CN100429312C

CN100429312C - 一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征

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Publication number: CN100429312C
Application number: CNB200480006407XA
Authority: CN
Inventors: E·格思里; T·戴维斯; J·本纳二世
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: US20060252118A1; JP4812617B2; EP1608765A4; CN1768148A; WO2004076628A3; US7319014B2; WO2004076628A2; JP2006518596A; CN101220368B; CA2516794A1; JP2011167210A; CN101220368A; EP1608765A2

Abstract

本发明提供了碱性磷酸酶的组合物以及过量表达和纯化热敏南极磷酸酶(TAP)的方法。TAP的应用包括核酸、糖、肽和蛋白的去磷酸化。在这里描述的TAP与其它来源的磷酸酶相比具有优势，例如在65摄氏度时的热敏性和在接近中性pH时去磷酸活性的效率方面。

Description

一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征

背景技术

纯化的磷酸酶被分子生物学家们用于在体外条件下去除线性DNA、RNA、核苷酸和蛋白的磷酸基团。从线性DNA载体上去除两个5’端磷酸残基可阻止载体DNA在连接反应中重新环化，因为DNA连接酶只有在其中一个核苷酸含有5’端磷酸基而另一个核苷酸含有3’端羟基的情况下才催化临近的核苷酸之间磷酯键的形成。然而，带有5’端磷酸基的外源DNA片段可以有效地连接到去磷酸化的载体上，如此形成的含有两个缺口的开环分子可以很容易地转化到感受态细胞中。

已经有好几种不同的磷酸酶被开发出来以用于去除来自不同生物分子的磷酸基团，而且每种磷酸水解酶都具有它们自身的优点和缺点。第一个用于这种目的的磷酸酶是从大肠杆菌(E.coli)中纯化到的细菌碱性磷酸水解酶(BAP)。BAP的优点是对于所有类型的DNA末端都具有很好的活性。然而，这种磷酸水解酶由于对热和去污剂的异常稳定性导致其很难从反应中被去除(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual Sections 1.53-1.72(1989))。据报道具有增加的热稳定性的一种突变BAP(美国专利号5,891,699，欧洲专利号0441252)已经被开发出来。牛肠碱性磷酸水解酶(CIP或者CIAP)是另外一种在分子生物学技术中广泛应用的磷酸酶(美国专利号5,773,226和5,707,853)。对于DNA的活性CIAP没有BAP高，但是却相对容易从反应中去除，这或者通过蛋白酶K处理之后用酚：氯仿抽提或者在存在EDTA的情况下热处理之后用酚：氯仿抽提来实现(Sambrook，et al.，supra(1989))。最近从北极甜虾(Pandalus borealis)中分离出的一种磷酸水解酶(SAP)(美国专利号6,387,634和6,379,940)被证明更加易于使用。它对于所有类型的DNA末端都具有和BAP类似的良好活性，而且据报道它还具有非常易于从反应中去除的优点，只要在65摄氏度处理15分钟就可以使之热失活(安玛西亚生物科学，皮斯卡特威，新泽西州)。

文献报道中出现的其它的热敏磷酸水解酶包括一种从南极嗜寒株系TAB5分离出来的被称为热敏南极磷酸酶(TAP)的酶(Rina，et al.，Eur.J.Biochem.267：1230-1238(2000))。TAP与其它的磷酸酶相比的优势包括热敏性和高的比活性。Rina等报道，这种磷酸酶对于底物对硝基苯磷酸(pNPP)具有1650单位/毫克蛋白的比活性，这一活性明显地高于其他任何已知的磷酸酶的活性。然而，这种由Rina等人报道的克隆得到的蛋白(supra(2000))在过量表达和纯化方面都有一些问题。比如，由Rina等人报道的纯化程序(supra(2000))需要多步超高速离心以便将TAP从与之联系的细胞膜上提取出来。这个程序不适合大规模工业生产(比如，涉及300克或者更多的细胞浆料的生产过程)。另外，采用Rina等人描述的程序过量表达TAP基因会导致该酶的产量非常低，这样对于大规模生产就不是非常节省费用。

发明概述

本发明的实施方案提供了在中性pH条件下具有更强的热敏性和增强的活性的碱性磷酸酶，以及在该蛋白的N末端的亲水前导序列(leader sequence)。该亲水前导序列可以是寡肽，比如带有净正电荷的寡肽例如His标记。这种磷酸酶的优势包括，通过升高温度至其它的反应物和产物不受影响的水平便能去除其活性。具有这些特性的磷酸酶的一个实例就是TAP，其在实施例中有详细描述。虽然这里描述的方法需要依赖一段亲水前导序列的存在，比如His标记，其融合到蛋白的N末端，但该蛋白优选不用镍柱来纯化，因为镍柱缓冲液对蛋白的活性具有负面影响。但是，亲水前导序列的存在令人吃惊地增加用其它柱组合物进行柱纯化时的产量。

在本发明的一个实施方案中，截短的但仍然具有酶活性的TAP被提供，其中所述的截短对应于一段信号序列的剔除，该磷酸酶具有一个C末端和一个N末端，其中所述N末端与一段亲水前导序列共价相连，该前导序列例如是带正电荷的寡肽，如His标记。这种截短的TAP可以在65摄氏度下15分钟之内基本失活。特别的是，这种截短的TAP在pH大于6或者更加特定地，在大约pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中是基本稳定的。

另外，编码TAP(也列于GenBank Y18016中)但缺少与自然发生的TAP基因相联系的信号序列的部分或者全部序列的DNA被描述。该DNA可以进一步包括编码多个His氨基酸的序列，这段序列优选在被表达的TAP基因的N末端。该DNA可以在一种强启动子的控制下表达，比如T7启动子。

在一个优选的实施方案中，含有上述的DNA的载体被提供。这样的载体的一个实例是pEGTAP7.4.1。在本发明的其他实施方案中，已经用至少一个载体转化了的宿主细胞被提供。在实施例中，宿主细胞为大肠杆菌，但并不排除使用其他类型的宿主细胞。

在本发明的其他实施方案中，TAP的制剂被提供，其在37摄氏度，在含有Tris-HCl、MgCl₂、DTT和甘油的缓冲液中相当稳定，特别是在pH为7.4的时候。

在本发明的一个实施方案中，用于过量表达TAP的方法被提供，所述方法包括(a)将与用于表达亲水寡肽比如His标记的序列相融合的截短TAP基因有效连接到(operably linking to)T7启动子上；(b)转化到宿主细胞中；(c)过量表达TAP。在进一步的实施方案中，该TAP基因编码TAP蛋白，其具有一个C末端和一个N末端，其中该TAP蛋白在N末端是被截短的，所述截短对应于一段信号序列，并在该N末端上连接亲水寡肽。

在本发明的其他实施方案中，用于获得纯化的TAP的方法被提供，所述方法包括(a)获得如上所述的转化的宿主细胞；(b)破碎宿主细胞以获得可溶性组分；(c)从可溶性组分中纯化出TAP。而且，该方法可以额外地包括柱纯化的步骤，其中TAP从柱子上被洗脱下来。在这里，纯化是指在破碎的细胞混合物中TAP蛋白与总蛋白的相对百分比例的增加。比如，当TAP蛋白在混合物的总蛋白中的比例超过5％，纯化便实现了。优选地，TAP蛋白的百分比可以超过总蛋白的50％、80％或者90％。在一个特定的实施方案中，TAP蛋白可以被纯化到占总蛋白的大约95％。

在本发明的其他实施方案中，用于分析TAP活性的方法被提供，它包括：(a)将TAP加入含有底物的pH大约5.5-7.0的缓冲液中；(b)在一定时间内和一定温度下测定从该底物上移去的磷酸基的量，从而测定TAP活性。在一个优选的实施方案中，缓冲液包含ZnCl₂和MgCl₂盐。更加特定的情况下，该缓冲液是Bis-Tris丙烷。

在其他的实施方案中，对磷酸化底物进行去磷酸化的方法被提供，它包括向含有底物的pH 5.5-7.0的缓冲液中加入TAP，以及在一定时间内和一定温度下导致一定量的磷酸基从该底物上移去。

所述底物可以是核酸或者核酸上的末端核苷酸、磷酸化糖分子，或者磷酸化的肽或者蛋白。

附图说明

图1显示的是从含有pN1的大肠杆菌株系中纯化TAP的结果。泳道1-6分别对应于纯化过程中的连续步骤。泳道1是诱导之后总粗提物。泳道2是可溶性的膜组分。泳道3是从DEAE柱上得到的流出物(flow-through)。泳道4是从Q-sepharose柱子上得到的混合在一起的洗脱组分。泳道6是从羟磷灰石柱子上得到的流出物。泳道7是由pN1克隆获得的纯化的TAP。分子量标准(S)用kD表示。泳道7中对应于47.5kD的条带代表基本上纯化的TAP。

图2显示的是构建用于过量表达TAP基因的载体的各个步骤的示意图。该图的顶部的四边形是TAP基因的示意图，其中TAP包括该基因的对应表达产物的N末端和C末端部分。在N末端，甲硫氨酸起始密码子的位置和编码假定的信号序列的加工位点附近的区域都被标示出来。在C末端，该基因产物的氨基酸被标示出来，并且终止密码子对应的氨基酸用星号标识出来。用于TAP基因的PCR扩增的引物分别标示在各引物与TAP基因杂交的位置，并分列于长方形的上方(未按比例)(对应于正向引物A、B和C)和下方(对应于反向引物D和E)。引物上的N和X表示的是限制性内切酶NdeI或者XhoI的剪切位点。引物C上NdeI位点之后有6个H′s。这些对应于在该引物中编码***在甲硫氨酸起始密码子相邻下游的组氨酸的6个密码子，如此就可以产生一个融合到TAP的N末端的His标记。“PCR”下面的一系列线条表示的是用所示的引物对得到的产物。同上，星号表示的是终止密码子，6个H表示的6个组氨酸密码子。通过将这些PCR产物***到pET21a中，得到5个不同质粒，如图所示。pEGTAP1.1.1编码不含His标记的完整TAP。pEGTAP1.2.1编码不含His标记的截短TAP。pEGTAP1.3.1编码在C末端含有His标记的完整TAP。pEGTAP1.4.1编码在C末端含有His标记的截短TAP。在后来的实验中，载体pEGTAP7.4.1被构建出来，其编码含有N末端His标记的截短TAP。

图3表示的从不同的克隆中得到的TAP的SDS-PAGE分析，其中TAP基因含有His标记或者不含有His标记，或者是截短或者是不截短的。“测试”纯化涉及小于1ml的样品体积。泳道1是来自于含有不带His标记的完整TAP基因的pEGTAP1.1.1克隆的可溶性粗提物。泳道2是来自于含有不带His标记的截短TAP基因的pEGTAP1.2.1克隆的可溶性粗提物。泳道3和4是来自于含有带有His标记的完整TAP基因的pEGTAP1.3.1克隆的两个不同菌落的可溶性粗提物。泳道5和6是来自于含有带有His标记的截短TAP基因的pEGTAP1.4.1克隆的两个不同菌落的可溶性粗提物。分子量标准(S)用kD表示。那些含有截短TAP基因的克隆(泳道2，5和6)提供了对应于TAP蛋白的信号最强的条带。

图4显示的是在非变性条件下从含有带C末端His标记的截短TAP基因的大肠杆菌(ER2566)克隆(pEGTAP1.4.1)中纯化的可溶性TAP的SDS-PAGE分析。分别为10微升的总粗提物(T)、经过澄清的粗提物(上样)(L)、从Ni-NTA高速离心柱(Qiagen，Studio City，加州)得到的流出物(FT)、从Ni-NTA高速离心柱得到的洗出物(W)和从Ni-NTA高速离心柱上用洗脱缓冲液洗脱得到的第一和第二洗脱样品(E1和E2)在10-20％的Tris Tricine PAG胶(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州)上进行分析，然后用考马斯亮蓝染色，分子量标准(S)用kD表示。

图5显示的是与图4中所用的流程类似的纯化流程的结果，不同的是被用来分析的克隆是ER2566(pEGTAP7.4.1)。另外，并不是将总细胞提取物在胶上分析，而是将高速离心粗提取物所得到的沉淀重悬并作为不溶性沉淀(P)来分析。分别为10微升的沉淀(P)、可溶性上样物(L)、从Ni-NTA高速离心柱得到的流出物(FT)、从Ni-NTA高速离心柱得到的洗出物(W)、用咪唑洗脱Ni-NTA高速离心柱得到的洗脱组分(E)和指示kD的分子量标准(S)都在10-20％的TrisTricine PAG胶上分离，之后用考马斯亮蓝染色。

图6显示的是TAP活性在不同pH和不同的缓冲液中的比较。pH优化是采用磷酸基释放分析来确定的。50mM的各种缓冲液在含有³²P标记的双链DNA、1mMMgCl₂和0.1mM ZnCl₂的反应混合物中温浴。反应在37摄氏度温浴5分钟，之后三氟乙酸(TCA)可溶性组分的计数被测量。

图7显示的是用磷酸基释放分析来检测不同的盐对TAP活性的影响。浓度为100mM的各种盐包括KCl、NaCl、醋酸钾或者醋酸钠被测试。

图8显示的CIAP、SAP和TAP的热敏性的比较。每一种酶都在存在DNA的情况下在65摄氏度温浴至30分钟。在温浴过程中不同的时间点取样，然后用pNPP检测其活性。

图9显示的是TAP在37摄氏度和25摄氏度时的稳定性，这是通过检测一段时间内pNPP被TAP去除的磷酸基来实现的。含有一个单位的TAP和没有反应的pNPP的样品管，在25摄氏度或者37摄氏度温浴。反应在0-30分钟内以5分钟的间隔被分别加入NaOH至终浓度5N而终止反应。磷酸基的释放(pNP的积累)是通过分光光度计在405nm(黄色)处测量，所得结果与反应时间作图。

图10显示的是TAP和SAP在去除不同类型的DNA末端上的磷酸基时的效率比较，被测试的末端类型包括：5’粘末端、平末端和3’粘末端。这些末端是分别通过用HindIII、EcoRV和PstI消化载体而得到的。

图11显示的是TAP和SAP的脱氧核苷酸酶活性的反应时间进程。dATPase反应混合物的组成采用Cap-HPLC每隔5分钟进行测量。这些结果是按照总核苷酸当中各组分的百分比例来表示的。

图12显示的是焦磷酸由于TAP的作用而释放出无机磷酸基团。量逐渐增加的TAP被加入到含有0.32mM焦磷酸钠的各反应混合物中。无机磷酸基的量基本上是根据Heinonen和Lahti的方法(Heinonen，J.K.and Lahti，R.J.“A new andconvenient colormetric determination of inorganic orthophosphate and its application toassay of inorganic pyrophosphatase.”Anal.Biochem.113(2)：313-17，1981)通过和已知的磷酸基标准比较而得到的。热稳定的无机焦磷酸(TIPP)被用于平行反应以证明其效力。这里显示的分别是TAP在37摄氏度反应10分钟和TIPP在75摄氏度反应10分钟的结果。

图13提供了一个表格，显示的是TAP与CIAP对磷酸化的髓磷脂碱性蛋白的比活性的比较。

图14显示的TAP对三种磷酸化的肽：磷酸化丝氨酸(图14A)、磷酸化苏氨酸(图14B)和磷酸化酪氨酸(图14C)的活性，其通过Cap-HPLC来测量。磷酸化肽和肽的吸收峰的面积被测量，并用其在总面积中所占的百分比例和TAP的单位数来作图。

图15显示的是TAP对三种不同的磷酸化糖分子：葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸的滴定的TLC分析。3微克的葡萄糖(G)和甘露糖(M)被点样作为阳性对照。阴性对照(-)含有的反应混合物只含有缓冲液和磷酸化糖分子底物，而没有酶与之温浴。泳道1到6对应于酶在反应混合物中的梯度系列稀释，稀释从反应体系1开始，其中含有12.5单位的TAP，一直稀释到反应6，其中含有0.4个单位TAP。箭头指示了糖分子和磷酸化糖分子在TLC板上迁移的距离。

图16显示的是用来从pN1质粒中PCR扩增一段1.1kb的片段所用的引物的序列(SEQ ID NOS：6和8)。通过克隆的PCR片段的表达而获得的预期蛋白的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO：7)标示在正向引物序列下方。

图17显示的是完整TAP基因的DNA序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。蛋白的起始点标示在框中，这是通过N末端序列分析确定的(Rina，et al.，supra)。箭头指示的是用于克隆截短的基因的PCR引物发生退火的位置。

实施方案详述

TAP基因已经由Rina等人分离并克隆出来，而且其DNA序列也已经被发表。然而，如果使用发表的流程试图从这个克隆过量表达并纯化TAP，一系列问题就出现了，包括不能获得用作试剂目的的足够量的纯化的酶，以及需要多个超高速离心步骤来将酶从与其相关的膜片断上分离下来。这里提供了一个流程，其可以保证TAP基因的过量表达，酶的产量对于满足大规模生产来说是费用节省的。进一步，已经开发出了纯化流程，其可以免去多个超高速离心步骤的需要，并且适合于大规模生产。TAP已经被用于去除核酸、肽和糖类分子上的磷酸基团。其它的可以作为TAP底物的底物是那些被Reid和Wilson在The Enzymes第五卷(1971)17章373页中描述过的底物。

在一个优选的实施方案中，这里提到的“糖”是指单糖、寡糖或者多聚糖。糖类分子包括任何五碳糖、六碳糖或者庚酮醣类化合物。磷酸基可以使用TAP从糖的任何碳位置上剪切下来，不论所述的一个或者多个磷酸基的位置，也不论磷酸基是α或者β异构体。一些糖磷酸基团的实例在网站http://www.arabidopsis.org上被提供。糖磷酸基的实例包括：甘露糖、葡萄糖、海藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、木糖和鼠李糖的磷酸基。

尝试从含有pN1质粒的ER2575(ER2566 pLysS)中纯化TAP，其中采用修改过的发表出来的流程，以增加产量并使纯化过程简单。转化后的大肠杆菌株系的生长、诱导以及磷酸酶的纯化基本上都是按照Rina等人发表的流程(supra)进行，只是有以下几个改动。可溶性膜组分通过超高速离心被分离出来之后，蛋白在缓冲液A(20mM Tris pH 7.6，10mM MgCl₂，50mM NaCl，0.2％Triton X-100)中透析，然后再上样到事先已经用缓冲液A平衡过的DEAE柱子上。按照Rina等人的描述通过pNPP分析确定的具有磷酸水解酶活性的流出物(flow-through)被上样到Q-sepharose柱子上。从Q-sepharose柱子上得到的组分合在一起之后在缓冲液B(磷酸钾缓冲液，pH 6.6，25mM NaCl，10mM MgCl₂)中透析，然后上样到事先用缓冲液B平衡好的Hi-trap SP柱子上。具有磷酸水解酶活性的流出物在缓冲液C(磷酸钾缓冲液，pH 7.2，50mM NaCl，10mM MgCl₂)中透析，然后上样到事先用缓冲液C平衡过的羟磷灰石柱子上。磷酸酶活性组分流出被获得。从每一步得到的样品在10-20％的Tris Tricine PAG(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州)胶上分离，然后用考马斯亮蓝染色。从图1的结果来看，泳道1至6的磷酸水解酶产量令人失望。

由于采用上述流程而得到让人失望的结果，其它的方法被研究，其中包括克隆TAP基因，如图2所示。

具体地，TAP基因被直接克隆到一个强启动子(T7启动子)之后，并连接上His标记(亲和标记)以促进纯化。图13和14中展示的His标记序列有6个组氨酸融合到蛋白的N末端(基因的5’端)。然而，组氨酸的数目并不是关键的。标记中组氨酸的数目可能少到只有三个或者多到超过6个，只要可以达到这里描述的目的。几个不同的构建物被构建出来。在两个构建物中，通过去除蛋白N末端与甲硫氨酸起始密码子相邻的22个氨基酸组成的推定信号序列而使蛋白被截短。其中一个克隆中，C末端His标记被加到蛋白上形成带有截短的磷酸酶的融合蛋白，而另外一个克隆却没有这段标记。比如，pEGTAP1.4.1有His标记，而pEGTAP1.2.1没有这个标记。在另外两个表达盒中，这个基因保留了推定的信号肽序列，而且在它们的C末端或者有His标记(pEGTAP1.3.1)或者没有(pEGTAP1.1.1)。

图2中显示了5个不同的质粒，它们是通过将PCR产物***到pET21a得到的(实施例I，图2，11和12)。pEGTAP1.1.1编码完整的不带有His标记的TAP。pEGTAP1.2.1编码截短的不带有His标记的TAP。pEGTAP1.3.1编码完整的带有C末端His标记的TAP。pEGTAP1.4.1编码截短的带有C末端His标记的TAP。pEGTAP7.4.1编码截短的带有N末端His标记的TAP。

包含带有假定信号序列的完整TAP基因的质粒，无论带有或者不带有C末端His标记，在诱导之后都没有在SDS-PAGE上产生明显的可溶性磷酸酶(图3，泳道1，3和4)。然而，那些被构建为不带有假定信号序列的质粒，不论带有或者不带有His标记，都能够在SDS-PAGE上形成正确大小的信号非常强的条带(图3，泳道2，5和6)。但是，在纯化该蛋白的过程中出现一些问题。含有pEGTAP1.4.1(截短TAP和C末端His标记)的转化宿主细胞ER2566在非变性条件下产生的主要是不溶性TAP(图4)。试图在变性条件下纯化蛋白，接着使变性的磷酸酶再折叠。然而，这种方法产生的活性酶的量相对很少。含有pEGTAP1.2.1(截短的TAP，不含有His标记)的大肠杆菌ER2566产生可溶性的TAP，可是，这种蛋白与大多数柱子不能结合。

为了克服上述困难，第五个克隆被构建出来，其中编码His标记的序列安放在N末端而不是在TAP基因的C末端(pEGTAP7.4.1)(图2)。这个构建物产生产量相当高的可溶性TAP(图5)，而且可以非常方便地被纯化出来而不需要多次超高速离心步骤(实施例II)。特别地，磷酸酶N末端His标记的存在可以使得该酶通过仅仅2或3个柱子的纯化便接近同质，而不需要镍柱的参与。尽管不希望受到理论的限制，似乎该His标记的首要用途是促进可溶性磷酸酶的表达而不是作为一种亲和标记。

按照上述方法(实施例I和II)制备的TAP磷酸酶的活性与SAP和CIAP磷酸酶活性的比较是通过以DNA和蛋白作为底物的分析来测定的。(实施例VII)TAP被发现具有增强的活性。比如，TAP和SAP的线性DNA去磷酸化活性是利用在实施例VII中描述的磷酸基释放分析来测定的，包括对DNA的5’粘末端、3’粘末端和平末端的活性。当这些不同结构的去磷酸化作用用相同的pNPP单位量去比较时，TAP被证明比SAP更加有效(图10)。

TAP也能够像CIAP一样有效地去除磷酸化蛋白的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸残基上的磷酸基团(实施例VII，图13)。

与其他磷酸酶相比，TAP除了活性增加之外，还发现其热敏性也增加了(实施例IV，图8)。当比较CIAP、SAP和TAP之间的热稳定性时，TAP被发现在65摄氏度温浴5分钟之后就失去了98％的活性，相比之下，在这一温度SAP失去70％的活性，而CIAP只失去10％的活性。

在本发明的其他实施方案中，ZnCl₂和MgCl₂被发现可以增加这种磷酸酶的活性(实施例III)。TAP的活性在大约pH 5.5-7.0之间达到最佳化，例如采用Bis-Tris丙烷缓冲液(实施例III)。

本发明通过下面的实施例被进一步说明。这里提供的实施例是为了帮助理解本发明，但本发明并不因此限于这些实施例。

上文和下文引用的参考文献在此通过引用方式整入。

实施例

实施例I：TAP-His标记融合基因的构建和表达

来源于一种还没有被分类的南极株系TAB5的截短的磷酸酶基因被克隆，其带有N末端6-组氨酸残基标记。简单来说，一段1.1kb的片断通过PCR从重组质粒pN1(Rina，et al.，Eur.J.Biochem.267：1230-1238(2000))中扩增出来。正向引物(图2引物C)，除了含有一段与该基因不含假定的信号序列(63bp)的5’端同源的序列之外(图16和17)，还含有与ATG起始密码子部分重叠的NdeI限制性剪切位点，以及位于起始密码子与截短的磷酸酶基因的第一个密码子之间的编码6个组氨酸的6个密码子(图16和17)。反向引物(图2引物D)，除了含有含有一段与基因3’端反向互补的序列之外，还包含紧接着TAA终止密码子下游的XhoI限制性剪切位点(图16和17)。一旦扩增以后，这个1.1kb的片断用NdeI和XhoI剪切消化，并连接到T7表达载体pET21a(Novagen，麦迪逊，威斯康辛)，消化过程与文献提到的类似(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，Sections 1.53-1.72(1989))。得到的连接产物转化到大肠杆菌ER2688(New EnglandBiolabs，贝福利，麻萨诸塞州)。来自转化株系的质粒被分离，并通过限制性酶切作图和DNA测序表征，鉴定表明质粒含有正确大小和序列的***片断。该质粒构建物被转化到大肠杆菌ER2566(New England Biolabs，贝福利，麻萨诸塞州)，以便由T7启动子表达该磷酸酶基因。pEGTAP7.4.1被发现可以提供最好的产量和纯化特征(图3-5)。

实施例II：TAP-His标记融合蛋白的生产和纯化

(a)TAP的小规模纯化

来自分离的菌落的ER2566(pEGTAP7.4.1)在30摄氏度在5ml含有100mg/ml羧苄青霉素的Rich Broth培养液(每升培养液含有10克胰蛋白胨(Difcolaboratories，利佛立亚，威斯康辛)，5克酵母提取物(Difco laboratories，利佛立亚，威斯康辛)，5克NaCl，用NaOH调整pH到7.2)中生长过夜。3毫升的过夜培养物被接种到300毫升含有100mg/ml羧苄青霉素的Rich Broth培养基中。培养物在30摄氏度生长到对数期中期(Klett 70)，然后放置在冰上预冷，用0.4mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，然后在20摄氏度生长15小时。通过在4摄氏度8000rpm离心10分钟，收集到35毫升细胞。上清被去除，细胞沉淀被称重并于-20摄氏度放置2个小时。这些沉淀在冰上解冻，然后将这些细胞重新悬浮在1ml裂解缓冲液中(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)。加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，样品放置在冰上30分钟。温浴之后细胞在冰上被超声破碎6次，每次10秒，进行到一半的时候有一分钟的间隔。粗提物在4摄氏度以14000rpm离心20分钟，除去所有没有破碎的细胞和所有其它不溶性物质以得到澄清的粗提物。0.6ml的澄清粗提物被上样到已经用0.6ml裂解缓冲液平衡好的Ni-NTA高速离心柱上。样品在700g离心2分钟。流出物被去除，之后用0.6ml洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗柱，共两次。蛋白用0.2ml洗脱缓冲液(50mMNaH₂PO₄，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱，共两次。每步得到的样品的10微升被用于SDS-PAGE分析。关于pEGTAP7.4.1的结果在图5中表示。

(b)利用ER2566的pEGTAP7.4.1大规模纯化TAP

含有质粒pEGTAP7.4.1的大肠杆菌ER2566在25摄氏度在2000ml发酵RichBroth培养基(每100升培养液含有500克Amberex酵母提取物(ScientistTechnologies，米尔沃克，威斯康辛)，1千克CE90MS胰蛋白胨(Marcor DevelopmentCorp.，卡尔斯塔特，新泽西)，27克NaOH，10克氨苄青霉素，5.5克聚丙二醇去泡剂(Arco Chemical Co.，南查尔斯顿，西弗吉尼亚))中生长。该培养物被用于接种到100升的发酵Rich Broth培养基中。这些细胞在有氧条件下25摄氏度生长5小时直到Klett值为70。然后将发酵罐冷却到15摄氏度，当Klett值达到90时加入IPTG至终浓度为0.3mM。这些细胞在15摄氏度下继续有氧生长17个小时，达到最终Klett值为305的稳定期。100升的发酵液可以收获321克湿细胞沉淀。321克细胞沉淀被重新悬浮于963ml缓冲液A(20mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，50mM NaCl，5％甘油)中，并在大约12000psig的压力下通过Gaulin匀浆器。裂解液在大约13000g离心40分钟，收集上清(1150毫升)。

上清溶液被上样到500毫升的事先用缓冲液A平衡过的Heparin Hyper-D柱子(Ciphergen Biosystems，Inc.，佛利蒙，加州)上。1升缓冲液A被用来洗涤柱子，之后2升的NaCl浓度梯度从0.05M到1M的缓冲液A被施于柱子上，每50ml的组分被收集。各组分被检测其磷酸酶活性，这是通过将样品与0.1M的pNPP在1M的含有10mM MgCl₂的二乙醇胺/HCl缓冲液(pH8.5)中温浴来实现的。反应在37摄氏度进行1-5分钟，酶活性是通过分光光度计测量405nm处黄色的产生来测定。磷酸酶的活性是在NaCl为0.05-0.35M时被洗脱下来。

含有磷酸酶活性的Heparin Hyper D柱组分被合并到一起，然后在缓冲液A中透析过夜。该800ml合并组分中的100ml被上样到105毫升的Source Q柱子(Pfizer，Inc.，纽约，纽约州)上。210ml缓冲液A被用来清洗柱子，接着1升的NaCl浓度梯度从0.05M到1M的缓冲液A被施于柱子上，每15毫升的组分被收集。应用pNPP分析各组分，如前所述，磷酸酶活性集中在0.15-0.18M NaCl的洗脱组分中。剩下的700毫升Heparin Hyper D柱组分也如此类似地被上样并洗脱；之后含有磷酸酶活性的剃度组分被合并在一起。

合在一起的Source Q组分在含有50％甘油的缓冲液A中透析。该120ml合并组分中的40ml用缓冲液A稀释到500ml，然后上样到400毫升的事先用缓冲液A平衡过的PEI柱子(Whatman，肯特，英国)上。400ml缓冲液A被用来洗涤柱子，接着用含有0.05M到1M的NaCl线性浓度的缓冲液A洗脱，每15ml的组分被收集。按照上述方法应用pNPP分析来检测各组分。磷酸酶活性在NaCl浓度为0.14M至0.2M之间时被洗脱下来。剩下来的80毫升Source Q合并组分类似地被上样并洗脱，之后收集含有磷酸酶活性的梯度洗脱组分。合并在一起的组分在含有10mMTris(pH7.4)，1mM MgCl₂，1mM DTT，50％甘油的储存缓冲液中透析。

实施例III：确定用于TAP去除磷酸基团的最适pH和盐条件

采用按实施例II中所述而纯化的TAP，从DNA上去除磷酸基团的优化条件被确定。去磷酸化作用是通过如下的磷酸基释放分析来测量的：在50微升的反应体系中，两条互补的40mer的寡核苷酸

5’-ACGTATGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGTTAGGCTC-3’(SEQ IDNO：1)

3’-TGCATACAATCCAATCCAATCCAATCCAATCCAATCCGAG-5’(SEQ IDNO：2)被退火，并根据制造商的建议用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Inc.，贝福利，麻萨诸塞州)和γ³²P-ATP标记末端。这种放射性的二聚物被用来“穿刺(spike)”1毫克的Lamda HindIII片断混合物，用作磷酸酶底物(终浓度为20μg/ml)。TAP活性是通过将磷酸酶与底物混合物(在含有1mM MgCl₂和0.1mMZnCl₂的缓冲液中每个反应0.01个pNPP单位)在37摄氏度温浴5分钟之后的放射活性的释放来测定的。释放的量是通过用TCA沉淀DNA底物之后闪烁计数没有被沉淀的放射活性来测定的。TCA沉淀包括向每个反应体系中加入100微升鲱鱼精DNA(2mg/ml)作为载体。之后加入150微升20％的冷TCA。样品被涡漩混匀之后放置在冰上冷却5分钟。每个反应体系在微量管中于14000g离心5分钟。150微升的上清(50％)被加入到2毫升闪烁体中，计数0.5分钟。通过pNPP比色法分析的测量，发现TAP活性在0.001至0.01个单位的范围内是线性的。

测试了pH范围为5.5到9.5的反应缓冲液，其中采用了三种不同的缓冲液体系：Tris-HCl pH范围6到9.5，Bis-Tris丙烷缓冲液pH范围6到7，和Bis-Tris丙烷缓冲液pH范围5.5到7。在Bis-Tris丙烷缓冲液中，对于DNA底物能够给出最优活性的pH范围为5.5到6.0(图6)。

对于阳离子的要求也被测试。已确定的是，如上所述的分析表明ZnCl₂的存在使磷酸基的释放增加了10倍，这与Rina等人(supra(2000))的报道相反，其报道锌离子在对pNPP的试验中具有抑制效果。1mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂相继被纳入TAP活性分析中。其它的盐类包括KCl、NaCl、醋酸钾和醋酸钠以100mM的浓度加入对TAP的活性并没有可观察到的影响(图7)。

实施例IV：测定TAP的热敏性

一个单位的pNPP活性是对应于在1毫升反应体系中1分钟内在室温下水解1μmol pNPP成为对硝基酚所需要的酶的数量。10个pNPP单位的TAP、CIAP和SAP磷酸酶分别与1微克的lamda HindIII片断在针对每种酶推荐的反应缓冲液中混合。混合物在37摄氏度温浴10分钟之后放置在冰上。然后将反应体系置于65摄氏度的水浴中，5、10、20和30分钟之后取出样品并放在冰上。热处理之后，分析样品的pNPP活性。剩余的活性按照相对于0时刻的活性比例来计算。5分钟之后TAP丢失了超过98％的活性。在同样的时间范围内，SAP还保留有30％的活性，而CIAP几乎保留了90％的活性。30分钟之后SAP仍然具有20％的活性，而CIAP保留有40％的活性，这些表明TAP要比SAP或者CIAP都热敏感得多(图8)。

实施例V：TAP在37摄氏度和25摄氏度的稳定性

TAP活性在37摄氏度和25摄氏度的稳定性是通过在比色法分析中pNPP上自由磷酸基的释放来测定的。该分析中的酶活性是通过当pNPP转化为对硝基酚(pNP)时生成的颜色来测定的。磷酸酶反应混合物被制备出来，其中每毫升含有1M二乙醇胺，(pH 8.5)，10mM MgCl₂，10mM pNPP，10个单位的TAP。这些混合物以每管0.1毫升被分装到3毫升的反应管中，反应通过将所述反应管放置于25摄氏度或者37摄氏度而起始。反应在0-30分钟时间内以每5分钟的时间间隔通过加入0.1ml的10N NaOH终止。每个反应体系用1毫升反应混合物(不含有pNPP或者TAP)稀释至适合于用分光光度计在405nm处进行测量的体积。释放出来的磷酸基是通过测量积累的pNP并与已知的pNP标准品相比较来确定的。结果用30分钟之内在25摄氏度或者37摄氏度释放的磷酸基的nmol数来表示(图9)。这些结果证明，TAP活性在37摄氏度时大约是在25摄氏度时候的两倍，而且TAP在其中任一温度下的稳定性均可保持至少30分钟。

实施例VI：用于储存TAP的优化条件

TAP在75摄氏度温浴5分钟以确定储存的优化条件。三种不同的缓冲液被测试，pH为6.0的Bis-Tris丙烷缓冲液、pH为7.0的磷酸缓冲液和pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，后者被证明可以最好地稳定TAP。不同浓度的NaCl被测试，没有NaCl的情况被证明比50mM、100mM或者200mM能够更好地维持酶活性。EDTA对于TAP酶活性具有抑制效果，而1mM的DTT和200μg/ml的BSA都可以稳定TAP活性。在一种含有Tris-HCl(pH 7.4)、1mM MgCl₂、1mM DTT、200μg/ml BSA和50％甘油的缓冲液中TAP被发现在超过12个月之后仍是稳定的，活性并没有下降。

实施例VII：磷酸酶活性

(a)在已经就pNPP活性进行归一化的DNA连接分析中比较TAP和SAP的活性：5’粘末端、3’粘末端和平末端的去磷酸化。

效率(efficiency)被定义为可以被1个pNPP单位的酶去磷酸化的DNA的数量，这是基于多少稀释能够去磷酸化1微克DNA计算的。

SAP和TAP都通过pNPP分析调整到每微升1个单位。Litmus 28DNA(NewEnglandBiolabs，Inc.，贝福利，麻萨诸塞州)用HindIII(5’粘末端)、EcoRV(平末端)或者PstI(3’粘末端)消化。等分体积的各种剪切过的载体DNA(1mg/50μl)在37摄氏度在针对各种磷酸酶而推荐的缓冲液中用各种磷酸酶的数个不同稀释倍数的稀释液处理30分钟。TAP在65摄氏度处理5分钟被热失活。SAP在65摄氏度处理15分钟被热失活。按照说明书利用快速连接酶试剂盒(Quick Ligase Kit)(New England Biolabs，Inc.，贝福利，麻萨诸塞州)使被剪切和去磷酸化的DNA重新环化。连接好的载体然后转化到大肠杆菌中，然后涂在含氨苄青霉素的培养基上过夜生长。如果克隆数少于对照(已被剪切但没有去磷酸化的载体)的5％，就认为磷酸酶活性就被认为是完全起作用的。这样，1个pNPP单位的SAP可以去磷酸化5微克的5’粘末端DNA，而同样pNPP单位数的TAP可以去磷酸化50微克同样的DNA(图10)。因此，相比而言，TAP在去除DNA 5’粘末端的磷酸基方面要更加有效10倍。对于平末端，TAP要比SAP更有效50倍，对于3’粘末端，DNA要更有效8倍。

(b)TAP可以去除脱氧核苷酸上的磷酸基团

TAP作为脱氧核苷酸酶的活性是利用基本上按照Heinonen和Lahti描述(supra)的比色法分析测量自由磷酸根的释放来测定的。这种分析中得到的活性是通过与已知的磷酸基标准相比较来确定的。0.1ml的四种不同的脱氧核苷酸反应混合物，包括50mM Bis Tris丙烷(pH6.0)、1mM MgCl₂、0.1mM ZnCl₂和1mM的dATP、dCTP、dGTP或TTP的钠盐，分别置于四个不同1.5ml管中。每个管中加入2.5个单位的TAP。反应通过将管放置在37摄氏度而起始，15分钟之后通过放置在65摄氏度处理5分钟终止。每个反应混合物管中的所有成分(0.1ml)被加入到含有2.4ml的包括1.25N H₂SO₄、4mM钼酸铵和50％丙酮的测量溶液的玻璃试管中。试管被短时涡漩，然后在室温温浴15分钟。测量反应通过加入柠檬酸至终浓度为0.33M来终止，每一管的OD₃₉₀值被记录。标准曲线是通过分别加入10μl的0-30mM的磷酸基标准溶液到对照反应试管中来产生的，所述对照反应试管的处理和测量都和TAP反应试管一样。测定结果是dATP、dCTP、dGTP和TTP是TAP的几乎等价的底物；在这些条件下每个单位每分钟生成1-2nmol的磷酸基。

SAP和TAP的脱氧核苷酸酶活性被比较。DATP被用作测试的底物，但是已经有结论表明采用dCTP、dGTP或者TTP可以获得类似的结果。脱氧核苷酸酶反应混合物被制备出来，其含有50mM BisTris丙烷(pH6.0)、1mM MgCl₂、0.1mMZnCl₂和0.8mM的dATP。该反应混合物的0.1ml被等份地分配到7个1.5ml反应管中。5个单位的TAP或者SAP被加入每个反应管。反应通过放置反应管在37摄氏度而起始，在0-30分钟内于每5分钟的间隔通过放置反应管在65摄氏度5分钟而终止。对反应产物进行毛细管高效液相色谱(Cap-HPLC)分析，与含有dATP、dADP、dAMP和脱氧腺苷的标准品的图谱比较。配有自动样品注射器、柱加热器和二极管阵列检测器的安捷伦1100系列Cap-HPLC被用来实施所有的分析。DATP、dADP、dAMP和dA标准品从Sigma Chemicals购买。3微米、150×1mm的C18反相Cap-HPLC

柱(Nomura Chemicals Co.Ltd.，Aichi，日本)被用于分离这四种物质。采用95％的0.1M K₂HPO4，pH 6.0，KOH和5％乙腈、30摄氏度时流速为20μl/min、采用100μl的流量感受器的等度分离(isocraticseparation)被发现对于所有四种物质都产生很好的分辨率。dATP、dADP、dAMP和dA的典型驻留时间分别是4.7、5.2、7.0和21.6分钟。TAP和SAP处理的样品在上述缓冲液中被稀释到0.2ml，每次分析上样4μl。254nm和280nm处吸光度数据通过Agilent ChemStation Software(Agilent Technologies，帕洛阿图，加州)收集，峰大小也通过该软件来定量。结果表示为每种反应组分占存在的总核苷酸的百分比(图11)。这些结果表明，TAP可以作为一种脱氧核苷酸酶，从dNTP、dNDP或者dNMP上去除磷酸基团(其中N代表腺苷、胞苷、鸟苷或者胸苷)，而且TAP作为脱氧核苷酸酶比SAP具有更高的比活性(Heinonen和Lahti(supra))。

(c)TAP可以从焦磷酸上释放无机磷酸基团

TAP作为焦磷酸酶的活性是通过采用基本上按照Heinonen和Lahti描述(supra)的比色法分析测量自由磷酸基的释放来测定的。这种分析得到的活性是通过与已知的磷酸基标准相比较并以已知的焦磷酸酶作为对照来确定的。焦磷酸酶反应混合物被制备，其含有50mM Bis Tris丙烷(pH6.0)、1mM MgCl₂、0.1mMZnCl₂和0.32mM的焦磷酸钠。该混合物被分装到1.5ml的反应管中，每管0.5ml，并进行TAP的两倍梯度的系列稀释，以第一个管中10个单位作为起始。反应通过将反应管放置在37摄氏度而起始，10分钟之后通过将管放置在65摄氏度5分钟而终止。磷酸基测量溶液被制备，其包含1.25N H₂SO、4mM钼酸铵和50％丙酮。每个反应混合物管中的所有成分(0.5ml)被加入到含有2ml测量溶液的玻璃管中，轻轻涡漩并在室温温浴15分钟。测量反应通过加入柠檬酸至终浓度为0.33M来终止，每一管的OD₃₉₀值被记录。标准曲线是通过加入0-30mM的磷酸基标准各10微升到对照反应试管中来获得的，所述对照反应管的处理和测量都和TAP反应试管条件一样。同时平行地进行含有TIPP的反应。TIPP反应混合物含有两个单位的TIPP、50mM曲辛(Tricine)(pH 8.0)、1mM MgCl₂和0.32mM焦磷酸钠；在75摄氏度温浴。10分钟之后将反应管放置在室温，这样TIPP会失活，从而终止反应。释放的磷酸基的测量按照和TAP同样的方法进行。这个实验表明10个单位的TAP与2个单位的TIPP释放出近似相同量的无机磷酸基(图12)。这些结果表明，TAP可以用作焦磷酸酶，剪切焦磷酸(PPi)成无机磷酸(Pi)。

(d)TAP去除磷酸化肽上的磷酸基团

制备³³P标记的髓磷脂碱性蛋白(MyBP)底物。

丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化的MyBP底物是利用来自New EnglandBiolabs，Inc.，贝福利，麻萨诸塞州的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PSP)分析***试剂盒(产品目录号#P0780S)制备的。Ser/Thr标记的MyBP底物被稀释到50μM(5×浓缩)的浓度，这是对于被整合的³³P而言。

酪氨酸(Tyr)磷酸化的MyBP底物是通过利用New England Biolabs，Inc.，贝福利，麻萨诸塞州的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)分析***试剂盒(产品目录号#P0785S)制备的。Tyr标记的MyBP底物被稀释到就被整合的³³P而言为25μM(5×浓缩)的浓度。

10微升的Ser/Thr(50μM)或Tyr(25μM)被标记的MyBP底物与一系列梯度稀释的TAP磷酸酶、10个pNPP单位的CIAP磷酸酶或者在没有酶的情况下在各种酶所推荐使用的缓冲液中37摄氏度温浴1个小时。反应通过加入200微升冷20％TCA并放置在冰上5-10分钟而终止。样品然后在12000g高速离心5分钟。150微升的上清被小心地移取，加入到2毫升闪烁体溶液，用闪烁计数器计数。结果如图13所示。

TAP对于磷酸化Ser/Thr残基的比活性为1910nmol/min/mg，这比CIAP对于同样的底物的比活性要稍高。TAP对于磷酸化Tyr残基的比活性也比CIAP的比活性高(图13)。

上述实验中TAP活性的结果用三个各自含有单个磷酸化氨基酸残基的肽验证。这些肽按照标准的FMOC化学方法制备。肽1含有一个磷酸化丝氨酸残基，肽2含有磷酸化苏氨酸残基，肽3含有磷酸化酪氨酸残基，分别用pSer、pThr和pTyr表示。下面列出每个肽的序列。

1.H-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-pSer-Val-Ala-Ala-Glu-NH₂(SEQ ID NO：3)

2.H-Thr-Ala-Asp-Ser-Gln-His-Ser-pThr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Glu-OH(SEQ DNO：4)

3.H-Glu-Trp-Met-Arg-Glu-Asn-Ala-Glu-pTyr-Leu-Arg-Val-Ala-OH(SEQ ID NO：5)

对照肽也被合成，它们具有相同的序列，只是每个肽段中缺少磷酸基团。

50微升的反应体系含有在1×TAP缓冲液(参见实施例VIII)中的5微克磷酸化肽，它们与一系列梯度稀释的TAP在37摄氏度温浴10分钟。温浴之后Cap-HPLC被用于分析样品。所有三种肽的去磷酸化反应都用Vydac 5um，C181×250mm柱分析，流速为25μl/min。然而，对于每组肽都需要优化的梯度来分离磷酸化和去磷酸化的肽。Cap-HPLC梯度程序的时间表如下所示，其中乙腈的百分比(％B)相对于含有0.1％TFA的水(v/v)在增加：

肽1

时间(分钟)	％B
时间(分钟)	％B	0-10	梯度从20％到35％
10-30	剃度从35％到95％	0-10	梯度从20％到35％

肽2

时间(分钟)	％B
时间(分钟)	％B	0-10	梯度从8.5％到35％
10-30	剃度从35％到95％	0-10	梯度从8.5％到35％

肽3

时间(分钟)	％B
时间(分钟)	％B	0-10	梯度从5％到25％
10-30	剃度从25％到55％	0-10	梯度从5％到25％
10-30	剃度从25％到55％	30-60	剃度从55％到95％

比例为80％A和20％B、91.5％A和8.5％以及95％A和5％B的溶液分别被用来平衡检测肽1、2和3的柱子。214nm、254nm和280nm处吸光度值的数据采用Agilent ChemStation Software(Agilent Technologies，帕洛阿图，加州)收集，峰大小通过该软件计算。为了验证反应体系中存在的物质的身份，反应也用基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)来检测。ABI VoyagerDE质谱仪被使用，α-氰基4-羟基肉桂酸作为基质，加速电压为20kV，正离子模式下延迟时间大约是150η秒。图14包括三个图表，其中所汇编的数据表明，随着TAP数量的增加，磷酸化肽的数量降低，去磷酸化肽的数量增加。这些数据表明，TAP对于磷酸化酪氨酸肽具有最高活性，只需要0.02个单位的酶就可以在10分钟内去除5微克肽上的所有磷酸基。对于磷酸化丝氨酸肽和磷酸化苏氨酸肽，分别需要2.5个单位和10个单位的TAP以完全去除磷酸基。这些数据表明TAP可以用于去除肽上的磷酸基团。

实施例VIII：TAP可以对磷酸化糖分子进行去磷酸化而不依赖于磷酸基团在该糖上的位置

为了测试TAP是否可以从磷酸化糖上剪切掉磷酸基残基而不论该磷酸基在什么位置，它对三种磷酸化糖，葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸的活性被测量。为每一种磷酸化糖制备一系列梯度稀释的反应混合物，其中起初每个反应混合物含有100微升5mg/ml的一种磷酸化糖的溶液、30微升10×TAP缓冲液(500mM Bis Tris丙烷、10mM MgCl₂、1mM ZnCl₂、pH6.0)和210微升水。将所述反应混合物的50微升加入到第一个管子，将反应混合物的25微升加入到5个后续的管子中。这个操作对于将要测试的三种磷酸化糖的每一种均被重复。这些管子被放置在冰上使之变冷。将冷的5微升TAP(5U/μl)加入到含有50微升反应混合物的第一个管子中。混合之后从该管子中取出25微升加入到下一个含有25微升反应混合液的管子中。混合之后从这个第二管子中取出25微升加入到下一个管子中。这种1∶1的稀释一直继续到所有的六个管子。在针对每种磷酸化糖进行TAP梯度稀释之后，这些管子从冰上移去，放置在37摄氏度温浴15分钟。温浴之后每个样品的3微升以紧密的条带形式被点样在由硅胶玻璃支持的薄层色谱(TLC)板上。只含有混合物而没有酶的阴性对照和含有1mg/ml的葡萄糖或者甘露糖的阳性对照也被点样在TLC板上。这些点用热空***(不超过70摄氏度)吹干。直到溶剂的前端在异丙醇、乙醇和水(2.5∶1∶0.5，v∶v∶v)中移动了9厘米才开始对板进行显影。层析之后，该板被干燥并用10％的高氯酸喷雾。这些糖通过用热枪将之烤焦来显色。在366nm的UV下对产物进行观察，可获得增加的灵敏度。应用6个单位的TAP在37摄氏度15分钟内实现了42微克的葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸的完全消化(图15)。

磷酸基在糖分子上的键接(即，1位或者6位)对于该酶的活性并没有明显影响。另外，TAP对磷酸化甘露糖的活性与对磷酸化葡萄糖的活性一样。

序列表

<110>新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)

E·格思里(Guthrie，Ellen)

J·本纳二世(Benner II，Jack)

T·戴维斯(Davis，Therdore)

<120>一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征

<130>NEB-224-PCN

<150>60/449，711

<151>2003-02-24

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>在分析中使用的随机底物

<400>1

acgtatgtta ggttaggtta ggttaggtta ggttaggctc 40

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>在分析中使用的随机底物

<400>2

tgcatacaat ccaatccaat ccaatccaat ccaatccgag 40

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>II型牛腺病毒

<220>

<221>MOD_RES

<222>(12)..(12)

<223>在位置12处，丝氨酸被修饰为单磷酸-氨基酸

<400>3

Val Pro Ile Pro Gly Arg Phe Asp Arg Arg Val Ser Val Ala Ala Glu

1 5 10 15

<210>4

<211>17

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>多瘤病毒BK

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)..(8)

<223>在位置8处，苏氨酸破修饰为单磷酸-氨基酸

<400>4

Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5 10 15

Glu

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>人类TFIIIB

<220>

<221>MOD RES

<222>(9)..(9)

<223>在位置9处，酪氨酸破修饰为单磷酸-氨基酸

<400>5

Glu Trp Met Arg Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala

1 5 10

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>未被鉴定的南极生物

<400>6

cccccccata tgcatcatca tcatcatcat gtaaaaaatg agcctcaatt aaaaacaccc 60

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>未被鉴定的南极生物

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(58)

<223>N末端氨基酸序列

<400>7

Met His His His His His His Val Lys Asn Glu Pro Gln Leu Lys Thr

1 5 10 15

Pro

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>未被鉴定的南极生物

<400>8

gtcaggtctt agctcgagtt attgattcca c 31

<210>9

<211>1140

<212>DNA

<213>未知

<223>热敏南极磷酸酶

<400>9

atgaagctta aaaaaattgt ttttacccta atcgcattag gtctattttc ttgcaaaaca 60

acaagtgttt tagtaaaaaa tgagcctcaa ttaaaaacac ccaaaaatgt tattctgtta 120

attagtgatg gcgcaggatt atcacaaatt tcatctacct tttattttaa agagggtact 180

ccaaactaca cacagtttaa aaatattggc ttgataaaaa catcctcttc cagagaagat 240

gtaactgatt cagcctctgg cgctactgct ttttcctgtg gtattaaaac atataatgcg 300

gcaattggtg ttgctgatga ttcaactgct gtaaaaagca ttgtggaaat tgcagcatta 360

aacaacatta aaacaggagt tgttgcaacg tcctccatta cacatgctac gcctgcaagt 420

ttttatgccc atgctttaaa cagaggccta gaagaagaaa ttgcgatgga tatgacggaa 480

tctgatctag acttttttgc tggaggcggt ttaaactact ttaccaagcg taaagacaaa 540

aaagatgttt tagctatttt aaaaggaaat caatttacca taaatactac tggattaaca 600

gatttttcaa gcattgcatc aaatagaaaa atgggttttt tattagcgga tgaagccatg 660

cctactatgg aaaaaggaag aggtaatttt ctatccgcag caacagattt agccattcag 720

tttttaagta aagacaattc agcgttcttt attatgagcg aaggttctca aatagattgg 780

ggtggccatg caaataatgc atcctattta atttctgaaa ttaatgattt tgacgatgcc 840

attggcactg ctttggcttt cgctaaaaaa gatggtaata cattggttat tgtaacttct 900

gaccatgaaa ctggaggttt tacattggct gccaaaaaaa ataaaagaga agatggtagt 960

gagtatagtg attatacaga gatcggacct actttttcta ctggagggca ttctgcaacc 1020

ttaattcctg tttttgctta cggccctgga tcagaagaat ttattggaat ctatgaaaac 1080

aatgaaattt ttcataaaat attaaaagtg acaaagtgga atcaataaac ataactaaga 1140

<210>10

<211>375

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>热敏南极磷酸酶

<400>10

Met Lys Leu Lys Lys Ile Val Phe Thr Leu Ile Ala Leu Gly Leu Phe

1 5 10 15

Ser Cys Lys Thr Thr Ser Val Leu Val Lys Asn Glu Pro Gln Leu Lys

20 25 30

Thr Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu Ile Ser Asp Gly Ala Gly Leu Ser

35 40 45

Gln Ile Ser Ser Thr Phe Tyr Phe Lys Glu Gly Thr Pro Asn Tyr Thr

50 55 60

Gln Phe Lys Asn Ile Gly Leu Ile Lys Thr Ser Ser Ser Arg Glu Asp

65 70 75 80

Val Thr Asp Ser Ala Ser Gly Ala Thr Ala Phe Ser Cys Gly Ile Lys

85 90 95

Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Gly Val Ala Asp Asp Ser Thr Ala Val Lys

100 105 110

Ser Ile Val Glu Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ile Lys Thr Gly Val Val

115 120 125

Ala Thr Ser Ser Ile Thr His Ala Thr Pro Ala Ser Phe Tyr Ala His

130 135 140

Ala Leu Asn Arg Gly Leu Glu Glu Glu Ile Ala Met Asp Met Thr Glu

145 150 155 160

Ser Asp Leu Asp Phe Phe Ala Gly Gly Gly Leu Asn Tyr Phe Thr Lys

165 170 175

Arg Lys Asp Lys Lys Asp Val Leu Ala Ile Leu Lys Gly Asn Gln Phe

180 185 190

Thr Ile Asn Thr Thr Gly Leu Thr Asp Phe Ser Ser Ile Ala Ser Asn

195 200 205

Arg Lys Met Gly Phe Leu Leu Ala Asp Glu Ala Met Pro Thr Met Glu

210 215 220

Lys Gly Arg Gly Asn Phe Leu Ser Ala Ala Thr Asp Leu Ala Ile Gln

225 230 235 240

Phe Leu Ser Lys Asp Asn Ser Ala Phe Phe Ile Met Ser Glu Gly Ser

245 250 255

Gln Ile Asp Trp Gly Gly His Ala Asn Asn Ala Ser Tyr Leu Ile Ser

260 265 270

Glu Ile Asn Asp Phe Asp Asp Ala Ile Gly Thr Ala Leu Ala Phe Ala

275 280 285

Lys Lys Asp Gly Asn Thr Leu Val Ile Val Thr Ser Asp His Glu Thr

290 295 300

Gly Gly Phe Thr Leu Ala Ala Lys Lys Asn Lys Arg Glu Asp Gly Ser

305 310 315 320

Glu Tyr Ser Asp Tyr Thr Glu Ile Gly Pro Thr Phe Ser Thr Gly Gly

325 330 335

His Ser Ala Thr Leu Ile Pro Val Phe Ala Tyr Gly Pro Gly Ser Glu

340 345 350

Glu Phe Ile Gly Ile Tyr Glu Asn Asn Glu Ile Phe His Lys Ile Leu

355 360 365

Lys Val Thr Lys Trp Asn Gln

370 375

Claims

1.对磷酸化底物进行去磷酸化的方法，包括：

(a)向含有所述底物的、pH为5.5-7.0的缓冲液中加入SEQ ID NO：10的热敏性南极磷酸酶(TAP)；和

(b)在使得磷酸基从所述底物上去除的条件下，温育含有所述底物和TAP的混合物。