CN100398651C - 植物偏好型重组人表皮生长因子及利用转基因植物生产其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种依据番茄偏爱的密码子设计的新重组人表皮生长因子以及编码所述表皮生长因子的核酸分子。本发明还涉及含有所述核酸分子的表达载体，以及所述表达载体用于制备转基因植物的用途。本发明又一方面涉及一种利用转基因植物生产人表皮生长因子的方法，以及利用所述核酸分子制备转基因植物的方法。

Description

植物偏好型重组人表皮生长因子及利用转基因植物生产其的方法

发明领域

本发明涉及一种依据番茄偏爱的密码子设计的编码人表皮生长因子的核酸分子。本发明还涉及含有所述核酸分子的表达载体，以及所述表达载体用于制备转基因植物的用途。本发明又一方面涉及一种利用转基因植物生产人表皮生长因子的方法，以及利用所述核酸分子制备转基因植物的方法。

发明背景

自1983年首次转基因植物成功以来，植物基因工程的研究与开发进展迅速。国际上已有生物技术公司约500家，已获得转基因植物100种以上，植物基因工程中所用的植物和转入的基因涉及面日益广泛。以植物为生物反应器，利用转基因植物生产基因工程药物和疫苗是目前植物基因工程研究中的一大热点。转化病毒蛋白、细菌毒素、和抗体分子的转基因植物已有成功的报道。

研究表明，大多数情况下，转基因植物中这些基因表达的蛋白都具有完全的生物活性。如转基因植物表达的***病毒或霍乱毒素B亚基抗原对动物进行喂服反应后，能对相应的抗原发生免疫反应。

植物反应器具有以下优点：易栽培管理；易大规模生产；成本低廉；无毒副作用；环保等。用番茄作为生物反应器除了它具有以上植物的优点外，还由于它本身是一种蔬菜，果实味道鲜美，大多数人喜欢生吃，不破坏其药效；番茄的转化过程较为简单；生长周期相对较短；适应性极强，在很多地域都能生长等。利用番茄作为转基因植物文献中曾有报道，如2001年Mor TS将重组的人乙酰胆碱酯酶基因转入番茄，并在果实及叶中检测到酶活性；中国农业科学院利用转基因番茄生产乙肝口服疫苗成功；林忠平等将胰岛素基因导入番茄，检测到有活性的胰岛素等等。

表皮生长因子是一类广泛存在于人和动物体内的可促进或抑制多类细胞生长的多肽，由53个氨基酸残基组成，分子量为6000da左右。人表皮生长因子是人自身分泌的一种生长调节物质，在人类的生命活动中起着十分重要的作用，分泌量不足会严重影响机体的正常生理机能，所以给该类人群补充适量的表皮生长因子能起到很好的预防和治疗效果。

利用转基因番茄生产的人表皮生长因子能够有效地实现对胃肠道的保护作用，主要适用于：胃溃疡；胃灼热，胃酸过多症；胃食道反流症；糜烂性食道炎；十二指肠溃疡；口腔溃疡等疾病。此外，从生产人表皮生长因子的转基因番茄中提取hEGF还可制成片剂、针剂或喷剂用于辅助治疗烧伤，创伤等其他疾病。

转基因番茄生产的人表皮生长因子还可用于制备保健品，适于正常人及老年人群的消化道保健，对胃酸过多及溃疡病人尤为适用。

本发明人利用番茄偏好的密码子人工合成重组人表表皮生长因子基因，并转化番茄，成功地实现了利用生物反应器生产高质量的、价格低廉的人表皮生长因子的目的。

发明内容

本发明的一个方面，涉及一种依据番茄偏爱的密码子设计的编码人表皮生长因子的核酸分子。为了利用番茄实现人表皮生长因子的表达，本发明人选用番茄植物偏爱的密码子，对人表皮生长因子基因加以修饰，并人工合成了经所述修饰的人表皮生长因子基因。具体地，本发明所涉及的番茄偏爱的人表皮生长因子基因编码天然人表皮生长因子的氨基酸序列，但所述核酸分子的核苷酸序列与天然的人表皮生长因子核苷酸序列并不相同(SEQ ID NO：1)。

本发明的又一方面涉及含有本发明所述核酸分子的表达载体。本领域普通技术人员知晓，任何能够用于异源蛋白质在植物中表达的表达载体均适于本发明。任选的，在所述表达载体中还具有与所述核酸分子有效连接的启动子。适于在本发明所述表达载体与本发明所述核酸分子有效连接的启动子选自番茄果实专一性启动子，或块茎、根或其他贮藏器官可大量表达的启动子。在本发明的一个具体实施方案中，其中采用了采用番茄果实专一性高效表达的启动子2A11，使表达的人表皮生长因子集中于果实部位。

本发明依据文献(Mark JJ et al.1993Plant Mol Biol 21：625-640)报道的番茄果实专一性启动子2A11的核苷酸序列及特征，设计一对引物，成功扩增出含有所述启动子的934bp序列。实验证明，这一启动子区域具有十分特异的果实专一性，而且表达量明显高于通用的组成型表达启动子CaMV35S。

在本发明的一个具体实施方案中，采用人工全合成方法合成经番茄偏好密码子修饰的人表皮生长因子基因，并于5’端添加起始密码子ATG及酶切位点BamHI，于3’端添加终止密码子TAA和TAG及酶切位点KpnI(如SEQ ID NO：1所示)，然后连接到pMD-18-T载体上(购自TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)，再通过添加启动序列和终止序列构成一完整的基因表达结构，最后连接到表达载体pCAMBIA2300上(购自澳大利亚CAMBIA公司)。所用各部件都经过了严格检测，确定无误后，进行重组质粒的构建。每构建一步都经过了严格检测，最后对构建的表达载体再经过酶切、PCR及测序检测。然后，转入土壤农杆菌C58和LBA4404中，最后再对转化的农杆菌进一步确认。表达载体的构建过程参见图2和图3。

在本发明又一具体实施方案中，所述表达载体为pCAM-35S-hEGF和pCAM-2A11-hEGF。

本发明再一方面还涉及一种利用转基因植物生产人表皮生长因子的方法，包括利用本发明所述的表达载体转化植物，在所得转基因植物的果实和其他部分实现人表皮生长因子的表达。本领域技术人员知晓，可以用于转化植物的方法包括但不限于农杆菌介导法、基因枪轰击法、PEG介导法，花粉管通道法。适于本发明所述方法的植物选自单子叶植物或双子叶植物。优选的，所述植物选自番茄、蔬菜类和瓜果类作物、水果类植物和块根、块茎类植物。

本发明还涉及含有本发明所述植物偏好的人表皮生长因子的编码核酸分子的表达载体用于制备转基因植物的用途。

本发明还涉及一种制备转基因植物的方法，其中包括用含有本发明所述植物偏好的人表皮生长因子的编码核酸分子之表达载体转化目标植物。适于本发明所述方法的植物选自单子叶植物和双子叶植物。具体的，所述植物包括但不限于番茄、蔬菜类和瓜果类作物、水果类植物和块根、块茎类植物。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明人对经本发明所述方法制备的转基因番茄的基因转化过程加以检测，具体步骤如下：

无菌番茄苗的培养及转化外植体：种子消毒→接种于MS培养基上→光照培养→外植体。

农杆菌介导的叶盘转化：将子叶剪成碎片，置农杆菌中浸泡，无菌水冲洗并吸干，在共培养基上避光培养。

抗性筛选及其稳定整合表达的再生培养：诱导番茄愈伤组织，外植体上的愈伤组织在含卡那霉素的选择培养基上筛选、分化培养，获得抗性转基因植株，抗性小苗经过生根及练苗培养，最后完成组培苗到大田移栽。

通过分子检测技术确定转化成功的植株。初步检测用PCR扩增目的基因，进一步用Southern杂交验证。

番茄(果实及植株)中表皮生长因子表达量的确定。Western杂交确定目的基因已经表达，精确含量由放射免疫法测定。

本发明是利用番茄做为一种植物生物反应器来制造人表皮生长因子，这种人表皮生长因子可以通过生吃番茄的果实，做为一种口服制剂集中于消化道上皮粘膜细胞损伤部位发挥作用，同时，也可以从这种番茄果实或其他部位提取，而获得其他用途的人表皮生长因子产品。

本发明的主要创新点在于(1)选用番茄植物偏爱的密码子，设计并人工合成人表皮生长因子基因；(2)采用番茄果实专一性高效表达的启动子2A11，使表达的人表皮生长因子集中于果实部位。

附图说明

图1表达载体pCAM-35S-hEGF和pCAM-2A11-hEGF结构示意图。

图2表达载体pCAM-35S-hEGF构建过程示意图

图3表达载体pCAM-2A11-hEGF构建过程示意图

图4左图为表达载体pCAM-35S-hEGF的酶切验证图，其中M分子量标准，泳道1、2号为用HindIII+EcoRI的双酶切，切出了大小为1.5kb，包含35S启动子、hEGF目的基因及终止序列的片段。右图为PCR电泳图，M分子量标准，1、2号为扩增图，扩出了大小为180bp左右的目的片段。

图5.表达载体pCAM-2A11-hEGF的PCR验证图。其中泳道1号为DNA分子质量标准，从下到上依次为500bp、1000bp、2000bp、3500bp、5500bp、7000bp；3，4，5号为以2A11的上下游引物进行的PCR扩增；2号为DNA分子质量标准，从下到上为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp；6，7，8号为以hEGF的上下游引物进行的PCR扩增。由图可以看出扩增结果完全正确，说明所构建的表达载体是正确的。

图6：为转基因番茄的Southern杂交图。+表示质粒对照，-表示未转化植株对照，1-8为转化植株，由图可以看出除2、4外都出现了阳性结果。

以下结合实施例和附图对本发明进一步加以阐明。

实施例1人工全合成番茄偏好的人表皮生长因子编码核酸分子

依据文献报道(Elizabeth E.Murray.et al，1989，Nucleic AcidsResearch，17(2)：477-498)确定番茄偏爱的密码子，将人表皮生长因子基因的有效区域替换为番茄偏爱的密码子序列，送到博亚公司全合成基因序列，所得序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2含有番茄偏好的人表皮生长因子编码核酸分子表达载体的构建

1.pCAM-35S-hEGF表达载体的构建过程

1)将如实施例1所述人工全合成hEGF基因连接到pMD-18T载体(购自TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)上，组成质粒pMD-18-hEGF.

2)按照厂家说明书中推荐的条件，用BamHI和KpnI双酶切所得质粒pMD-18-hEGF，回收目的基因片段；同时用BamHI和KpnI双酶切质粒pBS-nos(见实施例3)，电泳回收；将回收的片段进行连接得到质粒pBS-hEGF。

3)再用HindIII和BamHI双酶切质粒pBS-hEGF和pBS35S(见实施例4)，回收前者片段和后者中的通用启动子CaMV35S片段，连接得到包含CaMV35S启动子、hEGF基因和nos终止子的完整基因表达盒。该质粒命名为pBS35S-hEGF.

4)用HindIII和EcoRI双酶切质粒pBS35S-hEGF得到完整的基因表达盒，同时用这两种酶切质粒pCAMBIA2300(购自澳大利亚CAMBIA公司)，电泳回收目的片段后连接得到最终表达载体pCAM-35S-hEGF.

2.pCAM-2A11-hEGF表达载体的构建过程

1)设计一对引物，其中上游引物为：5’TTAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCTG3’(SEQ ID NO：2)，下游引物为：5’TTGGATCCAATGGTTTTGGATTAATTGC3’(SEQID NO：3)；从番茄的幼嫩子叶中提取DNA，通过具体条件为：在50ul的反应体系中加入2xTaq PCR MasterMix 25ul，上下游引物各2ul，DNA 4ul，灭菌水17ul。按94℃变性5min，94℃30s-60℃30s-72℃60s，重复30个循环，然后72℃延伸10min的PCR反应条件，扩增得到能在番茄的果实中特异表达的特异启动子2A11.

2)将该启动子片段连接到T载体pBS-T(购于清华大学北京天为时代科技有限公司)上，得到质粒pBS-2A11.

3)将质粒pBS-2A11和表达载体pCAM-35S-hEGF分别用HindIII和EcoRI双酶切，前者得到番茄果实特异表达的启动子2A11，后者得到去除CaMV35S启动子的表达载体部分，两者在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，即得到可在番茄果实中高效表达的表达载体pCAM-2A11-hEGF。

实施例3pBS-nos的构建过程

用HindIII和BamHI双酶切pBS-T和pLGV23(购于SIGMA公司)，回收前者整个片段和后者含nos终止序列的片段，两者在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接。

实施例4pBS35S的构建过程

用HindIII和BglII双酶切pBS-T和pCAMBIA2300，回收前者整个片段和后者含35S启动序列的片段，两者在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接。

实施例5番茄的转化及再生

a.转化材料的培养

对番茄种子进行表面消毒，先在70-75％的酒精中清洗1-2min，然后在0.1％的升汞或者30％的次氯酸钠中浸泡5-10min，用无菌水洗涤3-5次，无菌滤纸吸干后播种在含MS的培养基中，在25℃和光照16h/d条件下萌发一周左右，取番茄的幼嫩子叶作为转化材料。

b.外植体的转化

将无菌的番茄幼嫩叶片剪成大约5x5mm大小的方块，与农杆菌培养液共浸染10-30min，用无菌水洗涤2-3次，用无菌滤纸吸去多余的液体。将浸泡的叶片置于共培养培养基上(MS+2mg/L 6-BA+2mg/LZT+1mg/L IAA+100mg/L卡那霉素)，28℃黑暗中共培养2天。

c.愈伤组织的诱导及分化

将叶片转到选择分化培养基上(MS+2mg/L 6-BA+2mg/L ZT+1mg/L IAA+100mg/L卡那霉素+羧苄青霉素500mg/l)25℃，光照16h/d.大约三周左右换一次培养基。

d.生根培养

分化的抗性小苗长到1-2cm时用锋利的解剖刀从愈伤组织上切取单株转到生根培养基(1/2MS+1mg/L IBA)上诱导生根。

e.温室或大田移栽。

抗性小苗根系比较发达后，去除培养瓶上的封口膜，在室温下与空气接触练苗几天，基本适应外界环境后首先移栽到花盆中，成活后移栽到温室或大田。

实施例6分子检测

对移栽成活的植株分类编号，分别取幼嫩的组织100mg按植物基因组DNA提取试剂盒[购于清华大学北京天为时代科技有限公司]说明书的要求提取各植株的DNA，经电泳检测，所提DNA纯度较高，无降解拖尾现象，可用于分子检测实验。

首先对各植株的DNA进行PCR分析，以初步判断转化情况：在0.5ml小离心管中分别加入2xTaq PCR MasterMix10ul，5uM上下游引物各1ul，DNA样品2ul，去离子水6ul，总体积为20ul。按94℃变性5min，94℃30s-60℃30s-72℃60s，重复30个循环；然后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳分析，大部分植株都扩出了大小为180bp的特异片段；参考分子克隆，将电泳结果转移到带正电荷的尼龙膜上，利用地高辛标记法(参考分子克隆及公司说明书)进行Southern杂交，得到了明显的杂交条带。

取部分植株的PCR产物送到生物博亚生物公司测序，所得结果与目的基因的碱基序列完全相同。由此可以证明番茄植株的基因转化是成功的。

实施例7表达量的测定

参照<植物基因工程>[(第二版)王关林，方宏筠主编，科学出版社，2002]有关蛋白质提取的方法，取番茄的不同部位分别提取蛋白，然后按表皮生长因子放射免疫测定试剂盒(购于北京北方生物技术研究所)说明书的要求进行操作和测定，最后测得在2A11启动子启动下，每克鲜重番茄含1.6ng/g重组人表皮生长因子，CaMV35S启动子启动下得到0.7ng/g重组人表皮生长因子。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所

<120>植物偏好型重组人表皮生长因子及利用转基因植物生产其的方法

<130>IDC030067

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>168

<212>DNA

<213>artificial

<400>1

atgaatagcg attctgaatg tccactttcc cacgacggat actgcttgca tgatggtgtt     60

tgcatgtaca ttgaggcttt ggacaagtat gcatgcaact gtgttgtggg ttacatcgga    120

gagagatgtc aataccgtga ccttaaatgg tgggaacttc gttaatag                 168

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>primer

<400>2

ttaagcttag cacttgttag actcatctg                                       29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>primer

<400>3

ttggatccaa tggttttgga ttaattgc                                        28

Claims (11)

1.一种依据番茄偏爱的密码子设计的编码重组人表皮生长因子的核酸分子，其由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。

2.含有权利要求1所述核酸分子的表达载体。

3.权利要求2的表达载体，其中，在所述表达载体中还具有与所述核酸分子有效连接的启动子。

4.权利要求2的表达载体，其中所述启动子选自番茄果实专一性启动子2A11。

5.权利要求2所述的表达载体，其为pCAM-35S-hEGF或pCAM-2A11-hEGF。

6.一种利用转基因番茄生产人表皮生长因子的方法，包括利用权利要求2所述的表达载体转化番茄，在所得转基因番茄的果实部分实现人表皮生长因子的表达。

7.权利要求6的方法，其中转化植物的方法选自农杆菌介导法、基因枪轰击法、PEG介导法，花粉管通道法。

8.权利要求2所述表达载体用于制备转基因植物的用途。

9.一种制备转基因植物的方法，其中包括用权利要求2所述的表达载体转化目标植物。

10.权利要求9的方法，其中所述植物选自单子叶植物或双子叶植物。

11.权利要求10的方法，其中所述植物选自番茄、蔬菜类和瓜果类作物、水果类植物和块根、块茎类植物。

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