CN103476791A - 新型wnt组合物和该组合物的治疗用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有提高溶解性和改善类生物药物性能的新型Wnt多肽，以及编码本发明的Wnt多肽的多聚核苷酸。本发明的Wnt多肽在治疗方面可用在如例如预防或治疗肌肉损失和/或促进肌肉肥大和生长的方法中。

Description

新型WNT组合物和该组合物的治疗用途

关于序列表的声明

提供以文本格式替代纸质副本的本申请的序列表，据此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称为FATE_095_00WO_ST25.txt。文本文件的大小为124KB，创建于2011年1月11日并通过EFS-Web***电子提交。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)的规定，要求2012年1月11日提交的美国临时专利申请第61/431,701号的权益，通过引用将其整体并入本文。

背景

技术领域

本发明大体涉及新型Wnt组合物及利用所述新型Wnt组合物的治疗方法。本发明的Wnt多肽及其组合物在治疗方面可用于，例如通过促进干细胞扩增和肌肉肥大促进肌肉再生。

相关领域的描述

Wnt基因家族编码二十多种富含半胱氨酸的分泌型Wnt信号糖蛋白，这些蛋白通过结合靶细胞上的佛力子（Fzd）受体而起作用。佛力子受体是G-蛋白偶联受体蛋白家族。Wnt家族的不同成员与Fzd家族某些成员的结合可通过数条不同通路之一启动信号转导。在“经典通路”中，信号分子散乱蛋白（Disheveled）的激活导致糖原合成酶激酶-3（GSK-3β）的失活，所述糖原合成酶激酶-3是一种胞质丝氨酸-苏氨酸激酶。GSK-3β的靶标β-连环蛋白进而被稳定并易位至细胞核，在细胞核中，β-连环蛋白激活特定启动子的TCF（T-细胞因子）依赖型转录(Wodarz,1998,Dierick,1999)。“非经典”Wnt通路激活包括Wnt和Fzd间的一组相互作用，其可激活Ca²⁺通路信号转导和可能的PI3K信号转导、Rho通路信号转导以及平面细胞极性（PCP）通路信号转导。

Wnt是分泌型糖蛋白，其作为在多种原始细胞类型中有活性的旁分泌或自分泌信号而起作用。虽然Wnt蛋白从细胞中分泌，但是发现它们是疏水的，并且通过在保守的半胱氨酸残基和保守的丝氨酸残基处添加脂质部分进行翻译后修饰。这些脂质修饰对Wnt蛋白的生物活性和分泌的重要性被广泛接受。然而，去垢剂脂化和脂化Wnt的低溶解性与配制过程中没有使用去垢剂时的低产率有关，从而出现了Wnt临床规模生产的独特挑战。因此，尽管Wnt在多种临床环境的治疗应用中具有巨大潜力，但Wnt的治疗潜力由于Wnt的不溶性以及相应的不足以作为纯化的、生物活性制剂生产而未被充分了解。

因此，该领域需要保留Wnt生物活性的可溶的、新型Wnt多肽，产生临床规模的新型Wnt的方法以及使用新型Wnt促进组织形成、再生、维持和修复的方法。

发明概述

本发明提供修饰的Wnt多肽，其包含降低Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸。在具体实施方式中，所述Wnt多肽包含降低Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸的缺失、***或取代。

在一个实施方式中，多肽为激活非经典Wnt信号转导通路的Wnt多肽。

在具体实施方式中，激活非经典Wnt信号转导通路的Wnt多肽选自：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、和Wnt11。

在本发明的一些实施方式中，多肽是Wnt7a或Wnt5a多肽。

在具体实施方式中，本发明提供了修饰的Wnt7a多肽，其相对于对应SEQID NO：2和6-11中任一个的Wnt7a多肽的脂化具有降低的脂化。在其他实施方式中，本发明提供的修饰的Wnt7a多肽在相应于SEQ ID NO：2和6-11中任一个的第73位的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。在一些实施方式中，本发明提供的Wnt7a多肽在相应于SEQ ID NO：2和6-11中任一个的第206位的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。在具体实施方式中，本发明提供的Wnt7a多肽在相应于SEQ IDNO：2和6-11中任一个的第73位和第206位的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。

在一些实施方式中，本发明提供的Wnt7a多肽在相应于SEQ ID NO：2和6-11中任一个的第73位或第206位的氨基酸位置处包含丙氨酸。在其他实施方式中，本发明提供的Wnt7a多肽在相应于SEQ ID NO：2和6-11中任一个的第73位和第206位的氨基酸位置处包含丙氨酸。本发明还提供了包含本文中任一实施方式的组合物，其中所述Wnt7a多肽是人或小鼠Wnt7a多肽。

在具体实施方式中，本发明提供了修饰的Wnt5a多肽，其相对于对应SEQ ID NO：15和19-23中任一个的Wnt5a多肽的脂化具有降低的脂化。在其他实施方式中，本发明提供的修饰的Wnt5a多肽在相应于SEQ IDNO：15和19-23中任一个的第104位的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。在一些实施方式中，本发明提供的Wnt5a多肽在相应于SEQ ID NO：15和19-23中任一个的第244位的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。在具体实施方式中，本发明提供的Wnt5a多肽在相应于SEQ ID NO：15和19-23中任一个的位置104和244的氨基酸位置处包含氨基酸缺失、***、或取代。

在一些实施方式中，本发明提供的Wnt5a多肽在相应于SEQ ID NO：15和19-23中任一个的第104位或第244位的氨基酸位置处包含丙氨酸。在其他实施方式中，本发明提供的Wnt5a多肽在相应于SEQ ID NO：15和19-23中任一个的第104位和第244位的氨基酸位置处包含丙氨酸。本发明还提供了包含本文中任一实施方式的组合物，其中所述Wnt5a多肽是人或小鼠Wnt5a多肽。

在一些实施方式中，本发明提供的Wnt多肽包含SEQ ID NO：3-5、12-13和16-18中任一个所示的氨基酸序列。

在多个实施方式中，本发明部分地关注包含Wnt多肽的融合多肽，所述Wnt多肽包含SEQ ID NO：3-5、12-13和16-18中任一个所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，融合多肽包含天然信号肽、异源信号肽、或天然和异源信号肽的杂交体。

在具体实施方式中，异源信号肽选自：CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽、和病毒性信号肽。

在某些实施方式中，异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽、或IgGμ信号肽。

在其他实施方式中，融合多肽包含异源蛋白酶切割位点。

在一个实施方式中，异源蛋白酶切割位点选自：烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和因子Xa切割位点。

在进一步的实施方式中，融合多肽包含选自以下的表位标签：HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位、和HA表位。

在具体实施方式中，融合多肽包含SEQ ID NO:3-5和12-13中任一个所示的氨基酸序列，相较于SEQ ID NO:2和6-11所示的相应的天然Wnt多肽，其具有增加的产量、分泌、或溶解性。

在某些实施方式中，融合多肽包含SEQ ID NO:16-18中任一个所示的氨基酸序列，相较于SEQ ID NO:15和19-23所示的相应的天然Wnt多肽，其具有增加的产量、分泌、或溶解性。

本发明还提供编码Wnt多肽的多聚核苷酸，所述Wnt多肽具有降低Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸。本发明的一些实施方式提供了包含编码Wnt多肽的多聚核苷酸的载体，所述Wnt多肽具有降低Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸。本发明还提供了包括此类载体的宿主细胞，和所述宿主细胞产生的Wnt多肽。

本发明还提供了包含本发明的Wnt多肽、多聚核苷酸和载体的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含药学可接受的盐、载体、或赋形剂，并且在一些实施方式中，所述组合物在水溶液中可溶。在本发明的具体实施方式中，所述组合物配制为用于注射。在某些实施方式中，配制所述组合物无需去垢剂。在相关实施方式中，所述组合物的配制基本上不存在去垢剂。在另一个相关实施方式中，配制的组合物基本上不含去垢剂。在更具体的实施方式中，所述组合物配制为用于静脉注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射、或肌肉内直接注射中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述组合物促进组织形成、再生、维持或修复。在具体实施方式中，所述组织为肌肉，并且在更具体的实施方式中，所述肌肉为骨骼肌、心肌、或平滑肌。

在其他实施方式中，本发明的组合物促进干细胞扩增。在一些实施方式中，干细胞是成体干细胞，并且在具体实施方式中，成体干细胞是卫星干细胞。

在一些实施方式中，本发明的组合物促进肌肉肥大或防止萎缩。

本发明还提供了治疗或预防肌肉损失的方法，其包括给予个体具有Wnt多肽的组合物，所述Wnt多肽包含降低Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸。在一些实施方式中，所述组合物包含药学可接受的盐、载体、或赋形剂，并且在具体实施方式中，所述组合物在水溶液中可溶。在其他具体实施方式中，所述组合物配制为用于注射，并且在更具体的实施方式中，所述组合物配制为用于静脉注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射、或肌肉内直接注射中的一种或多种。

在某些实施方式中，配制所述组合物无需去垢剂。在相关实施方式中，所述组合物的配制基本上不存在去垢剂。在另一个相关实施方式中，配制的组合物基本上不含去垢剂。

在本发明方法的一些实施方式中，所述个体患有影响肌肉的疾病或病症或有患影响肌肉的疾病或病症的风险。在具体实施方式中，所述疾病是退行性疾病，并且在更具体的实施方式中，退行性疾病是肌营养不良。在更加具体的实施方式中，所述肌营养不良选自：杜兴氏肌营养不良（DMD）、贝克肌营养不良（BMD）、埃默里—德赖富斯肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良、von Graefe-Fuchs型肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、肌强直性营养不良（斯太纳特病）和先天性肌营养不良。

在所述方法的其他实施方式中，所述影响肌肉的疾病或病症是消耗病、肌肉衰减、肌肉萎缩、ICU诱发性虚弱、持续废用、手术诱发性虚弱、或肌肉退行性疾病。在更具体的实施方式中，所述病症为便随肌肉废用、固定、手术诱发性虚弱、或损伤的肌肉萎缩。

在一些实施方式中，给予所述组合物促进肌肉萎缩。在具体实施方式中，所述肌肉是骨骼肌或心肌。

在本发明方法的其他实施方式中，给予所述组合物促进卫星细胞扩增。

附图说明

图1显示的是全部19种人Wnt多肽序列的ClustalW比对。保守的可能的翻译后脂化位点用灰色阴影标出并与人Wnt7a的半胱氨酸73和丝氨酸206比对。被认为是糖基化位点的天冬酰胺残基用下划线示出。

图2显示的是来自多种物种的保守Wnt7a多肽序列的ClustalW比对。

图3显示的是用非经典Wnt刺激下的成肌细胞肥大。图3a显示的是非经典Wnt处理（Wnt7a）刺激的体外成肌细胞肥大的代表图。图3b显示的是某些Wnt处理诱发的体外成肌细胞纤维肥大的数据。每个处理组的3个生物重复中的每个当中计数100条纤维并显示微米下的个体计数和重复的中位数。

图4显示的是多种构建Wnt7a变体的示意图。白色显示的是野生型人Wnt7a序列，如图所示，导致氨基酸变化的特定点突变的变体用带有氨基酸变化的白色显示。灰色阴影指示的是天然存在Wnt7a的分泌信号肽用人IgGκ链信号肽替换。如图所示，免疫球蛋白Fc区的氨基或羧基端融合体用接头区构建成。

图5显示的是哺乳动物组织培养的HEK293细胞表达和分泌的Wnt7a的SDS-PAGE、Western印迹。具有CD33或IgGκ链的外源分泌信号肽的Wnt多肽增加的表达和随后的分泌可清楚地从具有天然信号肽的Wnt多肽上看出。

图6显示的是高效液相色谱法（HPLC）追踪检测溶液中的去垢剂CHAPS。图6a显示的是在磷酸盐缓冲液中校正***的CHAPS标准曲线。图6b显示的是与来自R&D***的商购蛋白（商业蛋白包含引起第二大峰的载体蛋白）相比，在1%CHAPS中配制的修饰的Wnt多肽制品。图6c显示的是，如图所示，透析4和20小时从Wnt多肽制剂中有效去除CHAPS。

图7显示的是成肌细胞肥大测定，其展示了在存在或不存在去垢剂的情况下配制的Wnt7a变体的活性。Wnt蛋白由IgGκ分泌信号肽构建而成。蛋白在HEK293哺乳动物培养***中产生并亲和纯化。蛋白在具有1%CHAPS去垢剂的PBS中配制而成。每种蛋白变体的等分试样通过透析去除去垢剂来重新配制。蛋白具有等摩尔浓度并应用于C2C12肥大测定。

图8显示的是测定用编码本文其他地方所述的修饰的人Wnt7a多肽、野生型人Wnt7a或LacZ对照的表达质粒电穿孔的小鼠胫骨前肌（TA）肌肉平均纤维直径的实验结果。

图9显示的是测定用编码本文其他地方所述的修饰的人Wnt7a多肽的表达质粒或盐水对照电穿孔小鼠胫骨前肌（TA）肌肉重量的实验结果。

图10显示的是测定用编码本文其他地方所述的修饰的人Wnt7a多肽、野生型人Wnt7a或LacZ对照的表达质粒电穿孔小鼠胫骨前肌（TA）肌肉中Pax7+卫星干细胞数量的实验结果。

图11是免疫球蛋白Fc融合蛋白。图11a显示用免疫球蛋白κ中的信号肽取代其天然分泌信号肽并构建为免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白的Wnt7a蛋白的Western印迹。图11a中显示与单独的Fc结构域对照相比的哺乳动物培养***的分泌。图11b显示利用抗-Wnt7a检测抗体通过SDS-PAGEWestern印迹得到的Wnt7a和Wnt7a-Fc融合蛋白间的相对分子量差异。

序列表简要说明

SEQ ID NO:1示出了人Wnt7a的cDNA序列。

SEQ ID NO:2示出了由SEQ ID NO:1编码的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3示出了SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第73位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:4示出了SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第206位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:5示出了SEQ ID NO:2的人Wnt7a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第73位和第206位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:6示出了小鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7示出了大鼠Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8示出了鸡Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9示出了斑马鱼Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10示出了猪Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11示出了牛Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12示出了人免疫球蛋白κ链的信号肽取代天然分泌信号肽的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13示出了在氨基酸第73位和第206位处具有丙氨酸突变的、并用人免疫球蛋白κ链的信号肽取代天然分泌信号肽的人Wnt7a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14示出了人Wnt5a的cDNA序列。

SEQ ID NO:15示出了由SEQ ID NO:14编码的人Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16示出了SEQ ID NO:15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第104位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:17示出了SEQ ID NO:15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第244位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:18示出了SEQ ID NO:15的人Wnt5a多肽的氨基酸序列，其在氨基酸第104位和第244位具有丙氨酸突变。

SEQ ID NO:19示出了小鼠Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20示出了大鼠Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21示出了鸡Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22示出了斑马鱼Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23示出了牛Wnt5a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24示出了人Wnt1多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25示出了人Wnt2多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:26示出了人Wnt2b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27示出了人Wnt3多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28示出了人Wnt3a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:29示出了人Wnt4多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30示出了人Wnt5b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:31示出了人Wnt6多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:32示出了人Wnt7b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:33示出了人Wnt8a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:34示出了人Wnt8b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:35示出了人Wnt9a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:36示出了人Wnt9b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:37示出了人Wnt10a多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:38示出了人Wnt10b多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39示出了人Wnt11多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:40示出了人Wnt16多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41-46示出了寡聚核苷酸序列。

详细描述

A.概述

虽然Wnt的翻译后脂化被认为是生物活性和蛋白分泌的需要，本发明提供新型Wnt多肽，其脂化氨基酸位点被改变使得不发生翻译后脂化。本发明的蛋白保留Wnt生物活性，并且本发明因此提供了具有改善的类生物药物性能，如增大的溶解性、产量和配方的修饰的Wnt组合物，以及该Wnt组合物的治疗用途。本发明提供了对由Wnt多肽的不溶性引起的问题的新的解决方案，并进一步地提供了适用于临床规模生产和治疗应用的包括融合多肽在内的创新的Wnt多肽。本发明的Wnt组合物的治疗用途包括，例如，促进组织形成、再生、修复和维持。

除非有明确的相反指示，在本发明的实施采用化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、DNA重组技术、遗传学、免疫学、细胞学的领域内常规方法，为了说明的目的，其中有许多在下面描述。这些技术在文献中有全面的解释。参见，例如，Sambrook,et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月修正);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of ComplexGenomes,(Academic Press,New York,1992);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning(1984);和Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998).

在此引用的所有的出版物、专利和专利申请据此通过引用将其整体并入本文。

B.定义

除另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域内普通技术人员所公知的相同含义。

虽然本发明的实施和测试中可使用任何与本文中所描述的相似或等同的方法和材料，但方法和材料的优选实施方式在本文中描述。为了本发明的目的，下述术语做出如下定义。

本文使用的冠词“一(a)”和“一个(an)”和“所述(the)”指该冠词的语法对象为一个或多于一个(即至少一个)。例如，“一元件(an element)”指一个元件或多个元件。

如本文所用，术语“约”或“大约”指与参考的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度相差多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度。在具体实施方案中，术语“约”或“大约”在数值前时是指该数值加或减15%、10%、5%或1%的范围。

如本文所用，术语“基本上”是指是参考值95%、96%、97%、98%、99%或100%的量、水平、浓度、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度。例如，基本上不含一种物质（如去垢剂）的组合物是95%、96%、97%、98%、99%或100%不含该指定物质，或用常规方法无法测出该物质。类似的含义可应用于术语“不存在”，其指不存在特定物质或组合物的组分。

如本文所用，术语“干细胞”是指这样的细胞：该细胞是未分化的细胞，其能够(1)长期自我更新，或能够产生原始细胞的至少一个相同的拷贝，(2)在单细胞水平上分化成多种，并在某些情况下，仅分化成一种特化的细胞类型，以及(3)在体内功能性再生组织。干细胞根据其发育潜能被细分为全能性(totipotent)、多潜能性(pluripotent)、多能性(multipotent)和寡能性/单能性(oligo/unipotent)。

如本文所用，术语“成体干细胞”是指在成熟有机体内发现的干细胞。成体干细胞包括，但不限于，外胚层干细胞、内胚层干细胞、中胚层干细胞、神经干细胞、造血干细胞、肌肉干细胞等。肌肉干细胞是传统上被认为时单能性的干细胞的例子，仅产生肌肉细胞。

如本文所用，术语“卫星干细胞”是指一种产生如成肌细胞和肌细胞的肌原性谱系细胞的成体干细胞类型。

如本文所用，术语“祖细胞”是指具有自我更新和分化成更多成熟细胞的能力、但定向于某个谱系的细胞(例如，造血祖细胞定向于血液谱系)，而干细胞不必有这样的限制。成肌细胞是祖细胞的一个实例，其可仅分化为一种类型的细胞，但其本身不是完全成熟或完全分化的。成肌细胞可分化为肌细胞。

如本文所用，术语“肌细胞”或“肌纤维”是指肌肉中发现的一种分化的细胞类型。每个肌细胞包含肌原纤维，所述肌原纤维是长链的肌小节，而肌小节是肌肉细胞收缩单位。多种特化型肌细胞：心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞，具有本领域中已知的多种特性。

如本文所用，术语“自我更新”是指细胞具有产生没有改变的子细胞并产生特化的细胞类型的独特能力(潜能)。自我更新可以通过两种方式实现。非对称细胞***产生一个与亲本细胞相同的子细胞和一个不同于亲本细胞并且是祖细胞或分化的细胞的子细胞。因此非对称细胞***并不增加与亲本细胞相同的子细胞的数量，而是维持亲本细胞类型的细胞数量。相比之下，对称细胞***产生两个均与亲本细胞相同的子细胞。因此对称细胞***增加与亲本细胞相同的细胞的数量，扩增亲本细胞群。在具体实施方式中，对称细胞***与“细胞扩增”互换使用。

如本文所用，术语“分化”是指细胞由此特化为一种特定功能的发育过程，例如，细胞获得不同于原始细胞类型的一种或多种形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定向和终末分化过程。例如，通过用免疫组织化学或本领域技术人员所知的其他方法评估或监测生物标记物的存在与否可评估未分化或分化状态。

如本文所用，术语“谱系定向”是指干细胞定向形成特定受限范围的分化细胞类型的过程。谱系定向发生在，例如，干细胞在非对称细胞***过程中产生祖细胞时。定向祖细胞通常可自我更新或细胞***。

如本文所用，术语“终末分化”是指细胞最终分化成为成熟、完全分化的细胞。通常地，终末分化伴随细胞周期的取消和增值停止。

如本文所用，术语“肌肉肥大”是指肌肉尺寸的增加，以及可包括个体纤维体积的增加和/或肌纤维的横截面积的增加，而且还可包括每根肌纤维细胞核数量的增加。肌肉肥大还可包括整个肌肉体积和量的增加；然而，肌肉肥大可以与肌肉增生(其是肌纤维数量的增加)区别开。在一个实施方式中，肌肉肥大是指肌动蛋白和肌球蛋白收缩蛋白数量的增加。

如本文所用，术语“促进”、“增强”、“刺激”或“增加”一般是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的反应相比，本发明的Wnt组合物产生或引起更强生理反应（即，可测量的下游效应）的能力。一种此类可测量的生理反应包括，但不限于，与非对称细胞***相比对称干细胞***的增加，例如，与正常、未处理的、或对照处理的肌肉细胞相比卫星干细胞的增加、和/或增加的肌肉肥大。例如，生理反应可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更高。在另一个非限制性的例子中，与正常、未处理的、或对照处理的肌肉相比，响应给予本发明的Wnt组合物的肌肉肥大可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%或更高。“增加的”或“增强的”反应通常是“统计学上显著的”反应，并可以包括为由媒介物(不存在试剂)或对照组合物所产生反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(如，500倍、1000倍)(包括两者之间和大于1的所有整数和小数、例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

如本文所用，术语“保留（retaining）”或“维持（maintaining）”，或“保留（retain）”或“维持（maintain）”一般是指本发明的Wnt组合物（即，修饰的Wnt组合物）产生或引起与天然存在Wnt氨基酸或核酸序列的Wnt组合物引起的反应性质相似的生理反应（即，可测量的下游效应）的能力。例如，本发明的Wnt组合物表现出Wnt生物活性，并因此保留Wnt活性。本发明的组合物还产生与天然存在Wnt多肽引起的反应性质相似的生理反应如肌肉肥大。引发相似生理反应的本发明的Wnt组合物可以引发这样的生理反应，该生理反应是包含天然存在Wnt氨基酸和核酸序列的组合物引发的生理反应水平的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或约100%。

保留“天然存在Wnt7a活性”的修饰或改造的本发明的Wnt7a多肽是指具有降低蛋白脂化的一个或多个氨基酸突变、添加、缺失和/或取代的修饰的Wnt7a多肽，其中该多肽产生的生理反应是对应的天然存在Wnt7a多肽产生的生理反应的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%生理反应。

保留“天然存在Wnt5a活性”的修饰或改造的本发明的Wnt5a多肽是指具有降低蛋白脂化的一个或多个氨基酸突变、添加、缺失、和/或取代的修饰的Wnt5a多肽，其中该多肽产生的生理反应是对应的天然存在Wnt5a多肽产生的生理反应的至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%生理反应。

如本文所用，术语“减少”或“减低”，或“减轻”或“降低”或“减弱”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的反应相比，本发明的Wnt组合物产生或引起更小的生理反应(即下游的效应)的能力，例如减少细胞凋亡。在一实施方式中，减少可以是通常与细胞活力降低相关的基因表达的降低或细胞信号转导的减少。“减少的”或“降低的”反应通常是“统计学上显著的”反应，并可以包括为由媒介物(不存在试剂)或对照组合物产生的反应的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500倍，1000倍)(包括两者之间和大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的降低。

C.Wnt信号转导通路

Wnt信号转导通路是古老的、进化的保守通路，其在发育和整个成年时期中调节细胞命运决定、细胞迁移、细胞极性、神经模式和器官形成的重要方面。已鉴定的Fz受体下游的Wnt信号转导通路包括经典通路或Wnt/β-连环蛋白依赖型通路以及非经典通路或β-连环蛋白非依赖型通路，并可进一步划分为平面细胞极性、Wnt/Ca²⁺通路和其他通路。

Wnt蛋白结合佛力子（Fz）受体家族的细胞外半胱氨酸富集区N端，在人类当中有十种Fz。Fz蛋白是与G-蛋白偶联受体具有拓扑同源性的七次跨膜蛋白。此外，对于Wnt和Fz间的相互作用，还需要辅助受体来介导Wnt信号转导。例如，需要低密度脂蛋白相关蛋白5/6（LRP5/6）介导经典Wnt信号，而可以需要受体酪氨酸激酶RYK介导非经典功能。Wnt信号转导的另一调节水平出现在存在不同数量的分泌型Wnt拮抗剂的细胞外环境内。Wnt结合受体复合物之后，信号转导至细胞质磷蛋白散乱蛋白（Dsh/Dvl）。Dsh可直接与Fz相互作用。在Dsh水平上，Wnt信号分为至少三个主要级联，经典（β-连环蛋白），平面细胞极性和Wnt/Ca²⁺。进一步地，G-蛋白偶联受体信号转导还可刺激生长和存活通路，如PI3K。

1.经典Wnt信号转导通路

经典Wnt信号转导通路最初在果蝇的遗传筛选中鉴定并描绘出，并且在苍蝇、蠕虫、青蛙、鱼和小鼠中的深入研究已引起基本分子信号转导框架的鉴定。经典Wnt通路的特点是黏合连接相关蛋白β-连环蛋白累积并易位至细胞核。缺乏Wnt信号转导时，细胞质β-连环蛋白被β-连环蛋白降解复合物降解，所述复合物包括Axin、腺瘤性结肠息肉（APC）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和酪蛋白激酶1α(CK1α)。β-连环蛋白被该复合物内的CK1α和GSK3β磷酸化，导致其被泛素化以及随后由蛋白酶体机制蛋白水解破坏。Wnt与其由Fz和LRP5/6组成的受体复合物的结合诱导CK1和GSK3-β对LRP6的双重磷酸化，并且这容许包含Axin的蛋白复合物从细胞溶质易位至质膜。Dsh也补充至质膜并结合Fz，并且Axin结合磷酸化的LPR5/6。在Fz/LRP5/6的质膜处形成的该复合物通过Axin的隔离和/或降解诱导β-连环蛋白的稳定化。β-连环蛋白易位至细胞核，在这里其与Lef/Tcf家族成员复合以介导靶基因的转录诱导。

经典Wnt信号转导影响前头结构和神经外胚层模式的形成、尾部模式和尾巴形成，还影响多种器官***包括心脏、肺、肾脏、皮肤以及骨骼的形成。

可通过经典Wnt信号转导通路信号转导的Wnt包括但不仅限于：Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b、和Wnt16。

2.非经典Wnt信号转导通路

非经典通路通常被称为β-连环蛋白非依赖型通路。该通路可进一步划分为至少两个不同分支，平面细胞极性通路（或PCP通路）和Wnt/Ca2+通路，其中本文仅进一步详细通论PCP。PCP通路出自果蝇的遗传研究，其中包括佛力子和散乱蛋白的Wnt信号转导组分中的突变被发现使包括角质毛发(cuticle hair)和感觉鬃的上皮结构的定位随机化。已知上皮中的细胞拥有确定的顶端-基底外侧极性，但是，另外，其还沿着上皮层表面极化。这种严格的组织性支配包括毛囊、感觉鬃和眼睛内小眼的六角形排列在内的结构的定向。在脊椎动物里，这种组织性已被证明引起肌肉细胞、内耳感觉上皮内的立体纤毛的组建和定向、毛囊的组建、和经历原肠胚形成的背部中胚层细胞的形态和迁移行为。

Wnt信号转导通过不依赖于Fz的LRP5/6转导，导致Dsh激活。Dsh通过Daam1介导Rho的激活，Rho依次激活Rho激酶（ROCK）。Daam1还通过肌动蛋白结合蛋白抑制蛋白（Profilin）介导肌动蛋白聚合。Dsh还介导Rac激活，Rac依次激活JNK。来自Rock、JNK和抑制蛋白中的信号转导整合在一起，用于原肠胚形成过程中细胞极性和运动的细胞骨架变动。

可通过非经典Wnt信号转导通路信号转导的Wnt包括但不仅限于：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。

3.肌肉细胞发育中的Wnt信号转导

卫星干细胞是产生肌肉细胞的成体干细胞。成体骨骼肌内的卫星细胞位于其宿主肌细胞的肌纤维膜和基膜间的小凹陷中。损伤，如，物理创伤、重复锻炼、或患病时，卫星细胞变为激活的、增殖的并产生表达成肌调节因子（MRF）MyoD和Myf5的成肌前体细胞（成肌细胞）群。在再生过程期间，成肌细胞在定向至终末分化、融合宿主纤维或产生新肌纤维以重建损伤组织前经历多轮***(Charge and Rudnicki,2004)。骨骼肌再生期间，卫星细胞群由干细胞亚群体维持，由此允许个体寿命期间的组织平衡和多轮再生(Kuang et al.,2008)。卫星干细胞(Pax7+/Myf5-)占成体卫星细胞库的约10%，并通过不对称的顶-底细胞***产生子卫星成肌细胞(Pax7+/Myf5+)。

Wnt信号转导在调节胚胎发育期间的发育程序、以及调节成体组织的干细胞功能中扮演重要角色(Clevers,2006)。Wnt在轴旁中胚层的胚胎成肌诱导中是必需的(Borello et al.,2006;Chen et al.,2005;Tajbakhsh et al.,1998)，在肌纤维发育过程的分化控制中也是必需的(Anakwe et al.,2003)。近年来，Wnt平面细胞极性（PCP）通路已涉及调节发育肌节中肌细胞生长的方向(Gros et al.,2009)。在成人中，Wnt信号转导被认为是急性损伤后肌肉组织中的成体干细胞的成肌定向所必需的(Polesskaya et al.,2003;Torrente et al.,2004)。其他的研究表明Wnt/β-连环蛋白信号转导通过储存成肌细胞的激活和补充调节成肌分化(Rochat et al.,2004)。此外，成体肌肉中卫星细胞内的Wnt/β-连环蛋白信号转导似乎通过限制Notch信号转导并由此促进分化来控制成肌谱系的进展(Brack et al.,2008)。

近年来，确定了Wnt受体Fzd7在休眠卫星干细胞中明显地上调。另外，进一步的研究显示出Wnt7a在肌肉再生中表达并通过其受体Fzd7和Vangl2（平面细胞极性（PCP）通路的组分）起作用，从而诱导对称卫星干细胞扩增并显著增强细胞再生。

PCP通路中受体或效应分子，例如Fzd7或Vangl2的抑制，被认为是在卫星干细胞上取消Wnt7a的效应(Le Grand et al.,2009)。进一步证实，给予脂化的Wnt7a多肽、或编码Wnt7a多肽的多聚核苷酸(其随后通过脂化进行翻译后修饰)，在体外和体内显著增加卫星干细胞数量，并促进体内组织形成，导致受伤的和患病的肌肉组织中增强的修复和再生(LeGrand et al.,2009)。

不希望受任何具体的理论限制，可以考虑到，导致受伤的和患病的肌肉组织中增强的修复和再生的Wnt7a作用机制有两条路：Wnt7a通过PCP通路可以刺激肌肉卫星（干）细胞的对称扩增，导致可随后分化为成肌细胞的更大的细胞库；以及，第二，经G蛋白偶联受体（Frizzled）的Wnt7a信号转导可刺激成肌细胞和肌纤维中磷脂酰肌醇3-激酶/Akt（蛋白激酶B）/哺乳动物类雷帕霉素靶标(PI3K/Akt/mTOR)通路信号转导，并显示为刺激肥大(Bodine et al.,Nature Cell Biology.2001;vol.3;pp.1014-1017;Glass et al.,Nature Cell Biology.2003;vol.5;pp.87-90;Ciciliotand Schiaffino,Current Pharmaceutical Design.2010;16(8);pp.906-914)。Wnt7a可通过G-蛋白偶联受体Frizzled7信号转导，并且该Wnt/Frz相互作用可有助于两种生物效应。

在多种实施方式中，本发明某种程度上涉及使用包含一种或多种修饰的Wnt的Wnt组合物来修复和再生受伤肌肉组织，所述Wnt通过非经典Wnt信号转导通路信号转导。在具体实施方式中，本发明的组合物包含选自以下的修饰的、非经典Wnt：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。在优选实施方式中，本发明的组合物包含修饰的Wnt5a或Wnt7a多肽。在另一优选实施方式中，本发明的组合物包含缺少一个或多个脂化位点的修饰的Wnt5a或Wnt7a多肽。

在某些实施方式中，本发明的组合物包括融合多肽，该融合多肽包含天然的、异源的、或杂合的信号肽和非经典Wnt多肽(任选缺乏一个或多个脂化位点)。

虽然已描述了PI3K/Akt/mTOR通路对肌肉细胞肥大的重要性，但在肌肉细胞中特异地刺激该通路的治疗挑战成为在受伤的和患病的肌肉组织中增强修复和再生的显著障碍。如IGF-1的有效PI3-激酶激活剂的早期研究产生体外肥大，但存在“脱靶”代谢效应的可能（即，IGF-1和PI3K是管家代谢、存活和代谢过程的关键调节剂）。因此，非经典Wnt通路的肌肉特异性刺激的潜力，如，PI3K/Akt/mTOR通路的Wnt7a-Fzd7刺激，会表现出重要且独特的治疗突破。

如下进一步描述的，本发明部分涉及创造性的Wnt组合物，其为Wnt组合物增强受伤的和患病的肌肉组织中的修复和再生的治疗用途的这一技术困难和其它障碍提供意想不到的方案。

D.多肽

Wnt信号转导通路是细胞信号转导网络的关键组分。人Wnt基因家族由19个成员构成，编码具有22或24个Cys残基和数个保守Asn和Ser残基的进化保守的糖蛋白。示例性人Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。

Wnt是分泌型糖蛋白，在转运前被高度修饰并释放如细胞外环境。信号序列切割并易位至内质网（ER）中后，Wnt通过内膜***转运至细胞表面并经历多次修饰。Wnt经历N-连接糖基化(Burrus and McMahon1995;Kadowaki et al.,1996;Komekado et al.,2007;Kurayoshi et al.,2007;Mason et al.,1992;Smolich et al.,1993;Tanaka et al.2002)。许多Wnt还在第一保守半胱氨酸处棕榈酰化，例如，Wnt1中的C93、Wnt3a中的C77、和Wnt5a中的C104(Galli et al.,2007;Kadowaki et al.,1996;Komekado etal.,2007;Willert et al.2003)。此外，Wnt3a在保守丝氨酸处（S209）用棕榈油酸修饰，这还被Wnt1(S224)Wnt5a保留(Takada et al.,2006)。而且，这些保守半胱氨酸和丝氨酸残基存在于很多Wnt中，例如，Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt6、Wnt7a、Wnt9a、wnt10a和Wnt11等(Takada et al.,2006;还参见图1)。

普遍认为Wnt酰化造成分泌型Wnt的普遍疏水的特性(Willert et al.,2003)。另外，哺乳动物类Wnt的翻译后脂化被认为是对功能至关重要。Wnt1、Wnt3a、或Wnt5a的保守N-端半胱氨酸的突变阻止了细胞培养物中的棕榈酰化。这些突变Wnt是分泌的但显示出很少或无信号转导活性(Galli et al.,2007;Komekado et al.,2007;Kurayoshi et al.,2007;Willert etal.,2003)，并且未棕榈酰化的Wnt被认为不可结合Fz受体(Komekado etal.,2007;Kurayoshi et al.2007)。突变Wnt3a中心部分保守的丝氨酸阻止了棕榈油酸添加并阻塞分泌和因此的活性(Takada et al.,2006)。果蝇Wg的研究确认了酰化的重要性(Franch-Marro et al.,2008a;Nusse2003;vanden Heuvel et al.,1993)。

进一步地，这些数据通过显示Wg信号转导强损失的果蝇刺猬（porc）表型得以支持(van den Heuvel et al.,1993)。Porc是Wg棕榈酰化(Zhai et al.,2004)和Wg ER输出(Tanaka et al.,2002)所需的ER-定位的整合膜O-酰基转移酶(Kadowaki et al.,1996)。脊椎动物Porc还提升Wnt脂化并且是Wnt信号转导和Wnt生物活性所需的(Galli et al.,2007)。

这些研究建立了这样的模型，其中棕榈油酸修饰是分泌和棕榈酸酯结合Fz所需的。因此，缺少一个或者全部这些脂质修饰的Wnt多肽预期将缺乏生物活性。

在多种实施方式中，本发明部分涉及被修饰或改造以降低或移除经典脂化位点但出乎意料地保留Wnt生物活性的Wnt多肽。在具体实施方式中，本发明的Wnt多肽促进细胞扩增和肌肉肥大，并促进组织形成、再生、维持和修复。如本文所用，结合氨基酸序列使用的术语“经典”是指天然存在多肽中存在的一个氨基酸或一组氨基酸。在一些情况下，在指示天然存在多肽中存在的氨基酸时，“经典”与“天然”可互换使用。

在某些实施方式中，修饰或改造Wnt多肽使之缺少用于Wnt多肽脂化的一个或多个天然氨基酸。在某些具体实施方式中，修饰或改造Wnt多肽使之缺少用于Wnt多肽脂化的所有天然氨基酸。在一些实施方案中，Wnt多肽是非经典Wnt多肽，即一种通过非经典Wnt信号转导通路信号转导的Wnt多肽。在具体实施方式中，非经典Wnt选自：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。在优选实施方式中，Wnt多肽是本文所述的缺少经典或天然脂化位点但保持或具有增加的经典和/或非经典Wnt信号转导活性的修饰或改造的Wnt5a或Wnt7a多肽。

如上所述，在一些实施方式中，本发明使用本领域已知的和可用的技术提供组合物，其包含改造的Wnt多肽或编码该改造的Wnt多肽的多聚核苷酸。在具体实施方案中，Wnt多肽改造为移除一个或多个、或所有脂化位点。

如本文所用，除有相反的说明外，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，并且根据常规含义，即为，肽键或修饰肽键连接的氨基酸的序列。在具体实施方式中，术语“多肽”包括融合多肽。多肽不限于特定长度，如其可包括全长蛋白序列或全长蛋白的片段，并且可包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、酰基化、磷酸化等，也包括本领域公知的、天然存在和非天然存在的其他修饰。本发明的多肽可通过多种公知的重组和/或合成技术制备，例证将在下面进一步讨论。然而，在具体实施方式中，本发明的Wnt多肽被改造，使得它们具有移除或消除Wnt多肽上的一个、两个或更多个或全部脂化位点的一个或多个氨基酸取代、缺失、***、或突变。在某些实施方式中，Wnt多肽是非经典Wnt多肽，即，通过非经典Wnt信号转导通路信号转导的Wnt多肽。

在多种实施方式中，Wnt多肽选自：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11，其中Wnt多肽通过如氨基酸取代、缺失或突变缺少一个或更多个或全部脂化位点。在优选实施方式中，Wnt多肽是通过如氨基酸取代、缺失、或突变缺少一个或更多个或全部脂化位点的Wnt5a或Wnt7a多肽。

如本文所用，术语“非经典Wnt多肽”是指通常或主要通过非经典Wnt信号转导通路信号转导的Wnt多肽。示例性非经典Wnt多肽包括但不仅限于：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。在一些实施方式中，术语“非经典Wnt多肽”是指具有这样序列的修饰或改造的非经典Wnt多肽，该序列与天然存在的非经典Wnt多肽序列至少约70%、更优选约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%一致。可在超过至少约10、25、50、100、200、300或更多个连续氨基酸上评估一致性，或者可在序列全长上评估一致性。确定一致性%或同源性%的方法是本领域公知的并可被用于该目的的任何适当的方法。非经典Wnt多肽的示例在SEQ ID Nos:2-13和15-23、29-32和39中示出。

如本文所用，术语“Wnt7a多肽”是指具有相应于野生型Wnt7a序列的多肽序列的Wnt7a蛋白。在一些实施方式中，术语“Wnt7a多肽”是指具有的序列与天然存在的Wnt7a序列至少约70%、更优选约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%一致的修饰或改造的Wnt7a多肽。可在超过至少约10、25、50、100、200、300或更多个连续氨基酸上评估一致性，或者可在序列全长上评估一致性。Wnt7a多肽的示例在SEQ ID Nos:2-13中示出。

如本文所用，术语“Wnt5a多肽”是指具有相应于野生型Wnt5a序列的多肽序列的Wnt5a蛋白。在一些实施方式中，术语“Wnt5a多肽”是指具有的序列与天然存在的Wnt5a序列至少约70%、更优选约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%一致的修饰或改造的Wnt5a多肽。可在超过至少约10、25、50、100、200、300或更多个连续氨基酸上评估一致性，或者可在序列全长上评估一致性。Wnt7a多肽的示例在SEQ ID Nos:15-23中示出。

如本文所用，术语“修饰的Wnt多肽”、“修饰或改造的Wnt多肽”和“改造的Wnt多肽”可交换使用，是指包含一个或多个氨基酸突变、增加、缺失或取代的Wnt多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本发明的具体实施方式中，为了防止Wnt多肽脂化但还得到保持Wnt生物活性的Wnt多肽，修饰的Wnt多肽包含保守脂化位点的一个或多个氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代。在具体实施方式中，修饰的Wnt多肽缺少一个或多个或所有脂化位点但保持Wnt活性。优选地，本发明的修饰的Wnt多肽保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt的活性。

如本文所用，术语“修饰的非经典Wnt多肽”、“修饰或改造的非经典Wnt多肽”和“改造的非经典Wnt多肽”可交换使用，是指包含一个或多个氨基酸突变、增加、缺失或取代的非经典Wnt多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本发明的具体实施方式中，为了防止非经典Wnt多肽脂化但还得到保持非经典Wnt生物活性的非经典Wnt多肽，例如通过非经典Wnt通路信号转导，修饰的非经典Wnt多肽包含保守脂化位点的一个或多个氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代，。在具体实施方式中，修饰的非经典Wnt多肽缺少一个或多个或所有脂化位点但保持非经典Wnt活性。优选地，本发明的修饰的非经典Wnt多肽保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在非经典Wnt的活性。

如本文所用，术语“修饰的Wnt7a多肽”、“修饰或改造的Wnt7a多肽”和“改造的Wnt7a多肽”可交换使用，是指包含一个或多个氨基酸突变、增加、缺失或取代的Wnt7a多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在本发明的具体实施方式中，为了防止Wnt7a多肽脂化但还得到保持或增加Wnt7a生物活性的Wnt7a多肽，修饰的Wnt7a多肽包含保守脂化位点的一个或多个氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代。在具体实施方式中，修饰的Wnt7a多肽缺少一个或多个或所有脂化位点但保持Wnt生物活性。优选地，本发明的Wnt7a多肽变体保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt7a的活性。修饰的Wnt7a多肽的示例在SEQ ID No:3-5和12-13中示出。

如本文所用，术语“修饰的Wnt5a多肽”、“修饰或改造的Wnt5a多肽”和“改造的Wnt5a多肽”可交换使用，是指包含一个或多个氨基酸突变、增加、缺失或取代的Wnt5a多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物。在具体实施方式中，为了防止Wnt5a多肽脂化但还得到保持或增加Wnt5a生物活性的Wnt5a多肽，本发明的修饰的Wnt5a多肽包含保守脂化位点的一个或多个氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代。在具体实施方式中，修饰的Wnt5a多肽缺少一个或多个或所有脂化位点但保持Wnt生物活性。优选地，本发明的Wnt5a多肽变体保持至少100%、至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%、或至少5%的天然存在Wnt5a的活性。修饰的Wnt5a多肽的示例在SEQ ID No:16-18中示出。

在具体实施方式中，本发明的修饰的Wnt多肽包含减少或阻止多肽脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代，但该多肽具有Wnt生物活性。在具体实施方式中，Wnt多肽是在表1中确定的一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的经典Wnt多肽，其中氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代防止确定位置的脂化，并且其中经典Wnt多肽保持或增加经典Wnt生物活性水平。

表1

Wnt	AA位置	Ref.SEQ ID
			Wnt1	93;224	24
Wnt2	76;212	25
			Wnt2b	88;224	26
Wnt3	80;212	27
			Wnt3a	77;209	28
Wnt8a	54;186	33
			Wnt8b	54;186	34
Wnt9a	93;221	35
			Wnt9b	89;216	36
Wnt10a	96;268	37
			Wnt10b	83;253	38
Wnt16	81;227	40

在具体实施方式中，Wnt多肽是在表2中确定的一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的非经典Wnt多肽，其中氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代防止确定位置的脂化，并且其中非经典Wnt多肽保持或增加非经典Wnt生物活性水平。

表2

Wnt	AA位置	Ref.SEQ ID
			Wnt4	78;212	29
Wnt5a	104;244	15
			Wnt5b	83;223	30
Wnt6	76;228	31
			Wnt7a	73;206	2
Wnt7b	73;206	32
			Wnt11	80;215	39

在具体实施方式中，Wnt多肽是在氨基酸73和/或206处包含防止在该位置发生脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中该Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一个实施方式中，多肽是在氨基酸第73位包含防止在该位置发生脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中该Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一些实施方式中，本发明的Wnt多肽是在氨基酸第206位包含防止在该位置发生Wnt7a脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中该Wnt7a多肽保持或增加Wnt7a生物活性水平。在一些实施方式中，多肽是在氨基酸第73位和第206位包含氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt7a多肽，其中该Wnt7a多肽缺乏翻译后脂化并具有Wnt生物活性。

在某些实施方式中，Wnt7a多肽的C73和/或S206是Ala或另一氨基酸取代的以防止这些残基脂化。在其他实施方式中，突变或缺失C73和/或S206以防止这些残基的脂化，例如，SEQ ID Nos:3-5。在一些实施方式中，C73和S206被Ala取代，并且本发明的Wnt7a多肽缺少脂化位点并保持一些Wnt生物活性水平，如，SEQ ID NO:5。

在具体实施方式中，Wnt多肽是在氨基酸104和/或244处包含防止在该位置发生脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中该Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一个实施方式中，多肽是在氨基酸第104位包含防止在该位置发生脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中该Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一些实施方式中，本发明的Wnt多肽是在氨基酸第244位包含防止在该位置发生Wnt5a脂化的氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中该Wnt5a多肽保持或增加Wnt5a生物活性水平。在一些实施方式中，多肽是在氨基酸第104位和第244位包含氨基酸突变、增加、缺失、和/或取代的Wnt5a多肽，其中该Wnt5a多肽缺乏翻译后脂化并具有Wnt生物活性。

在某些实施方式中，Wnt5a多肽的C104和/或S244是Ala或另一氨基酸取代的以防止这些残基脂化。在其他实施方式中，突变或缺失C104和/或S244以防止这些残基的脂化，例如，SEQ ID Nos:16-18。在一些实施方式中，C104和S244被Ala取代，并且本发明的Wnt5a多肽缺少脂化位点并保持一些Wnt生物活性水平，如，SEQ ID NO:18。

如本文所用，术语“天然存在”是指在自然界中可以找到的多肽或多聚核苷酸序列。例如，天然存在多肽或多聚核苷酸序列是有机体中存在的，并且可以从有机体中分离的，并且没有在实验室中被人为有意修饰的。术语“野生型”通常与术语“天然存在”可互换使用。

在本发明的上下文中，多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物在表现出约10%、20%、30%、40%或50%的野生型蛋白活性，优选至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或至少80%的野生型蛋白活性时，认为其与野生型蛋白具有至少大体上相同的活性。在具体实施方式中，多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物表现出至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的野生型蛋白活性。在某些实施方式中，可获得大于野生型活性的活性。如Wnt5a或Wnt7a多肽的非经典Wnt多肽、其生物活性片段或变体、或其同源物、旁系同源物或直系同源物的活性，例如，可通过如刺激Wnt信号转导通路，如促进对称干细胞扩增或细胞生长以测量其模拟野生型Wnt生物活性的能力，并与野生型蛋白活性的能力对比来确定。测量和表征干细胞***(如卫星干细胞***)和细胞生长(如肌肉肥大)的方法是本领域内已知的。

如本文所用，应用于参考多聚核苷酸或多肽序列的片段的术语“生物活性片段”是指具有至少约5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000%或更多的Wnt参考序列的生物活性(如刺激其Wnt信号转导通路的生物活性)的修饰的Wnt多肽的片段。本发明的某些实施方式部分涉及长度为至少约20、50、100、150、200、250、或300个（包括其间所有整数）连续氨基酸残基的修饰的Wnt多肽的生物活性片段或编码这些片段的多聚核苷酸序列，其包括或编码具有参考Wnt多肽(如天然存在的Wnt多肽)的生物活性的多肽。

修饰的多肽包括多肽变体。本文所用的术语“变体”是指如本文他处所述和本领域所知的，通过修饰、增加、缺失、或取代至少一个氨基酸残基而区别于参考多肽的多肽。在某些实施方式中，多肽变体是通过一个或多个氨基酸取代（例如，1、2、3、4、5或更多取代）而区别于参考多肽，所述取代可以是保守的或非保守的。例如，在多种实施方式中，可在靶向于天然存在Wnt多肽脂化的任何氨基酸残基中进行一个或多个保守或非保守取代。

在其他具体实施方式中，与天然存在的Wnt多肽相比，为了防止脂化、增加Wnt通路信号转导活性、和/或增加修饰的Wnt多肽的稳定性，Wnt多肽变体包含一个或多个氨基酸的增加、缺失、或取代。

在其他具体实施方式中，与天然存在的非经典多肽相比，为了防止脂化、增加Wnt通路信号转导活性、和/或增加修饰的Wnt多肽的稳定性，非经典Wnt多肽变体包含一个或多个氨基酸的增加、缺失或取代。

在其他具体实施方式中，与天然存在的Wnt7a多肽相比，为了防止脂化、增加Wnt通路信号转导活性、和/或增加修饰的Wnt多肽的稳定性，Wnt7a多肽变体包含一个或多个氨基酸的增加、缺失或取代。

在其他具体实施方式中，与天然存在的Wnt5a多肽相比，为了防止脂化、增加Wnt通路信号转导活性、和/或增加修饰的Wnt多肽的稳定性，Wnt5a多肽变体包含一个或多个氨基酸的增加、缺失或取代。

为了产生此类变体，例如，本领域技术人员可根据如表3改变一个或多个编码DNA序列的密码子。

表3 氨基酸密码子

决定可取代、***、或缺失哪些氨基酸残基而不去除生物或免疫活性的指导可利用本领域公知的计算机程序获得，例如DNASTAR^TM软件。若需要，可进行氨基酸取代，以从多肽中改变和/或移除功能基团。或者，本文所述的蛋白变体中氨基酸的改变可以为保守氨基酸改变，即带相似电荷的氨基酸或或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸的改变涉及与其侧链相关的氨基酸家族之一的取代。天然存在的氨基酸大体上分为四个家族：酸性（天冬氨酸、谷氨酸）、碱性（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、非极性（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）和无电荷极性（甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）氨基酸。苯基丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同分类为芳香族氨基酸。详见表4。

表4 保守氨基酸取代基

原残基	保守取代
		Ala(A)	Gly;Ser
Arg I	Lys
		Asn(N)	Gln;His
CI(C)	Ser
		Gln(Q)	Asn
Glu(E)	Asp
		Gly(G)	Ala;Pro
His(H)	Asn;Gln
		Ile(I)	Leu;Val
Leu(L)	Ile;Val
		Lys(K)	Arg;Gln;Glu
Met(M)	Leu;Tyr;Ile
		Phe(F)	Met;Leu;Tyr
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
		Tyr(Y)	Trp;Phe
Val(V)	Ile;Leu

其他取代也是可允许的，并且可根据经验或根据其他已知保守（或非保守）取代确定。

在做出这些改变时，可能需要考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物功能中的重要性被本领域普遍认可(Kyteand Doolittle,1982,在此通过引用并入本文)。本领域公知的是，某些氨基酸可被具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸取代，并仍得到带有相似生物活性的蛋白，即，仍获得生物功能等同的蛋白。在做出该改变时，取代的氨基酸的亲水指数优选是±2以内，更优选的是±1以内，并更优选的是±0.5以内。本领域还公知，相似氨基酸的取代可根据亲水性有效实施。

本发明的多肽的变体包括糖基化形式、与其他分子的聚合偶联物、和与无关化学部分（如，聚乙二醇化分子）的共价偶联物。如本领域公知，共价变体可通过将官能团与氨基酸链或N-端或C-端残基所见的基团连接来制备。变体还包括等位基因变体、物种变体、和突变蛋白。不影响蛋白功能活性的区域截短或缺失也是变体。

本发明多肽中功能必要的氨基酸可通过本领域公知的方法鉴别，例如，位点定向诱变或丙氨酸扫描诱变（Cunningham and Wells,Science244:1081-1085,1989）。对配体受体结合至关重要的位点也可通过如结晶、核磁共振或光亲和标记的结构分析确定(Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992and de Vos et al.Science255:306-312,1992)。

某些改变并不显著影响蛋白的折叠或活性。本领域技术人员将进行的氨基酸取代的数量取决于很多因素，包括上述的那些因素。一般而言，任何给定多肽的取代数量不会超过50、40、30、25、20、15、10、5或3。

此外，多肽和/或突变蛋白的聚乙二醇化预计提供改进的性能，如，增加的半衰期、溶解性、和蛋白酶抗性。聚乙二醇化是本领域公知的。

E.融合多肽

在多种实施方式中，本发明部分涉及融合多肽、和编码融合多肽的多聚核苷酸。在一个实施方式中，融合多肽包含修饰的Wnt多肽、生物活性Wnt多肽片段、和/或进一步包含本文他处记载的一个或多个氨基酸突变、取代、和/或增加的此类肽。在具体实施方式中，融合多肽包含选自以下的非经典Wnt多肽：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。在优选实施方式中，Wnt多肽是本文所述的缺乏经典或天然脂化位点但保持或增加Wnt信号转导活性的修饰的或改造的Wnt5a或Wnt7a多肽。

融合多肽可在蛋白N端包含信号肽，其在翻译的同时和翻译后指导Wnt多肽的转移。融合多肽还可包含接头或间隔区、一个或多个蛋白酶切割位点、一个或多个表位标签或便于多肽合成、纯化或产生的其他序列。

融合多肽和融合蛋白是指直接或通过氨基酸接头被共价连接至一个或多个异源多肽序列（融合伴侣）的本发明的多肽。形成融合蛋白的多肽通常是C-端与N-端连接的，尽管其也可也是C-端与C-端、N-端与N-端、或N-端与C-端连接的。融合蛋白的多肽可以为任何顺序。

只要融合伴侣不会不利影响所需的多肽活性，可设计和包括基本上用于期望的任何目的的融合伴侣。例如，在一个实施方式中，可选出融合伴侣以便增加蛋白的溶解性或稳定性、促进Wnt多肽的制备和/或纯化、和/或促进Wnt的***递送和/或组织摄入。融合多肽可通过化学合成方法或通过两个部分间的化学键合产生，或者可通常用其他标准技术制备。在一个实施方式中，Wnt融合蛋白包含以下的一个或多个、或全部：信号肽、Wnt多肽，如，为Wnt5a或Wnt7a的非经典Wnt、或其生物活性片段、蛋白酶切割位点、和表位标签。

如本文所用，术语“信号肽”是指确保进入分泌通路的前导序列。为了分泌蛋白的工业生产，产生的蛋白需要从宿主细胞或宿主机体中有效分泌。信号肽可以是，如待产生的蛋白的天然信号肽、异源信号肽、或天然和异源信号肽的杂合体。很多信号肽用于制备分泌蛋白。

因此，在多种实施方式中，本发明涉及促进Wnt多肽(包括如Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11的非经典Wnt多肽)产生和分泌的方法，其包括在如哺乳动物、昆虫、或细菌的细胞内表达具有信号肽和如本文所述的被修饰或改造而缺少经典或天然脂化位点的非经典Wnt多肽(其中该多肽保持或增加经典和/或非经典Wnt信号转导活性)的融合多肽。在优选实施方式中，促进Wnt5a或Wnt7a的产生和分泌的方法包括，在细胞内表达融合多肽，其具有信号肽和如本文所述的被修饰或改造而缺少经典或天然脂化位点但却保持或增加经典和/或非经典Wnt信号转导活性的Wnt5a或Wnt7a多肽。

用于本发明的融合多肽中的信号肽的示例包括但不仅限于：CD33信号肽；如IgGκ信号肽或IgGμ信号肽的免疫球蛋白信号肽；生长激素信号肽；红细胞生成素信号肽；白蛋白信号肽；分泌型碱性磷酸酶信号肽、和如轮状病毒VP7糖蛋白信号肽的病毒信号肽。

在具体实施方式中，本发明的融合多肽包含蛋白酶切割位点和促进如Wnt5a和Wnt7a的非经典Wnt多肽的纯化和产生的表位标签。蛋白酶切割位点的位置通常在Wnt多肽的C-端和表位标签间以在将Wnt递送至细胞或组织前帮助异源序列的移除。

本发明的融合蛋白中可用的异源蛋白酶切割位点的示例包括但不仅限于：烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和Xa因子切割位点。

本发明的融合蛋白中可用的表位标签的示例包括但不仅限于：HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。

若需要，还可以利用肽接头序列将融合多肽的组分间隔足以确保每条多肽折叠成其二级和三级结构的距离。这样的肽接头序列利用本领域公知的标准技术并入融合蛋白。某些肽接头序列可基于以下因素进行选择：（1）其采用弹性延伸构造的能力；（2）其无法采用能够与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力；（3）缺乏可能与多肽功能表位反应的疏水性或带电荷的残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其他接近中性的氨基酸，如Thr和Ala也可用在接头序列中。可用作接头的氨基酸序列包括在Maratea et al.,Gene40:3946(1985);Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:82588262(1986);美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号中公开的那些接头。接头序列的长度可大体上是1至大约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必要N-端氨基酸区时，不需要接头序列。两条编码序列可无需任何接头或通过使用由五聚物Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重复1至3次的弹性多聚接头而直接融合。该接头已通过***VH和VL之间用于构建单链抗体(scFv)(Bird et al.,1988,Science242:423-426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5979-5883)。接头被设计成可使形成单链抗体的可变区的两个β-折叠间恰当相互作用。其他可使用的接头包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(Chaudhary etal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(Bird et al.,1988,Science242:423-426)。

在一个实施方式中，本发明的融合多肽包含抗体的一部分(如免疫球蛋白“Fc区”)，和例如本文所述的被修饰或改造以缺少经典或天然脂化位点但保持或增加经典和/或非经典Wnt信号转导活性的修饰的Wnt多肽如Wnt5a或Wnt7a。抗体的Fc区由两条重链组成，该重链依赖抗体种类形成两个或三个恒定区。Fc区可从如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的任何免疫球蛋白种类中获得。在一些实施方案中，Fc区是野生型Fc区。在一些实施方式中，Fc区是突变Fc区。在一些实施方式中，Fc区在N-端被截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸（例如，在铰链结构域中）。包含Fc区的本发明的Wnt融合多肽可具有提升的产生和/或纯化效率。

在一个实施方式中，本发明的Wnt融合多肽包含被修饰以缺少天然脂化位点但保持非经典Wnt信号转导活性的Wnt7a多肽，和人IgG Fc区。在具体实施方式中，Wnt7a多肽包含在相应于SEQ ID NO:2第73位或第206位的氨基酸位置处的氨基酸缺失、***或取代，和人IgG Fc区。在具体实施方式中，Wnt7a多肽包含在相应于SEQ ID NO:2第73位和第206位的氨基酸位置处的氨基酸缺失、***或取代，和人IgG Fc区。在具体实施方式中，Wnt7a多肽包含在相应于SEQ ID NO:2第73位或第206位的氨基酸位置处的丙氨酸，和人IgG Fc区。在一个实施方式中，Wnt7a多肽包含在相应于SEQ ID NO:2第73位和第206位的氨基酸位置处的丙氨酸，和人IgG Fc区

包含Fc区和修饰的非经典Wnt多肽(如Wnt5a或Wnt7a)的融合多肽可进一步包含天然或异源信号肽、蛋白酶切割位点和表位标签中的一个或多个、或所有。

在优选实施方式中，改善修饰的Wnt5a或Wnt7a多肽的半衰期、药物动力学性质、溶解性、和产生效率的方法包括在细胞中表达融合多肽，该融合多肽具有Fc区和/或信号肽和如本文所述的被修饰或改造以缺少经典或天然脂化位点但保持或增加经典和/或非经典Wnt信号转导活性的Wnt5a或Wnt7a多肽。

例如，融合至免疫球蛋白Fc区的修饰的Wnt5a或Wnt7a多肽具有增加的***半衰期、改善的药物动力学性质、溶解性和产生效率。在一个实施方式中，将Wnt多肽融合至抗体Fc部分优化融合多肽的药物动力学和药效性质。例如，多肽的Fc部分可使多肽免于降解、使多肽循环更久。通常，多肽、融合多肽（及其编码多聚核苷酸）和细胞是分离的。“分离”的多肽或多聚核苷酸是从其原始环境移出的多肽或多聚核苷酸。例如，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从细胞环境中、和从与细胞其他组分的结合中体外分离和/或纯化，即其明显不与体内物质结合。相似地，本文所用的“分离的多聚核苷酸”是指已从在天然存在的状态下位于其侧翼的序列中纯化的多聚核苷酸，如从通常临近DNA片段的序列中移除的DNA片段。例如如果多聚核苷酸被克隆进不是天然环境的一部分的载体，则其被认为是分离的。“分离的细胞”是指从体内组织或器官中获得的并大体上不含细胞外基质的细胞。优选地，如果多肽、多聚核苷酸或细胞是至少约60%纯的、至少约70%纯的、至少约80%纯的、至少约90%纯的、更优选至少约95%纯的和最优选至少约100%纯的，则该多肽、多聚核苷酸、或细胞是分离的。

如本文所用，术语“从…中获得”意味着例如，如多聚核苷酸或多肽的样品分离自或获自如重组宿主细胞的特定来源中。在另一实施方式中，术语“从…中获得”是指细胞分离自或获自如体内组织或器官的来源。

F.多聚核苷酸

本发明还提供了编码本发明的Wnt多肽的分离的多聚核苷酸。在多种实施方式中，本发明部分涉及编码缺少经典脂化位点但保持Wnt生物活性、并在一些实施方式中增加Wnt信号转导活性的多肽的Wnt多聚核苷酸。在具体实施方式中，本发明的Wnt多聚核苷酸编码促进干细胞扩增并促进组织形成、再生、维持和修复的Wnt多肽。

本发明的Wnt多聚核苷酸适用于Wnt多肽临床规模生产，并且适用于增强人体中损伤的和患病的肌肉组织的修复和再生的方法。在某些实施方式中，Wnt多聚核苷酸编码缺少Wnt多肽的脂化用的一个或多个天然氨基酸的Wnt多肽。在某些具体实施方式中，Wnt多聚核苷酸编码缺少Wnt多肽的脂化用的所有天然氨基酸的Wnt多肽。在优选实施方式中，Wnt多聚核苷酸编码缺少非经典脂化位置但保持或增加Wnt生物活性的非经典Wnt多肽。在其他优选实施方式中，Wnt多聚核苷酸编码缺少经典脂化位置但保持或增加Wnt生物活性(如非经典Wnt信号转导活性)的Wnt5a或Wnt7a多肽。

核酸可用记载在如下文献中本领域已知的方案合成：Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology211,3-19;Thompson et al.,国际PCT公开号WO99/54459;Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684;Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59-68;Brennan et al.,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33-45;以及Brennan,U.S.Pat.No.6,001,311)。

所用“核苷酸”指的是与磷酸化糖通过N-糖苷键连接的杂环氮碱基。核苷酸在本领域中公认地包括天然碱基（标准）和本领域公知的修饰碱基。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸基。核苷酸可在糖、磷酸基和/或碱基部分未修饰或修饰，还可互换的称作核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等（详见例证：Usman and McSwiggen,同上;Eckstein et al.,国际PCT公开号WO 92/07065;Usman et al.,国际PCT公开号WO93/15187;Uhlman& Peyman,同上）。Limbach等人（1994,Nucleic Acids Res.22,2183-2196）总结了一些本领域公知的修饰的核酸碱基的例子。

如本文所用，术语“DNA”和“多聚核苷酸”和“核酸”是指从无特定物种的总基因组DNA分离的DNA分子。因此，编码多肽的DNA节段是指包含一个或多个编码序列但实质上从获得该DNA节段的物种的总基因组DNA分离出或纯化出的DNA节段。包含在术语“DNA节段”和“多聚核苷酸”内的是DNA节段和该节段的小片段，以及包括如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等的重组载体。

如本领域技术人员所知的，本发明的多聚核苷酸序列可包括表达、或可适于表达蛋白、多肽、肽等的基因组序列、基因组外序列和质粒编码序列和更小的改造的基因节段。此类节段可以是天然分离、重组、或人为修饰合成的。

如本领域技术人员公知的，多聚核苷酸可以是单链（编码或反义）或双链的，并且可以是DNA（基因组、cDNA或合成的）或RNA分子。其他编码或非编码序列可以但不必须存在于本发明的多聚核苷酸内，并且多聚核苷酸可以但不必须连接其他分子和/或支撑材料。

多聚核苷酸可以包括天然序列（即，编码本发明的多肽或者其一部分的内源序列）或可包括变体、或与其生物功能等同的序列。多聚核苷酸变体可含有一个或多个如本文他处所述的取代、增加、缺失和/或***，优选地以使变体编码缺少经典脂化位点但保持并在一些实施方式中增加生物活性(如通路信号转导活性)的多肽。

还包括的是与编码本发明的多肽的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。在“严紧条件”下杂交描述的是彼此至少60%相同的核苷酸序列保持杂交的杂交方案。高严紧杂交条件是使探针、引物或寡聚核苷酸仅与其靶序列杂交的条件。严紧条件是依赖序列的并且各不相同。中等严紧条件是使用洗涤液的条件和比高严紧条件的严紧性低(Sambrook,1989)的杂交条件，以使多聚核苷酸与本发明的核酸的整体、片度、衍生物或类似物杂交。中等严紧条件在(Ausubel et al.,1987;Kriegler,1990)中记载。低严紧条件是使用洗涤液并且比中等严紧条件(Sambrook,1989)严紧性低的杂交条件，以使多聚核苷酸与本发明的核酸的整体、片度、衍生物或类似物杂交。如那些跨种杂交的低等严紧条件记载在(Ausubel et al.,1987;Kriegler,1990;Shilo and Weinberg,1981)中。

在其他实施方式中，本发明提供分离的多聚核苷酸，其包含与本文所述的编码多肽的多聚核苷酸相同或互补的序列的不同长度的连续区段。例如，本发明提供的多聚核苷酸编码本发明多肽的至少约50、100、150、200、250、300、或约350或更多个以及所有中间长度的连续氨基酸残基。很容易理解本文中的“中间长度”指的是所记载的数值之间的任意长度，如56、57、58、59等、101、102、103等；151、152、153等；01、202、203等。

本领域技术人员应当理解的是，由于遗传密码简并性的结果，有很多编码本文所述的多肽的核苷酸序列，包括为人和/或灵长类密码子筛选优化的多聚核苷酸。进一步地，还可使用包含本文提供的多聚核苷酸序列的基因的等位基因。

本发明的多聚核苷酸组合物可使用多种已知技术中的任一种鉴别、制备和/或操作（详见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY,1989等类似文献）。

多种表达载体/宿主***是已知的，并可用于包含和表达多聚核苷酸序列。这些包括但不仅限于：微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母菌；用病毒表达载体（如，杆状病毒）感染的昆虫细胞***；用病毒表达载体（如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病病毒，TMV）或用细菌表达载体（如，Ti或pBR322质粒）转化的植物细胞***；或动物细胞***。

如本文所用，术语“调控元件”或“调节序列”是指存在于表达载体中是载体非翻译区的序列（如，增强子、启动子、5’和3’非翻译区），并且与宿主细胞蛋白相互作用以实施转录和翻译。此类元件可在其强度和特异性上变化。根据所用的载体***和宿主，可使用任何数量的适宜的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，在细菌***中克隆时，可使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)、pET质粒(Novagen)等的杂合lacZ启动子。载体组分通常包括但不仅限于一个或多个以下组分：信号序列、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、宿主机体识别的启动子、和转录终止序列。特定启动信号还可用于更有效完成编码目的多肽的序列翻译。

在酿酒酵母中，可使用包含组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶、和PGH)的载体，还包括Pichia pandoris表达***（详见如Li et al.,Nature Biotechnology.24,210-215,2006;以及Hamilton et al.,Science,301:1244,2003）。

在使用植物表达载体的情况下，如CaMV的35S和19S启动子的病毒启动子可单独或与TMV的Ω前导序列(Takamatsu,EMBO J.6:307-311(1987))结合使用。可通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体引入植物细胞。

昆虫***还可用于表达目的多肽。示例性杆状病毒表达***包括但不限于：使用SF9、SF21和Tni细胞的***（详见如Murphy andPiwnica-Worms,Curr Protoc Protein Sci.Chapter5:Unit5.4,2001）。

在哺乳动物宿主细胞中，一般可用一些基于病毒的表达***。此外，如Rous肉瘤病毒（RSV）增强子的转录增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。有用哺乳动物宿主细胞系的实例包括COS-7细胞、293或293T细胞、BHK细胞、VERO-76细胞、HELA细胞、和CHO细胞(包括DHFR-CHO细胞)。哺乳动物表达***可利用贴壁细胞系(例如，T烧瓶、滚瓶、或细胞工厂中的贴壁细胞系)或悬浮培养，如1L和5L转瓶、5L、14L、40L、100L和200L搅拌槽生物反应器、或20/50L和100/200LWAVE生物反应器、以及现有技术中其他已知反应器中悬浮培养。

还包括蛋白的无细胞表达。这些和相关实施方式通常使用纯化RNA聚合酶、核糖体、tRNA和核糖核苷酸。这些试剂可通过从细胞或基于细胞表达***提取制备。

在具体实施方式中，本发明的多肽从细菌中表达和纯化。示例性细菌表达载体包括BLUESCRIPT(Stratagene);pIN载体(Van Heeke &Schuster,J.Biol.Chem.264:55035509(1989));和可用于表达如带有谷胱甘肽s-转移酶的融合蛋白的外来多肽的pGEX载体(Promega,Madison,Wis.)。某些实施方式可采用基于E.coli的表达***。

在具体实施方式中，蛋白表达可通过T7 RNA聚合酶（如pET载体系列）控制。这些和相关的实施方式可利用表达宿主株BL21(DE3)、支持T7介导的表达并缺乏促进靶蛋白稳定性的lon和omp T蛋白酶的BL21的λDE3溶源体。还包括的是携带编码很少用于E.coli中的tRNA的质粒的表达宿主株，例如，Rosetta^TM(DE3)和Rosetta2(DE3)菌株。细胞裂解和样品处理还可利用如Benzonase核酸酶和BugBuster

蛋白提取剂的试剂完善。为了细胞培养，自动诱导培养基可提升很多表达***的效率，包括高产能表达***。这种类型的培养基（如，Overnight Express^TM自动诱导培养基）逐渐通过不加入如IPTG的人造诱导剂的代谢性迁移引起蛋白表达。某些实施方式可采用冷激诱导E.coli高产率生产***，因为低温下大肠杆菌中蛋白的过表达提高其溶解性和稳定性（详见如Qing et al.,Nature Biotechnology.22:877-882,2004）。

通过重组细胞产生的蛋白可以根据多种技术纯化和表征。实施蛋白纯化和分析蛋白纯度的示例性***包括快速蛋白液相层析（FPLC）（如KTA和Bio-Rad FPLC***）、高压液相层析(HPLC)(如Beckman和WatersHPLC)。示例性纯化化学包括离子交换层析（如，Q，S）、粒径排阻层析、盐梯度、亲和纯化（如，Ni、Co、FLAG、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白A/G）、凝胶过滤、反相法、陶瓷HyperD离子交换层析、和疏水作用柱（HIC）、以及其他本领域已知的方法。还包括如，SDS-PAGE（如，考马斯染色法、银染色法）、免疫印迹、Bradford、和ELISA的分析方法，可用在产生或纯化过程的任何步骤中，通常用于测量蛋白组合物的纯度。

在某些实施方式中，临床规模蛋白可从E.coli包涵体中分离。在具体实施方式中，本发明涉及制备适用于本文他处所述的治疗用途的重组Wnt多肽的方法。

在一个实施方式中，制备重组Wnt多肽的方法包括以下的一个或多个步骤：i)在宿主中表达Wnt多聚核苷酸；ii)培养宿主细胞以表达作为包涵体的Wnt多肽；iii)洗涤包涵体的一个或多个步骤；iv)溶解多肽；v)重折叠多肽；vi)纯化多肽；和vii)在所需缓冲液中透析多肽。

在某些实施方式中，密码子优化Wnt多聚核苷酸序列用于在细菌宿主中表达。

除了重组制备方法，本发明的多肽及其片段可使用固相技术通过直接肽合成制备(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。蛋白合成可使用手动技术或自动操作进行。例如可以利用Applied Biosystems431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现自动合成。或者，多个片段可分别化学合成并使用化学方法连接以产生全长分子。

G.组合物

在多种实施方式中，本发明部分涉及Wnt多肽及其编码多聚核苷酸的新型组合物。如本文他处讨论的，Wnt的治疗用途主要限制和障碍之一是其低溶解性，使其在临床规模上的产生行不通。发明人改造的新型Wnt多肽具有增加的溶解性、稳定性、并与天然存在Wnt相比保持或具有增加的Wnt生物活性。在具体实施方式中，本发明提供可溶Wnt多肽的水性制剂，以促进干细胞扩增和肌肉肥大，并促进组织形成、再生、维持和修复。在某些实施方式中，本发明提供了可溶Wnt多肽的水性制剂，以促进干细胞扩增和肌肉肥大，并促进组织形成、再生、维持和修复，其中制剂中基本上不存在去垢剂。

本发明的组合物可包含如本文所述的一种或多种多肽、多聚核苷酸、包含多聚核苷酸的载体等，以及用于单独或与一种或者多种其他治疗形式相结合给予细胞或动物的一种或多种药学可接受的盐或载体和/或生理学可接受的溶液。还应理解的是，若需要，本发明的组合物也可结合其他制剂给予，例如，其他蛋白、多肽、小分子或多种药物活性试剂。事实上，对还可以包含在组合物中的其他组分没有限制，只需其它试剂对Wnt组合物的治疗潜力(例如组合物促进肌肉肥大和促进组织形成、再生、维持和修复的能力)没有不利影响即可。

药学可接受的盐包括酸加成盐（与蛋白的游离氨基形成）和与例如如盐酸或磷酸的无机酸、或如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等这样的有机酸形成的盐。与游离羧基形成的盐还可来源于例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁的无机碱，以及如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等这样的有机碱。

在某些情况下，可取的是，将本文所述的组合物经肠道外、经血管(如经静脉或经动脉)、经肌肉、甚至经腹腔递送，例如如美国专利第5,543,158号、美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号所述的（每篇文献均明确通过引用整体并入本文）。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。此类介质和试剂对药物活性物质的用途是本领域公知的。除了任何与活性成分不相容的常规介质或试剂，涉及其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可并入组合物。

词组“药学可接受的”是指当给予人体时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。包含作为活性成分的蛋白的水性组合物的制备是本领域公知的。通常，此类组合物被制备成血管注射剂，为液体溶液或悬浮液。还可制备成适于在注射前溶解、或悬浮在液体中的固体形式。

在某些实施方式中，组合物可通过鼻内喷雾、吸入、和/或其他气溶胶递送媒介给药。美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号已记载了通过鼻气溶胶喷雾直接递送基因、多聚核苷酸、和肽组合物进入肺的方法（每篇文献均明确通过引用整体并入本文）。同样地，利用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871号，在此明确通过引用整体并入本文)也是制药领域公知的。同样地，聚四氟乙烯支持基质形式的经粘膜药物递送在美国专利第5,780,045号中描述（明确通过引用整体并入本文）。本发明的具体实施方式可包括其他制剂，如制药领域公知的制剂，并且描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000中。

H.递送方法

在一个实施方式中，将细胞(例如，如卫星干细胞的干细胞)与包含一种或多种本发明的Wnt多肽和/或多聚核苷酸的组合物接触。可考虑到，本发明的细胞可在体外、离体、或体内接触。在其他实施方式中，将本发明的Wnt组合物给予个体。

本发明的组合物可直接给予个体（如蛋白/多肽，或用于基因治疗的表达载体的情况下）或离体递送至来源于个体的细胞（例如，如离体基因治疗中）。直接体内递送组合物一般会通过肠道外注射完成，如，皮下、腹腔、静脉、心肌、瘤内、瘤周或组织胞间隙。其他给药方式包括口服和肺内给药、栓剂、和透皮给药、针、和基因枪或无针注射器。

本发明的组合物还可通过直接注射至如肌肉的组织给药。在本发明的一些实施方式中，本发明的组合物通过直接向肌肉组织注射组合物给药，以预防注射肌肉中的肌肉损失或促进注射肌肉的再生或修复，例如，通过促进注射肌肉的肌肉细胞扩增或肥大。

一般地，用于离体和体外应用的核酸递送可通过本领域公知的如葡聚糖介导转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体对多聚核苷酸的封装、的直接将DNA显微注射入核内、和如腺病毒（和腺相关病毒）或甲病毒的病毒介导来实现。

在某些实施方式中，优选地利用病毒载体或其他体内多聚核苷酸递送技术递送一种或多种修饰的Wnt。在优选实施方式中，病毒载体是非整合载体或基于转座子的载体。可利用多种公知方法中的任何一种来完成递送，如包括腺病毒、转录酶病毒、慢病毒、腺相关病毒(AAV)载体的载体，或如表达构建体的其他病毒载体的利用（包括但不限于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒）。

非病毒方法也可用于给予本发明的多聚核苷酸。在一个实施方式中，多聚核苷酸可直接通过显微注射给予细胞或通过注射给予组织，例如通过利用Dubensky et al.,(1984)或Benvenisty&Reshef(1986)中记载的技术。可以期望的是，编码目的基因的DNA还可在体内以类似方法转移并表达基因产品。

转移裸DNA表达构建体进入细胞的本发明的另一实施方式可涉及粒子轰击。该方法依赖加速包被DNA的微弹至高速，从而允许其刺穿细胞膜并进入细胞而不杀死细胞的能力(Klein et al.,1987)。在另一实施方式中，通过电穿孔向细胞给予多聚核苷酸。

I.治疗方法

本发明的修饰的Wnt多肽和组合物用于多种治疗应用。例如，本文所述的组合物和方法用于促进有需要的个体中的组织形成、再生、修复或维持。

本发明的Wnt组合物的一些相关治疗应用包括需要通过增加肌肉尺寸、体积或强度而防止肌肉损失或再生损失或损害肌肉组织的情况。这样的情况包括，例如，化学疗法或放射疗法之后、肌肉损伤之后、或者影响肌肉的疾病或病症的治疗或操作中。在某些实施方式中，影响肌肉的疾病或病症可包括消耗病（如，恶病质，其可以与如癌症或AIDS的疾病相关）、肌肉衰减或萎缩、或肌肉退行性疾病。肌肉衰减或萎缩可与以下相关：如肌肉衰减症（包括增龄相关的肌肉衰减症）、ICU诱发性虚弱、肌肉废用（例如，由于昏迷、瘫痪、损伤、或固定引起的肌肉废用）、手术诱发性虚弱（如，髋或膝盖置换之后）、或肌肉退行性疾病（如，肌营养不良症）。该列举并未详尽。

在某些实施方式中，本发明的多肽和组合物可用于刺激肌肉卫星细胞的对称扩增，由此增加肌肉组织中常驻卫星细胞、或定向前体细胞的比例。多肽和组合物还可用于通过如增加个体肌肉纤维的尺寸促进肌肉肥大。因此，本发明的多肽和组合物可增加肌肉细胞的数量和肌肉细胞的尺寸，并由此可用于例如，替换受伤或缺陷组织、或防止肌肉萎缩或肌肉量损失，尤其是如肌营养不良、神经肌肉性疾病和神经退行性疾病，肌肉消耗病和病症、萎缩、心血管疾病、中风、心力衰竭、心肌梗赛、癌症、HIV感染、AIDS等影响肌肉的疾病和病症。

在其他实施方式中，组合物和方法用于，例如在患有肌肉退行性疾病的个体中修复或再生机能障碍骨骼肌。该个体可疑似患有或有风险患有骨骼肌损伤、退化或萎缩。骨骼肌损伤可以是疾病相关的或非疾病相关的。人类个体可患有或有风险患有肌肉退化或肌肉消耗。肌肉退化或肌肉消耗可整体或部分由疾病，例如AIDS、癌症、肌肉退行性疾病或以上的组合引起。

肌肉萎缩症的示例包括但不限于：杜兴氏肌营养不良（DMD）、贝克肌营养不良（BMD）、肌强直性营养不良（也称斯太纳特病）、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良(FSH)、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、末梢型肌营养不良和埃默里—德赖富斯肌营养不良。详见如Hoffman et al.,N.Engl.J.Med.,318.1363-1368(1988);Bonnemann,C.G.et al.,Curr.Opin.Ped.,8:569-582(1996);Worton,R.,Science,270:755-756(1995);Funakoshi,M.et al.,Neuromuscul.Discord.,9(2):108-114(1999);Lim,L.E.and Campbell,K.P.,Cure.Opin.Neurol.,11(5):443-452(1998);Voit,T.,Brain Dev.,20(2):65-74(1998);Brown,R.H.,Annu.Rev.Med.,48:457-466(1997);Fisher,J.and Upadhyaya,M.,Neuromuscul.Disord.,7(1):55-62(1997)。

在某些实施方式中，在此提供本文所述的组合物在制备用于促进有需要的个体中肌肉形成、维持、修复或肌肉再生的药物中的用途。在具体实施方式中，提供制备用于促进有需要的个体中肌肉形成、维持、修复或肌肉再生的药物的本文所述的组合物。Wnt多肽可用于通过如增加肌纤维的尺寸或数量来预防或治疗肌肉萎缩。

可以以有有效量如治疗有效量给予组合物。对于人和非人类个体的体内治疗，个体通常被给予包含有效量的一种或多中本发明的修饰的Wnt多肽的组合物。“有效量”是指在给药并持续必要的时间时有效实现预期的治疗或预防结果的量。

本发明的Wnt多肽、或包含本发明Wnt多肽的组合物的“治疗有效量”可根据如下因素而不同：如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及Wnt多肽在个体中引起期望应答的能力。治疗有效量还是这样的情况，即治疗有益效果超过Wnt多肽的任何有毒或有害效果。术语“治疗有效量”是指有效“治疗”哺乳动物（如，患者）的疾病或病症的Wnt多肽或包含Wnt多肽的组合物的量。

“预防有效量”是指在给药并持续必要的时间时有效实现预期的预防结果的量。由于预防剂量在发病之前或疾病的早期阶段在个体中使用，因此预防有效量通常少于治疗有效量，但并非必然如此。

在多种实施方式中，本发明提供增加如卫星干细胞的成人干细胞对称***(与未处理的干细胞群相比)的方法。本文公开的方法能够进一步促进对称干细胞***，而不改变干细胞***的速率，并可以促进干细胞群的存活。该方法可在体外、离体或体内实施。

在具体实施方式中，包含一种或多种修饰的Wnt多肽和/或多聚核苷酸的组合物在有需要的个体体内给药。如本文所用，术语“个体”包括但不限于：哺乳动物，包括如人、非人灵长类（如，狒狒、猩猩、猴子）、小鼠、猪、牛、山羊、狗、猫、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴子、绵羊、或其他非人哺乳动物；非哺乳动物，包括如非哺乳类脊椎动物，例如鸟（如，鸡或鸭）或鱼；以及非哺乳无脊椎动物。在优选实施方式中，个体是人。需要治疗疾病或病症的个体包括表现出该疾病或病症的症状的个体，如患有疾病或病症的个体，以及具有患有疾病或病症风险的个体。

在具体实施方式中，体内、离体或体外扩增卫星干细胞群的方法包括：将干细胞与有效量的包含修饰的非经典Wnt多肽或编码该修饰的非经典Wnt多肽的多聚核苷酸的组合物接触。在具体实施方式中，非经典Wnt选自：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。在优选实施方式中，Wnt多肽是能结合Wnt受体并激活Wnt受体的Wnt5a或Wnt7a多肽或其活性片段或变体、或其旁系同源物、直系同源物或同源物。

不结合任何特定理论，认为增加组织内卫星细胞的数量提供了增强的组织再生潜力。

在具体实施方式中，分离或维持干细胞，并离体或体外扩增，并随后给予有需要的个体。例如，干细胞可被离体或体外培养并扩增，并与有效量的本发明的Wnt多肽接触，然后根据技术人员已知的方法作为治疗干细胞组合物给予患者。在某些实施方式中，扩增的干细胞群与治疗Wnt组合物结合给予患者。

促进干细胞扩增的方法可用于刺激干细胞的离体或体外扩增，并从而提供适于向有需要的个体移植或给药的细胞群。

在一些控尿形式中，功能障碍肌肉可用本发明的组合物或方法通过如将蛋白直接注射入肌肉治疗。因此，在一个实施方式中，该方法用于治疗尿失禁。

在进一步的实施方式中，受损的或功能障碍的肌肉组织可以是心肌。例如，受损肌肉组织可以是通过如心肌梗塞、或心力衰竭的心血管事件受损的心肌，其中靶干细胞是心脏干细胞。依照本发明的另一方面，提供了促进哺乳动物中心脏干细胞扩增或心肌肥大的方法，包括给予哺乳动物有效量的本文所述的组合物。

进一步地，除了在移植中使用干细胞，干细胞或包含干细胞的组合物可用作研究工具和/或诊断试验或试剂盒的一部分。不希望受到限制，试剂盒可包含肌肉干细胞、一种或多种修饰的Wnt多肽、细胞培养或生长培养基、细胞低温贮藏培养基、一种或多种药学可接受的递送介质、一种或多种修饰的Wnt多聚核苷酸序列或基因构建体、一种或多种向需要的个体移植或递送细胞的装置、使用、递送、移植、培养、低温贮藏或本文所述的细胞或以上的任何组合的说明书。

细胞扩增和/或肌肉肥大的指示物可定性地或定量地监测，并包括如总体形态学、总细胞数量、组织学、组织化学或免疫组织化学的改变、或特定细胞标记物的存在、不存在或相对水平。细胞标记物的存在、不存在或相对水平可通过如组织化学技术、免疫学技术、电泳、Western印迹分析、FACS分析、流式细胞术等分析。可选择地，编码细胞标记蛋白的基因表达的mRNA的存在可利用如PCR技术、Northern印迹分析、使用合适的寡聚核苷酸探针等方法探测。

所用出版物、专利申请、和本说明书中引用的授权专利在此通过引用并入本文，同明确并分别指出将每一篇单独的出版物、专利申请或授权专利通过引用并入一样。

尽管为清楚理解的目的，上述发明已通过阐释和举例的方式进行详细描述，在本发明的教导下，本领域普通技术人员可显而易见地对其作出某些改变和修改而不脱离随附权利要求书的精神或范围。下面的实施例仅通过阐释的方式，而非限制的方式提供。本领域的技术人员容易地认识到可改变或修改的多种非关键的参数并得到基本类似的结果。

实施例

实施例1

Wnt多肽具有翻译后修饰的保守位点

Wnt蛋白是参与细胞存活、增殖、***和迁移的分泌型信号转导蛋白。Wnt是胚胎形成和成体组织再生过程中有效的组织模式形成所必需的。某些Wnt蛋白通过刺激卫星干细胞对称扩增和肌肉纤维肥大而驱动骨骼肌再生。

以鉴别出19种人Wnt，并根据不连续的同源区分类。Wnt蛋白具有包括糖基化和脂化的复杂的翻译后修饰。蛋白糖基化是有效蛋白折叠和分泌所必需的。图1是所有19种人Wnt多肽的比对。糖基化或脂化修饰的氨基酸残基具有较好的保守性（参见阴影残基）。进一步地，这些相同残基在种间是保守的，这可从图2和图11中Wnt7a多肽的比对中看出。以往脂化被认为是通过固定成熟分泌蛋白至质膜、有效定位Wnt至其佛力子受体的有效活性所必需的。为此，Wnt被认为是自分泌或局部旁分泌信号转导分子而不是完全的***生长因子/细胞因子。

如本文他处所述，蛋白质脂化不是所有Wnt多肽活性必需的。选择突变野生型Wnt(wtWnt)序列(Wnt7a，SEQ ID NO:2)中脂化的半胱氨酸或丝氨酸残基，用非脂化的丙氨酸残基替换。在Wnt7a的具体实例中，第73位的半胱氨酸残基和/或第206位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基。这导致包含SEQ ID No:3-5中列出的序列的蛋白，其缺乏在突变残基处的翻译后脂化。

实施例2

非经典WNT诱导成肌细胞肥大

Wnt多肽通过佛力子受体和共受体信号转导以刺激数条细胞内通路。Wnt通常被分为“经典”或“非经典”信号转导分子，其中经典信号转导导致蛋白β-连环蛋白的核定位和随后的靶基因表达。非经典信号转导一般包括Wnt的细胞功能，并不直接涉及β-连环蛋白的核定位，如平面细胞极性（PCP）或钙/PLC/PKC通路的激活。经典和非经典通路激活的受体和共受体是不同的；经典信号转导通路显示对共受体LRP的依赖性。Wnt7a是非经典信号转导分子并已显示通过PCP通路的激活驱动肌肉卫星干细胞的对称扩增(Le Grand et al.,Wnt7a activates the planar cell polaritypathway to drive the symmetric expansion of satellite stem cells.Cell StemCell 4,535-547,2009)。最近，Wnt7a显示出可能通过PI3-激酶/mTOR通路的G蛋白依赖型激活驱动培养的成肌细胞肥大(Julia von Maltzahn,C.Florian Bentzinger and Michael A.Rudnicki,Nature Cell Biology,Dec.11,2011;epub)。

测试了数种Wnt多肽诱导成肌细胞肥大的能力。最初测试的Wnt多肽从R&D***中获得并代表经典（Wnt3a）和非经典（Wnt5a和Wnt7a）信号转导多肽。如图3所示，尽管缓冲液对照或经典Wnt多肽Wnt3a不具有成肌细胞肥大效果，但两个非经典Wnt多肽（Wnt5a和Wnt7a）在体外产生明显的成肌细胞肥大效果。

方法

C2C12小鼠成肌细胞从ATCC(#CRL-1772)获得，并生长在补充10％50FBS的DMEM(MediaTech#10-017-CV)的明胶包被的组织培养板上。整个实验中细胞保持少于20%的汇合度。96孔组织培养板在室温下（RT）用0.1%明胶包被至少15分钟，并且2000个细胞（在0.2mL生长培养基中）接种在96-孔板的各孔中。随后将平板在37℃孵育24小时。第二天，抽出培养基，并用0.2mL具有补充2％马血清（Fisher，Hyclone SH30074）的DMEM(MediaTech#10-017-CV)的分化培养基取代。分化3天之后，将Wnt多肽(rhWnt7a#3008-WN/CF、rhWnt3a#5036-WN/CF或rhWnt5a#645-WN/CF(来自R&D***)加入细胞培养物中并再培养2天。

对细胞进行固定、洗涤、透化、并用肌球蛋白慢和快肌球蛋白抗体染色（Sigma＃M4276-.2ML、Sigma＃M8421-.2ML）。观察细胞；肌纤维直径以每次实验100根纤维计算；并且收集3个独立生物重复的数据，每个处理组总共300个数据点。图3中显示每个生物重复组的中位数纤维直径。每组三个生物重复的中位数的平均值对单独的培养基为17.5μm、18.8μm（Wnt3a）、27μm（Wnt7a）、24.6μm（Wnt5a）、和25.8μm（胰岛素生长因子（IGF））。与培养基对照或Wnt3a处理相比，用Wnt7a、Wnt5a和IGF处理的细胞肥大的增加是统计上显著的。

实施例3

修饰的WNT7A多肽的构建和表达

非经典Wnt诱导肌肉卫星干细胞扩增和肌肉肥大。两个过程的诱导在治疗上对恶病质、肌肉萎缩、和肌营养不良的治疗大有益处。Wnt作为治疗剂的应用要求有效的规模生产和提纯以及适用于治疗用途并保持特异的Wnt活性和受体特异性的配方。Wnt多肽的翻译后脂化是这些生产要求的潜在难题。Wnt一般被认为为了有效活性需要脂化，脂化的蛋白在高浓度下纯化是困难的，并且为了溶解性和稳定性需要使用去垢剂配方。

为了解决这些挑战，构建了几种Wnt7a的变体。具体而言，靶向翻译后脂化的氨基酸残基(Wnt7a中的Cys73和Ser206)利用下述分子生物学技术突变为丙氨酸残基。野生型人Wnt7a通过正向引物5’-GCATGGATCCACCATGAACCGGAAAGCGCGG-3’(SEQ ID NO:41)和反向引物5’-GCATGCGGCCGCTCACTTGCACGTGTACATCTCC-3’(SEQ ID NO:42)进行PCR扩增。将PCR产物***pcDNA3.1(+)载体的BamHI和Not I位点间。修饰的Wnt7a构建体使用QuikChange

位点定向诱变法制备。人Wnt7a C73A构建体（氨基酸73的半胱氨酸用丙氨酸取代）以人野生型Wnt7a为模板，用正向引物5’-ATGGGCCTGGACGAGGCCCAGTTTCAGTTCCGC-3’(SEQ ID NO:43)和反向引物5’-GCGGAACTGAAACTGGGCCTCGTCCAGGCCCAT-3’(SEQ ID NO:44)制备。人Wnt7a S206A构建体（氨基酸206的丝氨酸用丙氨酸取代）以人野生型Wnt7a为模板，用正向引物5’-GTGCCACGGCGTGGCAGGCTCGTGCACC-3’(SEQ ID NO:45)和反向引物5’-GGTGCACGAGCCTGCCACGCCGTGGCAC-3’(SEQ ID NO:46)制备。人Wnt7a C73A/S206A构建体使用单独C73A和S206A构建体的试剂制备。最终的载体DNA用Qiagen Endo-free纯化试剂盒制备。pcDNA3载体中的Wnt cDNA在HEK293细胞中表达48-72小时。随后从HEK293培养基中使用对产生的Wnt7a的所有变体特异的抗体(抗体:Santa Cruz K15#26361)通过亲和层析纯化Wnt多肽。纯化的修饰的Wnt多肽的活性用随后的实施例中所述的体外肥大试验测试。构建的所有Wnt7a构建体的示意图在图4中显示。(还参见SEQ ID NOs:1、2、3、4、5、12和13)。

实施例4

异源信号肽促进WNT分泌和产生

为了提高显示出分泌不良(大部分表达蛋白残留在细胞内)的Wnt蛋白从哺乳动物HEK293细胞培养物中的产生、分泌、和溶解性，构建了Wnt融合多肽，其中内源性Wnt分泌信号肽由人免疫球蛋白Gκ链（IgGK）的信号肽或人CD33蛋白的信号肽取代。包含异源信号肽的Wnt7a融合蛋白的示意图如图4中显示（还参见SEQ ID NO:12和13）。

如图5中所示，比较在HEK293培养物中的表达和分泌时，具有异源信号肽的Wnt融合蛋白表现得显著地优于包含天然信号肽的Wnt多肽。

实施例5

修饰的WNT多肽可在不存在去垢剂下配制并保持稳定性和活性

Wnt蛋白的产生和配制传统上依赖于在去垢剂中配制，以保持这些脂化蛋白的溶解性。Wnt多肽的有效治疗递送要求在不存在去垢剂的的情况下配制。不具有脂化位点的Wnt多肽如实施例3中记载的方法构建、在哺乳动物培养***中表达、从培养基中纯化、并在1%CHAPS去垢剂中配制。配置基于HPLC的测定以有效测定Wnt多肽制剂中的CHAPS去垢剂。

如图6a中所示，溶液中CHAPS去垢剂的滴定允许测定的有效校准。测试纯Wnt多肽的多种制剂，并且最终制剂显示为PBS中～1%CHAPS溶液（图6b）。随后Wnt多肽溶液针对单独的PBS的透析将去垢剂有效去除至检测水平以下（图6c）。然后，透析后的多肽在存在或不存在CHAPS去垢剂的情况下测试稳定性和活性。

蛋白制剂在4℃或37℃孵育超过7天显示，具有天然脂化位点的Wnt在去垢剂中配制时相对稳定，但在不存在去垢剂的情况下配制时不稳定。相反地，与天然、脂化的蛋白相比，在不存在去垢剂的情况下，移除脂化位点并用丙氨酸取代(C73A,S206A)的修饰的Wnt显示出提高的稳定性。

然后将用或不用去垢剂配制的Wnt变体如实施例2中描述的在C2C12肥大测定中测试活性。Wnt多肽在HEK293哺乳动物培养***中产生并亲和纯化。Wnt多肽在具有1% CHAPS去垢剂的PBS中配制。每种Wnt多肽变体的等分试样通过渗析去除去垢剂而重新配制。Wnt蛋白具有等摩尔浓度并应用于C2C12肥大测定。

与阳性对照、天然Wnt序列相比，使用异源信号肽在HEK293培养***中产生的Wnt多肽保持其活性（图7）。进一步地，Wnt7a C73A和S206A突变体保持特异的肥大活性（图7）。在去垢剂中配制时，所有修饰的Wnt保持活性。

在不存在去垢剂下重新配制Wnt时，只有包含丙氨酸取代脂化位点的修饰的Wnt保持活性，而天然Wnt失去了成肌细胞肥大活性（图7）。因此，在保守脂化位点特定地改变的Wnt保持生物活性。在不存在去垢剂下配制时，修饰的Wnt仍保持活性。由此，本发明的修饰的Wnt多肽代表天然蛋白的有用治疗版本。

实施例6

修饰的WNT7A增加肌肉肥大和卫星干细胞扩增

为了证实去脂化的Wnt(如去除一个或多个脂化位点的Wnt)在体内刺激肌肉再生的能力，修饰的Wnt7a通过将CMV-Wnt7a表达质粒电穿孔进入3月龄小鼠的TA肌肉来过表达。

1.体内电穿孔

编码LacZ、野生型Wnt7a、Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7aC73A/S206A的质粒构建体在体内电穿孔进入小鼠。将40μg在0.9%NaCl中的各质粒DNA或0.9%NaCl(生理盐水)直接注射入左TA肌肉内，该TA肌肉已通过麻醉小鼠皮肤的切口暴露。紧随注射之后，使用5毫米的针形电极（BTX），以固定20ms的持续时间和200ms的间隔，通过100-150伏的脉冲发生器(ECM830,BTX)脉冲6次，直接向TA施加电刺激，。分离实验和对侧的TA肌肉，嵌入OCT-15%蔗糖（Tissue-Tek）中，并用冷氮冷却的异戊烷冷冻。

2.组织学和定量

实验和对侧肌肉的横切切片(8μm)用低温恒温器(Leica CM1850)切割。为了在连续切片（从每块TA肌肉获得约400个切片）的相同水平处对实验肌肉和对侧肌肉进行比较，对整个TA肌肉进行切片。对于LacZ反应，冰冻切片用0.1％戊二醛固定，并暴露于X-gal溶液。对于H&E和免疫染色，切片用4%多聚甲醛固定。对于纤维计数，组合层粘连蛋白染色的冰冻切片图片，并在Adobe Photoshop CS2上计数。肌纤维口径的量化用ImageJ实现。在Photoshop上，在所有纤维都具有位于中心的细胞核的再生区中采集的Pax7和层粘连蛋白共免疫染色的冰冻切片上进行卫星细胞计数。“Pax-7+细胞百分数”代表相对于每一纤维数和对侧腿标准化的亚层Pax7+ve卫星细胞的数量。

3.统计分析

对所提供的实验进行最低2个重复和高达5个重复。数据表示为平均值的标准误差。结果使用学生T检验(Microsoft Excel)进行统计显著性评估，并且P<0.05水平时认为差异是统计学显著的。

4.结果

与LaxZ对照质粒相比，WT Wnt7a、Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A构建体的电穿孔在小鼠TM肌肉的平均纤维直径上产生统计学显著的增加。而且，Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7aC73A/S206A构建体保持野生型Wnt构建体的Wnt生物活性，因为Wnt7aC73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A构建体产生的TA肌肉的平均纤维直径的增加与野生型Wnt构建体产生的TA肌肉的平均纤维直径的增加相当。这些结果显示在图1中。

值得注意的是，图2表明，用Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A构建体电穿孔的TA肌肉还表现出与用野生型Wnt构建体电穿孔的TA肌肉相当的TA肌肉量的增加。

为了评估Wnt7A C73A、Wnt7A S206A和Wnt7A C73A/S206A是否相似地刺激体内卫星干细胞的扩增，在用修饰的Wnt7a表达质粒电穿孔之后，评估再生肌肉中卫星细胞和卫星干细胞的数量。在电穿孔后3个星期时的切片上，Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A的过表达导致每根肌纤维Pax7+卫星细胞数量的统计学显著增加(Wnt7aC73A,p=0.001,n=4;Wnt7a S206A,p=0.01,n=2;Wnt7a C73A/S206A,p=0.05,n=2)。由Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A的过表达诱导的Pax7卫星细胞数量的增加与野生型Wnt7a诱导的增加相当。这些结果显示在图3中。

总的来说，图1-3中显示的这些结果表明，Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A的过表达明显增强了肌肉再生，如存在以下情况所证明的：较大纤维数量的增加和肌肉量的增加以及进一步的体内卫星干细胞数量的增加。此外，这些结果表明，Wnt7a C73A、Wnt7a S206A和Wnt7a C73A/S206A产生的效果与野生型Wnt7a产生的效果是相当的。

一般而言，在下述权利要求中，使用的术语不应解释为将权利要求限制至本说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应解释为包括所有可能的实施方案连同这类权利要求所给予的等同物的所有范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

实施例7

WNT蛋白可表达为免疫球蛋白FU融合体

免疫球蛋白融合蛋白和/或多肽已用于改善Wnt多肽的药物学性能，如其体内循环半衰期。如图4中示意性表示的，本发明的Wnt蛋白与氨基端或羧基端的Fc融合域在哺乳动物表达载体（pcDNA3+）中构建。将天然人Wnt7a或具有C73A和/或S206A突变的人Wnt7a的氨基酸残基31-349与作为N-或C-端融合体的IgGκ分泌信号肽和人IgG1e3-Fc1结构域符合读框地亚克隆。该Fc结构域包含与天然IgG1序列不同的氨基酸改变(E233P/L234V/L235A/ΔG236+A327G/A330S/P331S)，以降低抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）的影响。17个氨基酸的接头（GT（GGGGS）3）加入Wnt蛋白序列和Fc融合序列之间，以降低空间位阻并防止Wnt特异活性的降低。将这些载体转染入HEK293细胞并且蛋白表达持续48小时。蛋白表达和分泌通过Western印迹监测，并可参见图11a和11b。当用抗Wnt7a抗体或抗Fc检测免疫检测时，见到预期分子量的完整融合蛋白。观察融合蛋白的有效分泌。分泌的蛋白随后通过蛋白A或蛋白G亲和层析纯化。

Claims (59)

1.修饰的Wnt多肽，其包含降低所述Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸。

2.Wnt多肽，其包含降低所述Wnt多肽脂化的一个或多个氨基酸缺失、***或取代。

3.如权利要求1或权利要求2所述的Wnt多肽，其中所述Wnt多肽激活非经典Wnt信号转导通路。

4.如权利要求3所述的Wnt多肽，其中所述Wnt多肽选自：Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b和Wnt11。

5.如权利要求3所述的Wnt多肽，其中Wnt多肽是Wnt7a或Wnt5a多肽

6.修饰的Wnt7a多肽，其相对于对应SEQ ID NOs：2和6-11中任一个Wnt7a多肽的脂化具有降低的脂化。

7.如权利要求6所述的修饰的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：2和6-11中任一个的第73位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

8.如权利要求6所述的修饰的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：2和6-11中任一个的第206位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

9.如权利要求6所述的修饰的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：2和6-11中任一个的第73位和第206位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

10.如权利要求6所述的修饰的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：2和6-11中任一个的第73位或第206位的氨基酸位置处包含丙氨酸。

11.如权利要求6所述的修饰的Wnt7a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：2和6-11中任一个的第73位和第206位的氨基酸位置处包含丙氨酸。

12.修饰的Wnt5a多肽，其相对于对应SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的Wnt5a多肽的脂化具有降低的脂化。

13.如权利要求12所述的修饰的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的第104位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

14.如权利要求12所述的修饰的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的第244位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

15.如权利要求12所述的修饰的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的第104位和第244位的氨基酸位置处包含氨基酸的缺失、***或取代。

16.如权利要求12所述的修饰的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的第104位或第244位的氨基酸位置处包含丙氨酸。

17.如权利要求12所述的修饰的Wnt5a多肽，其中所述多肽在相应于SEQ ID NOs：15和19-23中任一个的第104位和第244位的氨基酸位置处包含丙氨酸。

18.Wnt多肽，其包含SEQ ID NOs：3-5、12-13和16-18中任一个所示的氨基酸序列。

19.融合多肽，其包含权利要求18所述的Wnt多肽。

20.如权利要求19所述的融合多肽，其包含天然信号肽、异源信号肽、或天然和异源信号肽的杂合体。

21.如权利要求20所述的融合多肽，其中所述异源信号肽选自：CD33信号肽、免疫球蛋白信号肽、生长激素信号肽、红细胞生成素信号肽、白蛋白信号肽、分泌型碱性磷酸酶信号肽和病毒性信号肽。

22.如权利要求20所述的融合多肽，其中所述异源信号肽为CD33信号肽、IgGκ信号肽或IgGμ信号肽。

23.如权利要求19-22中任一项所述的融合多肽，其包含异源蛋白酶切割位点。

24.如权利要求23所述的融合多肽，其中所述异源蛋白酶切割位点选自：烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点、肝素切割位点、凝血酶切割位点、肠激酶切割位点和因子Xa切割位点。

25.如权利要求19-24中任一项所述的融合多肽，其包含选自以下的表位标签：HIS6表位、MYC表位、FLAG表位、V5表位、VSV-G表位和HA表位。

26.如权利要求19-24中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQ ID NOs:3-5和12-13中任一个所示的氨基酸序列，相较于SEQ ID NOs:2和6-11中所示的对应的天然Wnt多肽，其具有增加的产量、分泌或溶解性。

27.如权利要求19-24中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含SEQ ID NOs:16-18中任一个所示的氨基酸序列，相较于SEQID NOs:15和19-23中所示的对应的天然Wnt多肽，其具有增加的产量、分泌或溶解性。

28.编码权利要求1-27中任一项所述的多肽的多聚核苷酸。

29.包含权利要求28所述的多聚核苷酸的载体。

30.包含权利要求29所述的载体的宿主细胞。

31.权利要求30所述的宿主细胞产生的多肽。

32.组合物，其包含权利要求1-27中任一项所述的多肽；编码权利要求1-27中任一项所述的多肽的多聚核苷酸；或包含编码权利要求1-27中任一项所述的多肽的多聚核苷酸的载体。

33.如权利要求32所述的组合物，其包含药学可接受的盐、载体或赋形剂。

34.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物在水溶液中可溶。

35.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物配制为用于注射。

36.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物无需去垢剂配制。

37.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物配制为用于静脉注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射或肌肉内直接注射中的一种或多种。

38.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物促进组织形成、再生、维持或修复。

39.如权利要求38所述的组合物，其中所述组织为肌肉。

40.如权利要求38所述的组合物，其中所述肌肉为骨骼肌、心肌或平滑肌。

41.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物促进干细胞扩增。

42.如权利要求41所述的组合物，其中所述干细胞是成体干细胞。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述成体干细胞是卫星干细胞。

44.如权利要求32所述的组合物，其中所述组合物促进肌肉肥大或预防萎缩。

45.治疗或预防肌肉损失的方法，其包括给予个体权利要求32所述的组合物。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述组合物包含药学可接受的盐、载体、或赋形剂。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述组合物在水溶液中可溶。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述组合物不在去垢剂中配制。

49.如权利要求45所述的方法，其中所述组合物配制为用于注射。

50.如权利要求45所述的方法，其中所述组合物配制为用于静脉注射、心内注射、皮下注射、腹腔内注射或肌肉内直接注射中的一种或多种。

51.如权利要求45所述的方法，其中所述个体患有或有风险患有影响肌肉的疾病或病症。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述疾病是退行性疾病。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述退行性疾病是肌营养不良。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述肌营养不良选自：杜兴氏肌营养不良（DMD）、贝克肌营养不良（BMD）、埃默里—德赖富斯肌营养不良、兰迪二氏肌营养不良、面肩肱型肌营养不良(FSH)、肢带型肌营养不良、von Graefe-Fuchs型肌营养不良、眼咽型肌营养不良(OPMD)、肌强直性营养不良（斯太纳特病）和先天性肌营养不良。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述影响肌肉的疾病或病症是消耗病、肌肉衰减、肌肉萎缩、ICU诱发性虚弱、持续废用、手术诱发性虚弱或肌肉退行性疾病。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述病症为与肌肉废用、固定、手术诱发性虚弱或损伤相关的肌肉萎缩。

57.如权利要求45所述的方法，其中给予所述组合物促进肌肉肥大。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。

59.如权利要求45所述的方法，其中给予所述组合物促进卫星细胞扩增。

Images