CN100448479C - 化合物psi在制备治疗白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化合物PSI在制备治疗白血病药物中的应用，包括在制备M2型急性髓性白血病和慢性粒细胞性白血病药物中的应用，其有效浓度为1×10^-9～1×10^-6M。化合物PSI为白血病病人提供在了新的治疗药物，具有剂量小，价格适中等优点，由PSI制备的药物可用于AML M2初发、复发期的治疗，还可以用于CML慢性期、加速期和急变期的治疗。

Description

化合物PSI在制备治疗白血病药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物I(proteasome inhibitor I；PSI)在制备治疗白血病药物中的应用，尤其是涉及PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病(AML M2)和慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的药物中的应用。

背景技术

白血病是一组基因组发生异常的造血干/祖细胞疾病，有急、慢性之分。根据细胞系列不一样，急性者分急性淋巴细胞性白血病(ALL)与急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)，后者又分M0～M7几个亚型；慢性白血病又分成慢性粒细胞性白血病(chronic myeloidleukemia，CML)和慢性淋巴细胞性白血病。

M2型急性髓性白血病(AML M2)发病率较高，占所有AML的25％，其中40％-80％具有t(8；21)染色体易位。该易位产生AML1-ETO融合基因，其编码的AML1-ETO融合蛋白不仅与野生型AML1竞争靶基因上AML1结合位点TG(T/C)GGT，而且活跃地抑制AML1靶基因的转录，因此是野生型AML1的显性抑制形式(dominant repressive form)。AML1-ETO还可抑制AML2/RUNX3蛋白、阻断RUNX2活性，使在造血细胞共表达的RUNX家族的遗传学效应广泛地受到抑制。ETO蛋白可与共抑制复合物N-CoR、SMRT与mSin3A特异区域结合的发现，说明ETO也可抑制AML1介导的基因转录。研究发现，AML1-ETO可促进组蛋白去乙酰化酶(HDACs)蛋白复合体与AML1的靶基因进行募集，而抑制P300/CBP组蛋白乙酰化酶共激活物与AML1靶基因的募集，最终导致转录抑制。Pabst等发现AM1-ETO明显抑制了在粒细胞分化过程中起关键作用的C/EBPα的表达，C/EBPα基因的转染可逆转AML1-ETO引起的分化障碍。AML1-ETO还可抑制G-CSF、GM-CSF、PU.1等的活性，引起细胞分化受阻；通过活化Bcl-2的转录、抑制P14(ARF)、TGFβ信号而引起白血病细胞凋亡的抑制与增殖潜能的增高。临床上，AML M2患者常有发热、贫血、出血及粒细胞肉瘤等症状体征，而血中白血病细胞增高，红细胞、血小板减少，自然病程仅半年左右。AML M2的治疗目前以阿糖胞苷、柔红霉素/去甲氧柔红霉素等化疗为主，虽然缓解率较高，但容易复发导致治疗失败，中位生存时间不足2年，5年生存率不足40％。而且迄今为止从总体上说，AML的治疗仍可由于治疗相关性死亡或更多地由于耐药性的产生而导致失败。

CML是一类以具有t(9；22)染色体易位及其形成的BCR-ABL融合基因为特征的克隆性髓系造血干细胞疾病，粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板、B淋巴细胞均可受累，在部分病例T淋巴细胞也被累及。临床症状包括乏力、发热、消瘦、脾大等，自然病程可分为慢性期、加速期及急变期，随着病程的演变对治疗的耐药性越来越严重。研究显示，BCR-ABL融合蛋白的形成可导致ABL蛋白酪氨酸激酶活性的异常增高并引起细胞周期异常、凋亡抑制与白血病细胞的恶性增殖，因而是CML发病的基本原因。在动物实验中，BCR-ABL可引起小鼠发生CML。治疗上，羟基脲(hydroxyurea，Hu)、阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)等曾被广泛应用，而α-干扰素(interferonα，IFNα)与Hu相比可使患者的生存期延长1-2年，并使带有t(9；22)的细胞数减少；IFNα与Ara-C联合应用进一步改善了疗效而一度被认为是CML治疗的“金标准”。但是，以上疗法均不能取得分子缓解[即BCR-ABL转录本的清除使之不能被聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测到]。同种异体干细胞移植固然可使约26％的患者获得长期的临床缓解，但较高(约25％)的移植相关死亡率及高昂的费用又令不少病人望而却步，近年来发现，酪氨酸激酶活性抑制剂STI-571/Imatinib mesylate/Gleevec可占据BCR-ABL蛋白分子上的ATP结合位点，抑制ABL激酶活性阻抑底物分子的磷酸化，从而抑制CML细胞的生长、诱导其发生凋亡与分化。Druker等用STI-571治疗54例对IFNα无反应或不能耐受IFNα治疗的慢性期CML患者，结果53例(98％)获得了血液学缓解，29例获得了细胞遗传学缓解。对出现原始细胞危象的CML病人，STI-571亦显示出一定的疗效。对初诊慢性期病人，STI-571治疗无论在诱导血液学/细胞遗传学缓解、耐受性及控制病情进展等方面均较IFNα+Ara-C疗法更有优势。但是，STI-571需长期服药，而且价格昂贵；对加速期与急变期病人，STI-571虽可使病情获得短暂缓解，但很快即可复发；即使对于慢性期病人，STI-571亦不能彻底清除异常克隆。

因而，开发新的治疗药物进一步改善M2型急性髓性白血病和慢性粒细胞性白血病患者患者预后仍是一项迫切需要解决的研究课题。

PSI(proteasome inhibitor I；PSI)是一种可透过细胞膜的蛋白酶体抑制剂，主要用于抑制糜蛋白酶样酶活性。其分子式为C₃₂H₅₀N₄O₈，化学结构式如下图所示。鉴于不同肿瘤其发病原因各不相同，蛋白酶体也有不同组分或亚单位，蛋白酶体抑制剂在不同肿瘤对不同亚单位的作用不一，化合物PSI能否作为药物治疗人类白血病，特别是急性髓性白血和慢性粒细胞性白血病，目前尚未见报道。

PSI的化学结构式

发明内容

本发明的目的在于提供化合物PSI在制备治疗白血病的药物中的应用。

本发明所述的化合物PSI在制备治疗白血病的药物中的应用，PSI的浓度为1×10^-9～1×10^-5M。

PSI抑制白血病细胞增殖、抑制白血病细胞生长、并诱导白血病细胞凋亡。

本发明所述在化合物PSI治疗白血病中的应用，包括化合物PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病的药物中的应用。

化合物PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病的药物中的应用更优选的浓度为1×10^-8～1×10^-7M，最优选的浓度为3.84×10^-8M。

PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病的药物时可与阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种联合使用。

本发明所述化合物PSI在治疗白血病中的应用，包括化合物PSI在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。

化合物PSI在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用，其优选的浓度为1×10^-7～1×10^-6M，最优选的浓度为3.45×10^-7M。

化合物PSI在制备治疗染慢性粒细胞性白血病的药物时可与阿糖胞苷、羟基脲、干扰素或蛋白酪氨酸激酶抑制剂STI-571中的一种或多种联合使用。

化合物PSI抑制白血病细胞增殖、抑制白血病细胞生长、并诱导白血病细胞凋亡。

特异地，化合物PSI在制备治疗AML M2的药物中的应用机制在于：在分子水平作用于AML1-ETO融合蛋白，可使AML1-ETO蛋白发生降解，并产生降解片段，从而抑制白血病细胞的增殖、生长、并诱导其凋亡。浓度为1×10^-9～1×10^-6M的PSI能抑制具有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞的增殖、生长，并使其凋亡。

化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用机制在于：在分子水平作用于BCR-ABL融合蛋白，抑制CML白血病细胞的增殖、生长、并诱导其凋亡。浓度为1×10^-8～1×10^-5M的PS-341处理含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，12～48小时后可引起K562细胞增殖抑制，生长抑制，并出现细胞凋亡。

本发明提供了PSI在临床上作为治疗白血病药物的用途。PSI为白血病患者提供了新的治疗药物，可进一步提高白血病患者的疗效，改善其预后，具有剂量小，价格适中等优点。并且，由PSI制备的药物可用于AML M2初发、复发期的治疗，还可以用于CML慢性期、加速期和急变期的治疗。

附图说明

图1是PSI对AML1-ETO融合蛋白的降解作用图；

图2是化合物PSI对Kasumi-1细胞的抑制率图；

图3是化合物PSI对K562细胞的抑制率图；

图4是Kasumi-1细胞在化合物PSI处理下的生长曲线图；

图5是K562细胞在化合物PSI处理下的生长曲线图；

图6是Kasumi-1细胞在PSI处理后Annexin V的表达情况图；

图7是K562细胞在PSI处理后Annexin V的表达情况图。

具体实施方式

本发明通过化合物PSI抑制白血病细胞增殖、抑制白血病细胞生长、并诱导白血病细胞凋亡达到制备治疗AML M2和CML的药物的目的。

采用浓度为1×10^-9～1×10^-5M的PSI(购自美国Calbiochem公司)处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞和含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，12～48小时后可引起Kasumi-1细胞和K562细胞增殖抑制，生长抑制，并出现细胞凋亡。

PSI对Kasumi-1细胞和K562细胞的作用依赖于PSI的浓度和处理时间，即PSI在低浓度、短时间时主要抑制Kasumi-1细胞和K562细胞的增殖，减慢其生长速度，发生凋亡的细胞仅占少数；当PSI的浓度较高或作用时间较长时，可明显抑制Kasumi-1和K562细胞的增殖，并出现染色质浓集、核碎裂但胞膜完整等细胞凋亡特征。

实施例1：PSI对AML1-ETO融合蛋白的降解作用图。

用不同浓度的PSI处理Kasumi-1细胞，处理24小时后收集细胞并用1×细胞裂解液裂解细胞抽取蛋白质，然后用抗ETO抗体(购自美国Santa Cruz公司)进行Western blot免疫印迹实验。结果发现，PSI可调变AML1-ETO融合蛋白的表达，使AML1-ETO蛋白部分发生降解并产生降解条带。(见图1，左为对照，右为50nM浓度的PSI处理24小时后AML1-ETO融合蛋白的变化。)

实施例2：

用不同浓度的1×10^-9～1×10^-5M的PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞和含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，44小时后加入含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)的CCK-8检测试剂，再孵育4小时，然后用酶标仪测定两者在450nm的吸光值(OD₄₅₀)。结果发现，PSI处理可明显降低Kasumi-1细胞和K562细胞的OD₄₅₀，说明PSI可明显抑制Kasumi-1细胞和K562细胞的增殖，抑制率与药物浓度成正相关(见图2和图3)。

根据PSI对Kasumi-1细胞的生长抑制作用，计算出PSI对Kasumi-1细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)为3.84×10^-8M。

根据PSI对K562细胞的生长抑制作用，计算出PSI对K562细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)为(3.45±1.35)×10^-7M。

实施例3：

用不同浓度的(1×10^-9～1×10^-6M)PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞和含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，分别在处理后12、24、36、48小时通过胎盼蓝拒染法计数活细胞数并绘制Kasumi-1细胞和K562细胞的生长曲线，发现PSI可明显抑制Kasumi-1细胞和K562细胞生长，这种作用呈时间-剂量依赖性。当PSI的浓度为10nM～100nM时，经PSI处理的含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1的活细胞数显著下降，参见图4。当PSI的浓度为20nM～160nM时，经PSI处理的含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562的活细胞数显著下降，参见图5。

实施例4：

用不同浓度的(1×10^-9～1×10^-6M)PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞和含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，分别在处理后12、24、36、48小时取细胞用瑞氏染液进行染色，并在显微镜下观察，发现PSI处理均可使该Kasumi-1细胞和K562细胞都出现胞体变小、胞核浓缩/碎裂、出现凋亡小体、但胞膜完整的细胞凋亡特征。发生凋亡的细胞随PSI浓度的增大、处理时间的延长而增多。

实施例5：

用不同浓度的(1×10^-9～1×10^-6M)PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株Kasumi-1细胞和含有t(9；22)染色体易位的CML细胞株K562细胞，分别在处理后12、24、36、48小时取细胞用Annexin V(膜联蛋白V)/碘化丙啶(PI)处理，然后用流式细胞仪检测AnnexinV阳性细胞，发现PSI处理可使该Kasumi-1细胞和K562细胞的Annexin V阳性率都明显增高，说明PSI可诱导Kasumi-1细胞和K562细胞凋亡。发生凋亡的细胞随PSI浓度的增大、处理时间的延长而增多。50nM PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株的Kasumi-1细胞，24小时后，Kasumi-1细胞Annexin V阳性率明显增高，如图6所示(其中，6A为对照，6B为50nM PSI处理含有t(8；21)染色体易位的细胞株的Kasumi-1细胞的结果示意图)。500nMPSI处理K562细胞，24小时后，K562细胞Annexin V阳性率明显增高，如图7所示(其中，7A为对照，7B为500nM PSI处理K562细胞24小时的结果示意图)。

Claims (4)

1、化合物PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病的药物中的应用

2.根据权利要求1所述的化合物PSI的应用，其特征是所述化合物PSI的浓度是1×10^-8～1×10^-7M。

3.根据权利要求2所述的化合物PSI的应用，其特征是所述化合物PSI的浓度是3.84×10^-8M。

4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物PSI的应用，PSI在制备治疗具有t(8；21)染色体易位的M2型急性髓性白血病的药物时与阿糖胞苷、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞单核细胞集落刺激因子中的一种或多种联合使用。

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