CN100425243C - 车叶草苷在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可以从杜仲中分离的物质——车叶草苷的新用途,特别是在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明以大鼠为人类RA动物模型,采用滑膜细胞原代培养的方法,观察了车叶草苷对滑膜细胞分泌TNF-α,PGE2和IL-1β的影响,结果表明,大剂量组、小剂量组均能显著下调TNF-α,PGE2和IL-1β的含量,与空白组存在显著性差异,不能恢复至空白组水平,且三组间无显著性差异,这表明车叶草苷能抑制TNF-α的产生,减少IL-1β的产生,从而减少PGE2等炎症介质产生,达到减轻致骨和软骨的破坏恢复关节活动功能,发挥治疗RA效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种可以从杜仲中分离的物质-车叶草苷的新用途,特别是在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
背景技术
车叶草苷(asperuloside)其化学结构式如下。
车叶草苷可以从杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)、猪殃殃(Tender Bedstraw)等植物中分离,车叶草苷也可以从其他植物中分离。车叶草苷作为一种已经有的物质,尽管有确切的分子式和结构式,但其研究的活跃性不高,作为单体在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用还没有见报道。
RA是Rheumatoid arthritis的简称。
RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病,目前仍无治疗良策。RA的早期病变主要在滑膜,由于感染或创伤等因素的刺激,滑膜细胞迅速增殖,合成多种细胞因子,如白细胞介素1β(IL-1β),肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等。各种细胞因子联合介导R A炎症和组织损伤,其中以TNF-α的作用较为突出,TNF-α是能够引起肿瘤组织出血坏死、并具有多方面的细胞因子。在活动性RA中,TNF-α参与三种主要病理过程:(1)激活血管内皮细胞,增强内皮细胞黏附分子的表达,在关节炎时,血液中的白细胞正是通过与黏附分子互相作用被汇集到关节腔的。(2)刺激***细胞和多形核细胞产生***素等小分子炎症介质。(3)通过刺激滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞,减少糖蛋白合成,增加蛋白降解,并产生胶原酶和其他中性蛋白酶,释放骨钙等,从而导致骨和软骨的破坏及骨关节运动障碍。因此通过抑制TNF-α的产生,从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
另外IL-1β的作用也较为突出,几乎各种有核细胞都能产生IL-1β,但大多数细胞在正常时并不合成IL-1β,只在激活后才被诱导合成IL-1β和IL-1β前体蛋白。脂多糖(LPS)是最有效的IL-1β诱导剂,能快速诱导多种细胞表达IL-1β。IL-1β能刺激滑膜成纤维细胞和毛细血管内皮细胞高度增殖,构成R A特征性血管翳;刺激软骨细胞和破骨细胞产生***素(PGE2)以及胶原酶等多种蛋白水解酶;激活中性粒细胞,释放溶酶体酶、自由基等炎性递质,引起关节软骨、骨质等组织破坏,导致关节炎粘连以及后期关节畸形。因此通过抑制IL-1β的产生;从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供车叶草苷的新用途,车叶草苷在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
车叶草苷的获得:
首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次,每次1小时;然后将提取液离心或过滤,滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml,过滤,取上清液;将上清液拌入硅胶,进行硅胶柱层析,用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱,收集丙酮洗脱液,减压浓缩至干;取丙酮提取物用乙醇溶解,拌入3倍量的硅胶,干燥后用硅胶柱色谱分离,硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液,洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查,合并相同部分,再重结晶得到车叶草苷,车叶草苷的得率是0.86%。
或者,首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次,每次1小时;然后将提取液离心或过滤,滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml,过滤,取上清液;将上清液进行大孔树脂柱层析,用含乙醇重量百分比60%的乙醇、水***洗脱,收集60%乙醇洗脱液,减压浓缩至干;取乙醇提取物用甲醇溶解,拌入3倍量的硅胶,干燥后用硅胶柱色谱分离,硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇混合液,洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查,合并相同部分,再进行一次凝胶柱色谱纯化,等比例重量的甲醇、水混合液洗脱,得到车叶草苷,车叶草苷的得率是0.29%。
车叶草苷还可以采用其他方法获得。
在类风湿性关节炎药物领域,有很多文献报道药物成分对对滑膜细胞分泌TNF-α,PGE2和IL-1β的影响,用动物实验的数据来考察药物治疗RA的效果。这些文献有:[1]鞠大宏,贾红伟,吴皓,等,鹿瓜多肽注射液对C II诱导的免疫性关节炎大鼠血清TNF-α、IL6以及C II抗体活性的影响,中国中医基础医学杂志,2003,9(11):17。[2]何金华,梁清华,张花先,等,痹肿消汤对实验性关节炎大鼠血浆TNF-α的影响,湖南医科大学学报,2002,27(5):524。[3]黄清春,张声鹏,徐秋英,复方丹参对II型胶原蛋白诱导大鼠模型滑膜细胞分泌及肿瘤坏死因子的影响,现代康复,2001,5(10):54-55。[4]郑治钢,细胞因子及其检测方法和临床意义,陕西医学检验,2001,16(2):59。[5]周军,方素萍,齐云,等,葛根汤对佐剂性关节炎大鼠关节液炎症介质的影响,中国实验方剂学杂志,2001,7(3):29。[6]马骥,卢秉久,朱晓明,等,通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的药效学研究,中医药学刊,2001,19(6):734。[7]朱江,谢文利,晋玉章,等,栀子对类风湿性关节炎大鼠血清IL-1β和TNFα的影响,中成药,2005,27(7):801。[8]黄清春,张声鹏,黄伟毅,等,复方丹参注射液对CIA大鼠滑膜细胞IL-1βmRNA表达的影响,安徽中医学院学报,2002,21(5).-39-41。
取本发明方法获得的车叶草苷,按文献[3]提供的方法进行模型制备、药物分组、大鼠滑膜细胞培养及上清液的制备。
按文献[3]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌TNF α,PGE2的影响。按文献[8]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌IL-1β的影响。
车叶草苷大剂量组(20mg/kg.d);车叶草苷小剂量组(10mg/kg.d)与正常对照、氯化钠组的实验数据如下:
表1滑膜细胞培养上清液中TNF-α的含量(x±s,ng/ml)
与正常对照组比较,P<0.05;与氯化钠组比较,△P<0.05
表2滑膜细胞培养上清液中IL-1β含量(x±s,ng/ml)
与正常对照组比较,P<0.05;与氯化钠组比较,△P<0.05
表3滑膜细胞培养上清液中PGE2的含量(x±s,ng/ml)
与正常对照组比较,P<0.05;与氯化钠组比较,△P<0.05
本发明采用文献1、2、3、4、5、6、7、8提供的方法考察车叶草苷成分对对滑膜细胞分泌TNF α,PGE2、IL-1β的影响。也有类似趋势。
本发明以大鼠为人类RA动物模型,采用滑膜细胞原代培养的方法,观察了车叶草苷对滑膜细胞分泌TNF-α,PGE2和IL-1β的影响,结果表明,大剂量组、小剂量组均能显著下调TNF-α,PGE2和IL-1β的含量,与空白组存在显著性差异,不能恢复至空白组水平,且三组间无显著性差异,这表明车叶草苷能抑制TNF-α的产生,减少IL-1β的产生,从而减少PGE2等炎症介质产生,达到减轻致骨和软骨的破坏恢复关节活动功能,发挥治疗RA效果。
具体实施方式
实施例1、首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次,每次1小时;然后将提取液离心或过滤,滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml,过滤,取上清液;将上清液拌入硅胶,进行硅胶柱层析,用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱,收集丙酮洗脱液,减压浓缩至干;取丙酮提取物用乙醇溶解,拌入3倍量的硅胶,干燥后用硅胶柱色谱分离,硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液,洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查,合并相同部分,再重结晶得到车叶草苷,车叶草苷的得率是0.86%。
实施例2、首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次,每次1小时;然后将提取液离心或过滤,滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml,过滤,取上清液;将上清液进行大孔树脂柱层析,用含乙醇重量百分比60%的乙醇、水***洗脱,收集60%乙醇洗脱液,减压浓缩至干;取乙醇提取物用甲醇溶解,拌入3倍量的硅胶,干燥后用硅胶柱色谱分离,硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇混合液,洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查,合并相同部分,再进行一次凝胶柱色谱纯化,等比例重量的甲醇、水混合液洗脱,得到车叶草苷,车叶草苷的得率是0.29%。
实施例3、取按实施例1的方法获得的车叶草苷200克,低取代羟丙纤维素20克,PEG6000 20克,微晶纤维素210克,PVP 50克,乳糖440克,硬脂酸镁60克分别粉碎均匀后,混合压制成1000片。
治疗方法:类风湿病人每天服用两次,每次1-2片。疗程7-21天。
实施例4、取按实施例2的方法获得的车叶草苷100克,低取代羟丙纤维素20克,交联聚乙烯吡咯烷酮30克,微晶纤维素100克,蔗糖650克,硬脂酸镁50克分别粉碎均匀后,混合压制成1000片。
治疗方法:类风湿病人每天服用两次,每次2-4片。疗程7-21天。
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杜仲叶化学成分和药理作用研究概括. 赖娟华,徐丽瑛等 |
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