CN100400547C - ***特异膜抗原的人类单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

分离的与PSMA特异结合的人单克隆抗体及抗原结合部分被公开，包括抗体和抗体部分的双特异性分子也被公开。人类抗体能够由非人转基团动物产生，如转基团小鼠，它能够通过V-D-J重组和同种型转变而产生人类单克隆抗体的各种同种型。另外，还公开了药物组合物，它包括人类抗体，产生人类抗体的非人转基因动物，杂交瘤和利用人类抗体的治疗和诊断方法。

Description

***特异膜抗原的人类单克隆抗体

发明背景

***癌是一种男性中非常普遍的癌，也是一种主要的致死性疾病。***癌的主要治疗方法包括手术、激素、放疗和化疗，对于已转移的***癌，几乎没有有效的治疗手段，因此必需鉴定某基因和/或基因产物，使它们能够作为诊断和预后的准确标志，以及治疗的靶点。***特异的抗原(PSA)就是这类癌标志物，它们能够用于临床诊断和判定***癌的时期。然而，PSA不能在4-10ng/ml范围内区分良性***肥大(BPH)和***癌，因此必需细胞学和/或组织学的检测来验证诊断的正确性(9)。

***特异的膜抗原(PSMA)含有750个氨基酸，是类型II的跨膜糖蛋白，约110kD，与运铁蛋白受体有54％的同源性。PSM′是PSMA的另外一种剪切形式，它位于细胞质中。PSMA具有3个结构域，包括含有19个氨基酸的细胞内结构域，含有24个氨基酸的跨膜结构域和含有707个氨基酸的细胞外结构域。PSMA显示出神经羧肽酶和叶酸水解酶活性，因而它可能参与***生长和分化的神经内分泌调控(7)。

研究PSMA表达状况表明：它是一种新的标志物，主要由***上皮细胞表达。而且，在***癌，尤其是低分化转移和激素耐受的癌中，PSMA表达增加(8，11)，所以，PSMA是有价值的***癌诊断、预后和治疗靶点。PSMA的低水平表达在非***组织中也有发现，如小肠、唾液腺、十二指肠粘膜、肾小管近侧区和大脑(11)。

PSMA在大脑中参与神经递质NAAG向HAA和游离谷氨酸的转变，这可能是神经紊乱的重要致病原因，如多发性硬化，肌萎缩性外侧硬化，Alzheimer氏疾病和精神***症(12)。在某些恶性肿瘤的周围和内部区域的毛细血管内皮细胞中也发现有PSMA的表达，这类肿瘤包括肾细胞癌和结肠癌，但在正常组织的血管中却未发现PSMA表达。这表明PSMA的表达也可能与肿瘤的血管产生有关(11)。

发明概述

该发明提供分离的人类单克隆抗体，此抗体特异性与***特异的膜抗原(PSMA)相结合，同时也提供包括一种抗体或几种此类抗体组合的组合物。在一项实施方案中，此人类抗体的特征在于以高亲和力与PSMA相结合，以及，在人类效应细胞(如，多形核细胞，单核细胞，巨噬细胞和树突状细胞)存在下(体内或体外)，抑制表达PSMA的细胞的生长和/或介导杀伤此类细胞(如，裂解或吞噬作用)。据此，发明中的人类单克隆抗体能够用作体内和体外的诊断和治疗试剂。

发明中所分离的人类抗体包括不同的抗体同种型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。尤其是它们包括IgG1(如IgG1k)和IgM同种型。这些抗体有的是全长(如IgG1或IgG4抗体)，有的只包括抗原结合部分(如，Fab，F(ab′)₂，Fv或单链Fv片段)。在一项实施方案中，人类抗体是重组人类抗体。在另一项实施方案中，人类抗体由一杂交瘤产生，该杂交瘤由B细胞和一永生化细胞融合而得，其中B细胞来自转基因非人动物，如转基因小鼠，它具有含有人类重链和轻链转基因的基因组。在特定的实施方案中，抗体由杂交瘤产生，这些杂交瘤被命名为4A3，7F12，8A11，16F9和8C12。

在另一项实施方案中，该发明的人类抗PSMA抗体具有以下特征中的一项或多项：

a)对PSMA的特异性；

b)与PSMA的结合亲和力，其亲和力常数至少约10⁷M^-1，优选约10⁹M^-1，更优选约10¹⁰M^-1到10¹¹M^-1或更高；

c)与PSMA缔合常数(K_assoc)至少约10³，更优选约10⁴，最优选约10⁵M^-1S^-1；

d)从PSMA上解离的解离常数(K_dis)约10^-3s^-1，优选约10^-4s^-1，更优选约10^-5s^-1，最优选10^-6s^-1；

e)能够调理表达PSMA的细胞；或

f)在约10μg/ml或更少(如，体外条件下)的浓度时，在有人类效应细胞存在条件下，能够抑制表达PSMA的细胞(如肿瘤细胞)生长和/或介导吞噬和杀伤此类细胞。

能够被此发明中的人类抗体靶向的肿瘤细胞包括***癌、肾癌和结肠癌细胞，但并不仅局限于这些细胞。

在一项实施方案中，发明中所分离的人类抗体与PSMA抗原相结合，其亲和力常数至少约10⁷M^-1，优选约10⁸M^-1，更优选约10⁹M^-1，最优选约10¹⁰至10¹¹M^-1或更高，该抗体能够通过人类效应细胞体外抑制表达PSMA的细胞的生长和/或介导吞噬和杀伤这些细胞，人类效应细胞如多形核细胞(PMNs)，单核细胞和巨噬细胞，其IC₅₀约10^-7M或更少，或抗体浓度约10μg/ml或更低。

另一方面，该发明提供了核酸分子，它们编码抗体或抗原结合部分，相应地，发明还包括重组表达载体和转染了此类载体的宿主细胞以及通过培养宿主细胞而制备抗体的方法，其中，表达载体包括编码抗体的核酸分子。

再一方面，该发明提供了B细胞，它从转基因非人动物，如转基因小鼠中分离得到，能够表达与PSMA特异结合的人类单克隆抗体的多种同种型(如IgG，IgA和/或IgM)。优选地，这些B细胞来自转基因非人动物，如转基因小鼠，这类动物已被免疫了纯化的或富集的PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞。优选地，转基因非人动物，如转基因小鼠含有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。然后这类B细胞被永生化以作为产生PSMA的人类单克隆抗体的来源(如杂交瘤)。

相应地，该发明也提供一种杂交瘤，它能够产生与PSMA特异结合的人类单克隆抗体。在一项实施方案中，杂交瘤包括一种与永生化细胞相融合的B细胞，该B细胞来自转基因非人动物，如转基因小鼠，该动物具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。这类转基因非人动物被免疫了纯化的或富集的PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞，以制备产生抗体的杂交瘤。发明中的杂交瘤包括4A3，7F12，8A11，16F9和8C12。

再一方面，该发明提供转基因非人动物，如转基因小鼠(也被称为“HuMab”)，该动物表达与PSMA特异结合的人类单克隆抗体。在一项特定的实施方案中，转基因非人动物是一转基因小鼠，它具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。转基因非人动物被免疫了纯化的或富集的PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞，优选地，转基因非人动物，如转基因小鼠，能够产生特异于PSMA的人类单克隆抗体的多种同种型(如IgG，IgA和/或IgM)，这些同种型通过V-D-J重组和同种型转型转换而相互转变。同种型转换可以通过经典同种型转换成非经典同种型转换而进行。

另一方面，该发明提供产生与PSMA特异反应的人类单克隆抗体的方法。在一项实施方案中，该方法包括用纯化的或富集的PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞免疫转基因非人动物，如转基因小鼠，该动物具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。然后得到动物的B细胞(如脾脏B细胞)，并与骨髓瘤细胞相融合，以形成永生化杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞分泌特异于PSMA的人类单克隆抗体。

发明中所分离的抗PSMA人类单克隆抗体或其抗原结合部分能够被偶联到另一功能分子上，如另外的多肽或蛋白(如Fab′片段)。例如，发明中的一种抗体或抗原结合部分被功能性偶联(如化学偶联，基因融合，非共价结合或其它方法)到一个或多个其它分子上，如另外的抗体(如双特异性或多特异性抗体)。相应地，另一方面，该发明的特征在于双特异或多特异性分子，它至少包括对PSMA的第一结合特异性和Fc受体的第二结合特异性，如人类FcγRI或人类Fcα受体。

发明中的多特异性分子也包括三特异性，四特异性和其它多特异性分子。在一项实施方案中，多特异性分子包括抗增强因子(EF)部位，如与参与细胞毒性活性的表面蛋白相结合的分子。

在特定的实施方案中，发明中的双特异性和多特异性分子至少包括一种抗体或其片段(如Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fv或单链Fv)。在特定的实施方案中，该抗体或其片段是一完整的人类抗体或其部分，或是“嵌合”或“人源化”抗体或其部分(如具有一可变区或至少一互补决定区(CDR)，该区域一部分来自非人类抗体(如小鼠)，剩下部分来自人类)。

在一项实施方案中，双特异性或多特异性分子中的至少一种抗体或其片段与Fc受体相结合，如人类IgG受体，如Fc-γ受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。一优选Fcγ受体是高亲和性Fcγ受体，FcγRI。然而，其它Fc受体，如人类IgA受体(如FcαRI)也能被结合，Fc受体优选位于效应细胞表面，如单核细胞，巨噬细胞或活化的多形核细胞。在一优选实施方案中，双特异性或多特异性分子与Fc受体相结合，该结合位点不同于此受体的免疫球蛋白Fc(如IgG或IgA)结合位点，因此，双特异性或多特异性分子的结合不会被生理水平的免疫球蛋白封闭。

另一方面，该发明的特征是人类抗PSMA抗体或其片段与一治疗性部分相连接，如细胞毒性药物，酶活性毒素或其片段，放射性同位素，或小分子抗癌药物。

另一方面，该发明提供靶特异性效应细胞和双特异性或多特异性分子，其中效应细胞包括表达Fc受体的效应细胞，如巨噬细胞或活化的PMN细胞。

另一方面，该发明提供组合物，如药用或诊断组合物，它包括药理上可接受的载体和至少一种与PSMA特异结合的人类单克隆抗体或其抗原结合部分。在一项实施方案中，组合物包括多种人类抗体或其抗原结合部分的一种组合，优选地，不同抗体结合不同的抗原表位，例如，一种药用组合物包括一种人类单克隆抗体，在效应细胞存在下介导高效率杀伤靶细胞，它与另一种抑制表达PSMA的细胞的生长的人单克隆抗体组合。因此，这种组合提供了多种治疗途径以达到最好的治疗效益。组合物，如药用组合物，也在发明范围内，它包括至少发明中的一种人类单克隆抗体或其抗原结合部分和至少发明中的一种双特异性或多特异性分子。

再一方面，该发明提供一种利用本发明的抗体或其抗原结合部分(或双特异性或多特异性抗体)来抑制表达PSMA的细胞增殖和/或分化的方法，这是通过人类效应细胞抑制靶细胞生长和/或诱导吞噬和/或杀伤靶细胞而实现，人类效应细胞如人类多形核细胞(PMNs)，单核细胞和巨噬细胞。在一项实施方案中，该方法包括体外或体内在人类效应细胞存在条件下让表达PSMA的细胞与发明的一种单克隆抗体或多种单克隆抗体的组合，或其抗原结合部分相接触。该方法可在培养物中进行，如体外(如包含表达PSMA的细胞和效应细胞的培养物)。例如，包含表达PSMA的细胞和效应细胞的样品在体外培养，并且与发明的抗体或其抗原结合部分(或发明的双特异性或多特异性分子)相混合，或者，该方法在一受试者上进行，如作为体内过程(如治疗或预防)的一部分。

对于体内方法，抗体或其抗原结合部分(或发明的双特异性或多特异性分子)被给药到受试者体内，该受试者患PSMA相关性疾病，如***癌，肾癌或结肠癌，因此诱导了表达PSMA的细胞的生长抑制被吞噬和/或被杀伤。在一项实施方案中，受试者可以被一种试剂治疗，该试剂调节如增强或抑制Fc受体的表达或活性，如Fcα受体或Fcγ受体，例如，用一种细胞因子治疗受试者，在用双特异性或多特异性分子治疗过程中，注射的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

分离的人类单克隆抗体组合物也可以与其它已知的疗法结合使用，如抗癌疗法。

能够用该发明的方法，和组合物治疗(如改善)或预防的典型疾病包括致肿瘤性疾病，但也不仅仅局限于此，这些致瘤性疾病包括***癌，肾癌和结肠癌。

再一方面，该发明提供了一种体外或体内检测样品中PSMA抗原是否存在的方法，如诊断PSMA相关性疾病。在一项实施方案中，该方法由以下方式进行：在允许抗体和PSMA形成复合物的条件下，使待测样品和对照样品与发明的人类单克隆抗体或其抗原结合部分(或双特异性或多特异性分子)相接触，然后测定(如利用ELISA)两样品中所形成的复合物，如果两样品的复合物存在显著差异，就表示待测样品中存在PSMA抗原。

该发明的其它特征和优点见以下的详述和实施方案部分。

附图简述

图1是将neo DNA序列定向***到μ1外显子的SmaI位点的图解式图。A表示μ基因座的基因组结构，其中实框表示μ外显子。B是CmD靶向载体的图解式图。C表示已被定向的μ基因座，其中neo DNA序列已被***到μ1中。

图2是产生IgG₁K人类单克隆抗体(HuMabs)的图解说明，其中此抗体特异于PSMA，HER2/neu和CD90(FcαR)，它通过免疫转基因小鼠产生。

图3表示完整的人类双特异性分子14.1×8C12，它与CD89(FcαR)和PSMA相结合。该分子含有一个抗CD89的Fab′抗体片段(来自于人类抗CD89单克隆抗体，14.1)，该片段通过二硫键与抗PSMA的抗体Fab′片段(来自于人类抗PSMA单克隆抗体，8C12)化学交联。

图4显示人类抗PSMA单克隆抗体与膜组份的反应性，其中膜组份来自人类***的腺癌细胞LNCaP和PC3，该反应性通过ELISA测得，405nm背景吸收值是0.05。

图5显示由流式细胞分析所得的人类抗PSMA抗体与LNCaP和PC3肿瘤细胞之间的结合。绿色直方图表示与LNCaP细胞的结合；粉色直方图表示与PC3细胞的结合；紫色直方图表示不相关的人类IgG1的结合。A，抗体4A3；B，抗体7F12；C，抗体8A11；D，抗体8C12；E，抗体16F9。

图6是图3中所示的双特异性分子14.1×8C12与表达PSMA的LNCaP细胞的结合与双特异性分子浓度的关系图，其结合由平均荧光强度测定。

图7是图3所示的双特异性分子14.1×8C12与表达CD89的U937细胞的结合与双特异性分子浓度的关系图，其结合由平均荧光强度测定。

图8显示了利用人类抗PSMA特异抗体从LNCaP细胞的去污剂裂解物中免疫共沉淀PSMA。泳道1是LNCaP细胞裂解物；泳道2到7分别是利用不相关人类IgG1，4A3，7F12，8A11，8C12和16F9抗体的免疫共沉淀物。免疫复合物由SDS凝胶电泳和免疫印迹法分析，其中免疫印迹是利用小鼠抗PSMA抗体4D8。

图9显示分离的PSMA的热变性对人类抗PSMA抗体结合的影响。

图10显示人类抗PSMA抗体的竞争性结合分析，此分析由流式细胞仪测得。用下列抗体进行预处理：不相关的人类IgG1(紫色实直方图)；4A3(黄色直方图)；7F12(绿色直方图)；8A11(蓝色直方图)；8C12(粉色直方图)；16F9(橙色直方图)。A，FITC 4A3；B，FITC7F12；C，FITC 8A11；D，FITC 8C12。

图11显示人类抗PSMA抗体与小鼠抗PSMA的构象性抗体的竞争结合分析，此分析由流式细胞仪测得，用以下抗体进行预处理：不相关人类IgG1(紫色实直方图)；4A3(黄色直方图)；7F12(绿色直方图)；8A11(蓝色直方图)；8C12(粉色直方图)；16F9(橙色直方图)。A，FITC 1G9；B，FITC 3C6；C，FITC 4D4。

图12，A图是单核细胞介导的对表达PSMA的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)与双特异性分子浓度的关系图，其中此毒性是在图3所示的双特异性分子14.1×8C12作用下。结果是在不加抑制剂，50μg/ml游离抗FcRαR(14.1)F(ab′)₂和50μg/ml游离的抗FcγRI(H22)F(ab′)₂条件下，细胞特异性裂解的百分比。B图是显示在双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12作用下，单核细胞介导的对LNCaP细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中效应细胞∶靶细胞为100∶1.C图显示双特异性分子14A8×8C12在无抑制剂，过量14A8F(ab′)₂或H22F(ab′)₂条件下，对单核细胞介导的对LNCaP细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的作用，其中效应细胞∶靶细胞为100∶1.

图13，A图是嗜中性白细胞介导的对表达PSMA的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)与双特异性分子浓度的关系图，其中此毒性是在图3所示的双特异性分子14.1×8C12作用下。结果是在无抑制剂，25μg/ml游离抗FcRαR(14.1)F(ab′)₂和25μg/ml游离抗FcγRI(H22)F(ab′)₂条件下，细胞特异性裂解的百分比。B图显示双特异性分子14A8×8C12在无抑制剂，过量14A8F(ab′)₂或H22F(ab′)₂条件下，对嗜中性白细胞介导的对LNCaP细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的作用，其中效应细胞∶靶细胞为200∶1。

图14，A图是全血介导的对表达PSMA的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)与双特异性分子浓度的关系图，其中此毒性是在图3所示的双特异性分子14.1×8C12作用下。结果是在无抑制剂，25μg/ml游离抗FcRαR(14.1)F(ab′)₂和25μg/ml游离抗FcγRI(H22)F(ab′)₂条件下，细胞特异性裂解的百分比。图B显示双特异性分子14A8×8C12在无抑制剂、过量14A8F(ab′)₂或H22F(ab′)₂条件下，对全血介导的对LNCaP细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的作用。

图15显示单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)(圆圈)在双特异性分子(14.1×8C12)介导下，对表达PSMA的细胞(LnCAP)的吞噬作用。结果是在抑制剂14.1抗体(方块)的存在和不存在及对照抗体H22(菱形)的存在和不存在条件下的吞噬百分比。

图16显示单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)在双特异性分子(14A8×8C12)介导和抗体(8C12)介导下对LnCAP肿瘤细胞的吞噬作用。

图17显示单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)(圆圈)在双特异性分子(14A8×8C12)介导下，对LnCAP肿瘤细胞的吞噬作用。***图显示在过量14A8F(ab′)₂或H22F(ab′)₂存在下，双特异性分子14A8×8C12(1μg/ml)所介导的吞噬作用。

发明详述

该发明提供了基于抗体基础上的治疗和诊断一类疾病的新方法，这类疾病的特征是表达，尤其是过量表达***特异的膜抗原(在这里表示为“PSMA”)和/或相关分子。该发明的治疗方法应用分离的人类单克隆抗体或其抗原结合部分，它们与PSMA上的抗原表位相结合，在一项实施方案中，人类单克隆抗体由非人转基因动物，如转基因小鼠，产生，这类动物能够通过V-D-J重组和同种型转变而产生特异于PSMA的人类单克隆抗体的多种同种型(如IgG，IgA和/或IgE)。相应地，发明的不同方面包括抗体和抗体片段和其药物组合物，以及非人转基因动物和用于产生单克隆抗体的B细胞和杂交瘤。该发明还包括体外或体内利用抗体来检测表达PSMA的细胞或相关的交叉反应性生长因子受体，及来抑制表达PSMA的细胞的生长、分化和/或游动性的方法。

为了使该发明更容易理解，首先定义了某些术语，另外的定义贯穿此详述部分。

术语“***特异膜抗原”，“PSMA”和“PSMA抗原”在这里互用，并且包括变异体、同种型和人类PSMA的物种同源物。在优选的实施方案中，PSMA抗原与发明的抗体的结合能抑制表达PSMA的细胞(如肿瘤细胞)的生长。在另一项优选实施方案中，PSMA抗原与发明的抗体的结合介导效应细胞对表达PSMA的细胞的吞噬作用和/或杀伤作用。

正如这里所应用的，术语“抗体”指一种糖蛋白，它至少包括两条重链(H)和两条轻链(L)，它们由二硫键相互连接。每一条重链包括一个重链可变区(这里简称为HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，CH1，CH2和CH3。每一条轻链包括一个轻链可变区(在这里简称为LCVR或VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH或VL区可以被进一步分为超变区，所谓的补体决定区(CDR)，散在于其它区域的比较保守的构架区(FR)。每一个VH和VL由三个CDRs和4个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有一个与抗原相作用的结合结构域。抗体的恒定区可能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这类组织或因子包括免疫***的不同细胞(如效应细胞)和经典补体***的第一组份(C1q)。

在此所用的术语抗体的“抗原结合部分”或仅仅“抗体部分”，指保留与抗原(如PSMA)特异性结合能力的一个或多个抗体片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段发挥。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段例子有(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包括2个Fab片段的双价片段，该2个Fab片段在铰链区通过二硫键桥相连；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al，(1989)Nature 341：544-546)，它由VH结构域组成；和(vi)分离的补体决定区(CDR)。而且，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH被独立的基因编码，但它们可以利用重组方法连在一起，这通过合成一段接头，使得它们能够被作为一个单链蛋白表达，该单链蛋白中，VL和VH区配对而形成单价分子(被看作单链Fv(scFv)；如见Bird et al.(1988).Scoemce 242：423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也将包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可利用该领域中的技术人员所知的便利技术获得，同样这些片段可利用与完整抗体相同的方法根据用途来筛选。

术语“双特异性分子”包括任何具有二种不同的结合特异性的试剂，如蛋白质，多肽，蛋白质复合物或多肽复合物，它们与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体相结合或作用。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”包括任何具有多于二个不同结合特异性的试剂，如蛋白质，多肽，蛋白质复合物或多肽复合物，它们与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面的Fc受体，和(c)至少一个其它组份相结合或作用，相应地，该发明包括双特异性、三特异性、四特异性和其它的特异性分子，但并不局限此，它们与细胞表面抗原，如PSMA和效应细胞表面的Fc受体相关。术语“双特异性抗体”还包括双抗体(diabodies)，它是双价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域通过接头而表达在一条多肽链上，接头太短而不能使这两个结构域在同一条链上配对，因而迫使这两个结构域与另外肽链上的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点(如见Holliger，P.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，P.J.et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。

如这里所见，术语“异种抗体”指两种或多种抗体、抗体结合片段(如Fab)、其衍生物、或连在一起的抗原结合区，其中至少两种具有不同的特异性。这些不同的特异性包括：与效应细胞表面Fc受体的结合特异性和靶细胞，如肿瘤细胞，抗原或抗原表位的结合特异性。如这里所用，术语“人类抗体”包括具有可变区和恒定区的抗体，它们由人类种系免疫球蛋白序列衍生而来。发明的人类抗体可含有不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，通过体外随机或位点特异性突变或体内体细胞突变而引入的突变)。然而，这里所用的术语“人类抗体”不包括CDR序列来自于其它哺乳动物种系如小鼠的抗体，这些CDR序列已经移植到人类构架序列中。

这里所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物代表对一个特定抗原表位的单一的结合特异性和亲和性。相应地，术语“人类单克隆抗体”指显示单一的结合特异性的抗体，它具有来自于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一项实施方案中，人类单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与一永生化细胞相融合的B细胞，其中B细胞来自转基因非人动物，如转基因小鼠，它具有包括人类重链转基因和轻链转基因的基因组。

这里所用的术语“重组人类抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、创造或分离的人类抗体，例如，从转入人类免疫球蛋白基因的转基因动物(如小鼠)中分离的抗体(在下面的部分I中进一步描述)；利用重组表达载体转入宿主细胞而表达的抗体，从重组的联合人类抗体库中分离的抗体，或通过涉及到将人类免疫球蛋白基因序列剪切到其它DNA序列上的任何其它方法而制备、表达、创造或分离的抗体。这些重组人类抗体具有衍生于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某项实施方案中，这些重组人类抗体来自于体外突变(或当利用人类Ig序列的转基因动物时，来自于体内体细胞突变)，因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列虽然来自于人类种系VH和VL序列并与其相关，但不在体内人类抗体种系全体中自然存在。

这里所用的“异种抗体”的定义与产生此种抗体的转基因非人生物相关，该术语指通常来自转基因非人动物以外的物种的抗体，它的氨基酸序列或编码核酸序列相应于转基因非人动物以外的生物中所发现的相关序列。

这里所用的“异种杂交抗体”指具有不同物种起源的轻链和重链的抗体。例如，具有人类重链和小鼠轻链的抗体是异种杂交抗体，异种杂交抗体的例子包括以上讨论的嵌合和人源化抗体。

这里所用的“分离的抗体”指基本上不含有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(如，与PSMA特异结合的分离的抗体基本上不含有与非PSMA抗原特异结合的抗体)。然而，与人类PSMA的抗原表位、同种型或突变体特异结合的分离的抗体可能与其它相关抗原，如来自其它物种(如PSMA的种间同源物)交叉反应。而且，分离的抗体基本上不含有其它细胞物质和/或化学物质。在该发明的一项实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合以确定的组成进行组合。

这里所用的“特异结合”指抗体与预先确定的抗原之间的结合。典型地，抗体以至少约1×10⁷M^-1的亲和力结合，以比非特异性抗原(如BSA，酪蛋白)至少高两倍的亲和力与预先确定抗原结合，其中非特异性抗原是除了预先确定抗原或紧密相关抗原之外的抗原。“抗体识别抗原”和“抗体特异于抗原”的说法在这里与术语“与抗原特异性结合的抗体”互用。

这里所用的对IgG抗体的“高亲和性”指结合亲和力至少约10⁷M^-1，优选地至少约10⁹M^-1，更优选地至少约10¹⁰M^-1，10¹¹M^-1，10¹²M^-1或更大，如高达10¹³M^-1或更大。然而，“高亲和力”结合对其它的抗体同种型可能不同。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合指结合亲和力至少约1×10⁷M^-1。

这里所用的术语“K_assoc”指一特定的抗体-抗原相互作用的结合常数。

这里所用的术语“K_dis”指一特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。

这里所用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(如IgM或IgG1)。

这里所用的“同种型转变”指抗体的类型或同种型从一种Ig类型变为另外一种Ig类型的现象。

这里所用的“非转变同种型”指重链的同种型类型，它是在没有同种型转变发生时产生的；典型的编码非转变同种型的CH基因是第一个CH基因，它位于功能重排的VDJ基因的下游最前端。同种型转变分为经典和非经典同种型转变，经典同种型转变通过重组事件发生，这在转基因中涉及到至少一个转变序列区。非经典同种型转变可以通过如人类σ_μ和人类∑_μ(δ相关性缺失)之间的同源重组而发生。另外的非经典转变机制，如转基因内和/或染色体内重组也可能发生，并影响同种型转变。

这里所用的术语“开关序列”指负责转变重组的DNA序列。“转变供体”序列，典型地是μ转变区，位于转变重组过程中将被删除的构成区域的5′(如上游)，“转变受体”区位于将被删除和取代的恒定区的构成区域之间(如γ，ε，等)。由于重组不是总在特定的位点发生，所以最终基因序列不能从构成物中明显地预测出。

这里所用的“糖基化模式”定义为碳水化合物单位共价地附着到蛋白质，尤其特异地附着到免疫球蛋白上的模式。异种抗体的糖基化模式的特征可以是：基本上与在非人转基因动物物种所产生的抗体所发生的糖基化模式相似，此时，该领域中的一种普通技术可将异种抗体的糖基化模式与非人转基因动物物种中的所述的糖基化模式之间相似性识别为比转基因的CH基因衍生的物种中的更高。

这里所用于某对象的术语“天然存在”指能在自然界中找到该对象的现象。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多聚核苷酸序列就是天然存在的，其中此生物体能够从自然界中的资源中分离到并没有被人类在实验中有意识地修饰过。

这里所用的术语“重排的”指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V片段恰好在构象上与D-J或J片段毗邻，分别编码完整的VH或VL结构域。重排的免疫球蛋白基因座可以通过与种系DNA相比较而鉴定；重排基因座含有至少一个重组的七碱基/九碱基同源片段。

相关于V片段，这里所用的术语“未重排的”或“种系构象”指V片段未被重组到恰好与D或J片段毗邻的位置。

这里所用的术语“核酸分子”包括DNA分子和RNA分子。一个核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。

涉及编码与PSMA结合的抗体或抗体部分(如VH，VL，CDR3)的核酸时，这里所用的术语“分离的核酸分子”是指编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不包含编码与非PSMA抗原结合的抗体或抗体部分，其中在人类基因组DNA中其它序列可能自发地位于该核酸分子的两侧。

对于核酸，术语“基本同源”表示，两核酸或其指定序列当以最佳方式排列和比较时，在有适当的核苷酸***或删除情况下，至少有约80％的核苷酸相同，通常至少为约90％至95％，更优选地，至少约为98％到99.5％。或者，当片段在选择性杂交条件下与其互补链杂交时，基本同源存在。

两序列之间的等同百分比是两序列所共同的位置的数目的函数(即同源％＝等同位置数/总位置数×100)，这需考虑进缺口数和每一缺口的长度，其中缺口的引入是为了两序列的最佳比较，序列的比较和两序列等同百分比的确定可以利用数学算法获得，如下面所描述的非局限例子。

确定两核苷酸序列的等同百分比可以利用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com获得)，其中运用NWSgapdna.CMP matrix和40，50，60，70或80的缺口权重及1，2，3，4，5或6的长度权重，确定两核苷酸或氨基酸序列的等同百分比也可利用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.4：11-17(1988))，该算法已被加入到ALIGN程序(版本2.0)，其中适用PAM120重量残基表口的缺口长度罚分和4的缺口罚分。另外，确定两氨基酸序列的等同百分比可利用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法，该算法已被加入到GCG软件包(在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，它运用或者Blossum 62matrix或者PAM 250matrix及16，14，12，10，8，6或4的缺口权重和1，2，3，4，5或6的长度权重。

该发明中的核酸和蛋白序列可进一步用作“搜索序列”来在公共数据库中搜索，例如，鉴定相关序列。这类搜索可以利用如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10所述的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸搜索可以利用NBLAST程序，分值＝100，字母长度＝12来获得与发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以利用XBLAST程序，分值＝50，字母长度＝3来获得与发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了比较而获得有缺口的排列，可以利用如在Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以利用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数.见http:www.ncbi.nlm.nih.gov.

核酸可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中或以部分纯化或基本纯化的形式存在。当核酸与其它细胞组份或其它污染物，如其它细胞的核酸或蛋白，分离开时，就是“分离的”或“变为基本纯净的”，其中这是利用标准技术，包括碱/DSD处理，CsCl分带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳和该领域中其它已知技术。见F.Ausubel等。Current Protocols inMolecular Biology，Greene出版社，Wiley Interscience，New York(1987)。

该发明的核酸组合物，来自cDNA，基因组成其混合物，它尽管通常是天然序列(除了修饰的限制性位点和相似位点)，但可以根据标准技术被突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可能影响预期的氨基酸序列。尤其地，与天然V，D，J，恒定区，开关序列和其它这里所描述的此类序列基本同源或衍生于这些序列的DNA序列也为本发明所考虑(这里的“衍生”表示一序列与另一序列相同或由另一序列修饰而来)。

当一核酸与另一核酸序列发生功能关系时，它们就“***作性相连”。例如，如果一启动子或增强子影响编码序列转录，它就与该序列操作性相连。当考虑到转录调控序列时，操作性相连是指被连接的DNA序列是连续的，及当需要时在阅读框中连接两个连续的蛋白编码区。对于开关序列，操作性相连显示，这些序列能够影响转变重组。

这里所用的术语“载体”指能够转运与它相连的另外核酸分子的核酸分子。一类载体是“质粒”，它指环状的双链DNA环，可以在它的上面连接其它的DNA片段。另一类载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中，一些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。其它载体(如非游离的哺乳动物载体)能够在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组上，因而随着宿主基因组复制。而且，某些载体能够指导与其操作性相连的基因的表达，这里这类载体定义为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般地，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒形式。在该特殊情况下，“质粒”和“载体”可以互用，这是因为质粒是最常用的载体形式。然而，该发明将包括其它形式的表达载体，如病毒载体(如，复制缺陷的逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们发挥相同的功能。

这里所用的术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)指引入了重组表达载体的细胞。应该理解的是，这类术语不仅指特定对象细胞，也指该细胞的前体。由于突变或环境影响，这种前体细胞在相继的传代过程中可能发生某种变异，所以实际上它不可能与亲本细胞等同，但它仍然被包括在这里所用的术语“宿主细胞”的范围之内。

该发明的不同方面在以下部分中进一步详细描述。

I.PSMA的人类抗体的制备

发明的单克隆抗体(mAbs)可用不同技术制备，这些技术包括常规的单克隆抗体制备方法，如标准的体细胞杂交技术，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)。尽管一般情况下优选体细胞杂交方法，但也可利用其它制备单克隆抗体的技术，如B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。

产生杂交瘤的优选动物***是小鼠***。在小鼠中产生杂交瘤的方法非常成熟。免疫程序及分离用于融合的免疫脾细胞的技术在此领域中也已知，融合的配对细胞(如鼠的骨髓细胞)和融合程序也已知。

在一优选的实施方案中，针对PSMA的人类单克隆抗体可以利用转基因小鼠产生，该小鼠含有人类免疫***而非小鼠免疫***的组份。这类转基因小鼠，在这里定义为“HuMAb”小鼠，含有人类免疫球蛋白基因的小区，它编码未重排的人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，HuMAb小鼠还含有使内源μ和κ链区失活的靶向突变(Lonberg，N.等，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。相应地，小鼠的鼠源IgM orκ表达下降，并且应答于免疫处理，引入的人类重链和轻链转基因进行类型转变和体细胞突变以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆(Lonberg，N.等(1994)，supra；Lonber；总述N(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101，Lonberg，N.和Huszar.D(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F和Lonberg，N(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546).HuMab小鼠的制备在部分II及见Taylor，L.等(1992)Mucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chem，J.等(1993)ENBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Taylor，L等(1994)International Innunology 6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中详述，以上文献的内容都引入文献。进一步见，U.S.专利Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；以上都属于Lonberg和Kay，和GenPharm International；U.S.专利5,545,807，属于Surani等；国际公开Nos.WO 98/24884，1998，1月11日出版；WO 94/25585，1994，9月10日出版；WO 93/1227，1993，1月24日出版；WO 92/22645，1992年12月23日出版；WO 92/03918，1992年3月19日出版，以上专利的公开内容引入文献。或者，例2中所描述的HCO12转基因鼠能用于产生人类抗PSMA抗体。

HuMab免疫

为了完全产生抗PSMA的人类单克隆抗体，可用纯化的或富集的PSMA抗原制备物和/或表达PSMA的细胞免疫HuMab小鼠，如在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和WO 98/24884中所描述的。优选地，在初次注射时，小鼠年龄为6-16周。例如，用纯化的或富集的PSMA抗原制备物(5-20μg)(如从表达PSMA的LNCaP细胞中纯化)腹腔注射免疫HuMab小鼠。当用纯化的或富集的PSMA抗原制备物免疫小鼠不产生抗体时，也可用表达PSMA的细胞免疫小鼠以启动免疫应答，如肿瘤细胞系。

不同抗原免疫所积累的经验表明，当以下列方式免疫HuMAb转基因小鼠时，其应答最好。免疫方式为：初次利用弗氏完全佐剂腹腔(IP)注射抗原，然后用弗氏不完全佐剂每隔一周腹腔免疫(直到总数为6)。可以在免疫过程中眼眶取血来测定免疫应答。血浆可以利用ELISA(见下述)来筛选，具有足够效价的抗PSMA人类免疫球蛋白的小鼠可用作融合，可在处死小鼠及取脾之前3天静脉注射抗原给小鼠以强化免疫。可预期对每一抗原需要进行2-3次融合，对每一种抗原需免疫几只小鼠。例如，可以免疫12只HCO7和HCO12系的HuMAb小鼠。

产生抗PSMA的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成

根据标准方法(8，13)，能够分离小鼠脾细胞，并利用PEG将其与小鼠的骨髓瘤细胞系相融合，然后筛选产生抗原特异性抗体的杂交瘤。例如，利用50％PEG，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与其数目1/6分之一的非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)P3X63-Ag8.653融合。约2×10⁵个细胞铺到平底微量滴定板上，接着在选择性培养基中培养二周，其中选择性培养基含有20％胎儿克隆血清，18％“653”条件培养基，5％(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L～谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合后24小时加入)。两周之后，细胞培养在HT取代了HAT的培养基中。然后利用ELISA来筛选能产生人类抗PSMA单克隆IgM和IgG抗体的孔。一旦发生杂交瘤生长过盛情况，通常在10-14天之后，检测培养基。分泌抗体的杂交瘤重新铺到板上并重新筛选，如果仍然是人类IgG抗PSMA单克隆抗体阳性，就可通过有限稀释法将其至少亚克隆二倍，这样体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于鉴定的少量抗体。

人类单克隆抗体与PSMA结合的鉴定

为了鉴定发明的人类PSMA单克隆抗体的结合作用，测定来自免疫小鼠的血清，例如利用ELISA。简单地，微量滴定板用纯化的PSMA包被，PSMA溶于PBS中，浓度为0.25μg/ml，然后用5％溶于PBS中的牛血清白蛋白封闭，将来自PSMA免疫小鼠的血浆的稀释液加入到每孔中，并在37℃保温1-2小时，用PBS/Tween洗板，然后加入偶联了碱性磷酸酶的山羊抗人IgG Fc特异的多克隆试剂，并在37℃保温1小时，洗涤之后，加入pNPP底物(1mg/ml)，在OD_405-650分析。优选地，达到最高效价的小鼠将用于融合。

如上所述的ELISA分析也可用于筛选与PSMA免疫原反应显示阳性的杂交瘤。与PSMA结合具有高亲和性的杂交瘤将被克隆和进一步鉴定。来自每个杂交瘤的一个克隆，它如果保持亲本细胞的反应性(通过ELISA)，就可被选择用于制备5-10活细胞库，保存在-140℃，以及用于抗体纯化。

为了纯化人类抗PSMA抗体，选中的杂交瘤生长在用于单克隆抗体纯化的两升旋转培养瓶中。在蛋白A琼脂糖(protein A-sepharose)(Pharmacia，Piscataway，NJ)亲和层析柱之前过滤及浓缩上清(洗脱下的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相色谱来核实其纯度)，缓冲液可被换成PBS，其浓度可以用OD₂₈₀测定，其消光系数为1.43，将单克隆抗体等分并保存于-80℃。

为了测定是否所选的人类抗PSMA单克隆抗体与特定的抗原表位相结合，可以利用可购买的试剂(Pierce，Rockford，IL)来生物素标记每一抗体。利用如上所述的PSMA包被的ELISA板来进行未标记的和生物素标记的单克隆抗体的竞争性研究。生物素标记的单克隆抗体的结合能够用链亲和素碱性磷酸酶探针检测到。

为了测定分离的抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。微量滴定板的孔用10μg/ml的抗人类Ig 4℃包被过夜。用5％BSA封闭之后，与10μg/ml的单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应2小时，然后再与或者人类IgG1或人类IgM特异的碱性磷酸酶偶联的探针反应，如以上所述分析反应板。

为了证明单克隆抗体与表达PSMA的活细胞结合，可用流式细胞仪。简单地，表达PSMA的细胞系(在标准生长条件下生长)与不同浓度的单克隆抗体混合，37℃保温1小时，其中单克隆抗体溶于含有0.1％Tween 80和20％小鼠血清的PBS中。洗涤之后，细胞在与初始抗体染色相同的条件下与荧光标记的抗人类IgG抗体反应，利用FACScan设备来分析样品，FACScan是利用光散射和衍射特性使单个细胞通过门。另一种分析方法可利用荧光显微镜(补充或取代)流式细胞仪分析。细胞正如上所述染色，然后用荧光显微镜检测。这种方法能够观察到单个细胞，但灵敏度可能降低，这依赖于抗原的密度。

抗PSMA人类IgG与PSMA抗原的反应性可用免疫杂交进一步测定。简单地，从表达PSMA的细胞中制备细胞提取物，并走十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将被分开的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测单克隆抗体杂交。人类IgG结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶及其底物BCIP/NBT片段(SigmaChem.Co.St.Louis，MO)检测到。

抗PSMA的人类单克隆抗体的吞噬和细胞杀伤活性

除了测定人类单克隆抗PSMA抗体与PSMA的特异性结合之外，还可测定其介导吞噬和杀伤表达PSMA的细胞的能力。体外测定单克隆抗体活性将在体内模型中测定之前提供初始筛选。简单地，利用FicollHypaque密度离心从健康供体中分离多形核细胞(PMN)或其它效应细胞，然后裂解污染的红细胞。PMNs被洗涤之后，悬浮于含有10％热失活胎牛血清的RPMI中，并以不同的效应细胞与肿瘤细胞之比(效应细胞：肿瘤细胞)与表达PSMA的⁵¹Cr标记细胞混合，接着加入不同浓度的人类抗PSMA IgG，不相关的人类IgG用作负对照，该测定可在37℃进行0～120分钟。通过测定释放到培养上清的⁵¹Cr来分析样品的细胞裂解作用，抗PSMA单克隆也可以互相组合的形式来测定，以分析细胞裂解作用是否在多种单克隆抗体作用下增强。

与PSMA结合的人类单克隆抗体也可在体内模型中(如小鼠中)检测其介导吞噬和杀伤表达PSMA的细胞的效应，如肿瘤细胞。例如，这些抗体可以基于以下标准来选择，这些标准也不是唯一的：

1)与表达PSMA的活细胞的结合；

2)与PSMA结合的高亲和力；

3)与PSMA的独特的抗原表位的结合(减少当以组合形式使用时，具有互补活性的单克隆抗体竞争性结合同一抗原表位的可能性)；

4)表达PSMA的细胞的调理作用；

5)在人类效应细胞的存在下，生长抑制、吞噬和/或杀伤表达PSMA的细胞的介导作用。

该发明中的优选人类单克隆抗体都符合这些标准中的一条或多条，优选地是符合所有各条。在一项特定的实施方案中，人类单克隆抗体以组合形式使用，如，作为一种药物组合物，它包含两种或多种抗PSMA单克隆抗体或其片段。例如，具有不同的但互补的活性的人类抗PSMA抗体可以在一种疗法中组合起来以获得理想的治疗或诊断效果。其中一例是这样的一种组合物，它含有在效应细胞存在下能够介导高效杀伤靶细胞的抗PSMA人类单克隆抗体和能够抑制表达PSMA的细胞生长的另一种人类抗PSMA单克隆抗体。

II.能够产生人类单克隆抗PSMA抗体的转基因非人动物的生成

另一方面，该发明提供转基因非人动物，如转基因小鼠，它能够表达与PSMA特异性结合的人类单克隆抗体，尤其是具有高亲和性的抗体。在一项优选的实施方案中，转基因非人动物，如转基因小鼠(HuMab小鼠)具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。在一项实施方案中，转基因非人动物，如转基因小鼠，被纯化的或富集的PSMA抗原制备物和/或表达PSMA的细胞免疫。优选地，转基因非人动物，如转基因小鼠，能够通过V-D-J重组和同种型转变而产生抗PSMA的人类单克隆抗体的多种同种型(如IgG，IgA和/或IgE)。同种型转变可以通过经典或非经典同种型转变而发生。

设计以异源性抗体所有组份形式对应答于外源抗原刺激的转基因非人动物，需要转基因动物在B细胞发育过程中含有功能正确的异源免疫球蛋白基因。在一项优选的实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转变。相应地，发明的转基因按产生同种型转变和以下的一项或多项目的构建(1)高水平和细胞型特异表达，(2)有功能的基因重排，(3)等位排斥的活化和应答，(4)足够的初始全部组份的表达，(5)信号转导，(6)体细胞超突变，和(7)在免疫应答过程中转基因抗体基因座的显性化。

并不是以上所有标准都需要满足。例如，在一些实施方案中，当转基因动物的内源性免疫球蛋白基因座被功能性破坏，转基因就不需要活化等位排斥。而且，在一些实施方案中，当转基因含有功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因时，第二条标准中的功能基因重排就不需要了，至少对已经重排的转基因而言。对于分子免疫学背景，见基本免疫学(Fundamental Immunology)，第二次出版(1989)，Paul William E.著，Raven出版，N.Y.它在此引入参考文献。

在某实施方案中，用于产生发明的人类单克隆抗体的转基因非人动物在某种系中含有重排的，未重排的或两者组合的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。每一重链转基因包括至少一个CH基因。另外，重链转基因可能含有同种型转变的功能序列，该序列能够在转基因动物的B细胞中支持编码多个CH基因的异源转基因的同种型转变。这些开关序列可以是自发存在于生物种系免疫球蛋白基因座上的序列，其中该物种是转基因CH基因来源的物种或这些开关序列可以来自存在于转基因受体(转基因动物)的序列，例如，如果用于产生转基因小鼠，人类转基因结构掺入与小鼠重链转基因座中自然存在的开关序列相似的序列，它就可以产生更高频率的同种型转变，这是因为小鼠开关序列与小鼠转变重组酶***之间以最佳状态发挥作用，而人类开关序列则不同。开关序列可以利用常规的克隆方法进行分离和克隆，或者在已发表的相关于免疫球蛋白转变区序列(Mills等，Nucl.Acids Res.15：7305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1：631-642(1989)，这里它们以文献形式引入)基础上。设计重叠合成的寡聚核苷酸，来体外合成。对于以上的每种转基因动物，功能性重排的异源性重链和轻链免疫球蛋白基因都在转基因动物的B细胞中存在着明显的比例(至少10％)。

发明中的用于产生转基因动物的基因包括重链转基因，该基因所包括的DNA编码至少一个可变基因片段，一个多样基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段。免疫球蛋白轻链转基因包括的DNA编码至少一个可变基因片段，一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段。这些编码重链和轻链片段的基因片段对于转基因非人动物是异源性的，因为它们来自或相应于不属于转基因非人动物物种的编码免疫球蛋白重链和轻链片段的DNA。该发明的一方面，转基因被构建结果使得单独的基因片段不重排，即不重排以编码有功能的免疫球蛋白的轻链或重链。这种不重排的转基因支持V，D和J基因片段的重组(功能性重排)，并且尤其支持在有PSMA抗原时D区基因片段的全部或部分***到转基因非人动物中的重排的免疫球蛋白重链中。

在一项可替代的实施方案中，转基因包括未重排的“小基因座”。这种转基因典型地包括C，D和J片段的基本部分以及V基因片段的一亚套。在这种转基因结构中，不同的调控序列，加启动子，增强子，类型转变区，用于RNA加工的剪切供体和剪切受体，重组信号等，包括来自异源DNA的相应序列，这种调控序列可以掺入到转基因中，该转基因来自与发明中所用的非人动物相同或相似的物种。例如，人类免疫球蛋白基因片段可以在转基因中与啮齿类的免疫球蛋白增强子序列相结合以用于转基因动物。或者，合成的调控序列可掺入到转基因中，这里这种合成的调控序列与哺乳动物基因组中自然存在的已知的功能DNA序列不同源。合成的调控序列根据保守性原则设计，例如规定剪切受***点或启动子/增强子基序的允许序列的原则。例如，一个小基因座包括，与自然存在的种系Ig基因座相比至少有一个内部(即不在部分的末端)删除非必需DNA序列(如间插DNA，内含子或其部分)的基因组免疫球蛋白基因座的一部分。

在发明的一项优选实施方案中，用于产生抗PSMA的人类抗体的转基因动物含有至少一个，典型2-10，有时25-50或更多拷贝的转基因，如WO 98/24884中的例子12所述的(如pHC1或pHC2)，或该转基因动物与含有单个拷贝轻链转基因的动物，如WO 98/24884中的例5，6，8或14所述，交配，后代与J_H缺失动物，如WO 98/24884中的例10所述，交配。WO 98/24884的内容引入文献。对于这三种特征的每一种，动物都被培育成纯合。这种动物具有以下基因型：人类重链未重排的小基因座(WO 98/24884的例12中所述)的单个拷贝(每套单倍体染色体)，重排的人类K轻链结构(WO 98/24884中的例14所述)的单个拷贝(每套单倍体染色体)，和在每一个内源性小鼠重链转基因座上除去所有功能性J_H片段的删除(WO 98/24884中的例10所述)。这种动物与J_H片段删除结合的小鼠(WO 98/24884的例10)交配，以产生J_H删除结合和人类重链和轻链构建物杂合的后代。注射抗原给此后代动物，以用于产生抗此抗原的人类单克隆抗体。

从这种动物中分离的B细胞在人类重链和轻链方面是单特异性的，这是因为它们只含有每个基因的单拷贝。而且，它们在人或鼠重链方面也将是单特异性的，这是因为鼠的两个内源性重链转基因拷贝由于引入了跨越J_H区域的删除而是无功能的，如WO 98/24884中的例9和12所述。再者，B细胞的基本部分在人类或鼠轻链方面是单特异性的，这是由于重排的人类κ轻链转基因的表达会在B细胞的相当部分中等位或同种型排斥内源性的小鼠κ和入链基因的重排。

优选实施方案中的转基因小鼠产生免疫球蛋白的所有组成成分，理想状况下，基本上与自然小鼠相似。因而，例如，在内源性Ig基因失活状况下，总的免疫球蛋白水平的范围在血清中是0.1到10mg/ml。优选地2.5到5mg/ml，理想是至少约1.0mg/ml。当能够影响IgM转变为IgG的转基因引入到转基因小鼠中时，成年鼠中的血清IgG与IgM之比倾向于约10∶1.IgG与IgM之比在不成熟鼠中将低得多。一般地，超过约10％，尤其40％到80％的脾和***B细胞专一地表达人类IgG蛋白。

所有组成成分将理想地以通常至少10％，优选25％到50％或更高的百分比相似于非转基因小鼠中。一般地，将产生至少约1000种不同的免疫球蛋白(理想的是IgG)，优选的为10⁴到10⁶或更多，这主要依赖于引入小鼠基因组中的不同的V，J和D区域的数目。这些免疫球蛋白典型地将识别高抗原性蛋白的一半或更多，如链球菌蛋白A.典型地，免疫球蛋白对预选的抗原显示出的亲和力至少约10⁷M^-1，优选的至少约10⁹M^-1，更加优选的至少约10¹⁰M^-1，10¹¹M^-1，10¹²M^-1或更大，如高达10¹³M^-1或更大。

在一些实施方案中，可能倾向于产生具有预先确定的所有组成成分的小鼠，以限制代表对预先确定的抗原类型的抗体应答的V基因的选择。例如，具有预先确定的所有组成成分的重链转基因可包括人类VH基因，该基因在人类中优选用于对预先确定的抗原类型的抗体应答。或者，一些VH基因由于不同的原因(如，对预先确定的抗原，其所编码高亲和力V区的可能性小，发生体细胞突变的倾向性弱和亲和性减小，或对某些人具有免疫原性)而被从确定的所有组成成分中排除。因而，具有不同重链和轻链转基因片段的转基因在重排之前，可以被预先鉴定是否来自非转基因动物的生物物种，如通过杂交或DNA测序。

如前所述，该发明的转基因小鼠可以免疫纯化的或富集的PSMA抗原制备物和/或表达PSMA的细胞。小鼠将产生B细胞，该B细胞通过转基因内的转变重组(顺式转变)进行类型转变以及表达与PSMA反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人类序列抗体，其中重链和轻链多肽由人类转基因序列编码，该转基因序列包括来自体细胞突变和V区重组或连接所产生的序列以及种系编码的序列；虽然对于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接而存在其它的非种系序列，这些人序列免疫球蛋白可以看作基本上等同于由人类V_L或V_H基因片段和人类J_L或J_L片段编码的多肽序列。考虑到这些人类序列抗体，每条链的可变区至少80％由人类种系V，J及对于重链还有D基因片段编码；经常至少85％的可变区由存在于转基因上的人类种系序列编码；常常90％或95％或更多的可变区序列由存在于转基因上的人类种系序列编码。然而，由于非种系序列因体细胞突变和VJ及VDJ连接而引入，人类序列抗体经常具有一些可变区序列(不经常的为恒定区序列)，这些序列不是由存在于小鼠种系中的人类转基因的V，D或J基因片段编码。典型地，这种非种系序列(或单独的核苷酸位置)将聚集在CDR内或其附近，或者聚集在已知的体细胞突变聚集的区域。

与预先确定抗原结合的人类序列抗体可来自同种型转变，因而产生了包括一人类序列γ链(如γ1，γ2a，γ2B或γ3)和一人类序列轻链(如K)的人类抗体。这种同种型转变的人类序列抗体常常包含一个或多个体细胞突变，典型地位于可变区，并且常常在CDR的约10个残基内，这是由于亲和的饱和和抗原对B细胞的选择，尤其是由于接着的第二次抗原刺激。这些高亲和人类序列抗体具有的结合亲和性至少1×10⁹M^-1，典型地至少5×10⁹M^-1，经常超过1×10¹⁰M^-1，有时5×10¹⁰M^-1至1×10¹¹M^-1或更大。

发明的另一方面属于来自这类小鼠的B细胞，这种B细胞被用于产生表达人类单克隆抗体的杂交瘤，其中此抗体以高亲和力与PSMA结合(如大于2×10⁹M^-1)。因而，在发明的另一项实施方案中，这些杂交瘤用于产生包括免疫球蛋白的组合物，其中免疫球蛋白与PSMA结合的亲和常数(Ka)至少2×10⁹M^-1，这里所说的免疫球蛋白包括：

人类序列轻链，由以下部分组成：(1)具有一个多肽序列的轻链可变区，此多肽序列基本等同于由人类V_L基因片段和人类J_L基因片段的多肽序列，和(2)具有一个多肽序列的轻链恒定区，该多肽序列基本等同于由人类C_L基因片段编码的多肽序列；和

人类序列重链，由以下部分组成：(1)具有一个多肽序列的重链可变区，该多肽序列基本上等同于由人类V_H基因片段，具可选择性的D区，和人类J_H片段编码的多肽序列，和(2)具有一多肽序列的恒定区，此多肽序列基本等同于由人类C_H基因片段编码的多肽序列。

抗PSMA的高亲和人类单克隆抗体的发展得益于用于在转基因小鼠中扩增人类可变区基因片段的所有组成成分的方法，该转基因小鼠具有含有一整合的人类免疫球蛋白转基因的基因组，此所说的方法包括将包含V区基因片段的V基因引入基因组，其中该V基因片段不存在于所说的整合人类免疫球蛋白转基因中。通常地，V区转基因是一酵母人工染色体，它包括人类V_H或V_L(V_K)基因片段排列的一部分，正如在人类基因组中可能自然出现的或可以通过重组方法分别地剪切到一起，V区转基因可包括乱序或省去的V基因片段。通常至少五个或更多个功能V基因片段包含在YAC中。在这变化中，通过V所有组成成分扩增方法来产生转基因小鼠是可能的，其中该小鼠表达免疫球蛋白链，它包括由位于V区转基因上的V区基因片段编码的可变区序列和由人类Ig转基因编码的C区。通过V所有组成成分扩增的方法，可以生成具有至少5个不同的V基因的转基因小鼠，这是由于小鼠至少含有约24个V基因或更多。一些V基因片段可能是无功能的(如假基因等)，如果需要，这些片段可以利用技术人员所用的重组方法来保留或选择性删除。

一旦小鼠种系被改造成含有具有扩增的V片段所有组成成分的功能YAC，其中这些V片段基本上在含有J和C基因片段的人类Ig转基因中不存在，这种性状就会被繁殖并且培育进其它的遗传背景，包括具有扩增的V片段所有组成成分的功能YAC被具有不同的人类Ig转基因的小鼠种系所获得。具有扩增的V片段所有组成成分的多功能YAC可以被一种系获得以与一人类Ig转基因(或多个人类Ig转基因)一起作用。尽管这里将其定义为YAC转基因，这种转基因当整合到基因组中时将基本上缺少酵母序列，例如在酵母中自主复制所需的序列；在酵母中复制不再需要后(即在引入到小鼠ES细胞或小鼠前合子之前)，这种序列可以被选择的通过基因工程(如限制性消化和脉冲场凝胶电泳或其它合适的方法)去除。增殖人类序列免疫球蛋白表达的性状的方法包括养殖一种转基因小鼠，它具有人类Ig转基因，并且最好还具有含有增殖的V片段所有组成成分的功能YAC。V_H和V_L基因片段都可存在于YAC。转基因小鼠可以被职业人员养殖进所需的任何遗传背景，包括人类Ig转基因和/或编码其它人类淋巴细胞蛋白的转基因。该发明还提供由转基因小鼠所产生的高亲和性人类序列免疫球蛋白，该转基因小鼠具有扩增的V区所有组成成分YAC转基因。虽然以上描述了发明的转基因动物的优选实施方案，其它实施方案也详细考虑到，它们分为四类：

I.含有未重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；

II.含有未重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；

III.含有重排的重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物；和

IV.含有重排的重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。

在这几类转基因动物中，优选顺序如下II＞I＞III＞IV，其中内源性轻链转基因(或至少K基因)已被通过同源重组(或其它方法)敲除；和I＞II＞III＞IV，其中内源性轻链转基因未被敲除而且通过等位排除而呈显性。

III.与PSMA结合的双特异性/多特异性分子

在发明的另外实施方案中，PSMA的人类单克隆抗体或其抗原结合部分可与其它功能分子偶联，如其它的多肽或蛋白(如Fab′片段)，以产生与多结合位点或靶抗原表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，发明的抗体或抗原结合部分与一个或多个其它结合分子，如其它抗体，抗体片段，多肽或结合模拟物，功能偶联(如通过化学偶联，基因融合，非共价结合或其它)。

相应地，该发明包括双特异性和多特异性分子，它们包含至少一个对PSMA的第一结合特异性和一个对靶抗原表位的第二结合特异性。在发明的一项特定实施方案中，第二个靶抗原表位是Fc受体，如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因此，发明包括能够与表达FcγR，FcαR或FcεR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMNs))结合和表达PSMA靶细胞结合的双特异性和多特异性分子。该双特异性和多特异性分子靶向于PSMA表达细胞和效应细胞，并且类似于发明的人类单克隆抗体，激活Fc受体介导的效应细胞活性，如吞噬PSMA表达细胞，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，细胞因子释放或超氧阴离子的生成。

发明的双特异性和多特异性分子可进一步包括除了抗Fc结合特异性和抗PSMA结合特异性之外的第三结合特异性。在一项实施方案中，这第三个结合特异性是抗增强因子(EF)部分，如与一表面蛋白结合的分子，该表面蛋白参与细胞毒活性并能增强对靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可以是一抗体，功能抗体片段或与一给定分子结合的配基，给定分子如抗原或受体，这样就会使得Fc受体或靶细胞抗体的结合决定子的效应增强。或者，抗增强因子部分能够与不同于第一和第二结合特异性所结合的单位结合。例如，抗增强因子部分能够结合细胞毒性T细胞(如通过CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它能增强对靶细胞的免疫应答的免疫细胞)。

在一项实施方案中，发明的双特异性和多特异性分子对于结合特异性包括至少一个抗体或其抗体片段，包括如Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fv或单链Fv。抗体也可是轻链或重链二聚体，或其任意的最小片段，如Fv或其单链组合物，这如Ladner等U.S.专利No.4,946,778，1990年8月7日所述，该专利的内容引入文献。

在一项实施方案中，发明的双特异性和多特异性分子包含对位于效应细胞表面的FcγR或FcαR的结合特异性和对靶细胞抗原，如PSMA的第二结合特异性。

在一项实施方案中，对Fc受体的结合特异性由人类单克隆抗体提供，其结合不能被人类免疫球蛋白G(IgG)所封闭。如这里所用，术语“IgG受体”位于染色体1上的八个γ链基因中的任何一个。这些基因总共编码12个跨膜或可溶的受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一项优选实施方案中，Fcγ受体是人类高亲和性FcγRI.人类FcγRI是72kDa分子，它对单体IgG显高亲和性(10⁸-10⁹M^-1)。

这些优选的单克隆抗体的生产和鉴定由Fanger等在PCT申请WO88/00052和U.S.专利No.4,954,617描述，这里它被以文献形式全部引入。这些抗体与FcγRI，FcγRII或FcγRIII的抗原表位结合，其结合位点不同于受体Fcγ结合位点，因此它们的结合基本上不被生理水平的IgG所封闭。该发明的有用的特异性抗FcγRI抗体是mAb 22，mAb 32，mAb44，mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可由美国典型培养物保藏中心取得，ATCC保藏号HB9469。抗FcrRI mAb22，mAb22的F(ab’)₂片段可由Medarax，lnc(Annandale，N.J.)获取。在其它实施方案中，抗Fc受体的抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的产生和鉴定在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT/US 93/10384中描述。H22抗体产生细胞系以HA022CL1名称在1992年11月4日保藏在美国典型培养物保藏中心，其保藏号是CRL 11177。

在另一项优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由与人类IgA受体结合的抗体提供，如Fc-α受体(FcαRI(CD89))，该结合优选地不被人类免疫球蛋白A(IgA)所封闭。术语“IgA受体”将包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码几种交替剪切的跨膜同种型，分子量为55到110kDa。FcαRI(CD89)组成性表达在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞中，但不在非效应细胞类群中表达。FcαRI对IgA1和IgA2具有中等亲和性(≈5×10⁷M^-1)，该亲和性在遇到细胞因子如G-CSF或GM-CSF时增强(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异的单克隆抗体，它们被鉴定为A3，A59，A62和A77，它们与FcαRI的IgA配基结合结构域以外的区域结合(Monteiro，R.C.等，1992，J.Immunol.148：1764)。

在发明中，优选使用FcαRI和FcγRI作为激活受体，这是因为它们(1)主要由效应细胞表达，如单核细胞，PMNs，巨噬细胞和树突状细胞；(2)以高水平表达(如每个细胞5000-100000)；(3)是细胞毒活性的介导因子(如ADCC，吞噬作用)；(4)介导靶向于自己的抗原的抗原呈递增强作用，包括自身抗原。

在其它实施方案中，发明的双特异性和多特异性分子进一步包括识别，如结合，靶细胞抗原，如PSMA的结合特异性。在一项优选实施方案中，此结合特异性由该发明的一种人类单克隆抗体提供。

这里所用的“效应细胞特异的抗体”指与效应细胞的Fc受体结合的抗体或功能抗体片段。在本发明中所用的优选抗体与效应细胞的Fc受体结合，其结合位点不与内源性免疫球蛋白近邻。

如这里所用，术语“效应细胞”指参与免疫应答的效应时期而相反于免疫应答的认知时期和活化时期的免疫细胞。典型的免疫细胞包括骨髓或淋巴起源的细胞，如淋巴细胞(如B细胞和包括细胞毒性T细胞(CTLs)的T细胞)，杀伤细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞，单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性细胞，多形核细胞，粒细胞，肥大细胞和嗜碱性细胞。一些效应细胞表达特异的Fc受体及发挥特异的免疫功能。在一优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，如嗜中性细胞能够诱导ADCC。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与特异杀伤靶细胞和呈递抗原给免疫***的其它组分，或结合呈递抗原的细胞。在另外的实施方案中，效应细胞能够吞噬靶抗原，靶细胞或微生物。效应细胞的特定FcR的表达受控于体液因子，如细胞因子。例如，已经发现干扰素γ(IFN-γ)增强FcγRI的表达，这种增强的表达提高了FcγRI表达细胞对靶的细胞毒活性，效应细胞能够吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。

“靶细胞”指对象(如人或动物)中的任何不需要细胞，它能被发明的组合物(如，人类单克隆抗体，双特异性或多特异性分子)所靶向。在一项优选实施方案中，靶细胞是表达过量表达PSMA的细胞。表达PSMA的细胞典型包括肿瘤细胞，如***、肾脏和结肠肿瘤细胞。

虽然人类单克隆抗体是优选的，其它抗体也可用于发明的双特异性或多特异性分子，它们是小鼠，嵌合和人源化单克隆抗体。

小鼠-人类嵌合的单克隆抗体(即嵌合抗体)可以通过该领域中已知的重组DNA技术产生，例如，编码小鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因用限制性酶消化以除去编码小鼠Fc的区域，并用编码人类Fc恒定区的等价部分取代(见Robinson等，国际专利出版PCT/US 86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，U.S专利No.4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。

嵌合抗体可以进一步被人源化，这通过用来自人类Fv可变区的等价序列取代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列。人源化嵌合抗体的一般综述见Morrison，S.L.1985，Science 229：1202-1207和Oi等，1986，BioTechniques 4：214。方法包括从至少一条重链或轻链中的之一中分离、操作和表达编码免疫球蛋白Fv可变区的所有或部分核酸序列。这种核酸的材料对此领域的技术人员是很熟悉的，例如，可以从一种产生抗GPII_bIII_a抗体的杂交瘤7E3中获得。接着就可把编码嵌合抗体的重组DNA或其片段克隆到合适的表达载体上。合适的人源化抗体还可通过CDR取代产生，U.S专利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等，1988 Science 239：1534和Beidler等，1988 J.Immunol.141：4053-4060。

一特定的人类抗体的CDRs的全部可以被至少非人CDR的一部分取代，或者只有CDRs的一部分被非人CDRs取代。仅取代人源化抗体结合Fc受体所需数目的CDRs就可以了。

抗体可以通过任何方法人源化，其中此方法能够用来自非人抗体的CDR取代至少人类抗体CDR的一部分。Winter描述一种方法，该方法可用于制备发明的人源化抗体(UK专利申请GB 2188638A，1987.3.26成文件)，该专利的内容在文献中以表述引入。人类CDRs被非人CDRs取代可用寡聚核苷酸定点突变法，如在国际申请WO 94/10332注册，Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on HumanMononuclear Phagocyles中所描述的。

特定的氨基酸被取代，删除或增加的嵌合和人源化抗体也在发明的范围之内。尤其是，优选的人源化抗体在构架区具有氨基酸取代，以增强对抗原的结合。例如，在具有小鼠CDRs的人源化抗体中，位于人类构架区的氨基酸可以被位于小鼠抗体的相应位置的氨基酸取代。已知这种取代在一些情况下是为了提高人源化抗体与抗原的结合。氨基酸被增加、删除或取代的抗体在这里被称为修饰的抗体或改变的抗体。

术语“修饰的抗体”也将包括如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，它们已经被通过删除、增加或取代抗体的部分而修饰过。例如，抗体可以被通过删除恒定区和用恒定区取代它而被修饰，这意味着提高半衰期，如血清中的半衰期，稳定性或抗体的亲和性。只要双特异性和多特异性分子具有至少一个特异于FcγR的抗原结合区和激发至少一种效应细胞功能，任何修饰都在发明的范围内。

制备此发明的双特异性和多特异性分子可以利用化学技术(见如D.M.Kranz等(1981)Proc.Nacd.Acad.Sci.USA 78：5807)，“Polydoma”技术(见U.S.专利4,474,893，待阅)，或重组DNA技术。

尤其地，此发明的双特异性和多特异性分子可以通过偶联组分结合特异性，如抗FcR，和抗PSMA结合特异性而制备，这可利用此领域中已知的方法和这里所提供的例子中所描述的方法，例如，可以分别产生双特异性分子和多特异性分子的每一结合特异性，然后将其彼此相连。当结合特异性是蛋白质或多肽时，多种偶联或交叉连接试剂可用于共价连接。交叉连接试剂包括蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰-S-乙酰基-巯基乙酸(SATA)，5，5′-二硫叉(2-硝基苯酸)(DTNB)，邻苯基二马来酰亚胺(oPDM)，N-琥珀酰-3-(2-二硫吡啶基)丙酸(SPDP)和硫代琥珀酰4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸(硫代-SMCC)(见，如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648).其它方法包括以下所述的Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)229：81-83)和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)。优选的偶联试剂是SATA和硫代SMCC，两者都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)购得。

当结合特异性是抗体时(如两人源化抗体)，它们可以通过两重链的C末端铰链区的巯基成键而连接。在一项特殊优选的实施方案中，在连接之前，铰链区被修饰而含有奇数的巯基残基，优选为1个。

或者，两个结合特异性由同一载体编码并在同一宿主细胞中表达及组装。当双特异性或多特异性分子是mAb×mAb，mAb×Fab，Fab×F(ab′)₂或配基×Fab融合蛋白时，这种方法尤其有用。发明的双特异性和多特异性分子，如双特异性分子，可以是单链分子，如单链双特异性抗体，包括一个单链抗体和一个结合决定子的单链双特异性分子，或者包括两个结合决定子的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可是单链分子或含有至少两个单链分子。制备双特异性和多特异性分子的方法已被描述，如U.S.专利号5,260,203；U.S.专利号5,455,030；U.S.专利号4,881,175；U.S.专利号5,132,405；U.S.专利号5,091,513；U.S.专利号5,476,786；U.S.专利号5,013,653；U.S.专利号5,258,498和U.S.专利号5,482,858。

双特异性和多特异性分子与其特异的靶结合可以用以下方法确定：酶联免疫分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，FACS分析，生物测定(如生长抑制)，或免疫杂交分析。这些分析通常都检测感兴趣的特定的蛋白质-抗体复合物的存在，这通过使用特异于感兴趣复合物的标记试剂(如抗体)，例如，FcR-抗体复合物可以利用识别并特异性与此复合物结合的酶联抗体或抗体片段而检测。或者，此复合物可用其它免疫分析的任何一种测定，例如，抗体被放射性标记而用于放射免疫分析(RIA)(见，例如Weintraub，B.Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March.1986，3，此书在这里被引入文献)。放射性同位素可以利用γ计数器或液闪计数器或通过放射自显影而检测到。

IV.抗体偶联物/免疫毒素

在另一方面，该发明的特征是人类抗PSMA单克隆抗体或其片段与一治疗性部分相连，如细胞毒素，药物或放射性同位素。当与细胞毒素相连时，这种抗体偶联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞有害的(如杀伤)的任何试剂，例子包括紫杉醇，松胞菌素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂毒素，鬼臼亚乙苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，长春花新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，道诺红菌素，二羟基炭疽菌素，半托蒽醌，光神霉素，放线菌素D，1-脱氢***，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，***和嘌呤霉素及其相似物或同源物。治疗试剂包括抗代谢物(如氨甲喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化剂(如氮芥，thioepa苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥，亚硝基脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露醇，链脲菌素，丝裂霉素C和顺式二氮二胺铂(II)(DDP)顺铂)，炭疽环素(如道诺红菌素(前体为放线菌素)和阿霉素)，抗生素(如放线菌素D(前体是放线菌素)，博来霉素，光神霉素和思霉素(AMC))和抗有丝***剂(如长春花新碱和长春花碱)，该发明的抗体可与放射性同位素连接，如放射性碘，以产生细胞毒性的放射性药物，用于治疗PSMA相关性紊乱，如癌。

发明的抗体偶联物可用于修饰一给定的生物应答，而且药物部分不局限于经典的化学治疗试剂。例如，药物部分可以是具有所需的生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如酶活性毒性或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假单胞杆菌外毒素，或白喉毒素；如肿瘤坏死因子或干扰素-γ的蛋白；或生物应答修饰因子，如淋巴因子，白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。

偶联这种治疗部分和抗体的技术已很成熟，如见：Arnon等“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In CancerTherapy”，出自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中，Reisfeld等(编辑)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，出自Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview”，出自Monoclonal Antibodies 84：Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective of The Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy”，出自Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(编辑)，pp.303-16(Academic Press1985)；和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties ofAntibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。

V.药物组合物

另一方面，该发明提供一组合物，如药物组合物，它含有该发明的人类单克隆抗体或其抗原结合部分的一种或其组合，其中的抗体与药学上可接受的载体结合在一起，在一项优选实施方案中，组合物包括发明的多种(如两种或更多种)分离的人类抗体或其抗原结合部分的组合。优选地，组合物中的每种抗体或其抗原结合部分结合PSMA的不同的预选抗原表位。

在一项实施方案中，具有互补活性的人类抗PSMA单克隆抗体用于互相组合，如，包含两种或多种人类抗PSMA单克隆抗体的药物组合物。例如，能在效应细胞存在下介导高效杀伤靶细胞的人类单克隆抗体可以与能够抑制表达PSMA的细胞生长的其它人类单克隆抗体相结合。

在另外的实施方案中，组合物包括发明的双特异性或多特异性分子(如它含有至少一个对Fc受体的结合特异性和至少一个对PSMA的结合特异性)的一种或其组合。

发明的药物组合物也可在组合治疗中给药，即与其它药剂相结合。例如，组合治疗可包括发明的具有至少一种抗肿瘤药剂的组合物或其它常规疗法。

如这里所用，“药理上可接受载体”包括任何和所有溶剂，分散剂，包被物，抗细菌和抗真菌试剂，等渗和吸收延伸试剂，以及其它生理可容的试剂。优选地，载体适合于静脉、肌肉、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药(如通过注射或灌注)。依赖于注射途径，活性复合物，即抗体，双特异性和多特异性分子，可被一种材料包被以保护其远离可能使其失活的酸性和其它自然环境。

“药理上可接受盐”指保留其母体化合物的理想生物活性并且不引入任何不需要的毒性效应的盐(如见Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的盐，如盐酸，硝基，磷酸，硫酸，氢溴酸，氢碘酸，磷及其它，以及来自无毒有机酸的盐，如单羧基和二羧基脂肪酸，苯取代的链烷酸，羟基链烷酸，芳香酸，脂肪酸和芳香硫酸以及其它。碱加成盐包括来自碱土金属的盐，如钠，镁，钙及其它，以及来自无毒有机胺的盐，如N，N′-二苯联苯胺，N-甲基谷氨酰胺，氯代普鲁卡因(chloroprocaine)，胆碱，二乙醇胺，乙基联二胺，普鲁卡因及其它。

该发明的组合物可以利用该领域的许多方法给药。正如技术人员所熟知的，给药的途径和/或方式随所需的结果而变。活性化合物在制备时加入载体，以保护它不迅速释放，如受控释放的形成，这包括移植、经皮膜片和微囊释放***。可以利用生物降解的和生物相容的多聚体，如多聚乙烯基乙酸，多聚氢离子，多聚甘油酸，胶原，多聚邻乙酯和多聚乙酸。制备这种形式的制剂的许多方法已申请专利或者对此领域的技术人员一般是熟悉的，见如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.Marcel Dekker.Inc.New York，1978。

在以一定的给药途径给药发明的化合物时，有必要将化合物用一种防止其失活的材料包被或共给药。例如，化合物可以在合适的载体中给药一对象，如脂质体，或稀释剂。药理可接受的稀释剂包括盐水和水缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂和常规的脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。

药理可接受的载体包括无菌水溶液或分散体及为了临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉状剂。利用这种介质和试剂作为药理上活性物在该领域中是熟知的。目前为此除了一些常规介质或试剂与活性化合物不相容外，在发明的药物组合物中，其使用是经详细考虑的。其它活性化合物也可加入到组合物中。

治疗组合物必须在操作和贮存条件下是无菌和稳定的。这种组合物可以以溶液、微乳剂、脂质体、或其它适于高浓度药的有序结构形式形成。载体可以是溶剂成分散介质，它们含有，如水、乙醇、多元醇(如甘油、预防烯甘醇和液相聚乙烯甘醇及其它)，和其合适的混合物。应该保持合适的流动性，例如，通过利用如卵磷脂的包被剂，在分散剂状况下保持所需的颗粒大小和利用表面剂。在许多状况下，组合物中优选包括等渗剂，如糖，如甘露醇的多元醇，山梨糖醇，或氯化钠。给药的组合物的长期吸收的实现可以通过在组合物中包含能够延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶。

无菌注射溶液可通过以下方式制备：将活性化合物溶于适当的溶剂中，以所需的量与以上所列成分的一种或几种组合一起引入，然后进行无菌微滤。一般地，分散剂以以下方式制备：将活性化合物引入无菌载体中，其中无菌载体含有基本的分散介质和所需的来自以上所列的其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这种方法产生了活性成分加上任何另外所需的来自预先无菌过滤溶液的成分的粉剂。

调整剂量以产生所需的最佳应答(如治疗应答)。例如，可以给药一大团丸剂，几个不同剂量在不同时间给药或剂量成比例减小或增大，这随治疗状况而定。为了易于给药及剂量的统一性，尤其有利的是以剂量单位形式形成肠胃外组合物。这里所用的剂量单位形式指为了治疗对象而不同于生理单位的剂量；每个单位含有为产生所需的治疗效应而计算的预定量的活性化合物，该化合物并与所需的药物载体相结合。发明的剂量单位形式的特异之处叙述并直接依赖于以下(a)活性化合物的独特牲征和将获得的特定治疗效应，和(b)为了治疗个体的敏感性而偶合此活性化合物的技术的局限性。

药理上可接受的抗氧化剂包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，半胱氨酸氯化氢，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠和其它；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸基棕榈酸，丁化羟基苯甲醚(BHA)，丁化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，丙基没食子酸，α-生育醇和其它；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸及其它。

对于治疗组合物，该发明的制剂包括那些适于口腔、鼻、局部(包括口和舌下)、直肠、***和/或肠胃外给药的形式。该制剂可以便利地以单位剂量形式表示及通过治药领域中任何已知的方法制备。可与载体材料结合以产生单位剂量形式的活性成分的量将随治疗对象、和给药的特定方式而变。可与载体材料结合以产生单位剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效应的组合物的量。一般地，除了百分之百，该量的范围是活性成分为0.01％至约99％，优选的是0.1％到约70％，最优选的是1％至约30％。

该发明的适于***给药的制备物也包括***环，棉条，凝胶，膏状物，泡沫或含有此领域中合适的载体的喷涂制剂。局部或经皮给药发明的组合物的剂量形式包括粉剂，喷剂，油膏，糊剂，乳膏，洗剂，凝胶，溶液，贴片剂，和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与下列物质混合：药理上可接受的载体，任何防腐剂，缓冲剂或可能所需的推进剂。

这里所有的说法“肠胃外给药”和“给药肠胃外”指肠道和局部给药之外的方式，通常是通过注射，它包括但不局限于皮内、肌肉、动脉、壁内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹腔、跨气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、硬膜和胸骨内注射和灌注。

在发明的药物组合物中可能使用的水和非水载体包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇和其它)，和其合适的混合物，植物油，如橄榄油，和注射性有机酯，如乙基油酸酯。其应保持合适的流动性，例如通过利用包被材料，如卵磷脂，通过在分散剂状况下保持所需的颗粒大小和通过利用表面活性剂。

这些组合物也可含有佐剂，如防腐剂，保湿剂，乳化剂和分散剂。确保防止微生物出现的方法有灭菌措施，如上所述，和加入不同的抗细菌和抗真菌试剂，例如食品防腐剂，氯代丁醇，苯酚山梨酸和其它。组合物也可包括等渗试剂，如糖，氯化钠，和其它。另外，注射的药物形式的延长吸收可通过加入延迟吸收的试剂来实现，如单硬脂酸铝和白明胶。

当该发明化合物以药物形式给药人类和动物时，它们可以单独给药或以药物组合物形式给药。它含有，例如与药理上可接受的载体相结合的0.01％至99.5％(更优选的0.1％到90％)活性成分。

不考虑所选的给药途径，该发明的复合物通过该领域的技术人员所熟悉的常规方法形成药理上可接受的剂量形式，其中复合物以水合形式和/或该发明的药物组合物形式使用。

该发明的药物组合物活性成分的实际剂量水平可变以获得活性成分的量，使得该量对于特定的病人，组合物和给药方式能有效达到期望的治疗应答，而且对病人无毒。所选的剂量水平依赖于不同的药物动力学因子，它包括所使用的该发明的特定组合物的活性，或其酯、盐或胺，给药途径，给药时间，所用特定复合物的***速度，治疗过程，与所用的特定组合物结合使用的其它药、复合物和/或材料，年龄，性别，体重，状态，治疗病人的健康状况和前医疗史，和医疗领域所熟知的相似因子。

具有此领域中一般技术的医生或兽医就易于指出和确定所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医开始时使得药物组合物中所用的发明化合物的剂量低于所需的量，以获得所期望的治疗效应，并且缓慢增加剂量，直到获得所期望的效果。一般地，发明的化合物的合适的日剂量是有效产生治疗效果的最低剂量时化合物的量。这种有效剂量一般依赖于以上所述的因素。优选的给药方式是静脉、肌肉、腹腔，或皮下给药，优选给药位点是靠近靶位点处。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以在一天内间隔适当时间分别以二、三、四、五、六或更多次亚给药方式给药，最好是以单位剂量形式。虽然可以单独给药该发明的化合物，但优选的是以治疗制剂(组合物)形式给药复合物。

治疗组合物可以用此领域中已知的医疗设备给药。例如，在优选的实施方案中，发明的治疗组合物用无针头皮下注射设备给药，如在U.S.专利Nos.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所公开的设备。该发明中有用的熟知的移植物和组件包括：U.S.专利No.4,487,603，它公开了用于分散药疗法的可控制速度的移植微灌注泵；U.S.专利No.4,486,194，它公开了用于通过皮肤给药药的治疗设备；U.S.专利No.4,447,233，它公开了用于以确定的灌注速度释放药疗物的药疗灌注泵；U.S.专利No.4,447,224，它公开了用于连续性药物释放的可变流动移植灌注装置；U.S.专利No.4,439,196，它公开了具有多室空间的渗透药物释放***；和U.S.专利No.4,475,196，它公开了渗透药物释放***。这些专利在这里引入文献。许多其它的这种移植物、释放***和组件是该领域的技术人员所已知的。

在一些实施方案中，发明的人类单克隆抗体能够确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性复合物。为了确保发明的治疗复合物越过BBB(如果期望)，它们可以以下列形式产生，如脂质体。操纵脂质体的方法，见如U.S.专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以含有一个或多个能够被选择性转运到特异细胞或器官的部分，因而增强了靶药物的释放(见，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分包括叶酸或生物素(见，如U.S.专利5,416,016，Low等)；乳糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其中表面蛋白A的不同种类可包括发明的制备物以及发明的分子的组分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273.在发明的一项实施方案中，发明的治疗化合物是在脂质体中形成；在一项更优选的实施方案中，脂质体包括靶向部分。在一项最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物以团注射到靠近肿瘤或感染位点的方式释放。组合物必须以易于注射的程度流动，它必须在操作和保存条件下稳定而且必须保持无细菌和真菌等微生物的污染。

相对未治疗对象“治疗有效剂量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％，更优选地至少约40％，还优选的至少约60％，及再优选的至少约80％。化合物抑制癌的能力可以在动物模型***中测定，其中动物模型***能够预示人类肿瘤中的效应。或者，组合物的特征可以通过测定化合物的抑制能力来测量，这种体外分析的抑制作用是技术人员所知道的。治疗化合物的治疗有效量能够减小肿瘤大小，或者在对象中减轻症状。此领域的一项通常技术能够确定该量，它基于以下因子：对象大小，对象症状的严重性和所选的特定组合物或给药途径。

组合物必须无菌及流动，其流动程度要使得组合物能用注射器释放。除了水，载体可以是等渗缓冲盐溶液，乙醇，多元醇(例如甘油，丙烯醇，和液相聚乙二醇，及其它)，和其合适的混合物。恰当的流动性可通过以下方式保持，如，利用如卵磷脂等包被，在分散状况下保持所需的颗粒大小和利用表面剂。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗试剂，例如糖，多元醇，如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。注射组合物的长期吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝或白明胶。

当活性化合物如上所述被恰当保护时，例如化合物可以口服，利用惰性稀释剂或可同化改造的载体。

VI.发明的用途和方法

该发明的组合物(如PSMA的人类单克隆抗体和其衍生物/偶联物)具有体外和体内治疗和诊断的用途。例如，这些分子可以给药到培养的细胞中，如体外，或给药到一对象中，如体内，以治疗，防止或诊断不同的病症。如这里所用，“对象”包括人和非人动物。优选的人类动物包括具有紊乱症的人类病人，其特征在于PSMA的表达，尤其是异常表达(如过量表达)。例如，该发明的方法和组合物能用于治疗具有肿瘤性紊乱的对象，如特征是出现表达PSMA肿瘤细胞的紊乱，这种肿瘤细胞包括，如***、结肠和肾肿瘤细胞。发明中的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类，绵羊，狗，牛，鸡，两栖类动物，爬行动物，等。

发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)可结合体外治疗或诊断用来在初始时测定其结合活性。例如，发明的组合物可以利用下述例子中所描述的ELISA和流式细胞分析来测定。而且，这些分子在启动至少一种效应者介导的效应细胞活性，包括对表达PSMA的细胞裂解作用，中的活性也可被分析。分析效应细胞介导的吞噬作用的步骤在下面的例子描述。

发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)在治疗和诊断PSMA相关的疾病方面具有另外的用处。例如，人类单克隆抗体，多特异性或双特异性分子可用于，如，体内或体外引发下列生物活性的一种或多种：调理细胞表达PSMA；在人类效应细胞存在下，介导吞噬或裂解表达PSMA的细胞，或抑制表达PSMA的细胞的生长。

在一特定的实施方案中，人类抗体和其衍生物体外用于治疗、防止或诊断不同的PSMA相关疾病。PSMA相关疾病包括不同的癌，例如***、肾和结肠癌。

给药发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)的方法是此领域中已知的。所用分子的合适剂量依赖于对象的年龄和体重以及所用的特定药物。分子可以与放射性核素偶联，如131I，90Y，105Rh等，如在Goldenberg，D.M等(1981)Cancer Res.41：4354-4360和在EP 0365997中所描述的。发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)也可与抗感染试剂偶联。

靶特异性效应细胞，如与发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)偶联的效应细胞，也可被用作治疗试剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，如巨噬细胞，嗜中性细胞或单核细胞。其它细胞包括嗜酸性细胞，自然杀伤细胞和其它具有IgG或IgA受体细胞。如果需要，效应细胞可以从被治疗的对象中获取。靶特异性效应细胞可以悬浮于生理上接受溶液形式给药。给药的细胞数在10⁸-10⁹之间，但将随治疗目的而异。一般地，其量将足够定位于靶细胞，如表达PSMA的肿瘤细胞，及足够影响细胞杀伤作用，如通过吞噬作用，给药途径也可改变。

利用靶特异性效应细胞的治疗可以结合其它技术，以除去靶向的细胞。例如，利用该发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)和/或具有这些组合物臂的效应细胞的抗肿瘤治疗可与化疗结合。另外，结合免疫治疗可用于指导不同的细胞毒性效应种群靶向消除肿瘤细胞。例如，与抗Fc-γRI或抗CD3偶联的抗PSMA抗体可以与IgG或IgA受体特异的结合试剂结合使用。

发明的双特异性和多特异性分子也可用于调控效应细胞的FcγR或FcαR水平，例如通过盖住或减少细胞表面的受体，抗Fc受体的混合物也可用于这一目的。

具有补体结合位点的发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)，也可用于在补体存在的状况下，其中补体结合位点如来自与补体结合的IgG1，-2，或-3或IgM的部分。在一项实施方案中，利用发明的结合试剂和适当的效应细胞体外治疗包括靶细胞的细胞群体时，可附加加入补体或含有补体的血清。对包被着发明的结合试剂的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白的结合而增强。在另一项实施方案中，包被着发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可被补体裂解。

发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)也可与补体一起给药。相应的，包含人类抗体，多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物也在发明的范围之内。这些组合物的优势在于补体与人类抗体多特异性或双特异性分子位置很靠近。或者，发明的人类抗体，多特异性或双特异性分子和补体或血清可分别给药。

包含发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)和使用说明的试剂盒也在发明的范围之内。试剂盒可进一步包括至少一种另外的试剂，如补体，或一种或多种发明的另外人类抗体(如具有补体活性的人类抗体，该抗体与不同于第一人类抗体的PSMA抗原的一个抗原表位结合)。

在其它实施方案中，对象可用能够调控，如增强或抑制，Fcγ或Fcα受体的表达或活性的一种试剂治疗，例如，通过用细胞因子治疗对象。在治疗过程中，与多特异性分子一起给药的优选细胞子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

发明的组合物(如人类抗体，多特异性和双特异性分子)也可用于靶向表达FcγR或PSMA的细胞，例如，标记这类细胞。为此，结合试剂可与能被检测的分子相连。因而该发明提供了体外定位表达Fc受体细胞的方法，如FcγR或PSMA。可检测的标记可以是，如放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅助因子。

在一项实施方案中，该发明提供检测样品中PSMA抗原的存在，或测定PSMA的量的方法，包括使人类单克隆抗体或其抗原结合部位接触样品和对照样品，该抗体与PSMA特异结合，其中测定是在允许抗体或其它部分与PSMA形成复合物的条件下。接着检测复合物，其中与对照样品相比，复合物的形成的差异显示样品中PSMA抗原的存在。

在另一项实施方案中，该发明提供了用于体内或体外检测Fc表达细胞的存在及其定量的方法。该方法包括i)与可检测的标记物相连的发明的组合物(如多特异性或双特异性分子)给药到对象中；ii)以一种方式展示对象以检测所述的可检测标记物，从而鉴定含有Fc表达细胞的区域。以下的例子将进一步阐释该发明，这些例子不应被理解为进一步限制。申请中所引用的所用图、所有文献、专利和公开的专利申请的内容在这里引入作为参考。

实施例

例1用于产生抗-PSMA人类抗体的Cmu靶向小鼠的生长

CMD靶向载体的构建

质粒pICEmu含有小鼠Ig重链转基因座的EcoRI/XhoI片段，跨越mu基因，其中mu基因来自Balb/C基因组λ噬菌体库(Marcu等，Cell22：187，1980)。该基因组片段亚克隆到质粒pICEMI9H的XhoI/EcoRI位点(Marsh等，Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重链序列延伸到恰位于mu基因内增强子3′端的EcoRI位点的下游，并延伸到XhoI位点，其中XhoI位点位于mu基因的最后跨膜外显子的下游约1kb；然而，许多mu转变重复区已经在大肠杆菌中通过传代而被删除。

靶载体的构建如下(见图1)。从pICEmu中除去1.3kb的HindIII/SmaI片段，并亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)。该pICEmu片段从位于Cmul 5′约1kb处的HindIII位点延伸到位于Cmul内的SmaI位点。所产生的质粒用SmaI/SpeI消化，并***来自pICEmu的约4kb的SmaI/XabI片段，其中该片段从Cmul 3′中的SmaI位点延伸到恰位于最后的Cmu外显子的下游的XbaI位点。所形成的质粒pTAR1在SmaI位点线性化，并***neo表达DNA序列组件。该DNA序列组件由neo基因构成，其中neo基因在小鼠的磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(XbaI/TaqI片段，Adra等(1987)Gene 60：65-74)转录调控下，并且含有pgk的聚腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段，Boer等(1990)Biochemical Genetics 28：299-308)。该DNA序列组件来自质粒pKJ1(由Tybulewiz等(1991)Cell 65：1153-1163描述)，neo DNA序列组件从该质粒中以EcoRI/HindIII片段形式切下并亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)以产生pGEM-7(KJ1)。neo DNA序列组件通过EcoRI/SalI消化从pGEM-7(KJ1)中切下，平末端化并亚克隆到质粒pTAR1的SmaI位点，其中方向与基因组Cmu序列相反。所产生的质粒用NotI线性化，并***单纯疱疹病毒的胸苷激酶(tk)的DNA序列组件以允许富集含有同源重组体的ES克隆，这如在Mansour等(1988)Nature 336：348-352中所描述的。该DNA序列组件由tk基因的编码序列组成，其中tk基因两侧分别是小鼠pgk启动子和多聚腺苷酸化位点，这如Tybulewicz等(1991)Cell 65：1153-1163中所述。所产生的CMD靶载体含有约5.3kb的重链转基因座的同源序列，并被设计产生突变的mu基因，在该基因中，***了位于第一个Cmu外显子中的唯一的SmaI位点处的neo表达DNA序列组件。靶载体在电转入ES细胞中之前用PvuI线性化，该酶从质粒序列内部将其切断。

靶向ES细胞的产生和分析

AB-1ES细胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.(1990)Cell 62：1073-1085)生长在有丝***失活的SNL 76/7细胞饲养层(ibid)，这基本上如已经描述的(Robertson，E.J.(1987)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：a Practical Approach(E.J.Robertson编辑)Oxford：IRL Press，p.71-112)。线性化的CMD靶向载体利用Hasty等(Hasty，P.R.等(1991)Nature 350：243-246)所描述的方法电转入到AB-1细胞中。电转化的细胞以1-2×10⁶细胞/培养皿的密度平铺到100mm培养皿中。24小时之后，G418(200微克/ml活性组分)和FIAU(5×10^-7M)加入到培养基中，药物耐受性细胞能够生长超过8-9天。挑选克隆，胰酶消化，分成两部分并进一步扩增。来自每一克隆的细胞的一半冻存，另一半则用于分析载体和靶序列的重组。

DNA分析利用Southern杂交进行。DNA用如Laird等(Laird.P.W.等(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)所描述的从克隆中分离。分离的基因组DNA用SpeI消化，用915bp的SacI片段，探针A(见图1)杂交，该探针与mu基因内增强子和mu转变区之间的一序列杂交，探针能检测来自野生型基因座的9.9kb SpeI片段和来自mu基因座的诊断性7.6kb泳道，其中该mu基因座已与CMD靶向载体(neo表达DNA序列组件含有SpeI位点)同源重组。利用Southern杂交分析在对1132个G418和FIAU耐受性克隆的筛选中，3个显示出表示在mu基因座发生同源重组的7.6kb SpeI泳道。这3个克隆进一步用酶BglI，BstXI和EcoRI消化，以确证载体同源性整合到mu基因中。当用探针A杂交时，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的Southern杂交分别产生15.7、7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在则分别由7.7、6.6和14.3kb的片段表示。由SpeI消化所检测到的所有3个阳性克隆显示出：所期望的BglI，BstXI和EcoRI限制性片段能够预测neo DNA序列元件***到Cmul外显子。

含有突变的mu基因的小鼠的产生

分别记为264，272和408的三个靶向ES克隆融化并如Bradley(Bradley，A.(1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：aPractical Approach(E.J.Robertson编辑)Oxford：IRL出版，p.113-151)所描述的注射到C57BL/6J胚胞中。注射过的胚泡转入到假孕雌性小鼠的子宫中以产生含有来自所转入的ES细胞的细胞和宿主胚泡的混合物的嵌合小鼠。嵌合体中ES细胞所占的比例可以直观的估计，这是利用位于黑色C57BL/6J后部的野灰色斑的数量，其中这是衍生于ES细胞系。克隆272和408仅产生低百分比的嵌合体(即低百分比的野灰色色斑)，但克隆克隆267则产生高百分比的雄性嵌合体。这些嵌合体与C57BL/6J雄***配，而产生了野灰色后代，这显示ES细胞基因组的种系传递。靶mu基因的筛选是通过对来自尾巴生物样本的BgII消化DNA的Sonthern杂交分析(如上所述的ES细胞DNA分析)而进行，约50％的野灰色后代显示出除了15.7kb的野生型泳道外的7.7kb的BglI杂交泳道，这证明靶mu基因的种系传递。

对转基因小鼠mu基因功能失活的分析

为了确定是否neo DNA序列组件***到Cmul中能使Ig重链转基因失活，克隆264嵌合体与一JHD突变的纯合体小鼠交配，其中该JHD突变是由于删除了JH基因片段而使重链表达失活(Chen等，(1993)，Immunol.5：647-656)，产生了4个野灰色后代。在这些动物1个月时从中获得血清，并用ELISA分析小鼠IgM的存在。四只小鼠的两只完全缺失IgM(见表1)，利用Southern杂交分析来自尾巴生物样本的DNA，来对四只动物进行基因型鉴定，其方法如下：BglI消化并用探针A杂交(见图1)，和StuI消化并用475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)杂交，结果证明在不能表达血清IgM的动物中，重链转基因座的一个等位基因含有JHD突变，另一基因座则含有Cmul突变。JHD突变杂合的小鼠显示出野生型水平的Ig。这些数据证明Cmul突变失活mu基因的表达。

表1

小鼠	血清IgM(mg/ml)	Ig H链基因型
			42	＜0.002	CMD/JHD
43	196	+/JHD
			44	＜0.002	CMD/JHD
45	174	+/JHD
			129×BL6F1	153	+/+
JHD	＜0.002	JHD/JHD

表1显示了由ELISA检测所得到的血清IgM水平，其中它们分别来自以下小鼠：含有CMD和JHD突变的小鼠(CMD/JHD)，JHD突变杂合的小鼠(+/JHD)，野生型(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)，和JHD突变纯合的B细胞缺陷小鼠(JHD/JHD)。

例2用于产生抗PSMA人类抗体的HCO12转基因小鼠的生成

HCO12人类重链转基因

HCO12转基因是通过共注射80kb的pHC2***物(Taylor等，1994，Int.Immunol.6：579-591)和25kb的pVx6***物而产生的。质粒pVx6按以下所述构建。

8.5kb HindIII/Sall DNA片段含有种系人类VH1-18(DP-14)基因，该基因具有5′端2.5kb和3′端5kb的基因组序列，该HindIII/SalIDNA片段亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)中以产生质粒p343.7.16。7kb BamHI/HindIII DNA片段含有种系人类VH5-51(DP-73)基因，该基因具有5′5kb和3′1kb的基因组序列，此BamHI/

HindIII DNA片段克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor等，1992，Nucleic Acids Res.20：6287-6295)以产生质粒p251f。来自pGP1f的新的克隆载体pGP1k用EcoRV/BamHI消化，并与10kb的EcoRV/BamHI DNA片段连接，该EcoRV/BamHI DNA片段含有5′端有4kb，3′端有5kb基因组序列的种系人类VH3-23(DP47)基因。所产生的质粒，p112.2RR.7用BamHI/SalI消化，并与7kb的纯化的p251fBamHI/SalI***物相连接。所产生的质粒pVx4用XhoI消化，并与p343.7.16的8.5kb XhoI/SalI***物连接。

获得了具有VH1-18基因并与其它两个V基因同向的克隆。这一克隆被记为pVx6，然后用NotI消化，分离的26kb***物与pHC2的分离的80kb NotI***物以1∶1摩尔比共注射到半天时间的F2胚胎(C57BL/6J×DBA/2J)的前核中，这如Hogan等所描述的(B.Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，第二版，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press.Plainview NY)。包括来自Vx6和HC2序列的转基因小鼠的三个独立的种系从注射的胚胎发育而来的小鼠中建立。这些种系记为(HCO12)14881，(HCO12)15083和(HCO12)15087。这三种系的每一个然后与含有CMD突变的小鼠交配，如在例1中的JKD突变(Chen等，19933，EMBO J.12：811-820)和(KCo5)9272转基因(Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14：845-851)中所描述的。所产生的小鼠在背景纯合体中表达人类免疫球蛋白的重链和Kappa轻链转基因，以破坏内源性的小鼠重链和Kappa轻链转基因座。

例3PSMA的人类单克隆抗体和双特异性分子的产生

人类抗PSMA的单克隆抗体是通过用从表达PSMA的LNCaP细胞中纯化的PSMA抗原和/或LNCaP细胞的粗制膜制备物免疫HuMAb小鼠的HCO7和HCO12株系而产生的。

HCO7HuMAb小鼠的产生如在U.S.专利Nos.5,770,429和5,545,806中所描述的，此专利的全部公开部分引入文献。

尤其，HCO7和HCO12小鼠最初用被完全弗氏佐剂乳化的抗原免疫。在以下的免疫中，抗原与不完全弗氏佐剂混合。最后，在取脾之前静脉给药不加佐剂的纯化的抗原。小鼠每2-3周免疫一次。第三次和以后的免疫之后，人类抗PSMA的IgG效价通过ELISA确定(如以下所述)。产生了抗PSMA IgG应答的小鼠在取脾之前静脉给药纯化的抗原三天或三和四天，从应答小鼠中收获脾脏并且分散成单个细胞。

为了生产产生抗PSMA抗体的杂交瘤，来自血浆中含有抗PSMA抗体的小鼠的脾细胞与P3X63-Ag8.653细胞(收藏在ATCC，记为ATCC CRL 1580非分泌小鼠骨髓瘤细胞)和PEG融合。杂交瘤长出之后(约10-14天)，含有杂交瘤的每一孔用抗人类IgG ELISA筛选人类IgG的产生。

阳性杂交瘤基于以下特性筛选和选择：(1)人类IgG1κ抗体的产生，(2)与纯化的PSMA的结合，和(3)与PSMA表达肿瘤细胞的结合。DNA序列分析确证抗PSMA抗体由人类免疫球蛋白转基因的V(D)J重排编码。

简单的说，以固相ELISA为基础的分析用于人类抗PSMA抗体的分析。从LNCaP细胞中免疫亲和纯化的PSMA包被到Maxi-SorP 96孔微量滴定板上(Nunc，Rochester，NY)，并且4℃保温过夜。接着用PBS-0.2％Tween-20洗板，用溶于PBS中的5％牛血清白蛋白室温下封闭1小时。来自抗PSMA产生杂交瘤的上清(50μl)或纯化的抗体(1-5μg/ml，溶于PBS中)加入到孔中，并室温下保温2小时。如以上方法用PBS/Tween洗板，然后与50μl HRP偶联的兔抗人类IgG(1∶5000；Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)室温下保温1小时。洗涤之后，100μl ABTS(150mg 2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸溶于500ml  0.1M柠檬酸，pH 4.35)/H₂O₂(每10ml ABTS溶液10μl30％H₂O₂)生色物/底物溶液加入到每个孔中，并用酶标仪在405nm波长处读取光吸收值。

产生人类IgG的杂交瘤通过ELISA方法与PSMA结合，该杂交瘤利用ELISA和流式细胞仪进一步鉴定同种型及与表达PSMA肿瘤细胞的结合和PSMA阴性细胞的不结合，这如以下所述。具有这些特性上清的杂交瘤被亚克隆，它们的抗体在纯化后进一步鉴定。

根据厂商说明(KPL，Gaithersburg，MD)，单克隆抗体从利用含有1％到5％胎牛克隆(Hyclone，Logan，UT)的HyQ-CCM1培养基的Cellmax生物反应器(Cellco.Laguna Hills，CA)中分离，并利用蛋白G-琼脂糖柱色谱纯化。

纯化的单克隆抗体在0.1M碳酸钠缓冲液，pH 9.5中充分透析，以标记异硫氰酸荧光素(FITC)。FITC贮存液是通过将1mg固体FITC溶于1ml DMSO中而制得。在恒定混合条件下，逐滴加入FITC贮存液，其量为使得每mg抗体蛋白中有50μg FITC。加入FITC之后，溶液在室温下暗处保温1-3小时。FITC标记的抗体利用凝胶过滤在葡聚糖G-10柱上分离，其中葡聚糖G-10柱用PBS平衡。

筛选的几个杂交瘤产生人类IgG1κ抗体，该抗体经ELISA和流式细胞仪分析特异性结合PSMA(如4A3，7F12，8A11，8C12和16F9)。从杂交瘤8C12上清中纯化的单克隆抗体具有≥10^-9的特异结合亲和性，其中此上清如ELISA所检测的显示与PSMA的明显结合。

记为14.1×8C12(图3中所示)和14A8×8C12的双特异性分子是利用经典的交叉连接方法通过二硫键来化学连接Fab′₂片段和人类抗PSMA抗体，8C12，其中Fab′₂片段分别来自人类抗CD89抗体14.1或记为14A8的14.1抗体的亚克隆。

例4抗PSMA的人类单克隆抗体的鉴定

I.人类抗PSMA抗体与肿瘤细胞的结合

通过ELISA检测而显示与PSMA明显结合的单克隆抗体(如4A3，7F12，8A11，8C12和16F9)被进一步测定其与高水平表达PSMA的肿瘤细胞的结合能力，其中单克隆抗体从杂交瘤上清中纯化。

人类抗PSMA的特异抗体的结合特性通过固相ELISA来研究，其中该ELISA利用衍生于LNCaP和PC3细胞的质膜部分。为了制备来自LNCaP和PC3细胞的细胞膜部分，从塑料培养皿中刮下细胞，用PBS充分洗涤，重悬于10体积的去离子水中，并用Dounce匀浆器通过三次每搏输出而匀浆细胞。通过在15000g离心45分钟来分离膜部分，沉淀部分重悬于PBS中。膜沉淀的蛋白浓度利用Pierce(Rockford，IL)BSA试剂盒来测定。

在96孔板中梯度稀释并风干LNCaP和PC3的膜部分。该板在利用如上所述ELISA方法测定之前，用5％BSA封闭，并用溶于PBS中的5μg/ml人类抗PSMA抗体处理1小时。图4中的结果显示了不同的人类单克隆抗体的结果。这些抗体在一定抗原浓度范围内显示出与LNCaP细胞膜的高特异性，然而相对于背景，与PC3细胞膜的结合很小或没有。

另外，人类抗PSMA抗体与活LNCaP和PC3肿瘤细胞的结合通过流式细胞仪研究。简单的，从组织培养中收获肿瘤细胞并制备单细胞悬液。约1百万的细胞重悬于含有0.5％BSA的PBS中，并与50-200μg/ml的FITC标记的人类抗PSMA抗体冰上保温30分钟。细胞用含有0.1％BSA，0.01％NaN3的PBS洗两次，然后在FACSCalibur细胞仪(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上用CellQuest获得性软件分析荧光染色。如图5所示，人类抗-PSMA抗体4A3，7F12，8A11，8C12和16F9显示出与表达PSMA的活LNCaP细胞的强的特异结合性。相反的，PC3细胞染色阴性，或当与不相关的人类抗体匹配的同种型用于LNCaP时，染色阴性。

利用相似的分析，也检测双特异性分子14.1×8C12与表达PSMA的LNCaP细胞(图6)和表达CD89的U937细胞(图7)的结合能力。如在图6和7所示，双特异性分子以剂量依赖性方式与LNCaP和U937细胞结合。

II.人类抗PSMA抗体的结合特异性

抗PSMA抗体4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的结合特异性通过来自LNCaP细胞的蛋白裂解物的免疫沉淀进一步研究。简单地，LNCaP细胞的去污剂裂解物制备如下：加入含1％NP-40的PBS到LNCaP细胞中，保温1小时，然后离心以除去特定的物质。通过在每毫升加入150μg不相关人类IgG1和室温下保温1小时来预处理裂解物，然后在每毫升裂解物中加入150μl填充的蛋白G-Sepharose珠。离心除去这些珠之后，使用上清部分。

预处理的LNCaP细胞裂解物的每等份(100μl)与5μg各种人类抗PSMA抗体混合，4℃保温过夜。珠用PBS充分洗涤，然后加入SDS样品缓冲液。相结合的免疫复合物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到PVDF膜上以作Western杂交分析。膜用TBS/5％脱脂奶粉封闭过夜，与溶于TBS中的5μg/ml的小鼠线性PSMA序列抗原表位特异性抗体4D8保温1小时，用含有0.5％Tween-20(TBS-T)的TBS洗杂交膜5次，并与HRP偶联的羊抗小鼠IgG(1∶5000)保温。用TBS-T洗5次之后，利用LumiGLO化学发光底物试剂盒(KPL，Gaithersburg，MD)显示杂交带并通过暴露给X衍射底片而观测。

结果显示在图8中。PSMA和PSM′如箭头所示，其中PSM′是从N末端缺少最前面的57个氨基酸的另外一种剪切形式。泳道1显示用位于LNCaP细胞裂解物中的BSMA和PSM′的Western杂交反应性。泳道2显示不相关人类抗体相符的同种型(IgG1)的免疫沉淀结果。泳道3到7分别显示抗体4A3，7F12，8A11，8C12和16F9的免疫沉淀结果。在每种状况下，都观察到了相应于PSMA和PSM′的深的泳道，这表明这些抗体与位于该蛋白的胞外结构域的抗原表位相结合，该结构域是跨越44-750氨基酸的区域。

测定抗体与天然PSMA和热变性PSMA的结合以确定蛋白质的构象对结合特异性的重要性。从LNCaP细胞中免疫亲和纯化的PSMA的一等份(40μg/ml溶于PBS中)通过煮沸10分钟而被热变性，然后冰上降温。热变性的PSMA和非变性PSMA的相同等份用PBS  1∶4稀释，加入到96孔Maxi-Sorp板(Nune)的孔中，4℃保温过夜。包被之后，板用溶于PBS中的5％BSA封闭1小时，用PBS洗涤，并利用人类抗PSMA抗体进行夹心ELISA。小鼠抗PSMA的单克隆抗体7E11用作阳性对照，其中7E11特异的抗原表位包括蛋白N末端的最前面的6个氨基酸。如图9所示，热变性对7E11抗体结合无影响，这与其识别线性序列的抗原表位相一致。与这些结果相反，人类抗PSMA抗体4A3，7F12，8A11，8C12和16F9都与天然纯化的PSMA牢固结合，而PSMA的热变性则彻底阻止了抗体的结合。这些结果表明天然蛋白的构象是人类抗PSMA抗体结合所需要的。与这一结果相一致，抗体4A3，7F12，8A11，8C12和16F9在检测PSMA的Western杂交分析中是无效的。

III.抗体结合竞争性研究

抗体结合竞争性研究是利用流式细胞分析来测定是否个别的人类抗PSMA抗体与PSMA上的相似或不同的抗原表位结合。在这些实验中，未标记的抗PSMA抗体封闭FITC标记的抗体PSMA抗体与LNCaP细胞结合的能力被测定。LNCaP细胞被FITC标记的强度通过流式细胞仪测定。

约1百万LNCaP细胞的等份用溶于PBS中的200μg/ml纯化的人类抗PSMA抗体或不相关的人类IgG1抗体冰上预处理1小时。细胞被充分洗涤，并进一步与50μg/ml FITC偶联的人类抗PSMA抗体(或在一些实验中是FITC偶联的小鼠PSMA特异性抗体，如1G9，3C6和4D4)冰上保温1小时。洗涤之后，细胞用10μg/ml的碘化丙锭染色，并利用CellQuest软件在FACSCalibur上利用流式细胞仪分析。

如图10所示，在LNCaP细胞用不相关的人类IgG1预处理的每一种状况下都观察到了FITC标记的人类抗PSMA抗体的很强结合。相反，用个别的人类抗PSMA抗体预处理时则导致了以后的FITC标记的人类抗PSMA抗体结合的基本抑制。不同的抗体配对，其结合抑制的程度有轻微的区别。例如，8C12有效抑制4A3，8A11和8C12结合，但对7F12结合的影响却弱得多。总的来看，这些数据表明7F12和16F9与其它人类抗抗PSMA抗体的竞争性结合行为是很相似的。总之个别的人类抗PSMA抗体识别PSMA上的轻微不同却分布相近的构象抗原表位。

抗体竞争性研究也可利用一小系列小鼠的PSMA特异性抗体来确定是否人类抗PSMA抗体识别与小鼠抗体相同的抗原表位。它们记为1G9，3C6和4D4，也指向蛋白的构象抗原表位。如图11所示，用个别的人类抗PSMA抗体预处理LNCaP细胞，然后用FITC-小鼠4D4和1G9标记，结果很弱或没有明显的抑制作用。相反，人类抗PSMA抗体7F12，8A11，8C12和16F9则明显抑制FITC小鼠3C6的结合，这显示这些抗体的每一种所结合的抗原表位都与3C6所识别的相似或分布相近。人类抗PSMA抗体4A3则对FITC标记的小鼠构象抗体没有抑制作用，这提示它与不同于小鼠1G9，3C6或4D4所结合的抗原表位结合。

例5人类抗PSMA抗体的活性

I.利用人类抗PSMA抗体和双特异性分子抑制肿瘤细胞生长

如上所阐释，可以测定对PSMA显示特异性结合的抗PSMA抗体和双特异性分子抑制表达PSMA肿瘤细胞生长的能力。简单的，在正常生长条件下，将肿瘤细胞与纯化的抗体保温，细胞密度通过结晶紫染色测定。

II.人类抗PSMA抗体和双特异性分子的抗体依赖性细胞介导的细 胞毒(ADCC)活性

测定了双特异性分子14.1×8C12(图3所示)和14A8×8C12，以及单克隆抗体8C12对标记的PSMA表达细胞的多形核细胞介导的ADCC杀灭。

尤其是，单个核细胞(单核细胞和嗜中性细胞)以及全血从健康者中分离，并在双特异性分子14.1×8C12存在的条件下与⁵¹Cr标记的PSMA表达细胞保温。约4小时之后，收集培养孔中的上清并利用γ计数器测定⁵¹Cr的释放。特异性裂解的百分比根据以下公式计算：(实验CPM-无靶CPM)/(去污剂裂解CPM-无靶CPM)×100％。图12A，13A和14A中所显示的结果表明：与对照抗体相比，14.1×8C12分别介导单核细胞和嗜中性细胞和全血对肿瘤细胞的剂量依赖性裂解作用。

在或者双特异性分子14A8×8C12或者单克隆抗体8C12存在下，单个核细胞和全血也与⁵¹Cr标记的LNCaP肿瘤细胞保温(图12B，12C，13B和14B)，在与单个核细胞和全血及不同浓度的双特异性分子或单克隆抗体保温之前，LNCaP细胞用100μCi ⁵¹Cr在37℃(5％CO₂)标记1小时。保温16小时之后，收集上清并如上所述分析放射性活性。

单核细胞诱导的ADCC

如图12A所示，双特异性分子14.1×8C12以剂量依赖方式介导单核细胞对表达PSMA肿瘤细胞的杀伤作用。加入50μg/ml的14.1 Fab′₂完全封闭了1μg/ml的双特异性分子14.1×8C12对肿瘤细胞的ADCC，这证明靶向细胞杀伤作用只由效应细胞上的CD89介导。如图12B所示，双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12也介导单核细胞对LNCaP肿瘤细胞的剂量依赖性裂解作用。而且，与H22F(ab)′₂(人源化抗FcγRI)相比，加入过量的14A8F(ab)′₂完全抑制了双特异性分子14A8×8C12对肿瘤细胞的ADCC，这显示靶向细胞杀伤作用由CD89介导(见图12C)。

嗜中性细胞诱导的ADCC

如图13A所示，以特异性分子14.1×8C12以剂量依赖方式介导嗜中性细胞对表达PSMA肿瘤细胞的杀伤作用。加入25μg/ml的14.1Fab′₂明显封闭双特异性分子对肿瘤细胞的ADCC，这证明靶向细胞杀伤作用特异地由与效应细胞结合的CD89介导。如图13B所示，双特异性分子14A8×8C12也介导嗜中性细胞对LNCaP肿瘤细胞的剂量依赖性裂解。与H22F(ab)′₂(人源化抗FcγRI)相比，加入过量的14A8F(ab)′₂完全抑制了14A8×8C12对肿瘤细胞的ADCC，这显示靶向细胞杀伤作用通过CD89介导。

全血诱导的ADCC

如图14A所示，双特异性分子14.1×8C12以剂量依赖方式介导全血对表达PSMA肿瘤细胞的杀伤作用。加入25μg/ml的14.1Fab′₂明显地封闭了双特异性分子对肿瘤细胞的ADCC，这又一次证明靶向的细胞杀伤作用特异地由与效应细胞结合的CD89介导。相似地，如图14B所示，双特异性分子14A8×8C12也介导全血对LNCaP肿瘤细胞的剂量依赖性裂解作用。与H22F(ab)′₂(人源化抗FcγRI)相比，加入过量的14A8F(ab)′₂完全抑制了14A8×8C12对肿瘤细胞的ADCC，这表明靶向细胞杀伤作用由CD89介导。

III.在人类效应细胞的存在下，人类抗PSMA抗体和双特异性分子 介导对表达PSMA肿瘤细胞的吞噬和杀伤作用

在单独存在下，以及在作为对照的过量的14.1(人类抗FcγR)Fab′₂抗体或过量的H22(人源化抗FcγRI)Fab′₂抗体存在下，测定双特异性分子14.1×8C12和14A8×8C12以及单克隆抗体8C12介导对标记的PSMA表达肿瘤细胞(LnCAP细胞)的吞噬作用的能力。

简单的，双特异性分子介导的单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)对LnCAP细胞的吞噬作用的测定是通过对Munn等(1990)J.Exp.Med.172：231-237中所描述的方法加以修饰而实现的。从正常人来源的白细胞(ABI)中分离的单核细胞在在24孔板(1×10⁶/ml)中分化7-12天，培养基是含有10％FBS和10ng/ml M-CSF的不含巨噬细胞血清的培养基(Gibco，Grand Island，NY).LnCAP细胞用亲脂性红色荧光染色剂，PKH26(Sigma，St.Louis，MO)标记。在不存或存在双特异性抗体(或对照抗体)时，将标记的LnCAP细胞加入到含有MDM的孔中，并在37℃(5％CO₂)保温5-24小时。MDM和未被吞噬的LnCAP细胞用胰酶回收，并用FITC标记的抗CD33mAb(251)和抗CD14mAb(AML-2-3)冰上染色1小时。洗涤细胞并利用FACScan通过双色荧光分析。吞噬作用的百分比按以下计算：双阳性靶细胞数(被MDM吞入)/总的靶细胞数×100％。

如图15所示，双特异性分子14.1×8C12以剂量依赖方式介导增强的特异性肿瘤细胞的吞噬作用。加入14.1Fab′₂则明显地封闭了双特异性分子对肿瘤细胞的吞噬作用，再一次证明靶向吞噬作用由与效应细胞结合的CD89特异性介导。相似地，如图16所示，双特异性分子14A8×8C12和单克隆抗体8C12也以剂量依赖方式介导对LNCaP细胞的吞噬作用。图17显示14A8×8C12介导的对LNCaP肿瘤细胞的吞噬作用由CD89介导，这是因为与H22F(ab)′₂(人源化抗FcγRI)相比，过量14A8F(ab)′₂的加入抑制了此吞噬作用(见***图，图17)。

以上例子证明产生了以高亲和性与PSMA特异性反应的人类单克隆抗体和双特异性分子。这些抗体和双特异性分子看起来识别位于分子的胞外结构域中的天然构象蛋白抗原表位，而不是线性氨基酸序列所确定的抗原表位。另外，在靶向于高水平表达PSMA的人类肿瘤细胞的效应细胞存在下，人类抗PSMA抗体和其双特异性分子介导细胞杀伤和吞噬作用。这些结果支持下列结论：该发明的完整的抗PSMA人类单克隆抗体及其片段和双特异性分子对于诊断和治疗PSMA相关症状是有用的。

等同声明

该领域的技术人员将认识到或仅仅使用常规的实验技术就可以确定这里所描述的发明的特异实施方案中的许多等同方案。这种等同方案包括在权利要求中。

1.G.Kobler和Milstein C.(1975)Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature 256：495-497.

2.G.L.Boulianne.Hozum N.和Shulman M.J.(1984)Production offunctional chimeric mouse/human antibody.Nature 312：643-646.

3.P.T.Jones.Dear P.H.Foote J.Neuberger M.S.和Winter G.(1989)Replacing the complementarity-detemining regions in a humanantibody with those of a mouse.Nature 321：522-525.

4.J.D.Marks等(1991)By-passing Immunization Humanantibodies from V-gene libraries displayed on phage.J.Mol.Biol.222：581-597.

5.N.Lonberg等1994.Antigen-specific human antibodies frommice comprising four distinct genetic modifications.Nature 368(6474)：856-859.

6.G.Gafie，Howe S.C.Butcher M.C.C.W.和Howard H.C.(1997)Antibodies to major histocompatibility antigens produced byhybrid cell lines.Nature 266：550-552.

7.Heston，W.D.(1996)Urologe-Ausgabe A.35：400-407.

8.Gregorakis，A.K.等(1998)Prostate-specific membrane antigen：current和future utility.Seminars in Urologic Oncology 16：2-12.

9.Barren，R.J.3rd等(1998)Method for identifying prostate cells insemen using flow cytometry.Prostate 36：181-188.

10.Murphy，G.P.(1998)Current evaluation of the tissue localization和diagnostic utility of prostate specific membrane antigen.Cancer 83：2259-2269.

11.Silver，D.A.(1997)Prostate-specific membrane antigenexpression in normal和malignant human tissues.Clinical CancerResearch 3：81-85.

12.O′Keefe，D.S.等(1998)Mapping，genomic organization和promoter analysis of the human prostate-specific membrane antigengene.Biochim.Biophys.Acta.1443：113-127.

Claims (41)

1.分离的人类单克隆抗体，它与***特异的膜抗原PSMA特异性结合，其亲和常数至少为10⁷M^-1，其中所述抗体：

(a)结合天然人类PSMA，但不结合热变性人类PSMA；

(b)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性；或

(c)被表达PSMA的细胞内在化。

2.分离的人类单克隆抗体，它与PSMA特异性结合，其亲和常数至少为10⁷M^-1，其中所述抗体：

(a)结合天然人类PSMA，但不结合热变性人类PSMA；和

(b)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。

3.分离的人类单克隆抗体，它与PSMA特异性结合，其亲和常数至少为10⁷M^-1，其中所述抗体：

(a)结合天然人类PSMA但不结合热变性人类PSMA；和

(b)被表达PSMA的细胞内在化。

4.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中抗体与人类PSMA结合的亲和常数至少为10⁸M^-1。

5.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中抗体与人类PSMA结合的亲和常数至少为10⁹M^-1。

6.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中抗体抑制表达PSMA的肿瘤细胞的生长至少约40％。

7.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中抗体抑制表达PSMA的肿瘤细胞的生长至少约60％。

8.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中PSMA是人类PSMA。

9.权利要求1-3任一项中的人类抗体，包括IgG1或IgG3重链。

10.权利要求1-3任一项中的人类抗体，包括κ轻链。

11.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中抗体具有至少一项下列特征：

a)结合亲和常数至少为10⁷M^-1；

b)能够调理表达PSMA的细胞；或

c)在人类效应细胞存在下，体外在浓度为10μg/ml或更少时，能够介导表达PSMA的细胞的细胞裂解作用。

12.权利要求1-3任一项中的人类抗体，它是一个抗体片段或单链抗体。

13.权利要求1-3任一项中的人类抗体，其中表达PSMA的细胞是***肿瘤细胞。

14.权利要求1-3任一项中的人类抗体，由一杂交瘤产生，杂交瘤包括与永生化细胞融合的来自转基因非人动物的B细胞，而转基因非人动物具有含有人类重链转基因和人类轻链转基因的基因组。

15.分离的人类单克隆抗体，它以至少10⁷M^-1的亲和常数特异性结合人类PSMA并且在人类效应细胞存在下介导表达人类PSMA的细胞的细胞裂解作用或抑制其生长。

16.权利要求1-3任一项中的分离的人类抗体，它在体外能够以IC₅₀为1×10^-7M或更低介导人类效应细胞对表达PSMA的细胞的细胞裂解作用。

17.一种包括与永生化细胞融合的来自转基因非人动物的B细胞的杂交瘤，所述转基因非人动物具有含有人类重链转基因和轻链转基因的基因组，其中杂交瘤产生权利要求1-16中任一项的人类单克隆抗体。

18.权利要求17的杂交瘤，它产生由人类IgG重链和人类κ轻链核酸编码的人类单克隆抗体。

19.产生以至少10⁷M^-1的亲和常数特异性结合PSMA的人类单克隆抗体的方法，包括：

用PSMA或表达PSMA的细胞免疫转基因非人动物，所述转基因非人动物具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组，这样抗体由动物的B细胞产生；

分离动物的B细胞；和

融合B细胞和骨髓瘤细胞以产生永生化杂交瘤细胞，杂交瘤细胞分泌特异于PSMA的人类单克隆抗体。

20.双特异性分子，含有权利要求1-16中任一项的人类抗体以及对Fc受体的第二个结合特异性。

21.权利要求20中的双特异性分子，其中Fc受体是人类Fcγ受体或人类Fcα受体。

22.权利要求20中的双特异性分子，它与Fc受体结合的位点不同于免疫球蛋白与此受体的结合位点。

23.权利要求20中的双特异性分子，其中与Fc受体结合的第二个结合特异性是人类单克隆抗体。

24.权利要求20中的双特异性分子，它是单链的或Fab′融合蛋白。

25.多特异性分子，它含有权利要求1-16中任一项的人类抗体、对Fc受体的第二个结合特异性和对非PSMA肿瘤抗原的第三个结合特异性。

26.权利要求25中的多特异性分子，其中Fc受体是人类Fcγ受体或人类Fcα受体。

27.含有权利要求1-16中任一项的人类抗体和药理上可接受的载体的组合物。

28.权利要求27中的组合物，含有与PSMA特异性结合的分离的人类抗体的两种或多种的组合，其中所述的抗体的每一种都与PSMA的不同抗原表位结合。

29.权利要求27中的组合物，还含有化疗性试剂。

30.以至少10⁷M^-1的亲和常数特异性结合PSMA的分离的人类单克隆抗体在制备用于抑制表达PSMA的细胞生长的药物中的用途。

31.以至少10⁷M^-1的亲和常数特异性结合PSMA的分离的人类单克隆抗体在制备用于诱导表述PSMA的细胞的细胞裂解作用的药物中的用途。

32.以至少10⁷M^-1的亲和常数特异性结合PSMA的分离的人类单克隆抗体在制备用于治疗或预防特征为异常表达PSMA的疾病的药物中的用途。

33.权利要求30-32中任一项的用途，其中人类单克隆抗体与对Fc受体的结合特异性偶联。

34.权利要求30-32中任一项的用途，其中人类单克隆抗体与细胞毒素偶联。

35.权利要求32中的用途，其中疾病是癌。

36.权利要求35中的用途，其中癌是***癌。

37.含有编码权利要求1-16中任一项的人类单克隆抗体的可变区的核苷酸序列的分离的核酸。

38.含有权利要求1-16中任一项的人类单克隆抗体的组合物，所述人类单克隆抗体与治疗部分偶联。

39.权利要求38的组合物，其中所述治疗部分是药物。

40.权利要求38的组合物，其中所述治疗部分是细胞毒素。

41.权利要求38的组合物，其中所述治疗部分是放射性同位素。

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