CN100423781C - Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用 - Google Patents

Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用。本发明针对Resistin结合多肽功能不明的技术问题，提出了Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用的技术方案。根据本发明的技术方案可利用Resistin结合多肽制备促胰岛素分泌药物。

Description

Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及Resistin结合多肽在制备促进胰岛细胞分泌药物中的应用。
背景技术
2型糖尿病是一种严重影响人体健康和生活质量的疾病，目前不但累及西方国家6％的成人，而且其发病趋于年轻化，并正以6％的年增长率高速增长。其危害性及在儿童群体中不断上升的发病率已引起了各国学者的广泛关注，并成为医学研究领域中的一个重要研究方向。
现已知，在2型糖尿病中主要有两个基本变化：1，胰岛素抵抗。2，胰岛B细胞功能受损。而肥胖则是2型糖尿病的一个重要危险因素。长期以来人们一直认为肥胖患者脂肪细胞功能异常与胰岛素抵抗的形成密切相关，并试图从脂肪组织中筛选胰岛素抵抗候选基因作为2型糖尿病防治的靶标。Resistin，正是2001年Steppan等人通过小鼠脂肪组织差减杂交实验发现的一种胰岛素抵抗候选基因。我们应用噬菌体表面展示(Phagedisplay)技术，筛选出三条Resistin结合多肽的cDNA片段，根据翻译密码翻译为以下氨基酸序列：
1.AWILLQGYPGSSS；(SEQ ID No.1)
2.AWILFRAASDIAIPS；(SEQ ID No.2)
3.AWILYLSFAFCIYSLITCLGVICQAWTLMHLHKFYHCSELKATE；(SEQ IDNo.3)
它们均含有共有序列(AWIL)。
但现有技术中对这些Resistin结合多肽的功能没有报导。
发明内容
本发明的目的是针对Resistin结合多肽功能不明的技术问题，提供了Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用。
所述的Resistin结合多肽是SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明通过对筛选出的Resistin结合多肽的功能研究，发现Resistin结合多肽不影响胰岛细胞株RINm5F的细胞活力，表示多肽对细胞没有毒性作用。Resistin结合多肽在10-10，10-11，10-12M范围内对胰岛细胞株的胰岛素分泌能力有促进作用，并且此作用有浓度和时间依赖趋势。同时细胞内钙(胰岛素分泌的始发因素)也有明显增高。因此，Resistin结合多肽可在细胞水平能促进胰岛细胞的胰岛素分泌，这些Resistin结合多肽可用于制备促胰岛素分泌的药物。
附图说明
图1是Resistin结合多肽促进胰岛素分泌的时间趋势图。
图2是Resistin结合多肽促进胰岛素分泌的浓度趋势图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
实施例1
一、多肽序列的获得
通过噬菌体表面杂交技术筛选出三条Resistin结合多肽的cDNA序列，根据翻译密码翻译为以下氨基酸序列：
1.AWILLQGYPGSSS(SEQ ID No.1)；
2.AWILFRAASDIAIPS(SEQ ID No.2)；
3.AWILYLSFAFCIYSLITCLGVICQAWTLMHLHKFYHCSELKATE(SEQ IDNo.3)；
它们均含有共有序列(AWIL)。
二、多肽的合成：
实验中采用的Resistin结合多肽(N-AWILFRAASDIAIPS-C)(SEQ ID No.2)由上海生工生物公司合成，纯度＞95％。
三、多肽对胰岛细胞株RINm5F的安全范围的确定：
将RINm5F细胞按每孔2×104个细胞的浓度接种于96孔板中，于37度5％CO2培养箱中培养当细胞达到80％的密度时，使用Resistin结合多肽(终浓度0，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12M)(1M＝1mol/L，下同)对细胞刺激3小时后采用MTT法检测细胞活力。首先在每孔中加入MTT液，使MTT终浓度达到0.5mg/ml，并在37℃C孵育2小时。吸去上清，加入DMSO溶解晶体，在570nm处测吸光度值。结果为：未用resistin结合多肽MTT值＝0.2467±0.01317；resistin结合多肽10-8mol/L MTT值＝0.2487±0.0814；resistin结合多肽10-9mol/L MTT值＝0.2492±0.01061；resistin结合多肽10-10mol/L MTT值＝0.2420±0.06；resistin结合多肽10-11mol/L MTT值＝0.2428±0.07414；resistin结合多肽10-12mol/L MTT值＝0.2435±0.07423。各组间没有显著性差异，P＞0.05说明resistin结合多肽不影响细胞活力。结果显示Resistin结合多肽在各个浓度不影响细胞的活力。
四、多肽的胰岛细胞分泌功能的影响
RINm5F细胞接种到6孔板中，在细胞达到3×105个/孔时，吸去上清并用PBS洗三遍，使用KRB缓冲液(128.8mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，1.0mM CaCl2，5.0mM NaHCO3，10mM HEPES，0.1％胎牛血清，2.8mM葡萄糖)，在缓冲液中加入Resistin结合多肽10-12M刺激，0、30分钟、1小时、2小时；以及加入Resistin结合多肽0，10-10，10-11，10-12M刺激2小时。实验结束后取上清，离心去除上清中细胞后使用胰岛素ELISA检测试剂盒(Mercodia AB Sweden)检测上清中的胰岛素。结果显示Resistin结合多肽刺激胰岛素的分泌有时间和浓度依赖趋势，分别见图1，2。其中：
图1：未用Resistin结合多肽刺激，胰岛素19.54±1.51；10-12M Resistin结合多肽刺激30分钟，胰岛素28.34±1.80；10-12M Resistin结合多肽刺激1小时，胰岛素32.61±2.01；10-12M Resistin结合多肽刺激2小时，胰岛素36.31±2.21这四组之间都有显著性差异，P＜0.05。
图2：未用Resistin结合多肽刺激，胰岛素19.54±1.51；10-12M Resistin结合多肽刺激2小时，胰岛素3631±2.21；10-11M Resistin结合多肽刺激2小时，胰岛素40.72±2.77；10-10M Resistin结合多肽刺激2小时，胰岛素52.55±3.82这四组之间都有显著性差异，P＜0.05。
五、胞内钙的测定
胞内钙是刺激胰岛素分泌的始发因素，胞内钙增加能代表胰岛素分泌增加。RINm5F细胞接种到6孔板中，在细胞达到3×105个/孔时，吸去上清并用PBS洗三遍，使用KRB缓冲液(128.8mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，1.0mM CaCl2，5.0mM NaHCO3，10mM HEPES，0.1％胎牛血清，2.8mM葡萄糖)，在缓冲液中加入Resistin结合多肽0M，10-12M(mol/L)刺激2小时，移去上清并PBS洗三次。FURA-3/AM(Sigma)钙探针4μM加入板中37℃孵育半小时后用PBS洗去钙探针，在激光共聚焦显微镜下测定荧光强度。结果显示使用Resistin结合多肽刺激能显著提高细胞胞内钙的水平。对照组(0M)荧光强度：35.2±2.8，n＝6；Resisitin结合多肽刺激组(10-12M)荧光强度，48.7±3.5n＝6。
<110>郭锡熔 刘峰 倪毓辉 龚海霞 辜楠 范红旗 陈荣华 彭宇竹 邱洁
<120>Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用
<160>3
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>采用噬菌体表面杂交技术筛选出的Resistin结合多肽
<400>1
Ala Trp Ile Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Gly Ser Ser Ser
1                5                   10
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>采用噬菌体表面杂交技术筛选出的Resistin结合多肽
<400>2
Ala Trp Ile Leu Phe Arg Ala Ala Ser Asp Ile Ala Ile Pro Ser
1                5                   10                 15
<210>3
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>采用噬菌体表面杂交技术筛选出的Resistin结合多肽
<400>3
Ala Trp Ile Leu Tyr Leu Ser Phe Ala Phe Cys Ile Tyr Ser Leu
1                5                  10                  15
Ile Thr Cys Leu Gly Val Ile Cys Gln Ala Trp Thr Leu Met His
                20                  25                  30
Leu His Lys Phe Tyr His Cys Ser Glu Leu Lys Ala Thr Glu
                35                  40

Claims (1)

1. Resistin结合多肽在制备促胰岛素分泌药物中的应用；
其中：Resistin结合多肽是SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3。
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A resistin binding peptide selected by phage display inhibits3T3-L1 preadipocyte differentiation. LIU Feng et al.Chin. Med. J.,Vol.119 No.6. 2006
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