CN100469780C - 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开为组织蛋白酶K抑制剂的式II化合物，这些化合物可以用于治疗或预防骨质疏松症，在式II中，R¹和R²之一为卤素，且另一个为H或卤素；R³为任选氟化的C₁-C₄直链或支链烷基；R⁴为H；或R³与R⁴一起和相邻的主链碳原子构成螺-C₅-C₇环烷基，该环烷基任选被1-3个选自卤素、羟基、C₁-C₄烷基或C₁-C₄卤代烷基的取代基取代；或者R³与R⁴任选通过亚甲基基团桥接；或者R³与R⁴一起构成含有选自下列杂原子的C₄-C₆饱和杂环：O、NRa、S、S(＝O)₂；其中Ra为H、C₁-C₄烷基或者CH₃C(＝O)-；R⁵独立选自H或甲基；E为-C(＝O)-、-S(＝O)_m-、-NR⁵S(＝O)_m-、-NR⁵C(＝O)-、-OC(＝O)-；R⁶为稳定的、任选取代的单环或双环碳环或杂环；m独立为0、1或2。

Description

半胱氨酸蛋白酶抑制剂

发明领域

本发明涉及半胱氨酸蛋白酶(特别是木瓜蛋白酶总科)抑制剂。本发明提供了新的用于预防或治疗由生理蛋白酶如组织蛋白酶K失衡所引起的紊乱的化合物。

相关领域描述

半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶总科广泛分布于各种种属，包括哺乳动物、无脊椎动物、原生动物、植物和细菌中。大量的哺乳动物组织蛋白酶，包括组织蛋白酶B、F、H、K、L、O和S，均归属于该总科，其活性的异常调节与大量的代谢紊乱有关，所述紊乱包括关节炎、肌营养不良、炎症、肾小球肾炎和肿瘤侵袭。病原组织蛋白酶如包括细菌蛋白酶(gingipain)、疟疾falcipains I、II、III等的酶类和自卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、枯氏锥虫(trypanosoma cruzei)和布氏锥虫(trypanosoma bruzei)、Crithidiafusiculata、血吸虫属(schistosoma spp)的半胱氨酸蛋白酶。

组织蛋白酶K的异常调节与许多紊乱(包括骨质疏松症、齿龈疾病如齿龈炎和牙周炎、佩吉特病、恶性高钙血症和代谢骨疾病)有关。由于组织蛋白酶K在骨关节炎滑膜的破软骨细胞中的水平升高，所以该酶与特征在于过多的软骨或基质降解的疾病有关，如骨关节炎和风湿关节炎。转移性肿瘤细胞通常表达了高水平的蛋白水解酶，这些酶可以使周围的基质降解，因此组织蛋白酶K的抑制有助于治疗瘤形成。

国际专利申请号WO02057270公开了式I化合物

其中UVWXY从广义上将相应于二肽半胱氨酸蛋白酶抑制剂的P3和P2，Z为O、S、亚甲基或-NR-，R¹为烷基、烷基芳基等，P1和Q1均为亚甲基，任选被各种碳链和环状基团取代。据称这些化合物可以用于治疗原生动物(如锥体虫)感染。

现在申请人发现，在特定的环位置上引入卤素原子使得对组织蛋白酶K的抑制能力提高了数量级。

发明概述

本发明提供了式II化合物及其药学上可接受的盐：

其中

R¹和R²之一为卤素，另一个为H或卤素；

R³为直链或支链、任选被氟化的C₁-C₅烷基；

R⁴为H；或者

R³与R⁴一起和相邻的主链碳原子构成螺-C₅-C₇环烷基，该环烷基任选被1-3个选自卤素、羟基、C₁-C₄烷基或C₁-C₄卤代烷基的取代基取代；或者它们任选通过亚甲基基团桥接；或者它们一起构成含有选自下列杂原子的C₄-C₆饱和杂环：O、NRa、S、S(＝O)₂；其中Ra为H、C₁-C₄烷基或者CH₃C(＝O)-；

R⁵独立选自H或甲基；

E为-C(＝O)-、-S(＝O)_m-、-NR⁵S(＝O)_m-、-NR⁵C(＝O)-、-OC(＝O)-；

R⁶为稳定的、任选取代的、单环或双环的碳环或杂环，其中该环或每个环具有4、5或6个环原子和0-3个选自S、O和N的杂原子，且其中任选的取代基包括1-3个选自R₇的基团；

R⁷独立选自卤素、氧代、腈、硝基、C₁-C₄烷基、-NRaRb、-XNRbR⁹、-NRbC₁-C₄烷基R⁹、NH₂CO-、X-R⁹、X-O-R⁹、O-X-R9、X-C(＝O)R⁹、X-(C＝O)NRaR⁹、X-NRbC(＝O)R⁹、X-NHSO_mR⁹、X-S(＝O)_mR⁹、X-C(＝O)OR⁹、X-NRbC(＝O)OR⁹；

R⁹独立为H、C₁-C₄烷基、C₃-C₆环烷基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、吡喃基、噻喃基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、苯基，它们中任一个可任选被R₁₀取代；

R₁₀独立选自羟基、-X-R⁹、-XNRaRb、-XNRbR⁹、-NRbC₁-C₄烷基R⁹、硝基、氰基、羧基、氧代、C₁-C₄烷基、C₁-C₄-烷氧基、C₁-C₄链烷酰基、氨基甲酰基；

X独立为键或C₁-C₄烷基；

Rb选自H、C₁-C₄烷基

m独立为0、1或2。

尽管不希望受任何理论的束缚，或者将其限定为具体的可变基团，但是，在此为方便起见，仍然采用了P1、P2和P3，它们具有传统的定义并代表那些被认为是分别可以填充酶的S1、S2和S3亚部位的抑制剂的部分，其中S1与裂解位相邻，而S3远离该裂解位。

优选P1基团的立体化学结构如下述部分结构所示：

优选R¹和/或R²的卤素为氯，最优选为氟。通常优选R²为卤素，特别是氟，且R¹为H，但本发明包括其中R¹为卤素(特别是F)且R²为H或R¹和R²均为F的化合物，。

可以理解的是，P1基团可以存在另外的形式，如

本发明也包括所有此类替代形式。

优选P2基团的立体化学结构相应于如下部分结构所示的L-氨基酸：

本发明也包括D-异构体。

本发明也包括所有其它手性中心的异构体和对映异构体。

通常优选的P2基团包括那些其中R⁴为H且R³为异-丁基的基团。另外优选的P2基团为高-叔-丁基，即-CH₂C(CH₃)₃。

也优选P2基团包括那些其中R³和R⁴一起构成螺环烷基的基团，如环戊基、环庚基，并优选环己基。

如果P2环烷基被取代，取代基通常位于与主链连接的键的对位。代表性的取代基包括单氟代、二氟代、单羟基、偕羟基和甲基取代基、单甲基或偕甲基。

P2基团也可以包括那些其中R³和R⁴一起构成6元饱和杂环的基团，其中杂原子选自O、S、S(＝O)₂或NRx，其中X为H或甲基，可以位于主链连接点的对位或间位。

上面两段所述代表性的P2基团包括

通常优选的P2基团包括

通常优选R⁵为H。

优选的E基团包括-S(＝O)_m-，特别是-S(＝O)₂-，并最优选-C(＝O)-。

R⁶通常为具有5或特别是6个环原子的单环或包含稠合至4、5或6元环的6元环的双环结构。

典型的R⁶基团包括饱和的或不饱和的杂环或饱和的或不饱和的碳环，它们中的任一个均可如上文所述被任选取代。说明性的实例包括C₃-₈环烷基、苯基、苄基、四氢萘基、茚基、茚满基、杂环基如氮杂环庚烷基、azocanyl、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、噻喃基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、四唑基、吡唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、喹唑啉基、四氢喹唑啉基和喹喔啉基，它们中的任一个可以如上文所述被取代。

因此，饱和的杂环包括如下基团：吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡喃基、噻喃基、哌嗪基、二氢吲哚基、氮杂环丁基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢呋喃基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基、1，4，5，6-四氢嘧啶基胺、二氢-噁唑基、1，2-thiazinanyl-1，1-二氧化物、1，2，6-thiadiazinanyl-1，1-二氧化物、异噻唑烷基-1，1-二氧化物和咪唑烷基-2，4-二酮，而不饱和的杂环包括基团如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、***基、四唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、氮茚基、吲哚基、异吲哚基。在每种情况下，杂环均可以与苯环稠合形成双环系。

优选的单环R⁶基团包括取代的吡啶基、取代的嘧啶基、取代的苯基，优选被环状基团取代的苯基，如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、4-甲基哌啶-1-基、4-(哌啶-3-基甲基)-哌啶-1-基、吗啉-4-基、4-甲基哌嗪-1-基、2-吗啉-4-基-乙基氨基、2-吗啉-4-基-乙基氧基、1-吡啶-2-基甲基氨基、哌嗪-1-基、哌啶-4-基或N-哌嗪基，被Ra N-取代，或4-位被-NRaRb取代的哌啶-1-基。苯基R⁶最好在3或4位被取代(对位或间位)，例如被环状基团取代。

单环R⁶(如苯基)的环状取代基包括芳基基团(如苯基)或5或6元杂芳基基团(如噻吩、呋喃、***、噻唑、二唑、吡唑或吡咯烷)。本文中优选的环状取代基包括噻唑-2-基、吡啶-3-基，优选吡啶-2-基、噻吩-2-基或噻唑-5-基。通常，该环状取代基(即R⁷)可以直接与R⁶连接(即X为键)，但也可以，例如，包含胺间隔(如-NH-、-N(Me)、-CH₂NH、-CH₂N(Me)-)、C₁-C₃烷基间隔(如-CH₂-)或者C₁-C₃-烷基氧基间隔(如乙氧基)。

上文中所述的任何R⁶的环状取代基可以如R¹⁰所述被取代。例如杂环R⁷基团如噻唑基可以被C₁-C₄烷基如甲基取代。

优选，上面两段所述的任何R⁶的环状取代基本身可以被环状基团取代(即R⁷包含R⁹部分)，取代基通常为饱和的杂环状基团如哌啶、哌嗪或吗啉，所述饱和的环状基团任选被下列基团取代，例如，C₁-C₃烷基、氟、二氟、C₁-C₃烷基氧基或C₁-C₃烷基氧基C₁-C₃烷基。如R⁷定义中所述，该饱和的环状基团(即R⁹)可以通过下列基团与R⁶基团间隔：X(如C₁-C₃烷基)、胺(如-NH-)、酰胺、氨磺酰等，但通常直接或通过亚甲基连接。

前文所述的代表性的R⁹基团包括杂环如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、4-甲基哌啶-1-基、4-(哌啶-3-基甲基)-哌啶-1-基、吗啉-4-基、4-甲基哌嗪-1-基、2-吗啉-4-基-乙基氨基、2-吗啉-4-基-乙基氧基、1-吡啶-2-基甲基氨基、哌嗪-1-基、哌啶-4-基或N-哌嗪基，被Ra N-取代，或4位被-NRaRb取代的哌啶-1-基。

优选的R⁹取代基包括4-取代的哌嗪-4-基如4-甲基-哌嗪-4-基或4-甲基氧基乙基-哌嗪-4-基、哌啶-1-基甲基，任选在4位被氟或二氟或吗啉基甲基取代。

另外优选的单环R⁶(如苯基)的取代基包括-NRaRb、-CH₂NRaRb、C₁-C₄直链或支链烷基或-O-R⁹。

因此，代表性的R⁶基团包括：

优选的代表性的R⁶基团包括

特别是

其中Rq和Rq’独立选自H、C₁-C₄烷基或C₁-C₄链烷酰基或者它们一起构成不饱和的5-7元环，如哌啶、哌嗪或吗啉，可以由被相应的R¹⁰基团取代，特别是C₁-C₄烷基、氟或二氟。

优选的R⁶基团包括

R⁶的代表性的双环状基团包括亚萘基，特别是亚萘-2-基；苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基，特别是苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基；苯并呋喃基，特别是苯并呋喃-2-基，优选C₁-C₆烷氧基取代的苯并呋喃基，更优选5-(2-哌嗪-4-甲酸叔-丁酯-乙氧基)苯并呋喃-2-基、5-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯并呋喃-2-基、5-(2-哌嗪-1-基-乙氧基)苯并呋喃-2-基、5-(2-环己基-乙氧基)-苯并呋喃-2-基、7-甲氧基-苯并呋喃-2-基、5-甲氧基-苯并呋喃-2-基、5，6-二甲氧基-苯并呋喃-2-基，特别是卤素取代的苯并呋喃基，更优选5-氟代-苯并呋喃-2-基、5，6-二氟代-苯并呋喃-2-基，特别是C₁-C₆烷基取代的苯并呋喃基，最优选3-甲基-苯并呋喃-2-基；苯并[b]噻吩基，特别是苯并[b]噻吩-2-基，优选C₁-C₆烷氧基取代的苯并[b]噻吩基，更优选5，6-二甲氧基-苯并[b]噻吩-2-基；喹啉基，优选喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-6-基以及喹啉-S-基；喹喔啉基，优选喹喔啉-2-基；1，8-萘啶基，优选1，8-萘啶-2-基；吲哚基，特别是吲哚-2-基，优选吲哚-6-基、吲哚-5-基，特别是C₁-C₆烷基取代的吲哚基，更优选N-甲基吲哚-2-基；呋喃并[3，2-b]吡啶基，特别是呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基，以及C₁-C₆-烷基取代的呋喃并[3，2-b]吡啶基，优选3-甲基-呋喃并[3，2-b]吡啶-2-基；噻吩并[3，2-b]噻吩，优选噻吩并[3，2-b]噻吩-2-基，更优选C₁-C₆烷基取代的噻吩并[3，2-b]噻吩-2-基，更优选5-叔-丁基-3-甲基噻吩并[3，2-b]噻吩-2-基。

优选的R⁶基团包括双环如萘基、quinoloyl、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基和二氢吲哚基，优选，其中连接在环的2位。优选的双环R⁶基团的取代基包括吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、4-甲基哌啶-1-基、4-(哌啶-3-基甲基)-哌啶-1-基、吗啉-4-基、4-甲基哌嗪-1-基、2-吗啉-4-基-乙氨基、2-吗啉-4-基-乙氧基、1-吡啶-2-基甲基氨基、哌嗪-1-基、哌啶-4-基或N-哌嗪基，被Ra N-取代，或4-位被-NRaRb取代的哌啶-1-基。特别优选的取代基，特别是与苯并呋喃基结合的，包括2-吗啉-4-基-乙氧基和N-甲基-哌啶-4-基氧基以及下文中定义的那些基团。

优选的双环R⁶基团为任选取代的苯并噻唑基或苯并呋喃基或苯并噁唑基，包括那些其中所述取代基为-OR⁹或-NRbR⁹的。例如，优选的R⁶基团包括苯并呋喃-2-基，它是未取代的或在5位被饱和的杂环如哌啶、哌嗪或吗啉取代，该杂环任选被C₁-C₃烷基取代和/或通过氧基、甲氧基或乙氧基与苯并呋喃基间隔。因此，特别优选的苯并呋喃R⁶基团包括：

因此，通常而言，对于式II：

X通常为亚甲基或优选为键。

C₁-C_n烷基，其中n为4，无论是其本身还是在其他表达如C₁-C₄烷氧基中，包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、异-丁基、仲-丁基、叔-丁基、环丙基、甲基环丙基等，对于n为其它值而言，也是如此。例如C₅烷基，包括高-叔-丁基(-CH₂C(CH₃)₃)。

卤素或卤代包括溴代、氯代，优选氟代。

卤代烷基意指如上文所述烷基基团，其中至少一个碳原子携有1-3个卤素原子，优选氟原子。代表性的卤代烷基基团包括氟代甲基、二氟代甲基、三氟代甲基、2-氟代乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基等。

本发明所使用的P1结构单元(building block)代表新的化合物并且形成本发明的另一方面。因此，本发明的另一方面进一步提供了下式化合物

其中R1和R2如上文定义，且PG为如下文所定义的氮保护基团，优选甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔-丁基乙酰基、苯基磺酰基、苄基、Fmoc、叔-丁氧基羰基(BOC)和苄基氧基羰基(Cbz)。因此，本发明的另一方面包括相应的未保护的胺(即PG＝H)。

本发明该方面的优选的实施方案包括下式化合物

其中PG如上文定义。

本发明还包括如下文实施例所述的为酸或被羧基保护基团保护的各种新的P3结构单元。

优选的本发明化合物包括那些自表A、B和C任一项中独立选择的P3、P2和P1成员所形成的排列组合：

表A P1基团

表B P2基团

表C P3基团

本发明另一方面包括含有如上文所定义的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

本发明的另一方面为上文所定义的化合物在生产治疗组织蛋白酶K介导的紊乱的药物中的用途，例如：骨质疏松症，齿龈疾病如齿龈炎和牙周炎、佩吉特病、恶性高钙血症、代谢骨疾病，以过多的软骨或基质降解为特征的疾病，如骨关节炎和风湿关节炎，骨癌包括瘤形成，疼痛。

本发明化合物可以形成盐，这构成了本发明的另一方面。适当的式II化合物的药学上可接受的盐包括有机酸盐，特别是羧酸盐，包括但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、羟乙基磺酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天门冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、二葡糖酸盐、环戊酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、烟酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、pivolate、樟脑酸盐、十一酸盐和琥珀酸盐，有机磺酸如甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对-氯代苯磺酸盐和对-甲苯磺酸盐；以及无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐、磷酸盐和磺酸盐。在某些情况下，式II化合物可以为水合物。

可以理解的是，本发明的范围包括前药、溶剂化物、复合物和在体内可以释放式II化合物的其它形式。

虽然活性成分可以单独使用，但优选将其以药物制剂的形式提供。此类制剂包括上述定义的活性成分和一种或多种可接受的载体/赋形剂以及任选的其它治疗成分。载体必须与该制剂的其它成分相容，并且对受体无害。

该制剂包括适于直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、***或肠胃外(包括皮下、肌肉、静脉内和皮内)给药的制剂，但优选的制剂为口服给药制剂。制剂最好为单位剂量的形式，如片剂和缓释胶囊，并且可以通过制药领域所熟知的方法制备。

此类方法包括将上文所定义的活性药物与载体混合的步骤。通常，可以通过将活性药物与液体载体或均匀粉碎的固体载体或与它们二种载体一起均匀且密切地混和来制备制剂，如果需要可以将产物塑形。本发明也包括制备药物组合物的方法，所述方法包括将式II化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或介质混和或联合。如果药物制剂的生产包括了将药用赋形剂和盐形式的活性成分充分混合，则通常优选采用本身非碱性的赋形剂，即酸性或中性赋形剂。

本发明用于口服给药的制剂可以为分剂量形式，如胶囊、扁囊剂或片剂，每种包含预定量的活性药物；可以为粉末或颗粒；可以为活性药物在水溶液或非水溶液中的溶液或悬浮液；或者也可以为水包油液体乳液或油包水液体乳液以及药丸等。

对于口服给药的组合物(如片剂和胶囊)来说，术语适当的载体包括赋形剂如常用赋形剂，如粘合剂，例如糖浆、***树胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶、聚维酮、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢二钙、氯化钠和褐藻酸；以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钠以及其它硬脂酸金属盐，甘油硬脂酸酯、硅树脂液、滑石、蜡、油和胶体硅胶。可以使用调味剂如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。也可能需要加入着色剂以使剂型易于辩认。片剂也可以根据本领域已知的方法包衣。

片剂也可以任选与一种或多种辅助成分一起压制或塑形。可以通过在适当的机器中，将自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性药物，任选与粘合剂、滑润剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合，压制制备压制片剂。可以通过在适当的机器中，将惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物混合物模塑。片剂可以任选包衣或刻痕，也可以制备成使活性药物缓慢或控制释放的形式。

其它适于口服给药的制剂包括含有在香味基质(通常为蔗糖和***树胶或黄芪胶)中的活性药物的锭剂；含有在惰性基质中的活性药物的锭剂，所述基质如明胶和甘油，或者蔗糖和***树胶；以及含有在适当的液体载体中的活性药物的嗽口液。

适当的本发明化合物或制剂的剂量取决于适应症和病人的状况，并且可以通过常规动物试验容易地确定。通常需要使细胞内(用于抑制木瓜蛋白酶总科的生理蛋白酶)浓度达到0.01-100μM(更优选0.01-10μM，如0.1-25μM)的给药剂量，并且该剂量是可以获得的。

本发明化合物可以采用各种溶液和固相化学方法制备。

化合物通常可以制备为代表终产物抑制剂的P1、P2和P3基团的结构单元。尽管不希望受任何理论的束缚，或者对于具体的可变基团给出了结合方式，但是在此使用的P1、P2和P3的定义仅是为了方便起见，它们实际上具有常规的Schlecter & Berger的意义并代表那些被认为是分别可以填充酶的S1、S2和S3亚部位的抑制剂的部分，其中S1与裂解位相邻，且S3远离该裂解位。无论其结合方式为何，式I所定义的化合物均在本发明的范围内。

广义上来讲，P1结构单元为N-保护的-6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯，P2为N-保护的氨基酸，而P3通常包括封端基团如取代的杂芳酰基或芳酰基基团。

可以首先制备适当保护的单独的结构单元，随后进行偶合，即P2+P1→P2-P1。可选择的是，结构单元的前体可以先进行偶合，然后在抑制剂的合成的后面阶段中进行修饰。另外的结构单元，结构单元的前体或所需结构的预制的较大片段，可以与生长链偶合，如R³-E-P2*+P1→R³-E-P2-P1或R³-E＊+P2-P1→R³-E-P2-P1，其中*指活化形式。

两种氨基酸、氨基酸和肽或两种肽片段之间的偶合均可采用标准的偶合步骤进行，如叠氮方法、混合的碳酸-羧酸酐(氯代甲酸异丁酯)方法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或水溶性碳二亚胺)方法、活性酯(对-硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯)方法、Woodward试剂K-方法、羰基二咪唑方法、磷试剂或氧化-还原方法。这些方法中的部分方法(特别是碳二亚胺方法)可以通过加入1-羟基苯并***或4-DMAP提高。这些偶合反应可以在溶液(液相)中进行，也可以在固相中进行。

更明确地讲，偶合步骤包括在偶合剂存在下，一种反应物的游离羧基与另外的反应物的游离氨基脱水偶合，形成酰胺键。有关这些偶合剂在下述常规肽化学教科书中有述及：如M.Bodanszky，“肽化学”，第二次再版，Springer-Verlag，柏林，德国，(1993)，此后简称为Bodanszky，本文中引用了此文的内容作为参考。适当的偶合剂的实例为N，N′-二环己基碳二亚胺、在N，N′-二环己基碳二亚胺存在下的1-羟基苯并***或N-乙基-N′-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺。一个切实有用的偶合剂可以自商业获得：(苯并***-1-基氧基)三-(二甲基氨基)膦六氟磷酸盐，可以直接采用或在1-羟基苯并***或4-DMAP存在下采用。另一个切实可行的偶合剂也可以自商业获得：2-(1H-苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐。另一个切实可行的偶合剂也可以自商业获得：O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐。

偶合反应可以在惰性溶剂中进行，如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺。加入过量的叔胺，如二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷或4-DMAP，以保持反应混合物pH为约8。反应温度通常在0℃和50℃之间，反应时间通常为15分钟至24小时。

构成性非天然氨基酸的官能团通常必须在偶合反应中被保护以避免不需要的键形成。可以使用的保护基团在下文中述及：Greene，“有机化学中的保护基团”，John Wiley & Sons，纽约(1981)，以及“The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology”，第3卷，Academic Press，纽约(1981)，下文中简称为Greene，本文引用此文的内容作为参考。

C-末端基团的α-羧基基团通常被保护为酯，该酯可以被裂解，得到羧酸。可以使用的保护基团包括1)烷基酯如甲基酯、三甲基甲硅烷基酯和叔丁基酯，2)芳烷基酯如苄基酯和取代的苄基酯，或者3)可以通过弱碱或弱还原方式裂解的酯如三氯乙基和苯甲酰甲基酯。

每一个待偶合氨基酸的α-氨基基团通常进行N-保护。任何本领域已知的保护基团均可使用。该基团的实施包括：1)酰基基团如甲酰基、三氟代乙酰基、邻苯二酰基和对-甲苯磺酰基；2)芳香氨基甲酸酯基团如苄氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄氧基羰基，以及9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基团如叔丁基氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基和烯丙基氧基羰基；4)环烷基氨基甲酸酯基团如环戊基氧基羰基和金刚烷基氧基羰基；5)烷基基团如三苯基甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基如三甲基甲硅烷基；以及7)含有巯基的基团，例如苯硫基羰基和二硫杂琥珀一酰基(dithiasuccinoyl)基团的硫醇。优选的α-氨基保护基团为Boc或Fmoc。用于肽合成的许多适当保护的氨基酸衍生物可以自商业获得。

在下一偶合步骤之前，α-氨基保护基团通常会被裂解。当采用Boc基团时，可选择的方法为：无水的或在二氯甲烷中的三氟乙酸、在二氧六环中或乙酸乙酯中的HCl。然后将得到的铵盐中和，中和可以在偶合之前或在原位进行，采用碱溶液如缓冲水溶液、或叔胺的二氯甲烷或乙腈或二甲基甲酰胺溶液。当采用Fmoc基团时，选择的试剂可采用哌啶或取代的哌啶的二甲基甲酰胺液，但也可以使用任何仲胺。脱保护可以于0℃至室温，通常在20-22℃进行。

任何具有侧链官能团的天然或非天然的氨基酸通常可以在肽制备过程中采用任何上文所述基团保护。本领域中的技术人员在选择和使用这些侧链官能团的适当的保护基团时，主要取决于氨基酸和肽中的其它保护基团的存在。在选择这类保护基团时，优选该基团在脱保护和α-氨基基团的偶合过程中不被除去。

例如，当Boc用作α-氨基保护基团时，适于采用下列侧链保护基团：对-甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)基团，可以用于保护氨基酸(如Lys和Arg)的氨基侧链；乙酰氨基甲基、苄基(Bn)或叔-丁基磺酰基基团，可以用于保护含有半胱氨酸侧链的硫基团；苄基(Bn)醚，可以用于保护含有丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸侧链的羟基；以及苄基酯，可以用于保护含有天冬氨酸和谷氨酸侧链的羧基。

当Fmoc用于α-胺保护时，通常可以采用叔丁基类的保护基团。例如，Boc可以用于赖氨酸和精氨酸，叔丁基醚可以用于丝氨酸、苏氨酸和羟基脯氨酸，叔-丁酯用于天冬氨酸和谷氨酸。三苯基甲基(三苯甲基)基团可以用于保护含有半胱氨酸侧链的硫基团。

一旦抑制剂合成完成，可以采用选择保护基团时所指明的任何方法，除去所有的保护基团。这些方法是本领域技术人员所熟知的方法。

合成通式II化合物的第一步通常为在功能化的P1结构单元的溶液中进行制备。本发明化合物可以使用不同的命名规则。为方便起见，此处通常使用碳水合物命名规则。得到双环P1基团的通常流程可以自适当保护的中间体的环闭合开始，可以采用4步骤方法，采用1，2:5，6-二-O-异亚丙基-D-呋喃阿洛糖(allofuranose)获得，如Mayer zum Reckendorf，Chem.Ber.101(1968)，3802-3807所述，得到3S，4R立体化学前体。

流程1.a)H₂、Pd/C、甲醇。b)氯代甲酸苄酯、吡啶、二氯甲烷

在流程1中，例如通过催化氢化，采用钯炭或其它适当的催化剂，在适当的溶剂如醇，例如乙醇或甲醇中，将衍生物1的叠氮基团还原，转化为游离胺。得到的亲质子氮自发地或任选在适当的碱如三乙胺或乙酸钠存在下，与C-6位反应形成5，5-双环。在C-6位的离去基团不仅限于磺酸酯，也包括其它离去基团如卤素，可以用于合成本发明化合物的全过程。也可以通过本领域其它已知的方法将叠氮基团还原为胺，如将叠氮衍生物用三烷基-或三芳基膦处理，随后形成的亚胺衍生物水解。当环闭合后，胺可以用适当的保护基团进行N-保护，如氨基甲酸酯，例如化合物3的氨基甲酸苄酯或任何其它类似的通常不会被酸裂解的保护基团。适当的保护基团可以在下文中找到：Protective groups in organic chemistry，第三版，1999，Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts(Wiley & sons)。

对于3R，4S双环，可以采用类似的方法，但以3-叠氮基-3-脱氧基-1，2:5，6-二-O-异亚丙基-D-呋喃古洛糖作为原料，所述原料可以如Tetrahedron Asymmetry，10(1999)1855-1859所述制备。然后，可以如流程2所述处理中间体。

流程2.a)乙酸水溶液。b)对-甲苯磺酰氯、吡啶、DCM，c)H₂、Pd/C、甲醇。b)氯代甲酸苄酯、吡啶、二氯甲烷。

化合物4可以用弱酸处理，得到二醇，所述弱酸如稀乙酸或类似的可以选择性水解化合物4的5，6-乙缩醛的酸。伯醇可以选择性地与烷基-或芳基磺酰氯如对-甲苯磺酰氯反应，得到化合物5。例如通过催化氢化，采用钯炭或其它适当的催化剂，在适当的溶剂如醇(例如乙醇或甲醇)中，将衍生物5的叠氮基团还原，转化为游离胺。得到的亲质子氮自发地或任选在适当的碱如三乙胺或乙酸钠中，与C-6位反应形成5，5-双环，该双环可以采用适当的保护基团如氨基甲酸苄酯(Cbz)进行N-保护，得到化合物6。

可选择的，3-叠氮基-3-脱氧基-1，2:5，6-二-O-异亚丙基-D-呋喃艾杜糖(Bull.Chem.Soc.Japan，57，1(1984)，237-241)也可以作为流程3的3R，4S双环的适当的起始原料。

流程3.a)乙酸水溶液，b)对-甲苯磺酰氯、吡啶、DCM，c)H₂、Pd/C、甲醇。b)氯代甲酸苄酯、吡啶、二氯甲烷。

化合物6可以用弱酸处理，得到二醇，所述弱酸如稀乙酸或类似的可以选择性水解化合物6的5，6-乙缩醛的酸。伯醇可以选择性地与烷基-或芳基磺酰氯如对-甲苯磺酰氯反应，得到化合物7。例如通过催化氢化，采用钯炭或其它适当的催化剂，在适当的溶剂如醇例如乙醇或甲醇中，将衍生物7的叠氮基团还原，转化为游离胺。得到的亲质子氮自发地或任选在适当的碱如三乙胺或乙酸钠存在下，与C-6位反应形成5，5-双环，该双环可以用适当的保护基团如氨基甲酸苄酯(Cbz)N-保护，得到化合物8。

环闭合不仅限于上述底物，也适用于流程4所述衍生物。

流程4.a)将叠氮化物还原为胺，随后进行环闭合。b)胺的保护。

流程4中的Rx可以选自甲基、三氟甲基、对-甲基苯基或类似的存在于获得的烷基磺酰卤中的基团，优选适于在二醇的伯醇上进行区域选择性反应的体积大的Rx，如下文所述：Chem.Ber.101(1968)，3802-3807。R^1’和R^2’为已定义的R¹和R²。Pg可以为适当的保护基团如氨基甲酸酯，例如氨基甲酸苄酯或任何类似的保护基团，通常不被酸裂解。

另外的可以用于环闭合反应的底物可以为如流程5所述的化合物。

流程5.a)叠氮化物还原为胺，随后环闭合。b)胺的保护(可任选)。

流程5中的Rx可以选自甲基、三氟甲基、对-甲基苯基或类似的存在于获得的烷基磺酰卤中的基团，优选适于在二醇的伯醇上进行区域选择性反应的Rx，如下文所述：Chem.Ber.101(1968)，3802-3807。R^1’和R^2’为上文定义的R¹和R²。Ry可以为氢或羟基保护基团，优选醚类保护基团。优选的Ry为氢。PG可以为适当的N-保护基团，如氨基甲酸酯，对于流程5中的衍生物，Ry通常为氢。

其它得到5，5-双环的方法公开于G.Lin和Z.Shi的Tetrahedron，53，4，1369-1382，1997中。

流程1中得到5，5-双环化合物的另外的改进方法如流程6所示。

流程6.a)苄基溴、氢化钠、DMF。b)BF₃.Et₂O、Et₃SiH、DCM。c)H₂、Pd/C、Boc₂O、1:1 EtOAc-EtOH。d)吡啶、乙酸酐。e)H₂、Pd/C、EtOAc

在质子惰性溶剂如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在所需烷化剂如苄基卤化物，特别是苄基溴存在下，通过用碱如氢化钠或氢氧化钠处理单-醇9，可以将化合物9采用适当的酸稳定保护基团保护，所述保护基团为，例如，取代的甲醚，特别是苄醚。然后，根据下文中所述方法：G.J.Ewing和M.J.Robins，Org.Lett.1，4，1999，635-636，或者其中引用的参考文献的方法，可以将得到的物质还原为化合物10。优选，在还原剂如三烷基硅烷，特别是过量的三乙基硅烷存在下，在适当的非质子溶剂如二氯甲烷中，采用过量的三氟化硼醚合物进行还原。在适当的溶剂或溶剂混合物如乙酸乙酯-乙醇中，在氢气环境中，在二碳酸二-叔-丁基酯存在下，采用例如钯炭进行化合物10的催化氢化，然后将产物用乙酸酐的吡啶液处理得到中间体11。通过如上文所述重复地催化氢化，得到单-醇12。

可以将氟引入化合物12，然后如流程7所示将双环化合物进行N-脱保护。

流程7.a)

二氯甲烷。b)甲醇制甲醇钠。c)1:1二氯甲烷-三氟乙酸。

化合物13可以用氟化剂如[双-(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫]

处理或用类似的氟化剂如二乙基氨基三氟化硫(DAST)处理，完成C-5位构型的转化得到产物14。然后，通过例如用甲醇制甲醇钠处理，或者任何类似的碱性溶液采用无机碱如氢氧化钠或碳酸钠处理，将化合物14脱乙酰化，随后采用酸性条件如二氯甲烷-三氟乙酸溶液进行N-脱保护，其它方法可以在下文中发现：Protective Groups in OrganicChemistry，第三版，1999，Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts(Wiley&Sons)。

可选择的是，根据流程8，通过处理上述衍生物9可以获得差向异构的氟。

流程8.a)偶氮二甲酸二异丙酯、苯甲酸、PPh₃、THF。b)甲醇制甲醇钠。c)苄基溴、氢化钠、DMF。d)BF₃.Et₂O、Et₃SiH、二氯甲烷。e)H₂、Pd/C、Boc₂O、1:1 EtOAc-EtOH。f)吡啶、乙酸酐。g)H₂、Pd/C、EtOAc。h)

二氯甲烷。i)甲醇制甲醇钠。j)1:1二氯甲烷-三氟乙酸。

使化合物16在Mitsunobo条件进行反应，完成C-5的构型的转化，得到苯甲酸酯。酯用甲醇制甲醇钠水解，随后用苄基溴处理单-醇，得到苄基保护的差向异构体17。流程8的反应步骤d-j如流程6和7所述。

另外得到其中R¹和R²为氟代的“二氟代衍生物”的方法如流程9所示。

流程9.a)苄基溴、氢化钠、DMF。b)Et₃SiH、BF₃.Et₂O或三氟代甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、DCM。c)H₂、Pd/C、Boc₂O、EtOAc-EtOH。d)苯甲酰氯、吡啶、DCM。e)H₂、Pd/C、EtOAc。f)Bu₂SnO、甲苯、回流。g)苄基溴、氟化铯、DMF。h)Dess-Martin periodinane。i)

或二乙基氨基三氟化硫、DCM。j)甲醇制甲醇钠。k)H₂、Pd/C、EtOAc。l)对-甲苯磺酰氯、吡啶、DCM。m)DCM、三氟乙酸。n)三乙胺、二氯甲烷。

P1结构单元的合成可以采用化合物21(3-叠氮基-3-脱氧基-1，2-O-异亚丙基-D-呋喃阿洛糖)作为起始原料，如Mayer zum Reckendorf，Chem.Ber.101(1968)，3802-3807所述。在碱如氢化钠或氢氧化钠存在下，在非质子溶剂(如N，N-二甲基甲酰胺)中，将化合物21用苄化剂如苄基溴或苄基氯处理得到衍生物22。然后，在过量Lewis酸如三氟化硼醚合物或三甲基甲硅烷基三氟代甲烷磺酸酯存在下，在非质子溶剂如二氯甲烷中，将化合物22用三烷基硅烷如三乙基硅烷处理。在碳酸二-叔-丁基酯存在下，采用例如钯炭催化氢化，可以将得到的叠氮化物选择性还原，得到化合物23。另外，叠氮化物也可以采用其它本领域已知的方法还原，如采用三苯基膦-水，随后进行保护得到适当的氨基甲酸酯。为避免在下列步骤中的区域选择性问题，化合物23也可以用酰化剂如酰基氯或酸酐，如苯甲酰氯处理，反应在无水有机碱如吡啶或三乙胺中或在非质子溶剂如二氯甲烷和碱的混合物中进行，得到化合物24。化合物24可以如上所述催化氢化，得到二醇25。化合物25的伯醇的选择性苄基化可以采用本领域中已知的几种方法进行。在流程9中，将二醇与二丁基锡氧化物在适当的溶剂如甲苯中回流，形成锡乙缩醛(tin acetal)。然后将锡乙缩醛与少量过量的苄基溴和氟化铯的DMF溶液反应得到所需化合物26。用适当的氧化剂如Dess-Martinperiodinane在二氯甲烷中将26氧化，使仲醇转化为酮化合物27，它适于转化为二氟化物28。在非质子溶剂如二氯甲烷或1，2-二氯乙烷中，用过量氟化剂如

或者二乙基氨基三氟化硫(DAST)处理化合物27，可以完成上述反应。化合物28的苯甲酸酯可以用碱如甲醇制甲醇钠裂解，随后采用催化氢化脱苄基化，得到二醇29。在碱如吡啶的存在下，在适当的溶剂如二氯甲烷中，通过用少量过量的烷基-或芳基磺酰氯处理化合物29，可以完成伯醇的磺酸酯的选择性导入，在低温下，加入磺酰化试剂并缓慢升至室温，这样得到单-醇30。于酸性条件下如二氯甲烷-三氟乙酸的混合物中处理化合物30，释出胺，然后用碱如三乙胺处理产物，促使内环闭合，得到结构单元31。

另外的得到5，5-双环的方法如流程10和11所示。

流程10.a)氟化剂。b)胺的还原或N-脱保护，任选随后进行N-保护。c)还原剂。

在流程10中，衍生物如化合物32(如上所述获得或采用本领域熟知的方法获得)可以用如上文所述的氟化剂处理，产生化合物33，上述化合物32在C-3和C-4的取代基为顺式，Lg为离去基团如卤素或磺酸酯，R为叠氮化物或被适当的N-保护基团保护的氮。当通过叠氮化物还原或通过适当的脱保护方法释放保护的胺时，胺可以在C-6进行分子内反应形成结构34的5，5-双环，它可以任选被N-保护(Pg＝保护基团或氢)。用适当的如上文所述的还原剂或用类似的还原剂还原C-1后得到结构单元35。

在流程11中，阐述了得到二氟代-5，5-双环的另外的可选方法：

流程11.a)氧化。b)氟化剂。c)叠氮化物还原或N-脱保护，任选随后进行N-保护。d)还原剂。

在流程11中，化合物36(如上所述获得或采用本领域熟知的方法获得)可以经Swern-type反应或其它适当的方法氧化，得到化合物37，上述化合物36在C-3和C-4的取代基为顺式，Lg为离去基团如卤素或磺酸酯，R为叠氮化物或被适当的N-保护基团保护的氮。将根据流程11的化合物37用如上文所述的过量的氟化剂处理得到化合物38。当通过叠氮化物还原或通过适当的脱保护方法释放保护的胺时，胺可以在C-6进行分子内反应形成结构39的5，5-双环，它可以任选被N-保护(Pg＝保护基团或氢)。用适当的如上文所述的还原剂或用类似的还原剂还原C-1后得到结构单元40。

一个方便的制备其中R1或R2为卤素如氯的化合物的方法如流程12所述：

流程12

a)亚硫酰氯。B)甲醇制甲醇钠.C)1:1的二氯甲烷-三氟乙酸。D)亚硫酰氯、吡啶

然后，通过常规溶液或固相化学，采用天然或非天然P2氨基酸和P3基团，使得P1结构单元延长，如下文中所列示，或者公开于WO00/69855或WO02/057270。P2和P3基团可以是自商业获得以对映异构体获得或自外消旋物拆分获得，或者采用本领域技术人员熟知的简单的化学转化获得。例如，4-(甲基-哌嗪-1-基)-苯甲酸可以采用Buchwald化学(S.L.Buchwald& J.P.Wolfe，Journal of Organic Chemistry，2000，65，1144)方法获得，随后处理。采用Friedel-Crafts酰化反应，随后采用本领域技术人员已知的标准化学转化处理，可以自1-(4-苯基-哌啶-1-基)-乙酮制备其它P3母核如4-(1-哌啶-4-基)-苯甲酸。可选择的是，如L.S.Richter & T.R.Gadek在Tetrahedron Lett.，1994，35，4705中所述，其它P3基团如5-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-2-苯并呋喃-2-甲酸可以采用Mitsunobu反应以固相方法制备。

流程13.典型的环酮的延长

氨基甲酸酯化合物(即E为-OC(＝O)-)可以例如通过使R₆醇与P2氨基酸的异氰酸酯反应形成。可以通过使P2-氨基酸的氨基基团与光气反应，或在适当的碱如三乙胺中与二硝基苯基碳酸酯反应，形成异氰酸酯，或者相当的反应中间体。或者，它们也可以通过使P2氨基酸的氨基基团与适当的氯代甲酸酯如氯代甲酸苄酯反应形成。

在溶剂如二氯甲烷中，在适当的碱如三乙胺或二甲基氨基吡啶存在下，可以通过使P2氨基酸的氨基基团与适当的磺酰氯反应制备磺酰胺衍生物(即E＝S(＝O)₂-)。

通过使适当的R₆胺在磺酰氯溶剂中反应，随后，在溶剂如二氯甲烷中，在适当的碱如三乙胺存在下，使反应形成的氨磺酰氯衍生物与上文所述R₄氨基酸的氨基基团反应制备硫酰胺衍生物(即E＝NRaS(＝O)₂-)。

含有羟基的P1结构单元也可以被延长，随后被氧化，如流程14和实施例所示。

流程14，典型的羟基化的P1结构单元的延长

此处使用的术语“N-保护基团”或“N-保护的”意指那些在合成过程中欲保护氨基酸或肽的N-末端或保护氨基基团以避免产生不需要的反应的基团。常用的N-保护基团在Greene，“Protective Groups in OrganicSynthesis”(John Wiley & Sons，纽约，1981)中公开，此处引用作为参考。N-保护基团包括酰基基团如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔-丁基乙酰基、2-氯代乙酰基、2-溴代乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二酰基、o-硝基苯氧基乙酰基、α-氯代丁酰基、苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-溴代苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基基团如苯磺酰基、对-甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团如苄氧基羰基、对-氯代苄氧基羰基、对-甲氧基苄氧基羰基、p-硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对-溴代苄氧基羰基、3，4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧基羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔-丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基、环己基氧基羰基、苯硫基羰基等；烷基基团如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；以及甲硅烷基基团如三甲基甲硅烷基等。优选的N-保护基团包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔-丁基乙酰基、苯磺酰基、苄基、t-丁氧基羰基(BOC)以及苄氧基羰基(Cbz)。

羟基和/或羧基保护基团在如上的Greene中也有充分述及，包括醚如甲基醚，取代的甲基醚如甲氧基甲基、甲硫基甲基、苄基氧基甲基、t-丁氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基醚等，甲硅烷基醚如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三苄基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、叔-丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基醚等，取代的乙基醚如1-乙氧基甲基、1-甲基-1-甲氧基乙基、叔-丁基、烯丙基、苄基、p-甲氧基苄基、二苯基甲基、三苯基甲基醚等，芳烷基基团如三苯甲基，以及pixyl(9-羟基-9-苯基氧杂蒽衍生物，特别是氯化物)。酯羟基保护基团包括酯如甲酸酯、苄基甲酸酯、氯代乙酸酯、甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、新戊酸酯(pivaloate)、金刚烷酸酯(adamantoate)、mesitoate、苯甲酸酯等。碳酸酯羟基保护基团包括甲基乙烯基、烯丙基、肉桂基、苄基等。

实施方案的详细说明

参照下列实施例对本发明的各种实施方案进行说明。

实施例1

P1 结构单元的构建

步骤a)

于轻微的正压下，将54(5.2g，13.0mmol)、钯炭(10％，Acros，0.66g)的甲醇混合物氢化。在1小时内换3次氢，经TLC(石油醚-乙酸乙酯7:3和二氯甲烷-甲醇9:1，采用钼酸铵-硫酸铈染色)显示转化完成，即起始原料全部转化为主要的非-UV活性斑点(它使得AMC着色)和部分较弱的略高的移动斑点(二氯甲烷-甲醇9:1)。反应混合物经硅藻土过滤，并浓缩，得到粗品化合物55。

于0℃，向残留物的二氯甲烷(60ml)和吡啶(3.2ml，40mmol)的悬浮液中加入氯代甲酸苄基酯(0.93ml，6.5mmol)。于室温下，搅拌反应混合物2h，然后于0℃，再加入一份吡啶(3ml)和氯代甲酸苄基酯(0.8ml)。然后于室温下搅拌反应混合物过夜，用二氯甲烷(100ml)稀释，顺次用1M硫酸(2×50ml)水溶液和1M碳酸氢钠(1×50ml)水溶液洗涤，然后干燥(硫酸钠)，过滤并于硅胶上浓缩。快速层析(直径：4cm，YMC-凝胶：50g，填充洗脱液：乙酸乙酯的石油醚1:4)残留物，采用乙酸乙酯的石油醚1:4(350ml)、2:3(250ml)、1:1(250ml)、3:2(250ml)和3:1(150ml)洗脱，真空干燥过夜后得到为泡沫状浆状物的化合物56(2.71g，8.1mmol，2步骤62％，)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：¹H，1.33，1.52(2s，6H，C(CH₃)₂)，2.34(2d，1H，-OH)，3.04(m，1H，H-6a)，3.97(m，1H，H-6b)，4.19(m，1H，H-5)，4.33(m，1H，H-3)，4.68，4.84(2d，1H，H-2)，4.79(t，1H，H-4)，5.08-5.24(m，2H，CH₂Ph)，5.86(br s，1H，H-1)，7.30-7.42(m，5H，Ar-H)。

步骤b)

于5分钟内，向搅拌的氢化钠(60％的矿物油，Aldrich，0.34g，8.4mmol)和化合物56(2.17g，6.47mmol)的二甲基甲酰胺(30ml)的悬浮液中加入苄基溴(0.81mmol，6.8mmol)。搅拌1h(TLC：乙酸乙酯的石油醚2:3)后，加入甲醇(约2ml)破坏过量的反应物，然后迅速分配于乙酸乙酯(180ml)和水(150ml)。有机层经水(3×100ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。快速层析(直径：4cm，YMC-凝胶：40g，填充洗脱液：乙酸乙酯的石油醚1:4)残留物，采用乙酸乙酯的石油醚1:4(100ml)、3:7(250ml)和2:3(250ml)洗脱，经真空干燥过夜，得到无色浆状物(2.7g，6.35mmol，98％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：¹H，1.31(s，3H，C(CH₃)(CH₃))，1.51(d，3H，C(CH₃)(CH₃))，3.29(m，1H，H-6a)，3.78-3.96(m，2H，H-5和H-6b)，4.22(dd，1H，H-3)，4.64，4.84(2M，4H，H-2，H-4和CH₂Ph)，5.07-5.22(m，1H，CH₂Ph)，5.94(m，1H，H-1)，7.28-7.39(m，10H，Ar-H)。

步骤c)

于0℃，向搅拌的化合物7(2.635g，6.19mmol)的二氯甲烷(28ml)和三乙基硅烷(9.9ml，61.9mmol)的溶液中加入一份三氟化硼醚合物(7.9ml，61.9mmol)。然后于室温下，搅拌反应混合物24h(TLC：石油醚-乙酸乙酯4:1和乙酸乙酯-甲苯3:2)，然后小心加入1M碳酸氢钠(40ml)水溶液和部分固体碳酸氢钠，直至泡沫停止产生。得到的混合物分配于二氯甲烷(100ml)和水(100ml)。有机层用1M碳酸氢钠(1×100ml)水溶液和盐水(1×100ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)，过滤并于硅胶上浓缩。快速层析(直径：4cm，YMC-凝胶：48g，填充洗脱液：乙酸乙酯-甲苯3:2)残留物，采用乙酸乙酯的甲苯液3:2(750ml)作为洗脱液，得到无色浓浆状物(1.38g，3.74mmol，60％)，采用TLC测定的纯度为约85-90％.LR-MS：C₂₁H₂₄NO₅的计算值为370.2。实测值为：370.0[M+H]。

步骤d)

于略高的压力下，将化合物58(1.38g，3.74mmol)、钯炭(Acros，10％，0.12g)和二碳酸二-叔-丁基酯(0.82g，3.7mmol)的乙酸乙酯(50ml)的混合物氢化。于1小时内换2次氢，反应经LC-MS监测。1小时后，再加入一份钯炭(0.1g)，将反应混合物用氢再处理1小时。然后经硅藻土过滤反应混合物并浓缩。残留物用2:1吡啶-乙酸酐(18ml)处理过夜，然后浓缩。残留物溶于二氯甲烷(60ml)并顺次用1M硫酸(2×40ml)水溶液和1M碳酸氢钠(1×40ml)水溶液洗涤，然后干燥(硫酸钠)过滤并浓缩。快速层析(直径：3cm，YMC-凝胶：20g，填充洗脱液：乙酸乙酯的甲苯液1:4)残留物(溶于甲苯-乙酸乙酯4:1)，采用乙酸乙酯的甲苯液1:4(200ml)和1:3(150ml)作为洗脱液，经真空干燥过夜后得到无色浆状物(1.13g，3.0mmol，80％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：¹H，1.45(s，9H，C(CH₃)₃)，2.08(s，3H，COCH₃)，3.10(m，1H，H-6a)，3.74-3.99(m，3H，H-1a，H-5和H-6b)，4.11(m，1H，H-1b)，4.16-4.74(m，4H H-3，H-4和CH₂Ph)，5.31(m，1H，H-2)，7.28-7.40(m，5H，Ar-H)。

步骤e)

于较高的压力下，将化合物60(1.08g，2.86mmol)和钯炭(10％，0.15g)的乙酸乙酯(30ml)的混合物氢化2h(TLC：甲苯-乙酸乙酯4:1和1:1)，然后经硅藻土过滤，浓缩。自二氯甲烷(3×10ml)中浓缩混合物，然后溶于二氯甲烷，于0℃，向溶液中加入双-(2-甲氧基乙基)氨基硫三氟化物(50％的THF，2.12ml，2当量)。于室温搅拌过夜，再加入一份双(2-甲氧基乙基)氨基硫三氟化物(50％的THF，2ml)，于室温下，将反应混合物再搅拌一夜(TLC：甲苯-乙酸乙酯1:1，茚三酮染色)，然后小心加入1M碳酸氢钠水溶液至泡沫停止产生。得到的混合物用二氯甲烷(50ml)稀释，将有机层用1M碳酸氢钠(40ml)水溶液洗涤1次，然后干燥(硫酸钠)、过滤并浓缩。快速层析(直径：3cm，硅胶：25g，填充洗脱液：甲苯-乙酸乙酯4:1)残留物(溶于甲苯-乙酸乙酯4:1)，采用甲苯-乙酸乙酯4:1作为洗脱液，真空干燥过夜后，得到为无色浆状物的化合物62(0.49g，1.7mmol，59％)。某些起始原料和硫中间体可以自反应混合物中回收。

LR-MS：C₉H₁₃FNO₅计算值：234.1。实测值：234.0[M+2H-叔-丁基]。

实施例2

采用典型P2的延长

步骤a)

向化合物62(0.49g，1.7mmol)的甲醇(9.5ml)溶液中加入0.5M甲醇制甲醇钠(1ml)，然后于室温下搅拌30分钟(TLC：甲苯-乙酸乙酯3:2，茚三酮染色)。小心加入甲醇洗涤的Dowex W×8(50-100目，H⁺-型)(pH经pH-试纸检测)直到中性，然后过滤混合物，并浓缩。残留物溶于二氯甲烷，于0℃加入三氟乙酸。然后于室温下搅拌反应混合物55分钟(TLC：二氯甲烷-甲醇9:1，茚三酮染色)，然后浓缩。柱层析(直径：2cm，硅胶：15g，填充洗脱液：二氯甲烷-甲醇95:5)残留物(溶于二氯甲烷-甲醇95:5)，采用甲醇的二氯甲烷液5:95(150ml)、7:93(100ml)和1:9(200ml)作为洗脱液，得到浓浆状物，放置后结晶(0.39g，1.50mmol，88％)。

NMR数据(400MHz，DMSO-d6)：¹H，3.34，3.44(2dd，1H，H-6a)，3.60-3.70(m，2H，H-1a和H-6b)，3.89(dd，1H，H-1b)，4.15(d，1H，H-3)，4.51(br s，1H，H-2)，4.76(dd，1H，H-4)，5.26(dd，²J_H，F＝48.3Hz，H-5)。

步骤b)

向搅拌的化合物64(0.34g，1.30mmol)、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.28g，1.43mmol)、1-羟基苯并***水合物(0.22g)和N-(叔-丁氧基羰基)-L-亮氨酸单水合物(0.34g，1.37mmol)的DMF(10ml)溶液中加入三乙胺(0.54ml，3.9mmol)，然后于室温下搅拌24h。反应混合物分配于10％柠檬酸(30ml)和乙酸乙酯(10ml)水溶液之间。水层用乙酸乙酯(3×10ml)萃取，然后合并有机层，顺次用水(1×20ml)和1M碳酸氢钠水溶液(3×20ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。采用乙酸乙酯的石油醚液(40-60％，逐步梯度洗脱)，快速层析残留物，得到15(0.35g，0.98mmol，75％)，为无色不定形固体。

LR-MS：C₁₃H₂₂FN₂O₅计算值：305.1。实测值：305.1[M+2H-叔-丁基]。

实施例3

采用典型P3的延长

于0℃，向化合物65(0.11g，0.31mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)，然后于室温下搅拌45分钟。浓缩反应混合物，然后再与甲苯共浓缩。向残留物、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.064g，0.34mmol)、1-羟基苯并***水合物(0.051g)和苯并[b]呋喃-2-甲酸(0.052g，0.32mmol)的DMF(3ml)悬浮液中加入三乙胺(0.13ml，0.9mmol)，然后于室温下搅拌24h。浓缩反应混合物。残留物分配于10％柠檬酸(30ml)和乙酸乙酯(10ml)水溶液。水层经乙酸乙酯(2×10ml)萃取，合并有机层，顺次用水(1×10ml)和1M碳酸氢钠(3×10ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。快速层析残留物，洗脱液为乙酸乙酯的石油醚液(50-60％，逐步梯度洗脱)，得到66(0.11g，0.27mmol，89％)，为无色玻璃状固体。

LR-MS：C₂₁H₂₆FN₂O₅计算值：405.2。实测值：405.1[M+H]。

实施例4

氧化为P1酮。

于室温下，向搅拌的化合物66(0.10g，0.25mmol)的二氯甲烷(4ml)的溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.12g，0.28mmol)。搅拌90分钟后，将反应混合物用二氯甲烷(10ml)稀释，用1:1的1M碳酸氢钠水溶液-10％硫代硫酸钠水溶液(4×10ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)，过滤并于硅胶上浓缩。快速层析残留物，采用乙酸乙酯的石油醚液(50-60％，逐步梯度洗脱)作为洗脱液，得到67(0.072g，0.18mmol，71％)，为无色泡沫。得到的化合物67为几何异构体(旋转异构体)和它们的水合物的混合物。

LR-MS：计算值C₂₁H₂₄FN₂O₅：403.2.实测值：403.0[M+H]。67酮形式的NMR样品可以如下获得：将5mg化合物67(几何异构体和水合物形式的混合物，比率为：水合物/酮6:4)溶于DMSO-d6，然后在NMR设备上加热至100℃，然后降到50℃，此时NMR显示只有痕量的水合物形式，旋转异构体的比率为2:1。

NMR数据(500MHz，DMSO-d6，50℃)：¹H，0.90-1.04(m，4×CH₃，主要和次要形式)，1.39-1.82(m，2×CH₂CH(CH₃)₂和2×CH₂CH(CH₃)₂，主要和次要形式)，3.56(m，H-6a，次要形式)，3.82(m，H-6A，主要形式)，3.97-4.25(m，4×H-1，主要和次要形式以及H-6b，次要形式)，4.37(dd，H-6b，主要形式)，4.62(d，H-3，次要形式)，4.79(m，H，主要形式)，4.84(d，H-3，主要形式)，4.94(m，H-4，主要形式)，5.12(m，H-4，次要形式)，5.15-5.34(m，H-5主要形式和H-5次要形式，H次要形式，J_H，F主要形式＝49.1Hz，J_H，F次要形式＝49.4Hz)，7.35(t，1H，Ar-H)，7.47(t，1H，Ar-H)，7.57-7.70(m，2H，Ar-H)，7.78(d，1H，Ar-H)，8.18(d，-NH，次要形式)，8.70(d，-NH，主要形式)。

实施例5

另外的P3

步骤a)

于0℃，向化合物55(0.11g，0.32mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)。于室温下，搅拌45分钟(TLC：石油醚-乙酸乙酯1:1和乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水40:3:3:2)，将反应混合物浓缩并自甲苯(3×5ml)共浓缩。向残留物、4-(二甲基氨基)苯甲酸(0.055g，0.33mmol)、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.067g，0.35mmol)和1-羟基苯并***水合物(0.053g)的DMF(3ml)的悬浮液中加入三乙胺(0.13ml，0.95mmol)，然后于室温下搅拌过夜(TLC：石油醚-乙酸乙酯2:3和乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水40:3:3:2)。然后浓缩反应混合物，于8％KH₂PO₄(30ml)水溶液和乙酸乙酯(10ml)之间分配。水层经乙酸乙酯(3×10ml)萃取，合并的有机层用水(1×10ml)和1M碳酸氢钠(3×10ml)水溶液洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并将残留物浓缩，溶于二氯甲烷，再于硅胶上浓缩。快速层析(直径：2cm，硅胶：8g，填充洗脱液：石油醚-乙酸乙酯1:1)残留物(逐步梯度洗脱，乙酸乙酯的石油醚液50-100％)，得到无色泡沫(0.10g，0.25mmol，80％)。

LR-MS：C₂₁H₃₁FN₃O₄计算值：408.2。实测值：408.1[M+H]。

步骤b)

于室温下，向搅拌的单-醇68(0.096g，0.24mol)的二氯甲烷溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.11g，0.26mmol)。反应混合物变红，搅拌约35分钟后(TLC：石油醚-乙酸乙酯2:3)，反应混合物用二氯甲烷稀释(10ml)，用1:11M碳酸氢钠水溶液-10％硫代硫酸钠水溶液(4×10ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。快速层析(直径：2cm，硅胶：7g，填充洗脱液：石油醚-乙酸乙酯1:1)残留物(逐步梯度洗脱，乙酸乙酯的石油醚液50-100％)，得到无色泡沫(0.039g，0.10mmol，41％)。

LR-MS：计算值C₂₁H₂₇FN₃O₄：404.2。实测值：404.1[M-H]。

实施例6

另外的P3

步骤a)

于0℃向化合物55(0.12g，0.32mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)，然后于室温下搅拌45分钟。然后浓缩反应混合物，并与甲苯(3×5ml)共浓缩。向残留物、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.068g，0.36mmol)、1-羟基苯并***水合物(0.055g)和4-苯氧基苯甲酸(0.073g，0.34mmol)的DMF(3ml)的悬浮液中加入三乙胺(0.14ml，0.97mmol)，然后于室温下搅拌24h。浓缩反应混合物。残留物分配于10％柠檬酸水溶液(30ml)和乙酸乙酯(10ml)。水层经乙酸乙酯(2×10ml)萃取，然后合并有机层，顺次用水(1×1oml)和1M碳酸氢钠(3×10ml)水溶液洗涤，干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。快速层析残留物，采用1:1乙酸乙酯的石油醚液作为洗脱液，得到无色浓浆状物(0.14g，0.30mmol，91％)。

LR-MS：C₂₅H₃₀FN₂O₅计算值：457.2。实测值：457.2[M+H]。

步骤b)

于室温下，向搅拌的单-醇(0.128g，0.28mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.12g，0.28mmol)。搅拌90分钟后，反应混合物用二氯甲烷(10ml)稀释，用1:1 1M碳酸氢钠水溶液-10％硫代硫酸钠水溶液(4×10ml)洗涤，干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。快速层析残留物，采用乙酸乙酯的石油醚液(50-60％，逐步梯度洗脱)作为洗脱液，得到71(0.072g，0.18mmol，71％)，为无色泡沫。

LR-MS：C₂₁H₂₈FN₂O₅计算值：455.2。实测值：455.1[M+H]。

实施例7

另外的P1差向异构体.

步骤a)

于室温下，向搅拌的化合物(60)(1.58g，4.19mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入0.5M甲醇钠的甲醇(5mL)溶液，然后搅拌40分钟。反应混合物用Dowex 50 WX8(H⁺-型)中和，过滤，加入三乙胺至弱碱性，然后浓缩并自甲苯(2×20mL)浓缩。于0℃，向搅拌的残留物和咪唑(0.43g，6.28mmol)的DMF(10mL)溶液中加入叔-丁基二甲基氯代硅烷(0.76g，5.02mmol)，然后于室温下搅拌过夜。然后将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，顺次用10％柠檬酸水溶液(3×50mL)和1M碳酸氢钠水溶液(3×50mL)洗涤，干燥(硫酸钠)、过滤并于硅胶上浓缩。柱层析(逐步梯度洗脱，乙酸乙酯的甲苯液，5-20％)残留物，得到完全保护的中间体，为浆状物(1.86g)。于略高的压力下，将钯炭(Aldrich10％，0.28g)和上述得到的中间体(1.80g，4.00mmol)的混合物的乙酸乙酯(40mL)液氢化1h，然后经硅藻土过滤并浓缩。结晶的物质经真空干燥得到72，为针状物(1.34g，90％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：¹H，σ0.14(m，6H，Si(CH₃)₂)，0.90(m，9H，SiC(CH₃)₃)，1.48(m，9H，C(CH₃)₃)，2.53(m，1H，OH)，2.78(dd，1H，-H-6A)，3.67-4.05(m，3H，H-1A，H-1B和H-6B)，4.05-4.21(m，2H，H-3和H-5)，4.35-4.50(2brs，1H，H-2)，4.57(m，1H，H-4)。

步骤b)

于0℃，20分钟内向搅拌的(72)(1.068g，2.97mmol)、苯甲酸(0.50g，4.46mmol)和三苯膦(1.17g，4.46mmol)的THF(15mL)溶液中滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(0.88mL，4.46mmol)的THF(5mL)溶液。然后于室温下搅拌反应混合物过夜，于硅胶上浓缩。快速层析残留物，采用石油醚-乙酸乙酯9：1作为洗脱液，得到无色浆状物(1.34g，97％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：1H，δ 0.08-0.21(m，6H，Si(CH₃)₂)，0.90(s，9H，SiC(CH₃)₃)，1.42-1.56(m，9H，C(CH₃)₃)，3.48(m，1H，H-6A)，3.70-4.01(m，3H，H-1A，H-1B，H-6B次要形式和主要形式)，4.21，4.30(2d，1H，H-3)，4.44，4.56(2brs，1H，H-2)，4.72(m，1H，H-4)，5.34(d，1H，H-5)，7.45(t，2H，Ar-H)，7.58(t，1H，Ar-H)，8.00(d，2H，Ar-H)。

步骤c)

于室温下，向搅拌的(73)(1.34g，2.89mmol)的甲醇(6mL)溶液中加入0.5M甲醇钠的甲醇(6mL)溶液，然后搅拌15分钟。反应混合物用Dowex 50WX8(H⁺-型)中和并过滤。将得到的溶液加至类似于上文所述自(II)(0.187g，0.40mmol)得到的溶液中，然后浓缩。快速层析残留物，采用甲苯-乙酸乙酯3:2作为洗脱液，得到为无色浆状物的74，经真空干燥结晶(1.091g，92％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：1H，δ 0.06-0.20(m，6H，Si(CH₃)₂)，0.89(s，9H，SiC(CH₃)₃)，1.42-1.54(m，9H，C(CH₃)₃)，2.03(brs，1H，OH)，3.28(dd，1H，H-6A)，3.53-3.79(m，3H，H-1A，H-1B，H-6B)，4.19和4.34-4.56(2m，4H，H-2，H-3，H-4和H-5)。

步骤d)

于室温下，向在涂有特氟纶的烧瓶中的搅拌的(74)(0.428g，1.19mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中在加入脱氧氟石(Deoxofluor)(50％的THF，0.53mL)，导致温度略有提高。于室温下，搅拌反应混合物72h，然后用二氯甲烷(20mL)稀释，用1M碳酸氢钠水溶液(2×20mL)洗涤、干燥(硫酸钠)，过滤并于硅胶上浓缩。快速层析残留物，采用石油醚-乙酸乙酯9:1作为洗脱液，得到(IV)，为无色油状物(0.118g，27％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：1H，δ 0.08-0.20(m，6H，Si(CH₃)₂)，0.89(s，9H，SiC(CH₃)₃)，1.42-1.53(m，9H，C(CH₃)₃)，3.26和3.36(2dd，1H，H-6A)，3.64(m，1H，H-1A)，3.73-4.04(m，3H，H-1B，H-6B)，4.20(dd，1H，H-3^＊)，4.40，4.51(2s，1H，H-2)，4.69(m，1H，H-4^＊)4.86，4.98(2brs，1H，H-5)。^＊表示可以相互转化。

步骤e)

向搅拌的(75)(0.229g，0.63mmol)的THF(8mL)溶液中加入1M四丁基氟化铵的THF(0.70mL)液，然后于室温下搅拌40分钟。然后将反应混合物于硅胶上浓缩。柱层析残留物，采用甲苯-乙酸乙酯1:1作为洗脱液，得到75，为无色浓浆状物(0.150g，96％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃)：1H，δ 1.46-1.53(m，9H，C(CH₃)₃)，2.70(d，0.3H，OH-次要形式)，3.26-3.46(m，1.7H，H-6A和OH-主要形式)，3.75-4.04(m，3H，H-1A，H-1B和H-6B)，4.29，4.34(2d，1H，H-3^*次要形式和主要形式)，4.43，4.50(2 brs，1H，H-2次要形式和主要形式)，4.74(m，1H，H-4^＊)，4.89，5.02(2 brs，1H，H-5)。

步骤f)

于0℃，向(75)(0.099g，0.40mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液中加入三氟乙酸(2mL)，然后于室温下搅拌35分钟，然后浓缩并自甲苯(3×5mL)浓缩。向残留物、1-羟基苯并***水合物(0.067g，0.44mmol)、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺×HCl(0.084g，0.44mmol)和N-(叔-丁氧基羰基)-L-亮氨酸单水合物(0.105g，0.42mmol)的DMF(4mL)的悬浮液中加入三乙胺(0.17mL，1.2mmol)，然后于室温下搅拌过夜。然后将反应物浓缩至一半体积，用乙酸乙酯(25mL)稀释，顺次用10％柠檬酸水溶液(3×15mL)和1M碳酸氢钠水溶液(3×15mL)洗涤、干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。柱层析残留物，采用乙酸乙酯-甲苯3:2作为洗脱液，得到(76)，为无色浓浆状物(0.137g，95％)。

NMR数据(400MHz，CDCl₃，可选择信号)：1H，δ 0.89-1.01(m，6H，C(CH)₂)，4.98，5.07(2dd，1H，H-5主要形式和H-5次要形式)。

LR-MS：C₁₇H₃₀FN₂O₅计算值：361.2。实测值：361.1[M+H]。

步骤g)

于0℃，向(76)(0.137g，0.38mmol)的二氯甲烷溶液中加入TFA，然后于室温下搅拌30分钟，然后浓缩并自甲苯(3×5mL)浓缩。向残留物、1-羟基苯并***水合物(0.064g，0.42mmol)、N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺×HCl(0.080g，0.42mmol)和苯并[b]呋喃-2-甲酸(0.065g，0.40mmol)的DMF(3mL)悬浮液中加入三乙胺(0.16mL，1.2mmol)，然后于室温下搅拌过夜。将反应物浓缩至一半体积，用乙酸乙酯(25mL)稀释，顺次用10％柠檬酸水溶液(3×15mL)和1M碳酸氢钠水溶波(3×15mL)洗涤、干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。柱层析残留物，采用乙酸乙酯-甲苯3:2作为洗脱液，得到(77)，为无色浓浆状物(0.148g，96％)。

LR-MS：C₂₁H₂₆FN₂O₅计算值：405.2。实测值：405.1[M+H]。

步骤h)

于室温下，向搅拌的(77)(0.148g，0.37mmol)的二氯甲烷溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.171g，0.40mmol)。搅拌2h后，反应混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，然后用1:1 1M碳酸氢钠水溶液/10％硫代硫酸钠水溶液(3×12mL)洗涤，干燥(硫酸钠)，过滤并浓缩。柱层析残留物(逐步梯度洗脱，乙酸乙酯的甲苯液，40-50％)，得到为无色泡沫的(VIII)(0.105g，71％)。

NMR数据(100MHz，CDCl₃，可选择信号)：¹³C，δ 206.7和206.5(C＝O主要形式和次要形式)。

LR-MS：C₂₁H₂₄FN₂O₅计算值：403.2。实测值：403.1[M+H]。

实施例8

另外的组织蛋白酶K抑制剂

采用下面列举的固相方法，可以通过将下表中的N-保护的P2和P3酸依次与实施例1的P1结构单元偶合，合成下表中所述化合物8.1-8.13和8.15-8.20。化合物8.14可以通过下面列举的方法在溶液相中合成。不易自商业获得的P2和P3结构单元的构建如下所示。

表1

P2 结构单元

8.1-8.13和8.15-8.67的固相合成通常采用Murphy’s连接方法学，用WO02/88106所述已知的化学方法进行。FmocNH双环的酮官能团衍生为具有酸不稳定的缩氨基脲，它提供了用于连接至氨甲基功能化聚合物载体树脂(采用HBTU、HOBt和NMM)的羧酸。经除去Fmoc后，相应的P2 Fmoc酸在形成的对称性的酐上进行偶合。偶合最初进行8h，然后用新鲜的反应物重复反应过夜。除去Fmoc后，采用标准的偶合条件引入P3酸。洗涤、干燥并自脂裂解得到所需的粗品物质，可以经柱层析或制备性hplc纯化。需要进行修饰的化合物如下文所述。

1H-吲哚-2-甲酸[1-(6-氟代-3-氧代-六氢呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲 基-丁基]-酰胺(实施例8.6)

向树脂结合的H₂N-L-Leu-P1(150mg，0.03mmol)中加入吲哚-2-甲酸(24.2mg，0.15mmol)的DMF(1.0mL)溶液。然后再加入1，3-二异丙基碳二亚胺(19mg，0.15mmol)和1-羟基苯并***水合物(23mg，0.15mmol)的DMF(1mL)的溶液。剧烈搅拌反应物过夜，然后用DMF(7×10mL)、MeOH(5×10mL)和TBME(5×10mL)洗涤。真空干燥17h后，通过悬浮在10mL的95:5TFA:水中45分钟，使得产物自树脂裂解。在N₂气流下，浓缩滤液，经半制备性HPLC纯化，然后冻干得到目标化合物，为白色固体。化合物经HPLC定性，¹H NMR和MS显示酮和水合物形式存在。

4-哌啶-4-基苯甲酸(实施例8.9)

将4-苯基哌啶(10.0g，62mmol)和吡啶(5.74mL，71mmol)溶于DCM(80mL)液中，并冷却至0℃。将乙酰氯(4.00mL，71mmol)的DCM(20mL)溶液滴加入上述溶液中。然后于室温下搅拌混合物2h，经hplc确定反应完成，用水萃取，干燥并真空浓缩得到淡黄色油状物(10.6g，84％)，放置后固化，可以不经进一步纯化使用。将黄色油状物(10.6g，52.2mmol)溶于DCM，并冷却至-78℃，滴加入草酰氯(18.3mL，209mmol)，随后分次加入氯化铝(20.9g，157mmol)处理。当加入完成后，将烧瓶放置入冰-盐浴中，于-20℃，搅拌混合物3h，于室温下过夜。然后将混合物倾于冰-水上，用DCM(100mL×3)萃取，干燥并真空浓缩。残留物溶于NaOH(2N)水溶液，然后于0℃加入HCl(6N)，酸化溶液至pH5。滤出沉淀(7.9g)，用水(200mL)洗涤。残留物悬浮于6N HCl，并于回流下加热18h。蒸发溶剂，残留物自乙醇再结晶。滤出晶体，得到目标化合物(5.05g，63％)。

4-(5-哌啶-1-基甲基-噻吩-2-基)苯甲酸(实施例8.15)

将5-溴代-2-噻吩甲醛(10mmol)和哌啶(10mmol)于THF(10mL)中混合，加入二氯化二丁基锡(0.2mmol)。于室温下搅拌5分钟。加入苯基硅烷(11mmol)，反应物于室温下再搅拌17h。然后将反应物真空浓缩，残留物经快速层析纯化(硅胶，DCM)，得到1-(5-溴代-噻吩-2-基甲基)-哌啶：MSES+：m/z＝260，262，金色油状物，可以直接用于随后的步骤。向装有磁搅拌棒的反应试管中加入4-羧基苯基硼酸酯(0.05mmol)、噻吩溴化物(0.05mmol)、Pd(PPh₃)₄(0.025mmol)、乙腈(2mL)和1M Na₂CO₃(水溶液)(2mL)。然后密封反应试管并经微波照射加热(100W，4分钟)至150℃，并于此温度放置10分钟。冷却至室温后，用1M HCl将反应液酸化至pH1，得到的沉淀滤出。然后将粗品产物通过硅胶柱除去所有的无机部分，并浓缩得到目标化合物，为棕色粉末，MS ES+：m/z＝304，经hplc和MS定性，并不经进一步纯化用于下一步骤。

4-(5-吗啉-4-基甲基-噻吩-2-基)苯甲酸(实施例8.16)

为合成4-(5-吗啉-4-基甲基-噻吩-2-基)苯甲酸，在前述试验中，用吗啉取代哌啶。

5-[2-(4，4-二氟代-哌啶-1-基)-乙氧基]-苯并呋喃-2-甲酸(实施例8.17)

向4，4-二氟代哌啶盐酸盐(1g，6.3mmol)的THF(20mL)溶液中加入溴代乙酸甲酯(0.63mL，6.6mmol)和三乙胺(2.65mL，19.0mmol)。于回流下，加热反应物4h。反应物用水(50mL)稀释，产物经乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机部分用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，真空浓缩得到(4，4-二氟代哌啶-1-基)乙酸甲酯，为棕色油状物(1.17g，96％)。MS194(M+H)⁺。于0℃，向(4，4-二氟代哌啶-1-基)乙酸甲酯(1.17g，6.1mmol)的THF(15mL)溶液中分次加入氢化铝锂(0.46g，12.2mmol)。一旦反应停止产生泡沫，将反应物于60℃加热1.5h。先用水(10mL)、随后用氢氧化钠溶液(2N，10mL)、然后再用水(10mL)淬灭反应。过滤反应物，滤液用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机部分用盐水洗涤，经硫酸镁干燥并真空浓缩得到2-(4，4-二氟代哌啶-1-基)-乙醇，为棕色油状物(0.99g，99％)。MS166(M+H)⁺。向二异丙基偶氮二甲酸酯(0.36mL，1.82mmol)的DCM(20mL)溶液中加入聚合物负载的三苯膦(728mg，2.18mmol)。于室温下，搅拌反应物10分钟。加入5-羟基苯并呋喃-2-甲酸乙酯(0.25g，1.21mmol)和2-(4，4-二氟代哌啶-1-基)-乙醇(210mg，1.27mmol)，于室温下，搅拌反应物16h。过滤反应物并将滤液真空浓缩。产物经硅胶纯化，用50％叔-丁基甲醚的n-庚烷液洗脱，得到5-[2-(4，4-二氟代哌啶-1-基)乙氧基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯，为黄色固体(375mg，88％)。MS354(M+H)⁺。向5-[2-(4，4-二氟代哌啶-1-基)乙氧基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯(375mg，1.06mmol)的THF(5mL)和水(1mL)的溶液中加入氢氧化锂(34mg，2.12mmol)。于室温下，搅拌反应物16h。真空除去THF，剩余的水溶液在冻干机中干燥过夜，得到粗品目标化合物，为棕色固体。MS 326(M+H，5.3分钟)，可以不经进一步纯化用于H₂N-Leu-P1偶合。

5-[2-(4-三氟代甲基-哌啶-1-基)-乙氧基]-苯并呋喃-2-甲酸(实施例8.18)

向4-三氟代甲基哌啶盐酸盐(1g，5.3mmol)的THF(20mL)溶液中加入溴代乙酸甲酯(0.52mL，5.5mmol)和三乙胺(2.2mL，15.8mmol)。于回流下，加热反应物4h，然后用水(50mL)稀释，产物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机部分用盐水洗涤，经硫酸镁干燥并真空浓缩得到(4-三氟代甲基哌啶-1-基)乙酸甲酯，为棕色油状物(1.19g，98％)。MS 226m+H)⁺。于0℃，向(4-三氟代甲基哌啶-1-基)乙酸甲酯(1.19g，5.3mmol)的THF(15mL)溶液中分次加入氢化铝锂(0.4g，10.6mmol)。当泡沫停止产生后，于60℃加热反应物1.5h。先用水(10mL)，随后用氢氧化钠溶液(2N，10mL)，然后用水(10mL)淬灭反应。过滤反应物，滤液用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机部分用盐水洗涤，经硫酸镁干燥并真空浓缩，得到2-(4-三氟代甲基哌啶-1-基)-乙醇，为棕色油状物(1.0g，99％)。MS198(M+H)⁺。向二异丙基偶氮二甲酸酯(0.58mL，2.28mmol)的DCM(20mL)溶液中加入聚合物负载的三苯膦(1.14g，3.4mmol)。于室温下搅拌反应物10分钟。加入5-羟基苯并呋喃-2-甲酸乙酯(0.47g，2.3mmol)和2-(4-三氟代甲基哌啶-1-基)-乙醇(0.45g，2.28mmol)，于室温下搅拌反应物16h。过滤反应物，真空浓缩滤液。产物经硅胶纯化，洗脱液为50％叔-丁基甲醚的n-庚烷液，得到5-[2-(4-三氟代甲基哌啶-1-基)乙氧基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯，为黄色固体(548mg，62％)。MS386(M+H)⁺。向5-[2-(4-三氟代甲基哌啶-1-基)乙氧基]苯并呋喃-2-甲酸乙酯(548mg，1.42mmol)的THF(5mL)和水(1mL)的溶液中加入氢氧化锂(45mg，2.84mmol)。于室温下搅拌反应物16h。真空除去THF，残留的水溶液在冻干机上干燥过夜，得到粗品目标化合物，为棕色固体。MS358(M+H)⁺，可以直接用于与H₂N-Leu-P1偶合。

4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.19和8.20)

于室温下，向硫代羰基二咪唑(2g，11.5mmol)的THF(30mL)中滴加N-甲基哌嗪(1.00g，10mmol)。于室温下搅拌反应物2h，然后于55℃，搅拌1h。反应物冷却至RT，真空除去20mL THF。加入2M NH₃(10mL)的MeOH液并搅拌反应物15h。再加入2M NH₃(10mL)的MeOH液，将反应物保持于55℃8h。观察得到淡黄色沉淀(1.00g)，过滤，干燥，直接用于下一步骤。将硫脲(0.84g，5.2mmol)溶于EtOH(30mL)，并加入4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(1.28g，5.2mmol)。于回流下，加热反应物3h。冷却反应物至RT，滤出固体。固体用Et₂O洗涤并充分干燥。该方法提供了目标化合物，为淡黄色固体(1.23g，77％)。

[1-(6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-环己基]-氨基甲酸 9H-芴-9-基甲酯(实施例8.20)

将Fmoc-1-氨基-1-环己烷甲酸(0.300mg，0.82mmol)溶于DCM(8mL)并加入DAST(1mL，8.2mmol)。1.5h后，起始原料全部消耗，小心滴加入H2O(5mL)。除去有机层，干燥(Na₂SO₄)并真空浓缩得到淡棕色固体(0.287g，96％)。该粗品物质可以直接用于下一步骤。将(1-氟代羰基-环己基)-氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.050g，0.135mmol)溶于DMF(1mL)并加至H₂N-P1的DMF(1mL)中。加入NMM(0.027g，0.27mmol)并将反应物放置过夜。滤除树脂以除去用过的反应物并加入新的反应物，再重复反应24h。用DMF(10mL×10)和DCM(10mL×10)洗涤后，得到与树脂结合的目标化合物(负荷当量为50％收率)。

[1-(6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-氨基 甲酸苄酯(实施例8.14)

实施例8.14 在溶液中制备，而非在固相上制备。

于0℃，将6-氟代-3-羟基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-甲酸叔-丁酯(0.200g，0.81mmol)溶于DCM(4mL)，加入TFA(4mL)。于0-4℃搅拌1h后，溶剂真空蒸发，并于高真空下将残留物放置4h，得到棕色油状物。残留物溶于DMF(5mL)，加入WSC.HCl(171mg，0.89mmol)、HOBt(137mg，1.01mmol)、Cbz-Leu-OH(226mg，0.85mmol)和Et₃N(337μl，2.43mmol)。于室温下搅拌过夜后，将反应混合物真空浓缩，溶于EtOAc(10mL)，用H₂O(5mL)和饱和的NaHCO₃溶液(5mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并真空蒸发得到无色油状物(242mg；[M+H]⁺395)。将[1-(6-氟代-3-羟基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-氨基甲酸苄酯(242mg，0.62mmol)溶于无水DCM(8mL)，加入Dess-Martin periodinane(261mg，0.62mmol)。反应物迅速变为淡棕色。于室温下搅拌2.5h后，黄色溶液用DCM(8mL)稀释，用饱和的NaHCO₃溶液(5mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并真空蒸发得到黄色残留物。经柱层析纯化(EtOAc：庚烷；1:2)得到目标化合物，为无色油状物，147mg；[M+H]⁺393。

4-硫代氨基甲酰基-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(实施例8.21)

向哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(32.2mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液中加入硫代羰基二咪唑(37.0mmol)。于室温下搅拌反应物2h，然后于55℃加热1h。将反应物真空浓缩至约一半体积，加入甲醇制氨(7N，107.4mmol)。于55℃加热反应物16h。将反应物真空浓缩至约一半体积，冷却至0℃，此时，产物自溶液中沉淀。过滤收集产物，得到目标化合物，为白色固体(3.3g)。1H NMR(400MHz，d₆-DMSO)1.40(9H，s)，3.32(4H，s)，3.71(4H，s)，7.42(1H，s).

4-[4-(4-羧基-苯基)-噻唑-2-基]-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯

向4-硫代氨基甲酰基-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(13.3mmol)的乙醇(60ml)悬浮液中加入4-(2-溴代乙酰基)-苯甲酸(13.3mmol)和4-甲基吗啉(13.9mmol)。于回流下加热反应物2.5h。反应物真空浓缩，固体用水(200ml)洗涤，得到目标化合物，为白色固体(3.9g)。1H NMR(400MHz，CDCl₃)1.45(9H，s)，3.58(8H，m)，4.86(1H，s)，6.95(1H，s)，7.97(2H，d，J8Hz)，8.1(2H，d，J8Hz).

4-{2-[4-(2-甲氧基-乙基)-哌嗪-1-基]-噻唑-4-基}-苯甲酸

将4-[4-(4-羧基-苯基)-噻唑-2-基]-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(5.0mmol)溶于盐酸的二氧六环液(4N，25ml)中，并于室温下搅拌反应物2h。真空浓缩反应物，得到4-(2-哌嗪-1-基-噻唑-4-基)-苯甲酸。将三甲氧基乙烷(6.5mmol)溶于盐酸水溶液(1N，10ml)，并于50℃加热反应物1.5h。将反应物冷却至RT，然后加至4-(2-哌嗪-1-基-噻唑-4-基)-苯甲酸(5.0mmol)的乙腈(25ml)和乙酸钠缓冲液(1N，pH 5.5，10ml)的悬浮液中。于室温下搅拌反应物1.5h。加入氰基硼氢化钠(6.5mol)并于室温下搅拌反应物16h。真空浓缩反应物并将产物经快速层析纯化(硅胶，10％甲醇的二氯甲烷液)得到目标产物，为无色油状物(0.9g)。MS ES+：m/z＝348(100％M用)。

4-[1-(5-溴代-噻吩-2-基)-乙基]-吗啉(实施例8.22)

向吗啉(1.20mmol)的异丙氧化钛(IV)(1.95mmol)溶液中加入2-乙酰基-5-溴代噻吩(1.20mmol)。于150℃在微波炉中加热反应物5分钟。加入硼氢化钠(1.95mmol)并于室温下搅拌反应物16h。反应物用氢氧化钠溶液(2N，10ml)稀释，形成的固体过滤除去。滤液经乙酸乙酯(3×20ml)萃取，合并的有机物用盐水洗涤并经硫酸镁干燥。产物经快速层析纯化(硅胶，10-20％乙酸乙酯的异-己烷液)得到目标产物，为棕色油状物：MS ES+：m/z＝276(100％，M+H)，278(100％，M+H)。

4-[5-(1-吗啉-4-基-乙基)-噻吩-2-基]-苯甲酸

将4-[1-(5-溴代-噻吩-2-基)-乙基]-吗啉(0.36mmol)、4-甲氧基羰基苯基硼酸酯(0.43mmol)和碳酸钠(1.09mmol)悬浮于二氧六环:水(2ml，2:1)中。向反应物吹入氮气5分钟，然后加入四(三苯基膦)钯(0)(0.04mmol)。于150℃，将反应物在微波炉中加热10分钟。反应物真空浓缩并将产物经快速层析纯化(硅胶，10％甲醇的二氯甲烷液)，得到目标产物，为棕色油状物：MS ES+：m/z＝318(50％M+H)，231(100％，M+H-吗啉)。

4-{[(1-甲基咪唑-2-基)甲基]氨基}苯甲酸(实施例8.23)

将1-甲基-2-咪唑甲醛(5.0mmol)和4-氨基苯甲酸甲基酯(5.0mmol)在MeOH(7mL)中混合。加入乙酸(0.3mL)，并于室温下将混合物搅拌30分钟。冷却反应物混合物。加入氰基硼氢化钠(5.0mmol)，于室温下再搅拌反应物17h。然后将反应混合物真空浓缩并分配于H₂O和EtOAc。水层用EtOAc萃取，合并的有机层用H₂O、盐水洗涤，经MgSO₄干燥，真空除去溶剂。残留物经快速层析纯化(硅胶，5％MeOH的DCM)，得到4-{[(1-甲基咪唑-2-基)甲基]氨基}苯甲酸甲酯：MS ES+：m/z＝246，为淡黄色固体，可以直接用于随后的步骤。

向甲酯(2.5mmol)的1，4-二氧六环(5mL)溶液中加入1M KOH水溶液(5.5mmol)并搅拌反应物混合物18h。用1M HCl将反应混合物中和至pH7，通入N₂气流浓缩。产物再悬浮于水并冻干得到4-{[(1-甲基咪唑-2-基)甲基]氨基}苯甲酸：MS ES+：m/z232，为白色固体，可以直接用于随后的步骤。

4-[5-(1-吗啉-4-基-乙基)-呋喃-2-基]-苯甲酸(实施例8.25)

将2-乙酰基呋喃(20mmol)和吗啉(20mmol)加至无水异丙氧化钛(32mmol)中，并于室温下，N₂中，将反应物搅拌3h。然后加入甲醇(90ml)，随后小心分次加入NaBH₄(32mmol)。于室温下搅拌10分钟后，加入0.1MNaOH使反应淬灭，得到的混合物经硅藻土垫过滤。滤液用DCM提取2次，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。快速层析残留物(硅，5-20％的EtOAc的庚烷液)得到纯净的4-(1-呋喃-2-基-乙基)-吗啉，为金色油状物：MS ES+：m/z＝182[M+H]⁺，2.76mmol，收率14％。

将4-(1-呋喃-2-基-乙基)-吗啉(1.1mmol)溶于DCM(5ml)并于0℃搅拌。向反应容器中通入氮并经含有饱和的硫代硫酸钠水溶液的Dreschel瓶吹出，同时滴加溴(1.54mmol的2ml DCM)。加入后，于室温下搅拌反应物2h，然后用更多的DCM稀释，用2M Na₂CO₃溶液洗涤2次，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。经快速层析纯化(硅胶，5-10％EtOAc的己烷液)，得到4-[1-(5-溴代-呋喃-2-基)-乙基]-吗啉，为金色油状物：MS ES+：m/z＝260，262[M+H]⁺，0.46mmol，收率42％。

将4-[1-(5-溴代-呋喃-2-基)-乙基]-吗啉(0.54mmol)溶于7ml甲苯，加入4-羧基甲基苯基硼酸酯(0.54mmol)的0.7ml EtOH溶液。加入12ml2MNa₂CO₃水溶液，随后加入Pd(PPh₃)₄(0.054mmol)。于70℃、氮气环境下，搅拌反应物17h，然后冷却至室温并用DCM(×2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，真空浓缩，残留物经快速层析纯化(硅胶，20-50％EtOAc的己烷液)。得到纯净的4-[5-(1-吗啉-4-基-乙基)-呋喃-2-基]-苯甲酸甲酯，为粉末状灰色固体：MS ES+：m/z＝316[M+H]⁺，0.08mmol，收率15％。

在18％HCl中，将该酯(0.08mmol)加热至70℃2h，至HPLC显示所有起始原料已经被水解。冷却反应物，产物自溶液中沉淀，过滤收集，为白色固体，可以直接用于下一步骤。

4-(2-甲基-吡啶-3-基氧基)-苯甲酸(实施例8.26)

向装有磁搅拌棒的反应试管中充入4-氟代苯甲酸乙酯(1mmol)、2-甲基-3-吡啶酚(1.0mmol)、碳酸钾(1.08mmol)和DMF(2ml)。将反应试管密封并经微波照射加热(100W，4分钟)至150℃，并于此温度保持80分钟。过滤溶液除去不溶的碳酸钾，然后真空浓缩。残留物经制备性HPLC纯化并冻干得到4-(2-甲基-吡啶-3-基氧基)-苯甲酸乙酯，为白色固体，经6N HCl水溶液水解，于150℃经微波照射加热(200W)3分钟。冻干溶液，得到63mg目标化合物的盐酸盐，为白色粉末，MS ES+：m/z＝229，可以经HPLC和MS定性。

4-[2-(1-二甲基氨基-乙基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.27)

4-{2-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-4-基}-苯甲酸甲酯

将Boc-L-NMe-丙氨酸-OH(1.0g，4.92mmols)溶于二氧六环(10mls)，向该溶液中加入吡啶(0.25mls)、二碳酸二-叔-丁基酯(1.4g，6.4mmols)和碳酸氢铵(0.49g，6.2mmols)。搅拌18小时后，真空浓缩粗品反应混合物并再悬浮于乙酸乙酯中。再用1MKHSO₄洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后，得到清澈油状物(0.79g)。将其溶于乙二醇二甲醚(10mls)，向该溶液中加入Lawesson’s试剂(4.31mmols，1.74g)。于室温下，搅拌3小时，将反应混合物真空浓缩并将残留物再悬浮于乙酸乙酯中。将其用1M Na₂CO₃洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后得到黄色油状物。经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)得到白色固体(0.73g)。溶于乙醇(10mls)并加入4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸甲酯(3.34mmols，0.86g)。将反应物于50℃加热一小时。粗品产物经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)得到白色固体(0.39g)。ESMS(M+H＝377.23)。

4-[2-(1-二甲基氨基-乙基)-噻唑-4-基]-苯甲酸

用4N HCl的二氧六环溶液将4-{2-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-4-基}-苯甲酸甲酯脱保护1h。真空除去溶剂并将残留物冻干得到白色固体，随后如下文所述甲基化。将4-[2-(1-甲基氨基-乙基)-噻唑-4-基]-苯甲酸甲酯(0.44mmol)与甲醛(1.1当量)的甲醇(2ml)液和乙酸钠缓冲液(1N，pH5.5，1ml)一起搅拌一小时。加入氰基硼氢化钠(0.49mmol)并于室温下搅拌反应物2h。真空浓缩反应物并将残留物用EtOAc萃取，用1M碳酸钠水溶液洗涤。有机层真空浓缩并将残留物用6N HCl水溶液水解，于150℃经微波照射加热(200W)3分钟。冻干溶液得到134mg目标化合物的盐酸盐，为白色粉末，MS ES+：m/z＝277，经HPLC和MS定性。

E-4-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙烯基]-苯甲酸(实施例8.28)

聚合物负载的{4-(甲氧基羰基)苄基(三苯基)}溴化鏻。

将4-溴代甲基苯甲酸甲酯(26mmol)加至4.4g PS-三苯基鏻树脂(Fluka，3mmolg^-1)的40ml DMF悬浮液中。于65℃，轻轻搅拌溶液48小时。鏻树脂用DMF(4×40ml)、DCM(4×40ml)和TBME(2×40ml)洗涤并真空干燥18h。

E-4-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙烯基]-苯甲酸

向装有磁搅拌棒的反应试管中充入1-甲基-1H-咪唑-2-甲醛(1.5mmol)、碳酸钾(2.1mmol)、聚合物负载的{4-(甲氧基羰基)苄基(三苯基)}溴化鏻(1.5mmol)和甲醇(4ml)。然后密封反应试管并经微波照射加热(100W，3分钟)至150℃，并于此温度保持5分钟。过滤溶液除去不溶的碳酸钾，然后真空浓缩。残留物经制备性HPLC纯化并冻干，得到E-4-[2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-乙烯基]-苯甲酸甲酯，为白色固体，然后经6N水溶液HCl溶液水解，于150℃经微波照射加热(200W)3分钟。冻干溶液，得到90mg目标化合物的盐酸盐，为白色粉末，MS ES+：m/z＝215，经HPLC和MS定性。

E-4-[2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-乙烯基]-苯甲酸(实施例8.29)

与实施例8.28相同。醛采用1-甲基-1H-咪唑-2-甲醛。得到目标化合物，为白色粉末，MS ES+：m/z＝229，经HPLC和MS定性。

E-4-[2-(3-甲基-3H-咪唑-4-基)-乙烯基]-苯甲酸(实施例8.30)

与实施例8.28相同。醛采用3-甲基-3H-咪唑-4-甲醛。得到目标化合物，为白色粉末，MS ES+：m/z＝229，经HPLC和MS定性。

4-[2-(1H-咪唑-4-基)-乙基]-苯甲酸(实施例8.31)

采用Pd/C(10％底物重量)、甲酸铵(5当量)的异丙醇液，经微波照射(200W)于150℃加热5分钟，将E-4-[2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-乙烯基]-苯甲酸甲酯氢化。溶液经硅藻土过滤，除去不溶的催化剂，用水稀释，冻干除去过量甲酸铵。通过微波照射于150℃C加热(200W)3分钟，将得到的固体经6N HCl水溶液水解。冻干溶液得到目标化合物的盐酸盐，为白色粉末，MS ES+：m/z＝217和MS ES+，经HPLC和MS定性。

4-[2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-乙基]-苯甲酸(实施例8.32)

与实施例8.31相同。甲酯采用4-[2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-乙烯基]-苯甲酸甲酯(实施例8.29)。得到目标化合物，为白色粉末，MS ES+：m/z＝231，经HPLC和MS定性。

4-甲基(吡啶-2-基)氨基甲基苯甲酸钾(实施例8.33)

将2-甲基氨基吡啶(1.0mmol)和4-甲酰基苯甲酸甲酯(1.0mmol)在THF(2mL)中混合，加入二氯化二丁基锡(0.1mmol)。于室温搅拌10分钟，加入苯基硅烷(1.1mmol)并于室温下再搅拌反应物混合物17h。然后经N₂气流浓缩反应混合物，残留物经快速层析纯化(硅胶，庚烷:EtOAc)，得到4-[甲基(吡啶-2-基)氨基]甲基苯甲酸甲酯：MS ES+：m/z＝257，为黄色油状物，可以直接用于随后的步骤。

向甲酯(0.27mmol)的1，4-二氧六环(0.6mL)溶液中加入1M KOH水溶液(0.59mmol)，并搅拌反应物混合物18h。反应混合物经N₂气流浓缩，再悬浮于水，产物冻干，得到4-甲基(吡啶-2-基)氨基甲基苯甲酸钾：MSES+：m/z243，为灰白色固体，可以直接用于随后的步骤。

4-(2-{1(S)-[(叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基}-5-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯 甲酸钠(实施例8.34)

于50℃，将4-丙酰基苯甲酸乙酯(2.0mmol)、吡咯烷酮氢三溴化物(pyrrolidinone hydrotribromide)(2.1mmol)和2-吡咯烷酮(2.2mmol)在THF(20mL)中加热2.5h。冷却混合物，过滤，真空浓缩，残留的油分配于H₂O和MTBE。水层用MTBE萃取，合并的有机层用饱和的偏亚硫酸氢钠水溶液、H₂O、盐水洗涤，MgSO₄干燥，真空除去溶剂。残留物经快速柱层析纯化(9:1ⁱ己烷：MTBE)得到4(2’-溴代丙酰基)苯甲酸乙酯，为澄清油状物。

于80℃，将4-(2’-溴代丙酰基)苯甲酸乙酯(0.5mmol)、BOC(Me)Ala硫代酰胺(0.5mmol)和NMM(0.5mmol)在EtOH(2mL)中加热3h。冷却混合物，经N₂气流浓缩，粗品产物分配于H₂O和MTBE。水层经MTBE萃取，合并的有机层用1M KHSO₄、盐水洗涤2次，经MgSO₄干燥，真空除去溶剂，得到黄色油状物。残留物经快速柱层析纯化(9:1ⁱ己烷：EtOAc)得到深黄色组分。放置几小时，该组分脱色，经快速柱层析(9:1ⁱ己烷：EtOAc)分离得到4-(2-{1(S)-[(叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基}-5-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯甲酸乙酯，为澄清油状物：MS ES+：m/z＝405(MH+)和349(M-BOC+)。

向乙酯(0.24mmol)的1，4-二氧六环(5mL)和水(1mL)的溶液中加入1M NaOH(0.53mL)，搅拌反应物混合物18h。真空浓缩反应混合物，产物再悬浮于水，冻干得到4-(2-{1(S)-[(叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基}-5-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯甲酸钠：MS ES+：m/z377(MH+)和321(M-BOC+)，为白色固体，可以直接用于随后的步骤。

4-{2-[1(S)-(二甲基氨基)乙基]-5-甲基-1，3-噻唑-4-基}苯甲酸锂(实施例 8.35)

如前述方法制备4-(2-{1(S)-[(叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基]乙基}-5-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯甲酸乙酯。

向BOC-保护的胺(0.25mmol)的1，4-二氧六环(3mL)溶液中加入4MHCl的二氧六环(4mL)液，并搅拌反应物混合物2h。真空浓缩反应混合物得到粘性淡黄色油状物。将油溶于1:1H₂O:MeCN，并冻干得到4-{2-[1(S)-(甲基氨基)乙基]-5-甲基-1，3-噻唑-4-基}苯甲酸乙酯盐酸盐。

将AcOH加至1M NaOAc中至pH达到5.5制备pH5.5的缓冲液。将上述胺盐酸盐(0.28mmol)溶于1:1的缓冲液:MeOH(4mL)中，加入甲醛(水中，37％(重量)；0.31mmol)。搅拌混合物1h，然后分次加入氰基硼氢化钠(0.31mmol)。1小时后，用N₂气流浓缩反应混合物。残留物分配于饱和的NaHCO₃水溶液和EtOAc。用EtOAc萃取水层，合并的有机层用H₂O、盐水洗涤。经Na₂SO₄干燥，真空除去溶剂。残留物经制备性HPLC纯化(0.1％TFA的H₂O:MeCN)。合并的HPLC组分分配于饱和的NaHCO₃水溶液和EtOAc。水层经EtOAc萃取，合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，真空除去溶剂。经1H-NMR确定已不存在EtOAc。

将上述乙酯(0.19mmol)溶于1:1的H₂O:1，4-二氧六环(8mL)中，加入1M LiOH(0.42mL)，搅拌反应物混合物17h。加入1M HCl将反应混合物pH调节至8。真空浓缩混合物，再悬浮于1:1的H₂O:MeCN中，冻干，得到4-(2-{1(S)-[(二甲基)氨基]乙基}-5-甲基-1，3-噻唑-4-基)苯甲酸锂：MSES+：m/z 291(MH+)，为白色固体，可以直接用于随后步骤。

5-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸(实施例8.36)

将5-甲氧基苯并呋喃甲酸乙酯(22.7mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，加入1.0M三溴化硼甲基硫复合物的二氯甲烷(68.1mmol)溶液。于回流下加热混合物过夜。真空蒸发溶剂，残留物经快速层析纯化得到5-羟基苯并呋喃甲酸乙酯，为白色固体。

将结合的三苯基膦聚合物(8.96mmol)再悬浮于无水二氯甲烷(20ml)，然后加入偶氮二甲酸二异丙酯(7.76mmol)，于室温下，搅拌混合物15分钟。然后用5分钟加入5-羟基苯并呋喃甲酸乙酯(5.97mmol)，随后也用5分钟加入4-N-boc-3-吗啉甲酸(5.97mmol)。于室温下搅拌混合物过夜。真空蒸发溶剂，残留物经快速层析纯化，得到5-(4-Boc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯：MS ES+：m/z＝406，为澄清油状物。

将5-(4-Boc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(2.47mmol)溶于30ml4.0M盐酸的二氧六环溶液并于室温下搅拌1小时。真空除去溶剂，得到的胺溶于无水二氯甲烷，加入N-甲基吗啉(5.67mmol)，并于室温下搅拌5分钟。然后加入氯代甲酸烯丙酯(2.71mmol)，于室温、惰性气体下，搅拌混合物过夜。混合物用1.0M盐酸溶液、水洗涤，Na₂SO₄干燥并真空蒸发溶剂。残留物经快速层析纯化，得到5-(4-alloc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯：MS ES+：m/z＝390，为白色固体。

将5-(4-alloc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(2.09mmol)溶于3ml四氢呋喃中。然后加入3ml 1.0M氢氧化锂溶液，于室温下搅拌混合物过夜。真空下除去四氢呋喃，将混合物用1M盐酸溶液酸化，用刚果红测试，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，经Na₂SO₄干燥，真空除去溶剂，得到5-(4-alloc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸，为白色固体。

然后，采用HBTU(3当量)、HOBt(3当量)和NMM(6当量)的DMF液，于室温下过夜，将5-(4-Alloc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸(3当量)结合到如前文所述的肽(600mg；0.32mmol/g)上。Alloc基团用下列物质除去(1)DCM(4×1分钟)；(2)硼烷二甲基胺复合物(40当量)，四(三苯基膦)钯(0)(0.1当量)的无水DCM(2×15分钟)液；(3)DCM(3×1分钟)；(4)DMF(3×1分钟)；(5)二氧六环-水(9:1)(3×1分钟)；(6)DMF(3×1分钟)；(7)MeOH(3×1分钟)；(8)DCM(3×1分钟)，于室温下，将肽树脂用二氯化二丁基锡(5当量)、苯基硅烷(5当量)和37％甲醛的水溶液(5当量)的THF溶液处理2小时。其它步骤如通用方法中所述进行。

3-甲基-5-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸(实施例8.37)

将4-甲氧基苯酚(0.119mol)溶于无水甲苯，并于室温下用氢化钠(0.120mol)处理60h。将苯酚钠溶液加热至+100℃，加入α-氯代乙酰乙酸酯(0.09mol)。于+110℃，再搅拌4小时后，将混合物冷却至室温，用水和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并真空蒸发溶剂得到粗品α-(4-甲氧基苯氧基)乙酰乙酸酯，为深棕色油状物。于室温下，将磷酸(0.22mol)与P₂O₅(0.35mol)混合，并于+130℃搅拌4小时。混合物冷却至+100℃，缓慢加入乙酰乙酸，于此温度保持2小时。冷却至室温后，向搅拌的溶液中小心加入冰，用甲苯萃取，真空浓缩并经硅胶快速层析纯化，得到3-甲基-5-甲氧基苯并呋喃甲酸乙酯：MS ES+：m/z＝235，为白色固体。

将3-甲基-5-甲氧基苯并呋喃甲酸乙酯(8.53mmol)溶于二氯甲烷(10ml)，并加入1.0M三溴化硼甲基硫复合物的二氯甲烷(25.59mmol)溶液。于回流下加热混合物过夜。真空蒸发溶剂，残留物经快速层析纯化得到3-甲基-5-羟基苯并呋喃甲酸乙酯，为白色固体。

将结合的三苯基膦聚合物(1.37mmol)再悬浮于无水二氯甲烷(10ml)，然后加入偶氮二甲酸二异丙基酯(1.18mmol)，于室温下搅拌混合物15分钟。然后用5分钟加入3-甲基-5-羟基苯并呋喃甲酸乙酯(0.91mmol)，随后也用5分钟加入4-N-boc-3-吗啉甲酸(0.91mmol)。于室温下搅拌混合物过夜。真空蒸发溶剂，残留物经快速层析纯化，得到3-甲基-5-(4-Boc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯：MS ES+：m/z＝419，为澄清油状物。

将3-甲基-5-(4-Boc-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(1.05mmol)溶于30ml 4.0M盐酸的二氧六环溶液，并于室温下搅拌1小时。真空除去溶剂，将得到的胺溶于2:1的甲醇和pH＝5.3的乙酸和乙酸钠的缓冲液的20ml的混合液中。加入37％甲醛的水溶液(1.16mmol)，并于室温下将混合物搅拌1小时。然后加入氰基硼氢化钠(1.16mmol)，搅拌混合物过夜。于室温下，真空除去甲醇，水经冷冻干燥除去。得到的固体经快速层析纯化，得到3-甲基-5-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯：MSES+：m/z＝334，为白色固体。

将3-甲基-5-(4-甲基-吗啉-2-基甲氧基)-苯并呋喃-2-甲酸乙酯(0.12mmol)溶于300μl四氢呋喃。然后加入300μl1.0M氢氧化锂溶液，于室温下搅拌混合物3小时。真空除去四氢呋喃，水经冷冻干燥除去，得到目标化合物，为白色固体；MS ES+：m/z＝304。

4-[2-(1-二甲基氨基-乙基)-噻唑-5-基]-苯甲酸锂盐(实施例8.38)

4-(2-叠氮基-乙酰基)-苯甲酸甲酯。

将4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸甲酯(15.5mmol)溶于乙醇(120ml)和乙酸(4.8ml)。加入叠氮化钠(31mmol)并于4℃搅拌反应物过夜。除去乙醇并将混合物用乙酸乙酯(100ml)稀释。有机层经饱和的碳酸氢钠(2×50ml)洗涤并干燥(MgSO₄)。真空除去溶剂，得到黄色固体，自乙醇再结晶，得到目标化合物，为淡黄色固体(2.6g)。IR2117cm^-1。

4-(2-氨基-乙酰基)-苯甲酸甲酯盐酸盐。

将4-(2-叠氮基-乙酰基)-苯甲酸甲酯(6.53mmol)再悬浮于甲醇(30ml)，加入盐酸水溶液(6.53mmol，1M)。加入催化量的钯炭(10％重量)并于氢气下搅拌反应物3h。过滤反应物，真空除去溶剂，得到目标化合物(1.3g)，为黄色固体，MS ES+：m/z＝194，可以不经纯化用于下一步骤。

4-{2-[2-(S)-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙酰基氨基]-乙酰基}-苯甲酸甲酯。

将4-(2-氨基-乙酰基)-苯甲酸甲酯盐酸盐(2.22mmol)、WSC.HCl(2.44mmol)、Boc-N-甲基-(L)-丙氨酸(2.44mmol)和HOBt(2.77mmol)悬浮于二氯甲烷(10ml)。加入NMM(2.44mmol)，并搅拌反应物2h。反应物用乙酸乙酯(50ml)稀释，用10％柠檬酸(2×25ml)和饱和的碳酸氢钠(2×25ml)洗涤。干燥有机层(MgSO₄)并真空除去溶剂，得到棕色油状残留物。经硅胶层析纯化，洗脱液为10-50％乙酸乙酯/异-己烷，得到目标化合物(620mg)，为淡黄色油状物，MS ES+：m/z＝379。

4-{2-(S)-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-5-基}-苯甲酸甲酯。

将4-{2-[2-(S)-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-丙酰基氨基]-乙酰基}-苯甲酸甲酯(1.65mmol)溶于无水THF，加入Lawesson’s试剂(2.5mmol)。于回流下加热反应物5h，冷却至室温。真空除去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯(100ml)。有机层用10％柠檬酸(2×50ml)和饱和的碳酸氢钠(2×50ml)洗涤，干燥(MgSO₄)。真空除去溶剂，得到黄色油状残留物，经硅胶层析纯化，得到目标化合物(570mg)，为淡黄色固体。1H NMR(CDCl₃，400MHz)1.5(s，9H)，1.6(d，7Hz)，2.8(brs，3H)，3.9(s，3H)，5.6(brm，1H)，7.6(m，2H)，7.9(s，1H)，8.0(m，2H)。

4-{2-(S)-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-5-基}-苯甲酸

将4-{2-(S)-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-5-基}-苯甲酸甲酯(0.75mmol)溶于甲醇(10ml)，加入氢氧化锂(10ml，1M)。于室温下搅拌反应物过夜，真空除去甲醇。用1M盐酸将水溶液调节至pH＝3并用乙酸乙酯(2×50ml)萃取。有机层干燥(MgSO₄)并真空除去溶剂，得到灰白色粉末，经硅胶层析纯化，洗脱液为50-80％乙酸乙酯/异-己烷。得到目标化合物，为白色粉末(252mg)，MS ES+：m/z＝363。

4-[2-(S)-(1-二甲基氨基-乙基)-噻唑-5-基]-苯甲酸甲酯。

将4-{2-(S)-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-5-基}-苯甲酸(0.75mmol)溶于50％TFA/DCM(2ml)并搅拌1h。真空除去溶剂，将残留物置于高真空下3h，得到淡棕色油状残留物。残留物溶于甲醇(2ml)，加入缓冲液(1ml，1M乙酸钠/乙酸，pH＝5.5)。加入甲醛(0.83mmol，37wt％的水)，搅拌反应物30分钟。加入氰基硼氢化钠(0.83mmol)，于室温下搅拌反应物过夜。真空除去甲醇，水溶液用饱和的碳酸氢钠(25ml)稀释。水层经乙酸乙酯(2×25ml)萃取，干燥有机层(MgSO₄)。真空除去溶剂，残留物经硅胶层析纯化，得到目标化合物(158mg)，为灰白色固体。1H NMR(CD₃OD，400MHz)1.5(d，J 7Hz)，2.3(s，6H)，3.9(s，3H)，3.95(q，J7Hz)，7.7(m，2H)，8.0(m，3H)。

4-[2-(1-二甲基氨基-乙基)-噻唑-5-基]-苯甲酸锂。

将4-{2-(S)-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-5-基}-苯甲酸(0.54mmol)溶于甲醇(2ml)，加入氢氧化锂(0.54mmol，1M)。搅拌反应物过夜，真空除去甲醇。残留物用水(5ml)稀释，水层用乙酸乙酯萃取。冻干水层，得到目标化合物，为灰白色固体(143mg)，可以不经进一步纯化用于下一步骤。MS ES+：m/z＝277。

5-N，N-二甲基氨基-1H-吲哚-2-甲酸(实施例8.39)

5-氨基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯。

将5-硝基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯(14.9mmol)悬浮于丙酮(50ml)，加至三氯化钛(III)(91ml，>10％的2M盐酸液)和乙酸铵(265ml，4M)的混合物中。搅拌反应物2h，用饱和的碳酸氢钠中和。混合物用乙酸乙酯(100ml)萃取，干燥有机层(MgSO₄)。真空除去溶剂，得到淡棕色固体，经硅胶层析纯化，得到目标化合物，为灰白色固体(1.57g)，MS ES+：m/z＝205。

5-N，N-二甲基氨基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯。

将5-氨基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯(7.7mmol)溶于乙腈(30ml)，加入甲醛(19.2mmol，37％wt的水溶液)。加入氰基硼氢化钠(7.7mmol)，并于室温下搅拌反应物过夜。真空除去乙腈，残留物经硅胶层析纯化，得到目标化合物，为淡黄色固体(244mg)。MS ES+：m/z＝233。

5-N，N-二甲基氨基-1H-吲哚-2-甲酸

将5-N，N-二甲基氨基-1H-吲哚-2-甲酸乙酯(1.05mmol)悬浮于乙醇(1ml)，加入氢氧化锂(1.2ml，1M的水溶液)。于室温下搅拌反应物过夜。用1M盐酸将溶液调节至pH＝7，真空除去乙醇。水层经乙酸乙酯萃取，干燥(MgSO₄)有机层。真空除去乙酸乙酯，得到目标化合物，为黄色粉末(75mg)，可以不经纯化用于下一步骤。MS ES+：m/z＝205。

4-{2-[1-(叔-丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-噻唑-4-基}-苯甲酸(实施例 8.40)

将Boc-L-NMe-丙氨酸-OH(1.0g，4.92mmols)溶于二氧六环(10mls)，并向混合物中加入吡啶(0.25mls)、二碳酸二-叔-丁基酯(1.4g，6.4mmols)和碳酸氢铵(0.49g，6.2mmols)。搅拌18小时后，真空浓缩粗品反应混合物，再悬浮于乙酸乙酯中。用1M KHSO₄洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后得到清澈油状物(0.79g)。将其溶于乙二醇二甲醚(10mls)，并加入Lawesson’s试剂(4.31mmols，1.74g)。于室温下搅拌3小时后，将反应混合物真空浓缩，并将残留物再悬浮于乙酸乙酯。用1M Na₂CO₃洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后得到黄色油状物。经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)，得到白色固体(0.73g)。溶于乙醇(10mls)，加入4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸甲酯(3.34mmols，0.86g)。反应物于50℃加热一小时。粗品产物经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)，得到白色固体(0.39g)。ESMS(M+H＝377.23)，随后水解为相应的酸。

4-[2-(1-二甲基氨基-2-甲氧基-乙基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.41)

将Boc-L-丝氨酸(OMe)-OH(2.4g，6.0mmols)溶于二氧六环(20mls)，加入吡啶(0.31mls)、二碳酸二-叔-丁基酯(1.7g，7.8mmols)和碳酸氢铵(0.62g，7.2mmols)。搅拌18小时后，将粗品反应混合物真空浓缩，再悬浮于乙酸乙酯中。用1M KHSO₄洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后，粗品产物经快速层析纯化，得到0.55g澄清油状物。溶于乙二醇二甲醚(20mls)，加入Lawesson’s试剂(2.78mmols)。于室温下搅拌3小时后，真空浓缩反应混合物，残留物经快速层析纯化(硅胶，DCM)，得到黄色油状物(2-甲氧基-1-硫代氨基甲酰基-乙基)-氨基甲酸叔-丁酯(0.49g)。

将上述酯(0.25g，1.07mmols)溶于乙醇(10mls)，加入4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸甲酯(1.18mmols，0.30g)。加热反应物至50℃一小时。粗品产物经制备性HPLC纯化(MeCN/H₂O)，得到0.138g黄色固体。通过用4M HCl/二氧六环处理一小时除去Boc基团，真空浓缩反应混合物。然后将游离胺(0.093g，0.265mmols)二甲基化。粗品HCl盐溶于5ml甲醇并用2.5ml pH5.5的乙酸钠/乙酸缓冲。加入甲醛(0.58mmols)，搅拌反应物一小时。加入氰基硼氢化钠(0.58mmols，0.036g)，再搅拌反应物30分钟。真空浓缩反应混合物并经制备性HPLC纯化，得到60mg黄色固体。最后，于室温下，甲酯用1M LiOH(5ml)和二氧六环(5ml)水解2小时。真空浓缩反应混合物，自水中冷冻干燥，得到62mg所需酸，为锂盐。ESMS(M+H＝307.04)

4-[2-(4-氟代-1-甲基-吡咯烷-2-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.42)

将4-氟代-2-[4-(4-甲氧基羰基-苯基)-噻唑-2-基]-吡咯烷-1-甲酸叔-丁酯(0.1g)用4M HCl/二氧六环(10mls)处理2小时。然后将反应混合物真空浓缩，自水中冻干，得到黄色固体(0.8g)。粗品HCl盐溶于5ml甲醇，用2.5mlpH5.5的乙酸钠/乙酸缓冲。加入甲醛(0.38mmols，0.0032ml)，搅拌反应物一小时。加入氰基硼氢化钠(0.38mmols，0.024g)，再搅拌反应物30分钟。真空浓缩反应混合物，将残留物再悬浮于乙酸乙酯中。用1M Na₂CO₃洗涤，有机层经硫酸镁干燥，浓缩后得到黄色固体(0.075g)。最后，于室温下将甲酯用1M LiOH(5ml)和二氧六环(5mls)水解2小时。真空浓缩反应混合物，自水中冻干，得到62mg所需酸，为锂盐。ESMS(M+H＝306.88)

2-[4-(4-羧基-苯基)-噻唑-2-基]-4-氟代-吡咯烷-1-甲酸(实施例8.43)

2-[4-(4-羧基-苯基)-噻唑-2-基]-4-氟代-吡咯烷-1-甲酸叔-丁酯

将酰胺(0.32g，1.37mmols)溶于乙二醇二甲醚(10mls)，加入Lawesson’s试剂(0.61g，1.5mmols)。于室温下搅拌3小时后，真空浓缩反应混合物，残留物再悬浮于乙酸乙酯中。用1M Na₂CO₃洗涤，有机层经硫酸镁干燥。浓缩后得到黄色油状物。经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)得到白色固体(0.36g)。溶于乙醇(10mls)，加入4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸甲酯(0.41g，1.59mmols)。加热反应物至50℃一小时。粗品产物经快速层析纯化(庚烷/乙酸乙酯)得到白色固体(0.34g)。然后用1M LiOH(10mls)和二氧六环(10mls)处理甲酯3小时。经过定量水解后，真空浓缩粗品产物并将残留物再悬浮于乙酸乙酯中。用1M KHSO₄洗涤，有机层经硫酸镁干燥。真空浓缩后产物自乙腈/水中冻干，得到目标化合物，为白色固体(0.32g)。ESMS(M+H＝393.03)。

5-(4-N-甲基吗啉基-2S-甲基氧基)苯并呋喃甲酸锂(实施例8.36，为单一 对映异构体)

5-(4-boc-吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸乙酯。

可以根据Heterocycles，1993 35，105-109中所述方法制备4-Boc-2R-羟基甲基吗啉。于室温下，向聚合物负载的三苯膦(2.4mmol)和羟甲基吗啉(1.2mmol)的无水二氯甲烷(5ml)的混合物中加入5-羟基苯并呋喃-2-甲酸乙酯(1.2mmol)和DIAD(1.2mmol)。进一步搅拌混合物16小时，过滤，在无水二氯甲烷(5ml)中稀释，并于室温下再搅拌16小时。过滤，真空浓缩并经硅胶快速层析纯化(乙酸乙酯，己烷)，得到5-(4-boc-吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸乙酯(0.3mmol)，MS ES+：m/z＝406，为油状物。

5-(4-N-甲基吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸锂。

将5-(4-boc-吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸乙酯(0.3mmol)溶于HCl的二氧六环(4M，15ml)，于室温下搅拌4小时，真空浓缩至淡黄色油状物。将粗品苯并呋喃盐酸盐(0.3mmol)和甲醛(0.35mmol)在THF(5mL)中混合，加入二氯化二丁基锡(0.05mmol)。于室温搅拌5分钟，加入苯基硅烷(0.6mmol)，于室温下再搅拌反应物17h。真空浓缩反应物，残留物经快速层析纯化(硅胶、乙酸乙酯、异丙醇、三乙基胺)，得到5-(4-N-甲基吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸乙酯：MS ES+：m/z＝320，为澄清油状物。

向5-(4-N-甲基吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸乙酯(0.6mmol)的5ml二氧六环中加入LiOH(0.6mmol)的1ml水溶液。回流混合物16小时，真空浓缩，得到5-(4-N-甲基吗啉基-2R-甲基氧基)苯并呋喃甲酸锂：MSES+：m/z292，为白色固体。

5-(4-N-甲基吗啉基-2S-甲基氧基)苯并呋喃甲酸锂.

S-异构体：MS ES+：m/z292，可以通过制备R-异构体的方法制备，但采用4-Boc-2S-羟基甲基吗啉取代4-Boc-2R-羟基甲基吗啉，为白色固体。

4-(3-甲基-5-吗啉-4-基甲基-噻吩-2-基)-苯甲酸(实施例8.44)

将5-溴代-4-甲基-噻吩-2-甲酸甲酯(8.51mmol)溶于EtOH(100ml)，加入NaOH(42.5mmol)的1M水溶液。加热反应物至80℃ 2h，此时所有起始原料已经消耗完毕。然后真空浓缩反应物，将残留物溶于DCM，并与1M HCl一起摇动。然后将得到的双相混合物过滤，滤液用己烷洗涤并干燥真空。得到5-溴代-4-甲基-噻吩-2-甲酸，为灰白色固体：MS AP-：m/z＝219，221[M-H]^-，6.79mmol，80％。

将5-溴代-4-甲基-噻吩-2-甲酸(6.79mmol)溶于30ml DMF，加入吗啉(7.47mmol)、WSC.HCl(7.47mmol)和HOBt(7.47mmol)。于室温下搅拌反应物17h，然后用EtOAc稀释，用1M HCl和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。快速层析残留物(硅胶，33-50％ EtOAc的己烷液)，得到(5-溴代-4-甲基-噻吩-2-基)-吗啉-4-基-甲酮，为淡金色油状物：MS ES+：m/z＝290，292[M+H]⁺，4.67mmol，69％。

将(5-溴代-4-甲基-噻吩-2-基)-吗啉-4-基-甲酮(1.78mmol)加至装有1MTHF.BH₃复合物的THF(4.45mmol)液的烧瓶中。于回流、氮气中，搅拌反应物2.5h。然后加入甲醇至气体停止产生，随后加入10ml1M NaOH，并于回流下再搅拌反应物7h。混合物冷却至室温，然后用EtOAc提取。真空浓缩提取物，残留物溶于1M HCl，用EtOAc洗涤。酸层用1M NaOH碱化，再用EtOAc萃取。除去溶剂，得到4-(5-溴代-4-甲基-噻吩-2-基甲基)-吗啉，为无色油状物：MS ES+：m/z＝276，278[M+H]⁺，0.98mmol，55％。

将4-(5-溴代-4-甲基-噻吩-2-基甲基)-吗啉(0.98mmol)溶于10ml甲苯，加入1ml EtOH中的4-羧基甲基苯基硼酸酯(0.98mmol)溶液。加入6ml 2MNa₂CO₃水溶液，随后加入Pd(PPh₃)₄(0.098mmol)。于70℃、氮气下搅拌反应物17h，然后冷却至室温，用DCM(×2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，真空浓缩，残留物经快速层析纯化(硅胶，33-99％ EtOAc的己烷)。得到纯净4-(3-甲基-5-吗啉-4-基甲基-噻吩-2-基)-苯甲酸甲酯，为蜡白色固体：MS ES+：m/z＝332[M+H]⁺，0.090mmol，9％。

在18％HCl中，将酯(0.09mmol)加热至70℃2h，至HPLC显示所有起始原料均已被水解。冷却反应物，过滤收集自溶液沉淀出的产物，为白色固体。不经进一步纯化，采用标准方法偶合。

3-甲基-4-(5-吗啉-4-基甲基-呋喃-2-基)-苯甲酸(实施例8.45)

将三颈烧瓶装入4-溴代-3-甲基苯甲酸甲酯(2.18mmol)、双(频哪酰)二硼(bis(pinacolato)diboron)(2.29mmol)、乙酸钯(0.065mmol)、乙酸钾(6.54mmol)和DMF(10ml)。吹入N₂气30分钟将溶液脱气，然后于N₂下加热至80℃ 3h。然后将反应物冷却至室温，加入4-(5-溴代-呋喃-2-基甲基)-吗啉(2.18mmol)、碳酸铯(3.27mmol)和Pd(PPh₃)₄(0.065mmol)。加热反应物至80℃，并再搅拌17h。然后将混合物用EtOAc和水稀释，经硅藻土垫过滤除去黑色微粒。分离有机层，用盐水洗涤并经Na₂SO₄干燥，真空浓缩。快速层析残留物(硅胶，10-99％ EtOAc的己烷)，得到3-甲基-4-(5-吗啉-4-基甲基-呋喃-2-基)-苯甲酸甲酯，为灰色粉末固体：MS ES+：m/z＝316[M+H]⁺，0.51mmol，23％。

在18％ HCl中将该酯(0.51mmol)加热至70℃ 2h，至HPLC显示所有起始原料均已被水解。冷却反应物，过滤收集自溶液中沉淀的产物，为白色固体。不经进一步纯化，采用标准方法偶合。

4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.46)

将4-丙酰基苯甲酸(890mg，5mmol)、NaHCO₃(1.26g，15mmol)和碘代甲烷(935μL，15mmol)的DMF(10mL)液于室温下搅拌过夜。混合物用饱和的NaCl水溶液(50mL)稀释，用***(3×50mL)萃取。有机相用水(50mL)洗涤，干燥并蒸发。快速层析(90g硅胶，2/1石油醚-EtOAc)得到白色固体4-丙酰基-苯甲酸甲酯(744mg，77％)。

1H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 1.24(t，3H，J＝7Hz)，3.03(q，2H，J＝7Hz)，3.95(s，3H)，8.0和8.12(ABq，4H)。

于50℃、氮气下，将4-丙酰基-苯甲酸甲酯(744mg，3.87mmol)、吡咯烷酮氢三溴化物(1.98g)和2-吡咯烷酮(380mg，4.5mmol)的THF(38mL)液加热3h。冷却混合物，过滤，浓缩，然后再溶于***(50mL)。醚溶液顺次经水(20mL)、饱和的硫代硫酸钠水溶液(20mL)、饱和的NaCl水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，干燥并蒸发，得到粗品4-(2-溴代-丙酰基)-苯甲酸甲酯，为黄色油状物(1.025g)，可以直接用于Hantzsch偶合。根据1H NMR测定，该物质包含91％所需溴酮、5％起始原料以及4％的4-溴代-1-丁醇。

  1H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 1.92(d，3H，J＝7Hz)，3.96(s，3H)，5.28(q，1H，J＝7Hz)，8.07和8.14(ABq，4H)

于70℃、N₂气下，将所有上述4-(2-溴代-丙酰基)-苯甲酸甲酯和哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(J.Med.Chem.，1998，5037-5054，917mg，3.73mmol)在36mLTHF中回流2h，过滤沉淀，蒸发滤液，得到黄色固体。快速柱层析(硅胶，5/1石油醚-EtOAc)，得到624mg 4-[4-(4-甲氧基羰基-苯基)-5-甲基-噻唑-2-基]-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯，为淡黄色固体。层析沉淀物(硅胶，2/1石油醚-EtOAc)，得到32mg更多的化合物。总收率为44％。

  1H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 1.46(s，9H)，2.43(s，3H)，3.42，(m，4H)，3.54(m，4H)，3.90(s，3H)，7.68和8.04(ABq，4H)。

于60℃，将上述甲酯(564mg，1.35mmol)与1.35mL2N NaOH、5mLTHF和3.65mL水加热4h。蒸发反应混合物，倾至20mL饱和NaCl水溶液和20mLCH₂Cl₂中，然后在冰浴中，用5％柠檬酸酸化至pH 3。分离各层，有机相进一步用2×10mL CH₂Cl₂萃取。合并有机相，用水(10mL)洗涤，干燥并蒸发，得到4-[4-(4-羧基-苯基)-5-甲基-噻唑-2-基]-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯，为淡黄色固体(537mg，98％)。

  1H NMR(CDCl₃，400MHz)δ 1.48(s，9H)，2.47(s，3H)，3.47(m，4H)，3.57(m，4H)，7.74和8.12(ABq，4H)。

 13C NMR(CDCl₃，100MHz)δ ppm：12.6，28.3，42.8，48.1，80.3，119.1，127.8，128.2，130.1，140.5，145.6，154.6，167.2，171.4。

LCMS：(M+H)⁺404，(M-H)^-402。

将4-[4-(4-羧基-苯基)-5-甲基-噻唑-2-基]-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(0.421mmol)溶于4M HCl的1，4-二氧六环中，于室温下搅拌1h。然后真空除去溶剂，残留物4-(5-甲基-2-哌嗪-1-基-噻唑-4-基)-苯甲酸悬浮于甲醇(10ml)，用AcOH/AcONa缓冲液(pH～5.5，5ml)和甲醛(0.547mmol)处理。于室温下搅拌反应物混合物1h，然后用NaCNBH₃(0.547mmol)处理，并于室温下搅拌过夜。然后真空除去溶剂，残留物经柱层析纯化得到目标化合物(0.403mmol，95％)。MS(ES)m/z 318(100％，[M+H]⁺)。

4-(2-吗啉-4-基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.47)

将4-(2-溴代乙酰基)苯甲酸(1.23mmol)和1-吗啉硫代甲酰胺(1.23mmol，J.Med.Chem1998，41，5037-5054)与THF(10mL)混合，然后回流3.5h。然后使反应混合物达到室温，过滤收集得到沉淀，用4份***洗涤。粗品产物自热的1:1EtOH-EtOAc中结晶，得到最初产物，无色针状物(0.16g，0.55mmol)。1H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ 7.94(4H，m)，7.49(1H，s)，3.72(4H，m)，3.44(4H，m).

4-(2-哌啶-1-基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.48)

将4-(2-溴代乙酰基)苯甲酸(1.23mmol)和1-哌啶硫代甲酰胺(1.23mmol)混合于THF(10mL)，然后再回流3h。然后使反应混合物达到室温，过滤收集得到的沉淀并用3份***洗涤。粗品产物自热的1:1 EtOH-EtOAc结晶，得到最初产物，无色针状物(0.28g，0.95mmol).1H NMR(DMSO-d₆，400MHz，)

 7.93(4H，m)，7.40(1H，s)，3.48(4H，m)，1.60(6H，m).

4-(2-二甲基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.49)

于室温下，向搅拌的硫代羰基二咪唑(44.9mmol)的THF(40mL)混合物中分次加入2M二甲基胺的THF(44mmol)，观察到温度升高。加入后40分钟，将反应混合物加热至55℃1h，然后再温热至室温。真空浓缩反应物，残留物经快速层析纯化(硅胶，石油醚-EtOAc)，得到中间体咪唑-1-硫代羟酸二甲基酰胺。该物质用新制备的饱和氨水甲醇液(40ml)处理60h，然后真空浓缩，将沉淀残留物再悬浮于***，过滤收集。沉淀用***洗涤，空气干燥，得到淡黄色固体(1.71g，16.4mmol)，用于随后的步骤。将4-(2-溴代乙酰基)苯甲酸(1.23mmol)和1-哌啶硫代甲酰胺(1.23mmol)混合于THF(10mL)，然后回流3h。反应混合物温热至室温，过滤收集得到的沉淀，用3份***洗涤。粗品产物自热的1:1EtOH-EtOAc结晶得到最初的产物，无色针状物(0.1g，0.40mmol).1H NMR(DMSO-d₆，400MHz) δ7.94(4H，m)，7.37(1H，s)，3.11(6H，m).

4-[2-(异丙基-甲基-氨基)-5-甲基-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.50)

于0℃，向4-丙酰基苯甲酸(11.2mmol)、苄基醇(1.1mL，10.7mmol)和二甲基氨基吡啶(0.14g，1.1mmol)的二氯甲烷(90ml)溶液中加入N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺×HCl(2.4g，12.3mmol)，然后于室温下搅拌过夜。得到的溶液用DCM稀释，顺次用10％柠檬酸水溶液和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩。快速层析残留物(硅胶，石油醚-EtOAc)，得到无色油状物，放置后结晶(2.67g)。将上文所述部分苄酯(1g，3.73mmol)与2-吡咯烷酮(0.37g，4.33mmol)和吡咯烷酮氢三溴化物(1.85g，3.73mmol)的THF液回流1.5h。得到的反应混合物放置至室温，然后用EtOAc稀释，顺次用水、10％硫代硫酸钠水溶液、饱和的碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩。由上得到的溴化物直接与异丙基硫代甲酰胺(0.44g，3.73mmol)的THF(20mL)液混合，回流过夜，然后于硅胶上浓缩。快速层析残留物(硅胶，石油醚-EtOAc-Et₃N)得到淡红色油状物(1.28g，3.49mmol)。

于0℃，向搅拌的上述得到的噻唑衍生物(0.250g，0.68mmol)的乙腈(7mL)、乙酸(1.3mL)和37％甲醛(2mL)水溶液的溶液中加入氰基硼氢化钠(0.09g)，然后于室温下搅拌过夜。再加入氰基硼氢化钠(0.08g)，再搅拌2h后，反应混合物用水稀释，用0.5M碳酸钠水溶液中和，然后用二氯甲烷萃取。收集二氯甲烷层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并浓缩。快速层析(硅胶，石油醚-EtOAc)残留物，得到淡黄色晶体固体(0.115g)。1H NMR(CDCl₃，400MHz，) 8.09(2H，d)，7.72(2H，d)，7.27-7.32(5H，m)，5.38(2H，s)，4.27(1H，m)，2.92(3H，s)，2.42(3H，s)，1.22(6H，d)。于60℃，将上述得到的苄酯(0.25g，0.66mmol)用1M LiOH(1.3mL)水溶液在THF(2mL)中处理水解。将得到的溶液用10％柠檬酸水溶液轻微酸化，然后采用二氯甲烷萃取。干燥(Na₂SO₄)有机层，过滤并浓缩。柱层析残留物(硅胶，二氯甲烷-甲醇)，得到目标化合物，为晶体固体(0.19g)，MS ES+：m/z＝304in MS ES+，经HPLC和MS定性。

4-(2-甲基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.51)

向25ml乙醇中加入4-(2-溴代乙酰基)苯甲酸(486mg，2mmol)和N-甲基硫脲(180mg，2mmol)。回流反应混合物3小时，TLC显示起始原料消失，荧光产物形成。于冰上冷却反应物。过滤收集产物，用预冷却至0℃的乙醇洗涤2次(2×3ml)，随后用***洗涤。干燥后，得到486mg产物。1H NMR(DMSO-d₆，400MHz)

 7.97(2H，d)，7.89(2H，d)，7.32(1H，s)，2.96(3H，s)。

4-[2-(4，4-二氟代-哌啶-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.52)

于0℃，将4，4-二氟代哌啶(盐酸盐，1.57g，10mmol)和二异丙基乙基胺(1.74ml，10mmol)的丙酮(10ml)液缓慢滴加至乙氧基羰基异硫氰酸酯(1.02ml，10mmole)的丙酮(10ml)混合物中。加入完成后，于室温下持续搅拌反应物一小时。加入3N盐酸(15ml)，反应混合物用乙酸乙酯萃取。有机相真空浓缩。

向残留物中加入浓盐酸(20ml)，将反应物保持于80℃5小时。向反应物中加入水(30ml)。用碳酸铵中和，反应混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用水洗涤并真空干燥，得到粗品中间体4，4-二氟代-哌啶-1-硫代羟酸酰胺(1.21g)。将上述残留物(360mg，2mmol)和4-(2-溴代乙酰基)苯甲酸(486mg，2mmol)的THF(20ml)液回流5小时。TLC显示起始原料全部消失，形成荧光产物。在冰上冷却反应物。固体过滤收集。产物自乙醇(380mg)再结晶。1H NMR(DMSO-d₆，400MHz)

 7.96(4H，m)，7.51(1H，s)，3.66(4H，m)2.12(4H，m)。

实施例8.53-8.61和8.63中的目标化合物的收率通常在30和90％之间。

4-(2-异丙基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.53)

将异丙基-硫脲(2.47mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.47mmol)与THF(12mL)混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃2小时。体积减少至5mL，然后将混合物冷却至-20℃并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝263.1，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

3-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.54)

将4-甲基-哌嗪-1-硫代羟酸酰胺(2.47mmol)和3-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.47mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，加热混合物至80℃2小时。然后将混合物冷却至室温并过滤。固体用少量二***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝304.1，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

3-(2-异丙基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.55)

将异丙基-硫脲(2.47mmol)和3-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.47mmol)混合于THF(12mL)中，于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃2小时。体积减少至5mL，然后将混合物冷却至-20℃并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝263.1，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-(2-哌啶-4-基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.56)

将4-硫代氨基甲酰基-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(2.47mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.47mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，混合物加热至80℃2小时。体积减少至5mL，加入***(5mL)。然后将混合物冷却至-20℃并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝289.1，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-[2-(1-甲基-哌啶-4-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.57)

向4-(2-哌啶-4-基-噻唑-4-基)-苯甲酸(1mmol)的乙酸(0.5mL)、甲醇(3mL)和四氢呋喃(4.5mL)的溶液中加入甲醛(约37％，300mL)和与聚苯乙烯结合的氰基硼氢化物(2.36mmol/g，900mg)。然后，将浆状物于室温下震摇16小时，然后过滤浆状物，树脂用甲醇(2mL)洗涤。真空浓缩溶液至干。MS ES+：m/z＝303.1，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-[2-(吡啶-3-基氨基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.58)

将吡啶-3-基-硫脲(2.06mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.06mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃ 2小时。然后将混合物冷却至室温并过滤。固体用少量二***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝298.0，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-[2-(吡啶-2-基氨基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.59)

将吡啶-2-基-硫脲(2.06mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.06mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃ 2小时。然后冷却混合物至室温，过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝298.0，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-)2-环戊基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.60)

将异硫代氰酸根合-环戊烷(4g)的氨水(37％的水溶液，8mL)和甲醇(32mL)液搅拌16小时，过滤并干燥。将环戊基-硫脲(2.06mmoI)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.06mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃ 2小时。然后将混合物冷却至室温并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝289.05，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-(2-环丙基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(实施例8.61)

于0℃，将异硫代氰酸根合-环丙烷(4g)与氨水(37％的水溶液，8mL)和甲醇(32mL)混合，然后于室温下搅拌16小时，将混合物冷却至0℃，过滤，用少量水洗涤并干燥。将环丙基-硫脲(2.06mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.06mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃2小时。然后将混合物冷却至室温并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝261.0，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

4-[2-(环丙基-甲基-氨基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(实施例8.62)

将4-(2-环丙基氨基-噻唑-4-基)-苯甲酸(1.98mmol)、甲基碘(4.36mmol)和碳酸钾在DMF(20mL)中混合，并于室温下搅拌72小时。浓缩混合物至干并分配于二氯甲烷和水。有机层干燥(MgSO4)并浓缩至干。将该固体与THF(4mL)、甲醇(2mL)和1N LiOH(3mmol)混合并加热至50℃1小时。然后将混合物冷却至室温，加入1N HCl至pH4。真空浓缩混合物，然后将得到的残留物溶于二氯甲烷-甲醇并于硅胶上浓缩。快速层析残留物(硅胶，二氯甲烷-甲醇)得到目标化合物，为灰白色固体(0.1g)，MS ES+：m/z＝275.0，经HPLC和MS定性。

4-[2-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-噻唑-5-基]-苯甲酸(实施例8.63)

将3-硫代氨基甲酰基-吡咯烷-1-甲酸叔-丁酯(2.47mmol)和4-(2-溴代-乙酰基)-苯甲酸(2.47mmol)在THF(12mL)中混合。于室温下搅拌5分钟后，将混合物加热至80℃1小时。然后将混合物冷却至室温并过滤。固体用少量***洗涤并干燥。MS ES+：m/z＝304.1。然后将该固体在二氯甲烷-三氟乙酸(2:1)中混合，并于室温下放置20分钟。浓缩混合物至近干，自二氯甲烷中浓缩一次，自1N HCl的***液中浓缩一次。剩余的固体与乙酸(0.5mL)、甲醇(3mL)和四氢呋喃(4.5mL)混合，加入甲醛(约37％，300mL)和聚苯乙烯结合的氰基硼氢化物(2.36mmol/g，900mg)。将浆状物于室温下震摇16小时。然后过滤浆状物，树脂用甲醇(2mL)洗涤。溶液真空浓缩至干。MS ES+：m/z＝289.0，经hplc和MS定性，并且可以不经进一步纯化用于下一步骤。

2-(1-甲基哌嗪-4-基)-6-(4-羧基苯-1-基)-吡啶盐酸盐(实施例8.64)

将2，6-二溴代吡啶(11.8g，50mmol)溶于二甲基甲酰胺(50ml)和1-甲基哌嗪(5.0g，50mmol)，加入碘化钠(0.6g)。加热溶液至80℃30分钟，然后降至室温，并用乙酸乙酯和水稀释。小心萃取水层，收集有机层，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。在硅胶上快速层析残留物(填充时用乙酸乙酯洗脱)，采用乙酸乙酯-甲醇-三乙胺20:2:1作为洗脱液。收集纯净部分并浓缩。

将1.54g残留物溶于二甲氧基甲烷(48ml)，加入四三苯膦钯(0)(5.0g)。于氮气环境下，将溶液脱气并搅拌15分钟。加入4-乙氧基羰基苯基硼酸(1.16g)，随后再加入36ml1M碳酸氢钠水溶液。再一次将溶液脱气并加热至回流，搅拌12小时。过滤溶液，并将滤饼用乙酸乙酯和二甲氧基甲烷小心萃取。蒸发萃取物并经硅胶快速层析纯化(装柱时用乙酸乙酯洗脱)，采用乙酸乙酯-甲醇-三乙胺20:2:1作为洗脱液。收集纯净部分并浓缩。残留物溶于30ml浓盐酸并回流12小时。蒸发溶液得到为固体的目标化合物。1H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)

 2.7(3H，m)3.3(4H，m)4.5(4H，m)7.0(1H，m)7.4(1H，m)7.8(1H，m)8.0(1H，m)8.15(1H，m)11.5(1H，bs)。

4-(6-吗啉-4-基-吡啶-2-基)-苯甲酸盐酸盐(实施例8.65)

将2，6-二溴代吡啶(2.0g)溶于二甲氧基甲烷和吗啉(4.0ml)，加入碘化钠(0.3g)。溶液加热至回流1小时，然后冷却至室温。得到的溶液用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，然后干燥(Na₂SO₄)，过滤并浓缩。采用逐步梯度洗脱快速层析残留物(乙酸乙酯的己烷20-33％)。浓缩纯净部分，然后如实施例8.64所述经Suzuki偶合，如上文所述经快速层析纯化。收集纯净部分并浓缩，然后将残留物溶于30ml浓盐酸，回流1小时。将得到的溶液蒸发，得到目标化合物，为固体。1H-NM

(400MHz，DMSO-d₆) δ 3.6(4H，m)3.7(4H，m)6.9(1H，m)7.3(1H，m)7.7(1H，M)7.9(2H，m)8.1(2H，m)。

实施例9

N-[(1S)-1-((3aS，6S，6aS)-6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰 基)-3-甲基-丁基]-4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺的液相合成

i)4M HCl的二氧六环溶液，ii)Cbz-Leu-OH，WSC，HOBt，DCM，iii)Dess-Martin试剂，DCM

iv)1，1，2-三甲氧基乙烷，p-TsoH，MeoH，60℃，v)H₂/Pd(C)，vi)RCooH，wsC，HoBt，DCM，vii)TFA

a)[(1S)-1-((3R，3aR，6S，6aS)-6-氟代-3-羟基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-氨基甲酸苄酯(2’)

将(3R，3aR，6S，6aS)-6-氟代-3-羟基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-甲酸叔-丁酯(1’)(20.24mmol)溶于4M HCl的1，4-二氧六环液中，并于室温下搅拌1h。真空除去溶剂，残留物悬浮于二氯甲烷(50ml)，用Cbz-Leu-OH(20.24mmol)、WSC·HCl(22.26mmol)、HOBt(22.26mmol)和NMM(40.48mmol)处理。于室温下搅拌反应物混合物过夜，然后用饱和的NaHCO₃水溶液洗涤，干燥并浓缩。残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯-己烷1:1，Rf 0.23)得到化合物2(15.62mmol，77％)。MS(ES)m/z 395(100％，[M+H]⁺)。

b)[(1S)-1-((3aS，6S，6aS)-6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-氨基甲酸苄酯(3’)

将化合物2’(15.61mmol)的二氯甲烷(70ml)溶液用Dess-Martinperiodinone(15.61mmol)处理，于室温下搅拌反应物混合物过夜。然后溶液用饱和的NaHCO₃水溶液洗涤，干燥并浓缩，残留物经柱层析纯化(乙酸乙酯-己烷1:1，Rf 0.37)，得到化合物3(9.38mmol，60％)。MS(ES)m/z 393(15％，[M+H]⁺)，411(100％，[MH+H₂O]⁺)。

c)[(1S)-1-((3aS，6S，6aS)-6-氟代-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-氨基甲酸苄酯(4’)

将化合物3’(8.49mmol)的无水甲醇(50ml)溶液用1，1，2-三甲基原甲酸酯(24ml)和p-TsOH(催化量)处理，并于60℃搅拌3h。然后冷却反应物混合物至室温，真空除去溶剂，残留物经柱层析纯化得到化合物4，(7.42mmol，87％)。MS(ES)m/z439(100％，[M+H]⁺)。

d)N-[(1S)-1-((3aS，6S，6aS)-6-氟代-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺(5’)

将化合物4’(0.625mmol)溶于乙醇(15ml)，用催化量的Pd(10％wt钯炭)处理。于氢气环境下搅拌反应物3-4h。然后经硅藻土垫过滤反应混合物，滤饼用乙醇洗涤，合并有机萃取物并真空浓缩。残留物溶于二氯甲烷(15ml)，并用4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸(0.60mmol)、WSC·HCl(0.625mmol)和HOBt(0.625mmol)处理。反应混合物经HPLC监测。当反应完成(4h)后，有机溶液用饱和的NaHCO₃水溶液洗涤，干燥并浓缩，残留物经制备性HPLC纯化，得到化合物5(0.30mmol，50％)。MS(ES)m/z604(100％[M+H]⁺)。

e)N-[(1S)-1-((3aS，6S，6aS)-6-氟代-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺(6’)

将化合物5’(0.21mmol)溶于无水三氟乙酸(2ml)，并于室温下搅拌，反应物经HPLC密切监测以避免叔酰胺的裂解。一旦起始原料消失(3小时45分钟)，在氮气流下除去TFA，残留物分配于乙酸乙酯和饱和的NaHCO₃水溶液，干燥有机萃取物并真空浓缩，残留物溶于乙腈-水1:1(2ml)并冻干过夜，得到化合物6’，为白色固体(0.20mmol，94％)。MS(ES)m/z558(10％，[M+H]⁺)，576(100％，[MH+H₂O]⁺)。

生物实施例

组织蛋白酶K催化蛋白水解活性的定性

优选的组织蛋白酶K的试验可以采用人重组细胞酶进行，如PDB中所述。

ID   BC016058  标准的；mRNA；HUM；1699BP。

DE   人组织蛋白酶K(骨发育障碍矮小症)、mRNA(cDNA  克隆MGC:23107)

RX  MEDLINE；.RX   PUBMED；12477932。

DR  RZPD；IRALp962G1234。

DR  SWISS-PROT；P43235；

重组组织蛋白酶K可以在多种商业表达***中表达，包括E大肠杆菌、Pichia和杆状病毒***。通过常规方法除去前体序列(prosequence)，可以激活纯化的酶。

用于测定动力学常数的标准试验条件为采用荧光肽底物(通常为H-D-Ala-Leu-Lys-AMC)，在含有1mM EDTA和10mM 2-疏基乙醇的pH7.0的100mM Mes/Tris中或在pH6.5的100mMNa磷酸盐、1mMEDTA和0.1％PEG4000中或者在含有5mM EDTA和20mM半胱氨酸的pH5.5的100mM乙酸钠中进行测定，在上述每种情况下，任选采用1MDTT作为稳定剂。所采用的酶的浓度为5nM。底物储备溶液在DMSO中以10mM制备。在固定的底物浓度为60μM时进行筛选，详尽的动力学研究在250μM的底物的双倍稀释下进行。试验中总的DMSO浓度保持于3％以下。所有试验均于室温下进行。产物荧光(于390nm激发，于460nm发射)采用Labsystems Fluoroskan Ascent荧光读板仪监测。生成AMC产物后经15分钟生成产物反应曲线。

抑制研究

可以采用上述试验方法，用各种浓度的试验化合物筛选有潜力的抑制剂。通过向底物和抑制剂的缓冲溶液中加入酶开始反应。K_i值可以根据方程1计算

$v_0=\frac{\mathrm{VS}}{K_M(1+\frac{I}{K_i})+S}---\left(1\right)$

其中v₀为反应速度，V为最大速度，S为底物的浓度，K_M为Michaelis常数，I为抑制剂浓度。

对上述WO 02057270中最接近的个体化合物和在P1基团上携有独特的卤素取代基的本发明化合物进行了对比实验，数据如下：

显然，本发明的在P1基团引入至少一个卤素原子的化合物产生了出人意料的效果，其效力增加了10倍。

^*需要注意的是，在现有技术WO 02057270中，给出的化合物的Ki值为低于0.1μM，而在同样的分析体系中，上述试验反映了的准确的对比试验值。

缩写

DMF   二甲基甲酰胺               DCM二氯甲烷

TBDMS 叔-丁基二甲基甲硅烷基      RT室温

THF四氢呋喃   Ac     乙酰基

TLC薄层层析   DMAP   二甲基氨基吡啶

EtOAc  乙酸乙酯

在本说明书和随后的权利要求书全文中，除非本文中特别要求，否则术语“包含”及其各种变化形式如“包括”以及“含有”均可以被理解为包含所述的整体、步骤、一类整体或一类步骤，但不排除任何其它整体、步骤、一类整体或一类步骤。

Claims (9)

1.式II化合物或其药学上可接受的盐：

其中

R¹为H，

R²为氟；

R³为异丁基；

R⁴为H；

R⁵为H；

E为-C(＝O)-；

R⁶为在对位被下列取代基取代的苯基：

(i)噻唑-4-基、5-甲基噻唑-4-基或噻吩-2-基，这些基团被选自下列的基团取代：吗啉基、吗啉基甲基-、哌啶基、哌啶基甲基-、哌嗪基和哌嗪基甲基，这些基团被下列取代基进一步取代：C_1-3烷基、氟、二氟或C_1-3烷基-O-C_1-3烷基-；或者

(ii)苯氧基；

其中立体化学结构如下述部分结构所示：

2.权利要求1的化合物，其中噻唑-4-基、5-甲基噻唑-4-基或噻吩-2-基的取代基为被甲基取代的哌啶-4-基、被C₁-C₃烷基或甲基氧基乙基进行N-取代的哌嗪基、或者为未取代的或4-位被氟或二-氟取代的哌啶-1-基甲基-。

3.权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为下式的化合物：

4.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1-3任一项所定义的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。

5.权利要求1-3任一项所定义的化合物在生产用于治疗由组织蛋白酶K介导的紊乱的药物中的用途。

6.权利要求5的用途，其中所述紊乱选自：骨质疏松症；齿龈疾病；佩吉特病；恶性高钙血症；骨代谢疾病；以过多的软骨或基质降解为特征的疾病；骨癌；和疼痛。

7.权利要求6的用途，其中所述以过多的软骨或基质降解为特征的疾病为骨关节炎或风湿性关节炎。

8.权利要求6的用途，其中所述齿龈疾病为齿龈炎或牙周炎。

9.权利要求6的用途，其中所述骨癌为瘤形成。