通气搅拌培养5～72小时，在上述条件下，本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的产量能够达到最大。培养结束后，通过离心分离分为菌体和培养上清液，由菌体和培养上清液分别可以得到本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶。

没有特别的限定，例如用适当的培养基培养本发明的Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，收集其菌体，利用通常采用的细胞破碎方法，例如超声波处理，将菌体破碎，得到无细胞提取液。接着，按照通常采用的纯化方法能够由该提取液得到纯化酶制品。通过例如盐析、离子交换柱色谱、疏水柱色谱、凝胶过滤等进行纯化，能够得到纯化的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶，实质上不含有其它含硫酸化岩藻糖的多糖分解酶。另外，如果使用固定了硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的树脂，也能够容易地分离本发明的α-D-葡糖醛酸酶和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶。

而且，由于上述培养上清液中大量存在本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶，因此可以采用与菌体内的酶同样的纯化方法进行纯化。

上述Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株是利用硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作为资源的微生物，为了分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，在菌体内和菌体外生产本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶。这3种酶可以通过柱纯化操作分离。

本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶如果与本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存，则将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解为硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，但是单独使用时几乎不能分解。另外，本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶能够单独分解本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。因此，可以得知为了将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解成硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，不一定必须与本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶共存，但硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的脱乙酰化和脱葡糖醛酸是必要的。

本说明书中，脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖是指使本发明的α-D-葡糖醛酸酶对脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，将至少1分子以上的α-D-葡糖醛酸键水解得到的物质。如果由该脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖除去D-葡糖醛酸，最终葡糖醛酸含量达到零(即，为脱乙酰化的硫酸化岩藻聚糖)，但是通过调整酶反应的条件，可以制备岩藻糖和葡糖醛酸的摩尔比为4:1至4:0的各种葡糖醛酸含量的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

为了得到本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，可以使α-D-葡糖醛酸酶对脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，通过例如超滤、凝胶过滤、阴离子交换柱处理等除去游离的D-葡糖醛酸。根据需要，也可以进行脱盐、冷冻干燥等处理。进行脱葡糖醛酸化处理时，如果预先通过岩藻依聚糖脱乙酰酶处理或碱处理等对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖进行脱乙酰化，则能够有效进行脱葡糖醛酸化。

例如，对来源于冲绳海蕴的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖进行脱乙酰化得到的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖中每4分子岩藻糖含有1分子左右的D-葡糖醛酸，利用α-D-葡糖醛酸酶除去D-葡糖醛酸，能够制备各种葡糖醛酸含量的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。通过调整脱葡糖醛酸反应中使用的酶的量或底物的量、反应时间、反应温度、pH等条件，没有特别的限定，例如在1g脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖中混合适量的氯化钠、牛血清白蛋白以及500mU本发明的α-D-葡糖醛酸酶，在20℃、pH7附近使之进行各种时间的反应，能够制备岩藻糖和葡糖醛酸的摩尔比为4:1至4:0的各种葡糖醛酸含量的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖可以直接用作糖链学用试剂，除了可以作为本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的底物用于活性测定以外，其反应产物本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖作为糖链学用试剂也是有用的。

制备本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖时，脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物的溶解可以采用常规方法进行，溶解液中的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或该脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物的浓度可以是其最高溶解浓度，但通常可以考虑其操作性、酶效价进行设定。作为脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的溶解液，可以根据目的由水、缓冲液等进行选择。溶解液的pH通常为中性附近，酶反应通常在20℃附近进行。通过调整酶量、反应液的组成、反应时间等，也可以调整脱葡糖醛酸的程度。脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖可以根据需要进一步进行离子交换树脂处理、超滤等纯化操作，也可以根据需要进行脱盐处理、无菌处理、冷冻干燥处理。

本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖在分子中具有硫酸基和/或羧基，该基团与各种碱反应形成盐。本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖成盐的状态稳定，通常以钠和/或钾和/或钙等的盐的形态提供。这些物质的盐可以通过利用Dowex 50W等阳离子交换树脂，获得游离的本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。另外，这些物质也可以根据需要进行公知惯用的盐交换，交换成所需的各种盐。

作为本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的盐，可以使用药学上允许的盐，例如钠、钾等碱金属，钙、镁、锌等碱土金属、铵等的盐。

本说明书中，硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖是指使本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶对上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用或者通过碱处理等脱乙酰后，使α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶作用得到的低聚糖，还原性末端糖为L-岩藻糖。没有特别的限定，可以例举具有选自下述通式(I)～(III)的化学结构的糖化合物。

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO。)

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO。)

(式中，R为H或SO₃H或CH₃CO。另外，n为0或1以上的整数。)

本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖能够通过使本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物作用有效制备，也可以通过使本发明的α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶对预先经碱处理等化学处理脱乙酰后的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用进行制备。作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物，适于使用例如硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的部分纯化品、来源于褐藻类的含有硫酸化岩藻糖的多糖级分、褐藻类的水性溶剂提取物或褐藻类藻体。另外，当然使本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶对本发明的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，也能够得到本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。没有特别的限定，例如将来源于冲绳海蕴的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖脱乙酰化，使本发明的α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶作用，能够得到具有选自上述通式(I)～(III)的化学结构的糖化合物或其盐。

制备本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖时，硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物的溶解可以采用常规方法进行，溶解液中的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或该硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖含有物的浓度可以是其最高溶解浓度，但通常可以考虑其操作性、反应中使用的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的量进行设定。作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的溶解液，可以根据目的由水、缓冲液等进行选择。溶解液的pH通常为中性附近，酶反应通常在25℃附近进行。通过调整反应中使用的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的配合比例或用量、反应液的组成、反应时间等，也可以调整硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的分子量以及葡糖醛酸和乙酰基的含量。硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖可以被3种酶，即本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶分解，这3种酶反应可以同时进行，也可以分别进行。也就是说，如果预先用本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖脱乙酰化和脱葡糖醛酸化，然后通过热处理或酸、碱处理等使本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶和α-D-葡糖醛酸酶失活后，使本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶作用，则容易调整生成的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的分子量分布以及葡糖醛酸和乙酰基的含量。

通过分子量分级或阴离子交换柱将如上所述得到的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖分级，能够制备分子量更均匀或电荷密度分布更均匀的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。分子量分级可以适用通常很好使用的方法，可以使用例如凝胶过滤法或分子量分级膜。低分子化物可以根据需要进一步进行离子交换树脂处理、活性炭处理等纯化操作，也可以根据需要进行脱盐处理、无菌处理、冷冻干燥处理。采用该方法，可以得到通过NMR分析能够确定结构的结构均一的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。

本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖在分子中具有硫酸基和羧基，该基团与各种碱反应形成盐。本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖成盐的状态稳定，通常以钠和/或钾和/或钙等的盐的形态提供。这些物质的盐可以通过利用Dowex 50W等阳离子交换树脂，获得游离的本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。另外，这些物质也可以根据需要进行已知的盐交换方法，交换成所需的各种盐。

作为本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的盐，可以使用药学上允许的盐，例如钠、钾等碱金属，钙、镁、锌等碱土金属、铵等的盐。

另外，本发明硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖可以用作糖链学用试剂。例如如果按照特公平5-65108号公报记载的方法进行2-氨基吡啶基化(PA化)，制备该低聚糖的PA-化物，则可以用作本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性测定用底物。因而本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖作为糖链学用试剂是非常有用的物质。

本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶由于将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化，因而能够用于硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的结构解析。而且，本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶通过在反应液中共存氯化钠、蛋白质和/或钙离子，能够提高稳定性和反应速度，因此通过使这些硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解酶活化因子共存，能够有效进行上述低分子化。另外，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖、脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖和脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖可以用作糖链学用试剂，也可以用作本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性测定用底物。

实施例

以下结合实施例具体说明本发明，但是本发明并不仅限于以下实施例的范围。

参考例1

(1)粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分的制备

将市售的盐腌冲绳海蕴625g悬浊于4375ml的30mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中，用匀浆机以8000转/分钟处理5分钟后，在95℃下处理1小时，离心分离得到上清液。向得到的上清液中加入10g活性炭后，搅拌30分钟，离心分离得到上清液。用装有排除分子量10万的中空纤维的超滤器将得到的上清液浓缩至2升后，用20mM氯化钠更换溶剂，冷冻干燥，得到10.9g粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分的干燥物。

(2)硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性测定方法

本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶单独作用于硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖不能有效生成低聚糖，但是通过将其组合能够分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，有效地使之低分子化。将上述3种酶在共存状态下分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的活性称为“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”，按照下述活性测定方法将其数值化。

也就是说，将10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶液、52.5μl的50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)、5.5μl的4M氯化钠、2μl的1M氯化钙、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、以及20μl的本发明岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶共存的酶液混合，在30℃下反应3小时后，在100℃下处理反应液10分钟，离心分离后采用HPLC对90μl进行分析，测定低分子化程度。作为对照，对于代替本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶共存的酶液，使用溶解该酶液的缓冲液使之反应得到的产物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分使之反应得到的产物，同样采用HPLC进行分析。1单位的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性为上述反应体系中1分钟切断1μmol硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的岩藻糖苷键的酶量。切断的岩藻糖苷键的量按照下式求出。

公式1

{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.02)}＝U/ml

10×1000×1/100：反应体系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分(μg)

MG：底物硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的平均分子量

M：反应产物的平均分子量

(MG/M)-1：1分子硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖被酶切断的部位数

180：反应时间(分钟)

0.02：酶液量(m1)

另外，HPLC条件如下所述。

装置：L-6200型(日立制作所制)

柱：OHpak SB-806HQ(8×300mm，昭和电工社制)

洗脱剂：含有5mM叠氮化钠的50mM氯化钠

检测：示差折射率检测器(Shodex RI-71，昭和电工社制)

流速：1ml/分钟

柱温：25℃

为了测定反应产物的平均分子量，采用与上述HPLC分析相同的条件对市售的分子量已知的茁酶多糖(pu11ulan)(STANDARD P-82，昭和电工社制)进行分析，用曲线表示茁酶多糖的分子量和保留时间的关系，作为用于测定上述反应产物的分子量的标准曲线。另外，蛋白质的定量通过测定酶液在280nm处的吸光度进行。这时以1mg/ml的蛋白质溶液的吸光度为1.0进行计算。

实施例1

将由含有按照参考例1(1)的方法制备的来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分0.2％和蛋白胨1％的人工海水(JamarineLaboratory公司制)pH8.0构成的培养基50ml在120℃下进行高压灭菌器处理20分钟，在得到的培养基中接种Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，在24℃下培养72小时，得到种培养液。将由含有按照参考例1(1)的方法制备的来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分0.2％、蛋白胨1％和消泡剂(KM70，信越化学工业制)的人工海水(Jamarine Laboratory公司制)pH8.0构成的培养基600ml装入2升的锥形瓶中，在115℃下进行高压灭菌器处理10分钟，准备7瓶这样的培养基，分别在各锥形瓶中接种上述种培养液5ml，以每分钟90转的旋转速度，在24℃下培养72小时。培养结束后，将培养液离心分离，得到菌体和培养上清液。

将得到的菌体悬浊于250ml含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声波破碎后，离心分离得到上清液。用相同的缓冲液对得到的上清液进行充分透析，离心分离，将上清液作为粗酶液。

将得到的粗酶液装入用相同缓冲液平衡后的300ml的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照100mM至400mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，收集活性级分。由此得到部分纯化酶液。另外，测定上述培养上清液和粗酶液具有的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”，结果确认均有活性，在菌体提取液中检测出每1ml培养基0.4mU的活性。

实施例2

(1)使实施例1记载的粗酶液对参考例1(1)记载的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分作用，制备本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。也就是说，将5g粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶解于1升含有250mM氯化钠和20mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)中，然后加入35mU实施例1记载的粗酶液，在30℃下使之反应6天。离心分离反应液，对于得到的上清液使用安装有排除分子量1万的中空纤维的超滤装置，回收分子量1万以下的低聚糖级分，作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分1。

(2)用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，旭化成工业制)对实施例2(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分1进行脱盐。向脱盐后的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分1中添加咪唑达到5mM，并添加氯化钠达到20mM，装入预先用含有20mM氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液充分洗涤后，按照20mM至600mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱出的级分均采用苯酚-硫酸法测定总糖量，并采用咔唑-硫酸法测定总糖醛酸量。结果，由于洗脱级分中存在至少8个明显的峰，因此收集各个峰部分，作为低聚糖1-(1)～(8)，用蒸发器分别浓缩至40ml后，装入预先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脱进行脱盐。由此得到本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)～(8)，即低聚糖1-(1)～(8)。

(3)对于实施例2(2)得到的低聚糖1-(1)～(8)，通过使用2-氨基吡啶的荧光标识法分析还原末端糖和糖组成，再使用UFC测定试剂Takara(宝酒造)确定岩藻糖的绝对构型，低聚糖1-(1)～(8)的还原性末端糖均为L-岩藻糖。另外，关于糖组成，低聚糖1-(1)仅为岩藻糖，低聚糖1-(2)～(8)由岩藻糖和葡糖醛酸构成。其次，测定硫酸含量(采用使用氯化钡的比浊法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通过质量分析装置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析质量。另外，使用JNM-α500型核磁共振装置(日本电子社制)进行NMR分析。分析试样按照常规方法用重水置换后，进行结构解析。构成糖的结合方式采用¹H-异核检测法即HMBC法进行检测。¹H-NMR的归属采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，¹³C-NMR的归属采用HSQC法。以下列出低聚糖1-(1)～(8)的物理性质。

(a)低聚糖1-(1)的物理性质

质量分析和NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)的¹H-NMR波谱如图7所示，¹³C-NMR波谱如图8所示，质谱如图9所示。在图7、图8中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图9中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：762

MS m/z380.2〔M-2H⁺〕^2-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表1所示。

表1

糖组成  仅为L-岩藻糖(4分子)

硫酸基  2分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(IV)所示。

(b)低聚糖1-(2)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(2)的质谱如图10所示。在图10中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示 m/z值。

分子量：1456

MS m/z  484.6〔M-3H⁺〕^3-

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝7:1

硫酸基  3分子

(c)低聚糖1-(3)的物理性质

质量分析和NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的¹H-NMR波谱如图11所示，¹³C-NMR波谱如图12所示，质谱如图13所示。在图11、图12中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图13中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：1682

MS m/z  873.4〔M+3Na⁺-5H⁺〕^2-、862.4〔M+2Na⁺-4H⁺〕^2-、574.4〔M+2Na⁺-5H⁺〕^3-、567.2〔M+Na⁺-4H⁺〕^3-、425.2〔M+Na⁺-5H⁺〕^4-、419.8〔M-4H⁺〕^4-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表2所示。

表2

表2(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝8:1

硫酸基  4分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(V)所示。

(d)低聚糖1-(4)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(4)的质谱如图14所示。在图14中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：2376

MS m/z  598.8〔M+Na⁺-5H⁺〕^4-、474.6〔M-5H⁺〕^5-

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝11∶2

硫酸基  5分子

(e)低聚糖1-(5)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(5)的¹H-NMR波谱如图15所示，¹³C-NMR波谱如图16所示，质谱如图17所示。在图15、图16中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图17中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：2602

MS m/z  666.4〔M+3Na⁺-7H⁺〕^4-、661.0〔M+2Na⁺-6H⁺〕^4-、524.0〔M+Na⁺-6H⁺〕^5-、433.0〔M-6H⁺〕^6-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表3所示。

表3

表3(续)

表3(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝12:2

硫酸基  6分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(XI)所示。

另外，以下将本物质称为12Fuc-6S-2G1cUA。

(f)低聚糖1-(6)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(6)的质谱如图18所示。在图18中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：3296

MS m/z  840.0〔M+3Na⁺-7H⁺〕^4-、672.0〔M+3Na⁺-8H⁺〕^5-、556.0〔M+2Na⁺-8H⁺〕^6-、473.2〔M+Na⁺-8H⁺〕^7-

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝15:3

硫酸基  7分子

(g)低聚糖1-(7)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(7)的¹H-NMR波谱如图19所示，¹³C-NMR波谱如图20所示，质谱如图21所示。在图19、图20中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图21中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：3522

MS m/z  896.6〔M+3Na⁺-7H⁺〕^4-、712.6〔M+2Na⁺-7H⁺〕^5-、597.2〔M+3Na⁺-9H⁺〕^6-、505.4〔M+Na⁺-8H⁺〕^7-、439.6〔M-8H⁺〕^8-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表4所示。

表4

表4(续)

表4(续)

表4(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝16:3

硫酸基  8分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(XII)所示。

另外，以下称为16Fuc-8S-3G1cUA。

(h)低聚糖1-(8)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(8)的质谱如图22所示。在图22中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：4216

MS m/z  1092.0〔M+7Na⁺-11H⁺〕^4-、869.0〔M+6Na⁺-11H⁺〕^5-、713.0〔M+3Na⁺-9H⁺〕^6-、611.0〔M+3Na⁺-10H⁺〕^7-、529.2〔M+Na⁺-9H⁺〕^8-、470.2〔M+Na⁺-10H⁺〕^9-

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝19:4

硫酸基  9分子

实施例3

(1)使实施例1记载的部分纯化酶液对参考例1(1)记载的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分作用，制备本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。也就是说，将3g粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶解于1升含有250mM氯化钠、20mM氯化钙及1g牛血清白蛋白的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)中，然后加入29mU实施例1记载的部分纯化酶，在30℃下使之反应3天。离心分离反应液，对于得到的上清液使用安装有排除分子量1万的中空纤维的超滤装置，回收分子量1万以下的低聚糖级分，作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分2。

(2)用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，旭化成工业制)对实施例3(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分2进行脱盐。向脱盐后的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分2中添加咪唑达到5mM，并添加氯化钠达到10mM，装入预先用含有10mM氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液充分洗涤后，按照10mM至600mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱出的级分均采用苯酚-硫酸法测定总糖量，并采用咔唑-硫酸法测定总糖醛酸量。结果，由于洗脱级分中存在至少5个明显的峰，因此收集各个峰部分，作为低聚糖2-(1)～(5)，用蒸发器分别浓缩至40ml后，装入预先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脱进行脱盐。由此得到低聚糖2-(1)～(5)。

(3)低聚糖的结构解析

对于实施例3(2)得到的低聚糖2-(1)～(5)的脱盐物，通过使用2-氨基吡啶的荧光标识法分析还原末端糖和糖组成，所有低聚糖的还原性末端糖均为L-岩藻糖。另外，关于糖组成，低聚糖2-(1)仅为岩藻糖，低聚糖2-(2)～(5)由岩藻糖和葡糖醛酸构成。其次，测定硫酸含量(采用使用氯化钡的比浊法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通过质量分析装置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析质量。另外，使用JNM-α500型核磁共振装置(日本电子社制)进行NMR分析。分析试样按照常规方法用重水置换后，进行结构解析。构成糖的结合方式采用¹H-异核检测法即HMBC法进行检测。¹H-NMR的归属采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，¹³C-NMR的归属采用HSQC法。

以下列出低聚糖2-(1)～(5)的物理性质。

(a)低聚糖2-(1)的物理性质

上述分析结果判断出该物质是与低聚糖1-(1)相同的物质。

(b)低聚糖2-(2)的物理性质

上述分析结果判断出该物质是与低聚糖1-(3)相同的物质。

(c)低聚糖2-(3)的物理性质

质量分析和NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(3)的¹H-NMR波谱如图23所示，¹³C-NMR波谱如图24所示，质谱如图25所示。在图23、图24中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图25中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：1536

MS m/z 800.2〔M+3Na⁺-5H⁺〕^2-、789.2〔M+2Na⁺-4H⁺〕^2-、526.0〔M+2Na⁺-5H⁺〕^3-、518.6〔M+Na⁺-4H⁺〕^3-、388.8〔M+Na⁺-5H⁺〕^4-、383.2〔M-4H⁺〕^4-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表5所示.

表5

表5(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝7:1

硫酸基  4分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(VI)所示。

(d)低聚糖2-(4)的物理性质

上述分析结果判断出该物质是与低聚糖1-(5)相同的物质。

(e)低聚糖2-(5)的物理性质

质量分析的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖2-(5)的¹H-NMR波谱如图26所示，¹³C-NMR波谱如图27所示，质谱如图28所示。在图26、图27中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图28中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：2456

MS m/z 854.8〔M+5Na⁺-8H⁺〕^3-、847.2〔M+4Na⁺-7H⁺〕^3-、840.4〔M+3Na⁺-6H⁺〕^3-、635.4〔M+4Na⁺-8H⁺〕^4-、630.0〔M+3Na⁺-7H⁺〕^4-、624.4〔M+2Na⁺-6H⁺〕^4-、503.6〔M+3Na⁺-8H⁺〕^5-、499.4〔M+2Na⁺-7H⁺〕^5-、495.0〔M+Na⁺-6H⁺〕^5-、416.0〔M+2Na⁺-8H⁺〕^6-、412.4〔M+Na⁺-7H⁺〕^6-、408.8〔M-6H⁺〕^6-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表6所示。

表6

表6(续)

表6(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝11:2

硫酸基  6分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(XIII)所示。

另外，以下将该物质称为11Fuc-6S-2GlcUA。

观察上述实施例2和实施例3得到的酶反应产物，例如低聚糖1-(1)、1-(3)、1-(5)、1-(7)之间的质量差相当于4分子岩藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸的质量。低聚糖1-(2)、1-(4)、1-(6)、1-(8)之间的质量差、低聚糖2-(1)、2-(2)、2-(4)之间的质量差、低聚糖2-(3)和2-(5)之间的质量差也同样。由此认为实施例1得到的粗酶液以及部分纯化酶液中包括以硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的重复单元进行切割的酶，即以4分子岩藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸单元((-3F-3(4S)F1-3(4S)F1-3(GU1-2)F1-)，其中将α-L-岩藻糖简记为F，将硫酸基简记为S，将α-)-葡糖醛酸简记为GU)进行切割的酶。但是，反应产物中没有4分子岩藻糖、2分子硫酸基和1分子葡糖醛酸构成的低聚糖，作为与该结构近似的物质，生成了4分子岩藻糖和2分子硫酸基构成的低聚糖。也就是说，暗示实施例1(1)得到的粗酶液和部分纯化酶液至少是葡糖醛酸酶和岩藻糖苷酶的混合物。

实施例4

(1)硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine的制备

为了制备用于分离实施例1(1)得到的部分纯化酶液中含有的酶的亲和(affinity)树脂，将参考例1(1)记载的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分固定于Amino-Cellulofine(生化学工业制)。固定的方法按生化学工业的说明书。也就是说，将1.5g的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶解于80ml的水中后，用盐酸将pH调节至4.5，加入50ml的Amino-Cellulofine和3g的1-乙基-3-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐，在4℃下搅拌20小时，过滤后，用水充分洗涤，得到硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine。

(2)用硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine分离α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶

将实施例1(1)得到的部分纯化酶液用含有50mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)充分透析后，装入用相同缓冲液平衡后的50ml硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine中，用相同缓冲液洗涤后，按照50mM至1M氯化钠的浓度梯度进行洗脱。测定洗脱出的级分的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”，结果活性的回收率为约2％，但是如果将仅残留很少“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”的洗脱级分和硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine非吸附级分混合，则“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”几乎与上柱时的活性相等。

由于上述非吸附级分完全不能单独将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖低分子化，且仅具有很少“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”的洗脱级分也不能单独将硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖完全低分子化，因而判断出非吸附级分和洗脱级分分别通过不同的作用分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，而且如果洗脱级分不预先对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用则非吸附级分也不能发生作用。由此提示洗脱级分切断硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的侧链，即α-D-葡糖醛酸键或硫酸酯键等不会使硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分子量大幅度改变的部分，而非吸附级分切断主链，即α-L-岩藻糖苷键。

实施例5

(1)按照利用2-氨基吡啶的荧光标识(PA化)法标识低聚糖

为了确认实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分的作用机理，进行以下实验。

取硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)～(8)以及2-(3)和2-(5)的干燥物各50nmole，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent试剂盒(均为宝酒造社制)用2-氨基吡啶对还原性末端进行荧光标识(PA化)，制备该低聚糖的PA化物。

(2)利用下述反应体系考察实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分对实施例5(1)记载的10种低聚糖的PA化物的作用。

反应体系

50μl    50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)

23μl    水

5μl     4M氯化钠

2μl     1M氯化钙

5μl     5mg/ml牛血清白蛋白

10μl    2pmole/μl低聚糖的PA化物

5μl     水或实施例4(2)记载的非吸附级分或实施例4(2)记载的洗脱级分

将上述所有成分混合后在30℃下反应3小时，在100℃下处理10分钟后离心分离，在下述条件下用HPLC对上清液进行分析，确认对各低聚糖的PA化物的作用。

装置：L-6200型(日立制作所制)

柱：OHpak SB-803(8×300mm，昭和电工社制)

洗脱剂：含有5mM叠氮化钠和10％二甲基亚砜的0.2M氯化钠

检测：荧光检测器F-1150(日立制作所制)激发波长320nm、荧光波长400nm

流速：1ml/分钟

柱温：50℃

根据上述分析结果判断出的实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分对各种硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的PA化物的作用的有无以及作用前后在SB803柱上的保留时间如表7所示。

表7

 

低聚糖的PA化物	作用的有无非吸附级分    洗脱级分	洗脱级分的保留时间作用前    作用后
			1-(1)	无            无	9.74      9.72
1-(2)	无            有	9.09      9.22
			1-(3)	无            有	8.94      9.06
1-(4)	无            有	8.76      8.91
			1-(5)	无            有	8.56      8.65
1-(6)	无            有	8.50      8.60
			1-(7)	无            有	8.40      8.48
1-(8)	无            有	8.31      8.40
			2-(3)	无            有	8.92      9.04
2-(5)	无            有	8.56      8.68

如表7所示，实施例4(2)的非吸附级分对上述所有低聚糖的PA化物均不能发生作用。另一方面，实施例4(2)的洗脱级分对硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)不能发生作用，但对其它硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖发生作用。这一结果强有力地提示实施例4(2)的洗脱级分是切断硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的葡糖醛酸的酶。例如由低聚糖1-(3)切断1分子岩藻糖生成低聚糖2-(3)。认为这时保留时间的变化是由8.94分钟变为8.92分钟。实施例4(2)的洗脱级分对低聚糖1-(3)的反应中，保留时间由8.94分钟变化为9.06分钟。因此，认为该反应不是切断岩藻糖的反应。同样，通过比较低聚糖2-(5)和1-(4)以及2-(3)和1-(2)，认为实施例4(2)的洗脱级分的反应不是切断硫酸酯的反应。而且，通过比较低聚糖1-(5)和1-(4)、1-(7)和1-(6)、以及1-(3)和1-(2)，认为实施例4(2)的洗脱级分的反应不是切断硫酸化岩藻糖的反应。

(3)为了确认实施例4(2)记载的洗脱级分具有α-D-葡糖醛酸酶活性，使实施例4(2)记载的洗脱级分对实施例2记载的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)作用，分析其质量变化。首先，构筑下述反应体系。

反应体系

32.1ml  50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)

2.0ml   4M氯化钠

0.8ml   1M氯化钙

4.0ml   5mg/ml牛血清白蛋白

10mg    实施例2记载的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)

1.0ml   实施例4(2)记载的洗脱级分

将上述所有成分混合后，在30℃下反应5天，为了脱盐，装入用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱(4×90cm)中，每1级分分别收集9.1ml，对分别收集的级分测定总糖量(苯酚-硫酸法)以及总糖醛酸量(咔唑-硫酸法)。结果利用苯酚-硫酸法的显色为强阳性的级分其利用咔唑-硫酸法的显色为阴性。也就是说，强有力地提示由含有葡糖醛酸的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)切断了葡糖醛酸。而且，为了确认切断了葡糖醛酸，对利用苯酚-硫酸法的显色为强阳性的级分进行质量分析。结果，这些级分中存在质量1506，即与由硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)切断葡糖醛酸后的质量(1506)一致的物质。另外，由于不能检测出与硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)一致的质量(1682)的物质，因而可以得知脱葡糖醛酸化反应完全进行。

根据以上结果，判断出实施例4(2)记载的洗脱级分中存在α-D-葡糖醛酸酶。认为与由硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)切断葡糖醛酸后的质量(1506)一致的物质具有下述式(VII)的结构。

另外，以下将该物质称为8Fuc-4S。

于是，研究本发明的α-D-葡糖醛酸酶对实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的PA化物的最适反应条件。另外，欲求得本发明的α-D-葡糖醛酸酶的活性时，由下述反应体系测定活性。

反应体系

50μl    含有100mM氯化钠的50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)

21μl    水

4μl     1M氯化钙

10μl    3mg/ml牛血清白蛋白

10μl    4pmole/μl实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖

        1-(3)的PA化物

5μl     α-D-葡糖醛酸酶溶液

将上述所有成分混合后在22℃下反应3小时，在100℃下处理10分钟后离心分离，在下述条件下用HPLC对上清液进行分析。

装置：L-6200型(日立制作所制)

柱：L-柱(4.6×250mm，(财)化学品检查协会制)

洗脱剂：含有0.3％丁醇的50mM醋酸-三乙胺缓冲液(pH5.0)

检测：荧光检测器F-1150(日立制作所制)激发波长320nm、荧光波长400nm

流速：1ml/分钟

柱温：40℃

1单位的本发明α-D-葡糖醛酸酶为在上述反应体系中1分钟切断1μmole的实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的PA化物的葡糖醛酸键的酶量。切断的葡糖醛酸键的量按照下式求出。

公式2

DGA/180×0.005＝U/ml

DGA：切断的实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的PA化物的量(μmole)

180：反应时间(分钟)

0.005：酶液量(ml)

(4)利用2-氨基吡啶对实施例5(3)记载的8Fuc-4S进行的荧光标识(PA化)

取实施例5(3)记载的8Fuc-4S 50nmole，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent试剂盒(均为宝酒造社制)用2-氨基吡啶对还原性末端进行荧光标识(PA化)，制备该低聚糖的PA化物。以下将该物质称为8Fuc-4S-PA。

(5)使用8Fuc-4S-PA的实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分的作用的研究

采用下述反应体系考察实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分对实施例5(4)记载的8Fuc-4S-PA的作用。

反应体系

50μl    50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)

23μl    水

5μl     4M氯化钠

2μl     1M氯化钙

5μl     5mg/ml牛血清白蛋白

10μl    2pmole/μl8Fuc-4S-PA

5μl     水或实施例4(2)记载的非吸附级分或实施例4(2)记载

        的洗脱级分

将上述所有成分混合后在30℃下反应3小时，在100℃下处理10分钟后离心分离，在实施例5(3)记载的条件下用HPLC对上清液进行分析。

上述分析结果表明实施例4(2)记载的非吸附级分分解8Fuc-4S-PA，但是实施例4(2)记载的洗脱级分不分解8Fuc-4S-PA。另外，通过实施例4(2)记载的非吸附级分分解8Fuc-4S-PA得到的分解物在与实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)的PA化物相同的洗脱位置洗脱出。这与实施例2和实施例3中得到大量与硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(1)相同的物质并不矛盾。也就是说，判断出实施例4(2)记载的非吸附级分是对脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖等作用的内切-α-L-岩藻糖苷酶。

由该结果判断出实施例4制备的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine是对于分离本发明的α-D-葡糖醛酸酶和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶有用的树脂。

(6)另外，研究本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶对8Fuc-4S-PA的最适反应条件。另外，欲求得本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性时，采用下述反应体系测定活性。

反应体系

50μl    含有40mM氯化钠的50mM醋酸缓冲液(pH5.5)

23μl    水

2μl     1M氯化钙

10μl    3mg/ml牛血清白蛋白

10μl    4pmole/μl 8Fuc-4S-PA

5μl     内切-α-L-岩藻糖苷酶溶液

反应在30℃下进行3小时，反应液的分析与上述同样进行。

1单位的本发明内切-α-L-岩藻糖苷酶为在上述反应体系中1分钟内切地切断1μmol的8Fuc-4S-PA的岩藻糖苷键的酶量。切断的岩藻糖苷键的量按照下式求出。

公式3

DPA/180×0.005＝U/ml

DPA：切断的8Fuc-4S-PA的量(μmole)

180：反应时间(分钟)

0.005：酶液量(ml)

实施例6

对于实施例4(2)记载的非吸附级分和洗脱级分分别通过预先用含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡后的Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)进行凝胶过滤，分别收集每13.5ml洗脱液。对于洗脱级分，实施例4(2)记载的非吸附级分按照实施例5(2)记载的方法，使用硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的PA化物作为底物，测定本发明的α-D-葡糖醛酸酶的活性，实施例4(2)记载的洗脱级分按照实施例5(5)记载的方法，测定本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性。采用上述凝胶过滤法测定的本发明的α-D-葡糖醛酸酶的分子量为约12万～18万，本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的分子量为约15万～20万。

实施例7

通过DEAE-Cellulofine A-800纯化参考例1(1)记载的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分。也就是说，在预先用含有50mM氯化钠和10％乙醇的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡后的5升DEAE-Cellulofine A-800柱中装入用相同缓冲液溶解的5g参考例1(1)记载的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分，用相同缓冲液洗涤后，用含有100mM氯化钠和10％乙醇的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)洗涤，按照100mM至2M氯化钠的浓度梯度进行洗脱。洗脱级分按每500ml为1级分，采用苯酚-硫酸法测定总糖量。收集在洗脱盐浓度500mM附近洗脱出的认为是硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的主成分的级分，用装有排除分子量10万的中空纤维的超滤装置进行脱盐，冷冻干燥，得到纯化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分0.9g。研究上述纯化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分的葡糖醛酸含量的调整。首先构筑下述反应体系。

反应体系

5ml     50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)

0.5ml   4M氯化钠

0.5ml   1M氯化钙

0.25ml  5mg/ml牛血清白蛋白

3.35ml  实施例4(2)记载的洗脱级分

2.4ml   1.25％纯化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分水溶液

将上述所有成分混合后，在25℃下使之反应，经时取样，将样品充分透析，除去切断了的葡糖醛酸。表8中记载了透析后的各样品中含有的岩藻糖量、葡糖醛酸量以及它们的比例。

表8

 

反应时间(小时)	岩藻糖含量(mM)	葡糖醛酸含量(mM)	岩藻糖与葡糖醛酸的摩尔比
				0	6.1	1.4	4.4∶1
1	6.3	1.3	4.9∶1
				2	6.9	1.2	5.8∶1
5	6.5	0.90	7.2∶1
				10	6.9	0.70	9.9∶1
20	6.3	0.65	9.7∶1

由上述结果判断出如果使用实施例4(2)记载的洗脱级分，通过切断除去硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的葡糖醛酸，能够调整岩藻糖和葡糖醛酸的比例。

实施例8

(1)酶反应中钙盐浓度的影响

在测定本发明的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”时，确认如果降低反应体系中含有的氯化钙的浓度，则活性降低。因此，对于本发明的α-D-葡糖醛酸酶以及本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶，考察反应体系中含有的氯化钙的浓度和相对活性的关系。结果，判断出两种酶均被氯化钙活化。另外，确认采用醋酸钙也同样能够活化。

(2)酶反应中蛋白质的影响

在测定本发明的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”时，确认如果由反应体系除去牛血清白蛋白，则活性降低。因此，对于本发明的α-D-葡糖醛酸酶以及本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶，考察反应体系中含有的牛血清白蛋白的浓度和相对活性的关系。结果，判断出两种酶均被牛血清白蛋白活化。另外，确认采用本发明的Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株生产的蛋白质也同样能够活化。

(3)酶反应中氯化钠的影响

在测定本发明的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”时，确认如果由反应体系除去氯化钠，则活性降低。因此，对于本发明的α-D-葡糖醛酸酶以及本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶，考察反应体系中含有的氯化钠的浓度和相对活性的关系。结果，判断出两种酶在以低分子的低聚糖作为底物时均不被氯化钠活化。由此可以确认氯化钠在酶的底物为高分子的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖时活化两种酶。

实施例9

将由含有按照参考例1(1)的方法制备的来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分0.2％和蛋白胨1％的人工海水(JamarineLaboratory公司制)pH8.0构成的培养基600ml在120℃下进行高压灭菌器处理20分钟，在得到的培养基中接种Fucophilusfucoidanolyticus SI-1234株，在24℃下培养72小时，得到种培养液。将由含有蛋白胨200g和消泡剂(KM70，信越化学工业制)的人工海水(Jamarine Laboratory公司制)pH8.0构成的培养基18升用30升容量的发酵罐在120℃下进行高压灭菌器处理20分钟，在得到的培养基中混合将按照参考例1(1)的方法制备的来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分40g溶解于2升人工海水并在95℃下处理1小时得到的物质，接种上述种培养液，以每分钟125转的旋转速度，在24℃下培养72小时.另外，在培养过程中自动控制培养基的pH为7以上。培养结束后，将培养液离心分离，得到菌体和培养上清液。

可以确认象上述方法那样对本培养的培养基中添加的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的加热温度为95℃时，与在120℃附近加热杀菌时相比，Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的利用率高，单位培养基的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶的产量多。

将上述培养得到的菌体悬浊于1升含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声波破碎后，离心分离，用相同缓冲液对得到的提取液进行充分透析，离心分离，得到本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶共存的上清液。

按照参考例1(2)记载的方法测定得到的上清液中具有的“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”，并按照实施例14、实施例5(3)和实施例5(6)记载的方法分别测定本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的活性。结果，可以确认“硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性”为每1ml培养液生产6mU，本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶为每1ml培养液生产1mU，本发明的α-D-葡糖醛酸酶为每1ml培养液生产130μU，本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶为每1ml培养液生产6μU。

实施例10

(1)对于硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分研究育发效果

由日本SLC社连同母鼠一起购入出生后2日龄的雄性C3H/He小鼠，在5日龄用于实验。使小鼠脱血致死，使用剪刀和镊子连同皮下组织一起采集触须。接着，按照Ogawa等的方法(J.Invest.Dermatol103：306-309，1994)，在显微镜下于培养皿中将触须连同毛囊一起分离。由一只的左右两侧采集14～16根触须。接着，将参考例1(1)记载的来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶解于RPMI-1640培养基中，配制给定浓度的20倍浓度溶液，向培养体系中加入20分之1的量。对照组加入相同量的培养基。触须的培养使用组织培养用皿Falcon 3037(Becton Dickinson Labware社制)，在中央的孔中装入0.7mL添加有20％FCS的RPMI-1640培养基，并敷上灭菌后的不锈钢网(池田理化株式会社制)和拭镜纸(T.C.Ks株式会社制)。将触须置于其上进行培养。来源于冲绳海蕴的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分预先添加到培养基中。培养在35℃、5％CO₂存在下进行6天。触须的长度在培养开始前和结束后，在显微镜下使用测径规测定到0.1mm的位数。对于各试样浓度的一组，使用3～5根触须进行测定，伸长的长度用平均值±标准误差表示。另外，显著性差异检验进行Student′s t检验，相对于对照组求出P值。其结果如表9所示。

表9

如表9所示，确认来源于冲绳海蕴的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分与对照相比，具有使小鼠的触须伸长的效果。

实施例11

(1)酶的制备

将按照实施例9的方法制备的Fucophilus fucoidanolyticusSI-1234株的菌体提取液用含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)充分透析，离心分离，得到上清液，即本发明的α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶共存的粗酶液。将得到的粗酶液装入用相同缓冲液平衡后的500ml的DEAE-CellulofineA-800柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照100mM至400mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，每支分别收集67ml，收集硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分。将得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分用装有分级分子量1万的中空纤维的超滤器浓缩，用含有50mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)更换缓冲液。将得到的酶液装入用相同缓冲液平衡后的实施例4(1)记载的50ml的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖-Cellulofine柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照50mM至600mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。按照每支10ml分别进行收集，测定各级分的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性。结果，洗脱级分中仅检测出很少的活性，而非吸附级分中未见活性。但是，如果将非吸附级分和洗脱级分混合，则硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性几乎与上柱时的活性相等。

收集非吸附级分，通过超滤器浓缩至100ml，得到非吸附级分浓缩液。另一方面，洗脱级分使用浓缩的非吸附级分测定硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性，将其活性级分用超滤器浓缩至200ml，得到洗脱级分浓缩液。进一步对这些酶进行纯化，尝试制备硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。首先，构筑用于测定各种级分的活性的反应体系。

上述非吸附级分和洗脱级分单独对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，均不能有效生成低聚糖，但是如果共存，则能够分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，有效地使之低分子化。按照下述活性测定方法将两种酶共存的状态下分解硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的活性进行数值化。

非吸附级分的活性测定方法如下所述进行。也就是说，将10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶液、53μl的50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)、5μl的4M氯化钠、2μl的1M氯化钙、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、1μl的洗脱级分浓缩液以及19μl的欲测定活性的来源于非吸附级分的酶液混合，在30℃下反应3小时后，在100℃下处理反应液10分钟，离心分离后采用HPLC对90μl进行分析，测定低分子化程度。作为对照，对于代替来源于非吸附级分的酶液，使用溶解该酶液的缓冲液使之反应得到的产物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分使之反应得到的产物，同样采用HPLC进行分析。

1单位的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性为上述反应体系中1分钟切断1μmol硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的岩藻糖苷键的酶量。切断的岩藻糖苷键的量按照下式求出。

公式4

{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.019)}＝U/ml

10×1000×1/100：反应体系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分

(μg)

MG：对照反应液的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的平均分子量

M：反应产物的平均分子量

(MG/M)-1：1分子硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖被酶切断的部位数

180：反应时间(分钟)

0.019：酶液量(ml)

另外，HPLC条件如下所述。

装置：L-6200型(日立制作所制)

柱：0Hpak SB-806HQ(8×300mm，昭和电工社制)

洗脱剂：含有5mM叠氮化钠的50mM氯化钠

检测：示差折射率检测器(Shodex RI-71，昭和电工社制)

流速：1ml/分钟

柱温：25℃

为了测定反应产物的平均分子量，采用与上述HPLC分析相同的条件对市售的分子量已知的茁酶多糖(pullulan)(STANDARD P-82，昭和电工社制)进行分析，用曲线表示茁酶多糖的分子量和保留时间的关系，作为用于测定上述反应产物的分子量的标准曲线。

另一方面，洗脱级分的活性测定如下所述进行。也就是说，将10μl的1％粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶液、53μl的50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)、5μl的4M氯化钠、2μl的1M氯化钙、10μl的5mg/ml牛血清白蛋白、19μl的非吸附级分浓缩液以及1μl的欲测定活性的来源于洗脱级分的酶液混合，在30℃下反应3小时后，在100℃下处理反应液10分钟，离心分离后采用HPLC对90μl进行分析，测定低分子化程度。作为对照，对于代替来源于洗脱级分的酶液，使用溶解该酶液的缓冲液使之反应得到的产物，以及用水代替粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分使之反应得到的产物，同样采用HPLC进行分析。

1单位的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性为上述反应体系中1分钟切断1μmol硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的岩藻糖苷键的酶量。切断的岩藻糖苷键的量按照下式求出。

公式5

{(10×1000×1/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.001)}＝U/ml

10×1000×1/100：反应体系中添加的粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分(μg)

MG：对照反应液的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的平均分子量

M：反应产物的平均分子量

(MG/M)-1：1分子硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖被酶切断的部位数

180：反应时间(分钟)

0.001：酶液量(ml)

非吸附级分浓缩液的纯化如下所述进行。也就是说，向上述非吸附级分浓缩液中加入4M的氯化钠，达到250mM，装入用相同缓冲液平衡后的30ml的Pheny1-Cellulofine柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照250mM至0mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，然后用含有10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)洗脱，接着用含有10％乙醇和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)洗脱，按照每支10ml分别进行收集，收集按照上述方法测定的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分。

用Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)对得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分进行分级，以含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)作为洗脱剂。按照每支13.5ml分别进行收集，以按照上述方法测定的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分作为纯化非吸附级分。

而且，洗脱级分浓缩液的纯化如下所述进行。也就是说，通过装有分级分子量1万的中空纤维的超滤装置，用含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)交换上述洗脱级分浓缩液，装入用相同缓冲液平衡后的45ml的DEAE-Cellulofine柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照100mM至400mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，按照每支10ml分别进行收集，收集按照上述方法测定的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分。

用Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)对得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分进行分级，以含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)作为洗脱剂。按照每支13.5ml分别进行收集，以按照上述方法测定的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解活性级分作为纯化洗脱级分。

(2)硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备

使用上述纯化非吸附级分和纯化洗脱级分制备硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。

也就是说，将10g粗硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分溶解于1升含有250mM氯化钠、20mM氯化钙、5mM叠氮化钠以及1g牛血清白蛋白的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)中，然后加入100mU的纯化洗脱级分和600mU的纯化非吸附级分，在30℃下使之反应10天。离心分离反应液，对于得到的上清液使用安装有排除分子量1万的中空纤维的超滤装置，回收分子量1万以下的低聚糖级分，作为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分3。

(3)硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的纯化

用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，旭化成工业制)对上述硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分3进行脱盐。向脱盐后的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖酶消化物级分3中添加咪唑达到5mM，并添加氯化钠达到10mM，装入预先用含有10mM氯化钠的5mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)平衡后的1升DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液充分洗涤后，按照10mM至400mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱.洗脱出的级分均采用苯酚-硫酸法测定总糖量，并采用咔唑-硫酸法测定总糖醛酸量。结果，由于洗脱级分中存在至少5个明显的峰，因此收集各个峰部分，作为低聚糖3-(1)～(5)，用蒸发器分别浓缩至40ml后，装入预先用10％乙醇平衡后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脱进行脱盐。由此得到本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(1)～(5)，即低聚糖3-(1)～(5)。

(4)低聚糖的结构解析

对于得到的上述低聚糖3-(1)～(5)的脱盐物，通过使用2-氨基吡啶的荧光标识法分析还原末端糖和糖组成，所有低聚糖的还原性末端糖均为岩藻糖。另外，关于糖组成，低聚糖3-(2)仅为岩藻糖，低聚糖3-(1)和3-(3)～(5)由岩藻糖和葡糖醛酸构成。其次，测定硫酸含量(采用使用氯化钡的比浊法)、糖醛酸含量(采用咔唑-硫酸法)，通过质量分析装置(API-III，Perkin-Elmer Sciex公司制)分析质量。另外，使用JNM-α500型核磁共振装置(日本电子社制)进行NMR分析。分析试样按照常规方法用重水置换后，进行结构解析。构成糖的结合方式采用¹H-异核检测法即HMBC法进行检测。¹H-NMR的归属采用DQF-COSY法以及HOHAHA法，¹³C-NMR的归属采用HSQC法。以下列出低聚糖3-(2)～(5)的物理性质。

(a)低聚糖3-(2)的物理性质

上述分析结果判断出该物质是与上述低聚糖1-(1)相同的物质。

(b)低聚糖3-(3)的物理性质

质量分析和NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(3)的¹H-NMR波谱如图29所示，¹³C-NMR波谱如图30所示，质谱如图31所示。在图29、图30中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图31中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：1230

MS m/z 1273.4〔M+2Na⁺-3H⁺〕^-、625.2〔M+Na⁺-3H⁺〕^2-、409.2〔M-3H⁺〕^3-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表10所示。

表10

表10(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝6:1

硫酸基  2分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(XIV)所示。

另外，以下将该物质称为6Fuc-2S-1GlcUA。

(c)低聚糖3-(4)的物理性质

质量分析和NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(4)的¹H-NMR波谱如图32所示，¹³C-NMR波谱如图33所示，质谱如图34所示。在图32、图33中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图34中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：1724

MS m/z 894.1〔M+3Na⁺-5H⁺〕^2-、588.7〔M+2Na⁺-5H⁺〕^3-、435.6〔M+Na⁺-5H⁺〕^4-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表11所示。

表11

表11(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝8:1

硫酸基  4分子

乙酰基  1分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(IX)所示。

另外，以下将该物质称为8Fuc-4S-1GlcUA-1乙酰基。

(d)低聚糖3-(5)的物理性质

质量分析及NMR分析的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖3-(5)的¹H-NMR波谱如图35所示，¹³C-NMR波谱如图36所示，质谱如图37所示。在图35、图36中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。另外，在图37中，纵轴表示相对强度(％)，横轴表示m/z值。

分子量：2689

MS m/z 924.0〔M+4Na⁺-7H⁺〕^3-、687.3〔M+3Na⁺-7H⁺〕^4-、545.3〔M+2Na⁺-7H⁺〕^5-、450.5〔M+Na⁺-7H⁺〕^6-

¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表12所示。

表12

表12(续)

表12(续)

糖组成  L-岩藻糖：D-葡糖醛酸＝12:2

硫酸基  6分子

乙酰基  2分子

另外，¹H-NMR和¹³C-NMR中峰归属的序号如下述式(X)所示。

另外，以下将该物质称为12Fuc-6S-2GlcUA-2酰基。

实施例12

(1)α-D-葡糖醛酸酶以及内切-α-L-岩藻糖苷酶的纯化

按照实施例9的方法将Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株培养3次，由每次培养得到的菌体按照实施例9的方法制备菌体提取液，用含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)充分透析，离心分离，得到上清液，即本发明的α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶共存的粗酶液。以下，按照实施例5(3)记载的方法测定本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性，按照实施例5(6)记载的方法测定本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性，对各种酶进行纯化。

将得到的粗酶液装入用相同缓冲液平衡后的3L的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照100mM至400mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱，每支分别收集200ml，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分。在这一时刻本发明的两种酶显示几乎相同的性质，不能分离。

将上述两种酶活性级分用装有分级分子量1万的中空纤维的超滤器浓缩，用含有100mM氯化钠和10mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)更换缓冲液。

将得到的酶液装入用相同缓冲液平衡后的240ml的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照100mM至300mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。按照每支25ml分别进行收集，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分。在这一时刻本发明的两种酶显示几乎相同的性质，不能分离。

将上述两种酶活性级分用装有分级分子量1万的中空纤维的超滤器浓缩，用含有50mM氯化钠和5mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)更换缓冲液。

将得到的酶液装入用相同缓冲液平衡后的50ml的硫酸化-Cellulofine(生化学工业制)柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照50mM至1M氯化钠的浓度梯度进行洗脱。按照每支50ml分别进行收集，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分。这里，由于两种酶完全分离，因此以下对各种酶分别进行纯化。

(2)内切-α-L-岩藻糖苷酶的纯化

使用分级分子量1万的超滤膜将上述(1)得到的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分浓缩，装入用含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡后的Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)中，用相同缓冲液洗脱。按照每支13.3ml分别进行收集，收集内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分。

将得到的内切-α-L-岩藻糖苷酶活性级分装入用含有10mM氯化钠和5mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)与乙醇的混合比为85:15的缓冲液平衡后的Pheny1-Cellulofine柱(2.4×44cm)中，用相同缓冲液进行洗脱。按照每支30ml分别进行收集。得到的活性级分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断是均一的。由此得到本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的纯化物。

(3)α-D-葡糖醛酸酶的纯化

使用分级分子量1万的超滤膜将上述(1)得到的本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分浓缩，装入用含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡后的SephacrylS-200柱(4.4×100cm)中，用相同缓冲液洗脱。按照每支13.3ml分别进行收集，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分。

将得到的本发明的α-D-葡糖醛酸酶级分用含有300mM氯化钠和5mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液充分透析，装入用相同缓冲液平衡后的20ml的硫酸化-Cellulofine柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照300mM至900mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。按照每支10ml分别进行收集，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分。

将得到的本发明的α-D-葡糖醛酸酶级分用含有200mM氯化钠和5mM氯化钙的10mM咪唑-盐酸缓冲液充分透析，装入用相同缓冲液平衡后的20ml的硫酸化-Cellulofine柱中，用相同缓冲液洗涤后，按照200mM至800mM氯化钠的浓度梯度进行洗脱。按照每支7ml分别进行收集，收集本发明的α-D-葡糖醛酸酶活性级分。得到的活性级分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断是均一的。由此得到本发明的α-D-葡糖醛酸酶的纯化物。

实施例13

使用实施例12(2)得到的本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶的纯化物以及实施例12(3)得到的本发明的α-D-葡糖醛酸酶的纯化物，尝试硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的低分子化。首先为了考察乙酰基对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解的影响，制备脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

(1)脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的制备

将按照参考例1(1)的方法制备的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖200mg溶解于20ml的1N氢氧化钠中，在25℃下处理20小时，接着用含有200mM氯化钠和50mM氯化钙的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.6)充分透析，得到脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。

(2)各种底物的分解

对于按照参考例1(1)的方法制备的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及按照上述(1)的方法制备的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖，每200mg添加本发明的α-D-葡糖醛酸酶150μU和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶1mU，在25℃下进行分解反应。另外，这些反应液中各成分的最终浓度为硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖6.7mg/ml、牛血清白蛋白0.1mg/ml、氯化钠200mM、氯化钙50mM、咪唑20mM，pH调节至6.6。结果，反应开始时硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖与脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的分子量几乎相同，但是反应2天后的平均分子量是硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖为约195万，脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖为约27000。

也就是说，确认为了通过本发明的α-D-葡糖醛酸酶和本发明的内切-α-L-岩藻糖苷酶，有效得到硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖，有必要进行脱乙酰化。另外，使实施例1记载的粗酶以及部分纯化酶对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，则得到的低聚糖几乎不带有乙酰基，如果使实施例11(1)记载的纯化非吸附级分和纯化洗脱级分对硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖作用，则生成带有乙酰基的低聚糖，由此推测本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株生产使硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的乙酰基游离的岩藻依聚糖脱乙酰酶。

实施例14

对Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株生产的使硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的乙酰基游离的岩藻依聚糖脱乙酰酶进行研究。

(1)岩藻依聚糖脱乙酰酶的纯化

首先，确立用于测定按照实施例11(1)的方法制备的本发明的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株的粗酶溶液中存在的岩藻依聚糖脱乙酰酶活性的反应体系。

也就是说，在100μl的50mM咪唑盐酸缓冲液(pH7.5)、10μl的4M氯化钠、1μl的1M氯化钙、40μl的1％硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖和29μl的水中，加入20μl的岩藻依聚糖脱乙酰酶溶液，在30℃下反应3小时，采用市售的醋酸定量用试剂盒(F-试剂盒醋酸，RocheDiagnostics制)测定游离出的乙烯基的量。结果，每1ml培养液中本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的活性为约2mU。

另外，作为其他方法，使用将低聚糖3-(4)的还原性末端用2-氨基吡啶荧光标识得到的物质作为底物，采用下述反应体系，测定岩藻依聚糖脱乙酰酶的活性。

反应体系

75μl    50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)

28.5μl  水

9μl     4M氯化钠

15μl    3mg/ml牛血清白蛋白

15μl    4pmole/μl低聚糖3-(4)的荧光标识物

7.5μl   岩藻依聚糖脱乙酰酶溶液

将上述所有成分混合后在30℃下反应1小时，在100℃下处理10分钟后离心分离，在下述条件下用HPLC对上清液进行分析，测定脱乙酰化量。

装置：L-6200型(日立制作所制)

柱：L-柱(4.6×250mm，(财)化学品检查协会制)

洗脱剂：含有0.5％丁醇的50mM醋酸-三乙胺缓冲液(pH5.0)

检测：荧光检测器F-1150(日立制作所制)激发波长320nm、荧光波长400nm

流速：1ml/分钟

柱温：40℃

1单位的本发明岩藻依聚糖脱乙酰酶为在上述反应体系中1分钟切断1μmole的乙酰基的酶量。另外，在上述反应体系中，如果切断底物的乙酰基，则变成与实施例5(1)得到的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖1-(3)的PA化物相同的结构，因此为了确认切断了乙酰基的底物的柱保留时间，使用该PA化物。切断的乙酰基的量按照下式求出。

公式6

DA/60×0.015＝U/ml

DA：切断的乙酰基的量(μmole)

60：反应时间(分钟)

0.015：酶液量(ml)

采用上述方法测定时，每1ml培养液中本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的活性为0.8mU/ml。

将上述粗酶溶液50ml装入用含有100mM氯化钠、10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡后的SephacrylS-200柱(4.4×100cm)中，用相同缓冲液进行洗脱。按照每支13ml分别进行收集，按照上述方法测定各级分中含有的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的活性。由洗脱液量计算出的本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的分子量为约3万～5万.

收集上述活性级分，考察本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的性质。其结果如图1～图2所示。即，图1表示最适pH，图2表示最适温度。

如图1所示，本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶的最适pH为约6～9.1的范围，最适温度为23～45℃的范围。

(2)使用岩藻依聚糖脱乙酰酶由各种岩藻依聚糖脱乙酰基的反应构筑下述反应体系，测定各种岩藻依聚糖中含有的乙酰基的量。反应中使用下述表13所示的来源于海藻的岩藻依聚糖。

反应体系

60μl    1％岩藻依聚糖

50μl    100mM磷酸钠缓冲液pH7.5

10μl    4M氯化钠

20μl    3mg/ml牛血清白蛋白

30μl    水

30μl    岩藻依聚糖脱乙酰酶

将上述所有成分混合后在30℃下反应21小时，采用上述醋酸定量试剂盒测定生成的醋酸量。另外，将各岩藻依聚糖在1N的氢氧化钠中在25℃下处理18小时，采用上述醋酸定量试剂盒测定生成的醋酸量。其结果如表13所示。

表13

 

海藻	使用脱乙酰酶时	使用氢氧化钠时
			冲绳海蕴	13.6	17.2
海蕴	n.d.	1.74
			墨角藻	0.91	15.4
泡叶藻	0.69	7.74
			龙目	1.27	4.40
海带	2.00	11.3
			爱胜蚓(Eisenia bicyclis)	1.70	3.77
裙带菜	2.70	30.3
			黑巨藻	3.80	22.9
Macrocystis Pyriferra	1.46	12.9
			Durvillaea antarctica	1.84	15.3

mg·乙酰基/g·岩藻依聚糖

n.d.：未检测(not detected)

如表13所示，可以确认本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶是对各种来源于海藻的岩藻依聚糖作用水解乙酰基的酶。另外，可以确认与使用氢氧化钠非特异性地脱乙酰化的场合相比，本发明的岩藻依聚糖脱乙酰酶对来源于冲绳海蕴的岩藻依聚糖即硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的乙酰基的特异性高。

实施例15

(1)本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的主要结构的解析

为了确定实施例7制备的纯化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖级分的整体结构和硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖分解酶的切断部位，进行NMR分析。NMR的归属的结果如下所示，本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的¹H-NMR波谱如图38所示，¹³C-NMR波谱如图39所示。图38和图39中，纵轴表示信号强度，横轴表示化学位移值(ppm)。而且，红外吸收波谱如图40所示。在图40中，纵轴表示透过率(％)，横轴表示波数(cm^-1)。¹H-NMR和¹³C-NMR的分析结果如表14所示。

表14

根据表14所示的归属，可以确认本发明的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖如下式(假XV)所示，F1的岩藻糖通过α键结合在另一重复5糖的F4的岩藻糖的3位上。另外，乙酰基是每个重复5糖有1个残基主要结合在F1的岩藻糖的4位上。也就是说，判断出硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖具有以下所示的主骨架的重复结构。

工业实用性

按照本发明，提供能够用于硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的结构解析和再现性良好地制备硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的低分子化物的新型岩藻依聚糖脱乙酰酶、α-D-葡糖醛酸酶和内切-α-L-岩藻糖苷酶。另外，还提供该酶的制备方法。另外，通过使用该酶，提供作为糖链学用试剂有用的以各种比例脱乙酰化得到的脱乙酰化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖、以各种比例脱葡糖醛酸化得到的脱乙酰化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖以及硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖。另外，还提供用于有效使用该酶的添加物。另外，还提供生产来源于各种褐藻类的硫酸化多糖分解酶的微生物。

序列表独立文本(Sequence Listing Free Text)

序列号1：为扩增16S rDNA区域设计的低聚核苷酸引物

序列号2：为扩增16S rDNA区域涉及的低聚核苷酸引物

序列表

<110>宝酒造株式会社

<120>硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖(Sulfated glucuronofucan)

<130>662466

<150>JP 2000-121116

<151>2000-04-21

<150>JP 2000-186346

<151>2000-06-21

<160>3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为扩增16S rDNA区域设计的低聚核苷酸引物

<400>1

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>为扩增16S rDNA区域设计的低聚核苷酸引物

<400>2

<210>3

<211>1535

<212>DNA

<213>Fucophilus fucoidanolyticus Sl-1234

<400>3

Claims (10)

1.硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，其特征在于，具有下述理化性质：

(1)构成糖：含有岩藻糖和葡糖醛酸，其摩尔比为35～44:10，

(2)以下述通式(VIII)表示的硫酸化糖作为构成糖的必需成分，

式中，R为H或SO₃H或CH₃CO，n是1以上的整数.

2.权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，其特征在于，所述的n在1～5000的范围。

3.岩藻依聚糖脱乙酰酶，其特征在于，具有下述理化性质：

(I)作用于如权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，水解乙酰基，使乙酸游离；

(II)在约6-9.1的范围具有最适pH；

(III)在约23～45℃的范围具有最适温度；

(IV)培养Fucophilus fucoidanolyticus，通过精制方法从其培养物分离.

4.α-D-葡糖醛酸酶，其特征在于，具有下述理化性质：

(I)作用于脱乙酰化的权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，水解α-D-葡糖醛酸键，使D-葡糖醛酸游离；

(II)在约5.8～7.8的范围具有最适pH；

(III)在约14～29℃的范围具有最适温度；

(IV)培养Fucophilus fucoidanolyticus，通过精制方法从其培养物分离.

5.内切-α-L-岩藻糖苷酶，其特征在于，具有下述理化性质：

(I)作用于脱乙酰化脱葡糖醛酸化的如权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐，内切地水解α-L-岩藻糖苷键，生成还原性末端具有L-岩藻糖的低聚糖；

(II)在约4.5～7.5的范围具有最适pH；

(III)在约23～42℃的范围具有最适温度；

(IV)培养Fucophilus fucoidanolyticus，通过精制方法从其培养物分离.

6.硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备方法，其特征在于，使权利要求3所述的岩藻依聚糖脱乙酰酶、权利要求4所述的α-D-葡糖醛酸酶和权利要求5所述的内切-α-L-岩藻糖苷酶对权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐作用，采集硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖.

7.硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备方法，其特征在于，使权利要求4所述的α-D-葡糖醛酸酶和权利要求5所述的内切-α-L-岩藻糖苷酶对通过碱处理脱乙酰化得到的权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐作用，采集硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖.

8.如权利要求6或7所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻低聚糖的制备方法，其特征在于，在氯化钠、钙盐和/或蛋白质共存的条件下进行.

9.分解如权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖或其盐所得的具有选自下述通式(I)-(III)的化学结构的糖化合物或其盐：

式中，R为H或SO₃H或CH₃CO，n为0或1以上的整数.

10.具有利用如权利要求1所述的硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖的能力的Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234株FERM BP-7495.

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