CN100374569C

CN100374569C - 一种磷酸甘露糖异构酶基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN100374569C
Application number: CNB2006100790443A
Authority: CN
Inventors: 陈蕾; 徐建勇
Original assignee: BEIFANGJIESHI BIOLOGICAL SCIO-TECH Co Ltd BEIJING
Current assignee: Shanghai Longyu Industrial Co. Ltd.
Priority date: 2006-04-30
Filing date: 2006-04-30
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2026-04-30
Also published as: CN1844397A

Abstract

本发明公开了磷酸甘露糖异构酶基因作为转基因植物筛选标记的应用；该方法中，所述磷酸甘露糖异构酶基因，是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQIDNO：1所示的DNA序列；2)编码序列表中SEQIDNO：2所示蛋白序列的DNA序列。甘露糖对人畜无危害，在环境中易降解，且该选择标记***具有产物安全、选择剂价格低廉、选择程序简单，而且不影响转化植物的代谢平衡，转基因植株生长旺盛，筛选效果显著等优点，在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景，有望发展成为植物转化中主导选择标记***。

Description

一种磷酸甘露糖异构酶基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种选择标记基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一种磷酸甘露糖异构酶基因及其编码蛋白与其在筛选转基因植物中的应用。

背景技术

在植物基因工程操作中，转基因植株的筛选是至关重要的环节。目前，普遍利用对某种毒性物质(如抗生素、除草剂等)具有抗性的基因作为选择标记对转基因植株进行筛选，即将毒性物质加入到培养基中，可以杀死未转化的植物细胞。尽管用这种方法可有效地筛选到转基因植株，但同时也存在着极大的缺陷。众所周知，在基因转化操作中，只有极少部分的细胞被转化，获得外源DNA片段，大多数细胞仍处于非转化状态，需要被选择性除去。传统的筛选方法虽可杀灭非转化细胞，但这些死细胞可能会释放出毒性物质，对转化细胞造成损伤；大量的死细胞还会形成转化细胞与培养物之间的屏障，阻碍转化细胞的营养吸收及其正常生长，导致转化率降低(Joersbo，M.& Okkels，F.T.1996.Plant Cell Rep 16：219-221)；基于抗生素和除草剂的筛选***还将；还经常会出现非转化细胞的逃逸现象，出现假阳性植株(Girgi，M.etal.2002.Mol Breed 10：243-252；Zhang，P.& Puonti-Kaerlas，J.2000.PlantCell Rep 19：1041-1048)；此外，使用抗生素、除草剂，有时会导致转基因植株表型异常，对自然环境造成污染，甚至还可危及到人类的健康。抗除草剂基因的使用可能会导致抗除草剂杂草的出现，并增加除草剂在环境中的使用，引发生态危机。特别是转基因植物细胞裂解后，编码抗生素的抗性基因有可能会被细菌获取，导致细菌产生抗药性，从而对公共健康构成威胁。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷酸甘露糖异构酶基因。

本发明所提供的磷酸甘露糖异构酶基因，被命名为KL manA，来源于克拉维乳酸酵母(Kluyveromyces lactis)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，60℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1358个碱基组成，其编码序列为自5’端第11-1297位碱基，编码序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

本发明磷酸甘露糖异构酶基因编码的蛋白(KL manA)，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有磷酸甘露糖转化功能的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由428个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增KL manA中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种用于筛选转基因植物的载体。

本发明所提供的用于筛选转基因植物的载体，是含有所述磷酸甘露糖异构酶基因(选择标记基因)的植物双元表达载体。

所述用于筛选转基因植物的载体中还含有甘露糖异构酶基因的启动子和终止子。所述启动子和终止子的选择是多种多样的，所述启动子可为组成型表达启动子中的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Actin启动子或Ubiquitin启动子等，所述终止子可为Tnos终止子或T35S终止子等。

用于构建所述筛选载体的出发载体可为任意一种可在植物中表达外源基因的植物双元表达载体，如pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1301或Bin19等。

以pCAMBIA1300为出发载体，构建的筛选载体为pC1300(KLmanA)。

本发明的第三个目的是提供一种转基因植物的筛选方法。

本发明所提供的转基因植物的筛选方法，是将目标基因及其启动子和终止子连接入具有上述含有磷酸甘露糖异构酶基因的筛选载体中，得到目标基因的转基因植株筛选载体，再将该载体转化植物，经甘露糖筛选，得到转基因植株。

在上述筛选方法中，所述目标基因的启动子和终止子可根据实际需要进行选择。

可将所述包含目标基因的转基因植株筛选载体转化植物组织，再将经转化的组织置于含甘露糖的筛选培养基上筛选出抗性组织，然后将抗性组织置于含甘露糖的再生培养基上进行再分化，随后对分化出根和芽的转基因苗进行培养，得到目标基因的转基因植株。

当所述植物组织为植物愈伤组织时，将所述目标基因的转基因植株筛选载体转化植物愈伤组织，再将经转化的愈伤组织置于含甘露糖的愈伤组织筛选培养基上筛选出抗性愈伤组织，然后将抗性愈伤组织置于含甘露糖的再生培养基上进行再分化，随后对分化出根和芽的转基因苗进行培养，得到目标基因的转基因植株；所述含甘露糖的愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5-8mg/L，6-苄氨基嘌呤0-0.5mg/L，激动素0-0.5mg/L，水解酪蛋白0.5-2g/L，蔗糖0-15g/L，甘露糖10-30g/L和抗生素，所述抗生素为羧苄青霉素或噻孢霉素，其中，羧苄青霉素的浓度为250mg/L；含甘露糖的再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-BA 0.1-0.5mg/L，激动素0.1-0.5mg/L，蔗糖0-15g/L，甘露糖5-20g/L和抗生素，所述抗生素为羧苄青霉素或噻孢霉素，其中，羧苄青霉素的浓度为250mg/L。

此外，还可将所述目标基因的转基因植株筛选载体转化植物繁殖器官，并收获种子，再将萌发后的种子置于含甘露糖的筛选培养基上进行筛选，得到目标基因的转基因植株；所述含甘露糖的筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加了甘露糖1.5-2.0g/L。

上述培养基中的甘露糖为纯的甘露糖或甘露糖与其它糖类的组合，所述甘露糖可为D-甘露糖。

所述携带有目标基因的转基因植株筛选载体可通过使用农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法或脂质体融合法等方法转化植物愈伤组织或植物繁殖器官；所述农杆菌可为任意一种根癌农杆菌或发根农杆菌。

上述转基因植物的筛选方法对所有植物都适用，既适用于玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也适用于拟南芥、烟草、棉花等双子叶植物。

本发明提供了一种磷酸甘露糖异构酶基因及其编码蛋白。可以本发明的甘露糖异构酶基因(KL manA)作为筛选标记基因，利用植物表达载体将该基因转化植物愈伤组织或植物繁殖器官，经在含甘露糖(筛选试剂)的培养基上筛选和分化，获得转基因植株。该筛选方法的原理为：在以甘露糖作为主要碳源的培养基中，细胞所吸收的甘露糖被己糖激酶转化为6-磷酸甘露糖，转基因细胞表达磷酸甘露糖异构酶能将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，为细胞生长提供碳源，而非转基因的细胞则积累了大量的6-磷酸甘露糖，使其细胞生长受抑制，从而达到筛选目的。和传统的遗传转化选择方法相比，使用甘露糖选择标记***时，非转化细胞处于饥饿状态，而并非被杀死，所以选择培养过程中较少出现坏死组织，更有利于转基因组织的生长和再生。甘露糖对人畜无危害，在环境中易降解，且该选择标记***具有产物安全(编码的酶已被广泛应用于食品工业)、选择剂价格低廉、选择程序简单，而且不影响转化植物的代谢平衡，转基因植株生长旺盛，筛选效果显著等优点，在转基因植物研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景，有望发展成为植物转化中主导选择标记***。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为质粒pC1300(KLmanA)的物理图谱

图2为质粒pC1300(KLmanA)::gus的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，可参考：Sambrook et al.，2001，Molecular cloning：A Laboratory Manual，所用引物序列均由上海生工公司合成。克拉维乳酸酵母(Kluyveromyces lactis)菌种从中国科学院微生物所购买。一般生化试剂购于北京化学试剂公司，T₄ DNA连接酶、限制性内切酶等购于TaKaRa公司。

实施例1、磷酸甘露糖异构酶基因KL manA的克隆

根据克拉维乳酸酵母基因组序列预测其磷酸甘露糖异构酶基因序列并设计引物，在引物两端添加限制性内切酶Xho I识别位点，引物序列如下：

P1(上游引物)：5’-CTCGAGTACCATGCCACAGCTTTTCAG(带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)；

P2(下游引物)：5’-CTCGAGCTTGTCGATCGACAGATCATACTGTTTCTTTGATTGTG GTTC(带下划线碱基为限制性内切酶Xho I识别位点)

以克拉维乳酸酵母的基因组DNA为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增。50μl PCR反应体系为：5μl 10×PCR反应缓冲液，10μM引物P1和P2各0.5μl，100ng DNA，1μl 10mM dNTPs，2.5U pfu DNA聚合酶(上海申能***公司)，加无菌水至50μl。PCR反应条件为：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，共30个循环。反应结束后，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1.36kbp的DNA片段，将其连接入克隆载体pBluescript II KSM(Genebank Accession No.X52329)的EcoR V位点，再将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将阳性克隆质粒命名为pBS::KL manA，对其进行测序，测序结果表明来源于克拉维乳酸酵母的甘露糖异构酶基因(命名为KL manA)具有序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中的序列1由1358个碱基组成，其编码序列为自5’端第11-1297位碱基，编码序列表中序列2的氨基酸残基序列，序列表中的序列2由428个氨基酸残基组成，将该蛋白命名为KL manA。

实施例2、构建用于筛选转基因植物的载体

用限制性内切酶Xho I对质粒pBS::KL manA进行酶切，回收并纯化含有KL manA的1.36kb的DNA片段，将其***到经同样酶酶切的农杆菌双元载体pCAMIBA1300(Genbank Accession No.AF234296)中，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将含有KL manA的阳性克隆质粒命名为pC1300(KLmanA)，其物理图谱如图1所示，在该载体中，KL manA受到植物基因表达元件CaMV 35S增强型启动子和CaMV 35S polyA加尾信号的调控，可在植物细胞内有效表达，此外，该质粒还含有多克隆位点及其大肠杆菌lacZ表达框，便于进行外源基因的克隆。

实施例3、gusA转基因高羊茅草的筛选

一、构建含有gusA(目标基因)的转基因植株筛选载体

用限制性内切酶EcoR I和Hind III对质粒载体pBI121(Genbank AccessionNo.AF485783)进行酶切，回收并纯化3kb的含有gusA完整表达套件的DNA片段，并将其***到经相同酶双酶切的实施例2构建的专用筛选载体pC1300(KLmanA)上，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将含有gusA完整表达套件的阳性克隆质粒，命名为pC1300(KLmanA)::gus，其物理图谱如图2所示。

二、gusA转基因高羊茅草的筛选

将质粒pC1300(KLmanA)::gus用冻融法转化农杆菌LBA4404，得到含有该质粒的农杆菌，命名为LBA4404-(KLmanA)::gus，再用农杆菌侵染法将pC1300(KLmanA)::gus转化草坪草高羊茅，具体方法如下：

1)农杆菌的培养

将农杆菌LBA4404-(KLmanA)::gus接种至5mL含卡那霉素50mg/L和利福霉素50mg/L的YEB培养基(牛肉浸膏5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，琼脂15g/L，pH5.8)中，在28℃、180rpm下振荡培养24小时后，转接100μl至新鲜的含卡那霉素50mg/L和利福霉素50mg/L的YEB培养基中，28℃震荡培养约12小时，待菌液OD₆₀₀值约为0.8时，5000rpm离心10分钟收集菌体，将菌体重新悬浮到含0.1mM乙酰丁香酮的MS液体培养基中。

2)高羊茅愈伤组织的诱导

选取成熟饱满的高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)种子，将胚剥下，横切成两半后，将其接入愈伤组织诱导培养基(在MS基本培养基的基础上加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)5mg/L，水解酪蛋白0.5g/L，pH5.8)，每两星期将愈伤组织转皿一次。并在侵染前将愈伤组织转接到愈伤组织状态调整培养基上(在MS基本培养基的基础上加入2，4-D 0.5-2mg/L，细胞***素类物质6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1-0.5mg/L，激动素(KT)浓度0.1-0.5mg/L，水解酪蛋白浓度在0.5g/L，pH5.8)。

3)愈伤组织的侵染及筛选

将调整好状态的愈伤组织置于步骤1)的农杆菌LBA4404-(KLmanA)::gus菌液中浸泡10分钟，倒去菌液，转接入愈伤组织诱导培养基上，25℃共培养3天后，用添加甘露糖的愈伤组织筛选培养基对愈伤组织进行筛选(在MS基本培养基的基础上加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L，6-苄氨基嘌呤0.1mg/L，水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖5g/L，甘露糖15g/L，羧苄青霉素250mg/L)，2-3周后，可见新鲜、浅黄白色的抗性愈伤组织生长出来。

4)再生

暗培养一个月后，将抗性愈伤组织置于添加甘露糖的再生培养基(在MS基本培养基的基础上加入细胞***素类物质6-BA 0.5mg/L，KT 0.3mg/L，蔗糖5g/L，甘露糖10g/L，羧苄青霉素250mg/L)上进行分化培养，转基因愈伤组织可见分化出芽和根，而非转基因对照没有正常的芽和根产生。将分化出根和芽的愈伤组织按常规培养条件继续进行培养，得到转基因再生高羊茅草。

5)转基因植株的检测

再对经筛选获得的转基因再生高羊茅草进行葡糖醛酸糖苷酶活性染色实验，以非转基因植株为对照，具体方法为：剪取高羊茅草叶片浸泡于X-Gluc反应液中(1％X-Gluc，2.5mM铁***，2.5mM亚铁***，0.05％Triton-X 100，pH7.0)，置37℃下保温12-24小时，再用无水乙醇脱色。结果经筛选获得的转基因高羊茅草中的gusA可正确表达，呈现蓝色，筛选阳性率达30％。

实施例4、gusA转基因拟南芥的筛选

现用花苞浸染法将实施例3构建的农杆菌LBA4404-(KLmanA)::gus转化拟南芥，具体方法如下：

1)农杆菌的培养

将农杆菌LBA4404-(KLmanA)::gus接种于5mL含卡那霉素50mg/L和利福霉素50mg/L的LB液体培养基中，在28℃、180rpm下振荡培养约48小时，然后将菌液倒入1升LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀为1.2-1.8(约需48小时)，培养结束后，5000rpm室温离心10分钟收集菌体，再将菌体细胞重悬于1升转化液(1/2MS大量元素，1/2MS微量元素，1/2×铁盐，1×B₅有机，5％蔗糖，1mg/L 6-BA，50μlSilwetL-77，用NaOH调pH至5.8)中。

2)拟南芥的转化及培养

待拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia)的种子萌发并培养至茎高3-10cm时，去其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，继续生长7-9天后，保留花苞，将拟南芥基生部以上部分浸没于步骤1)获得的的农杆菌悬液中，放入真空泵中，抽真空至0.5Bar，保持5分钟。然后取出转化植株，将其横放在一个塑料盆内，用塑料膜盖好，以保持湿度，避光，在22℃下恒温培养1天，然后竖立培养，待荚果变黄后，小心收集种子。

3)转基因阳性植株的筛选

将经过表面消毒的种子平铺于MS选择培养基(1xMS大量元素，1×B₅微量元素，1x铁盐，1×B₅有机元素，100mg肌醇，琼脂7.8g，用KOH调节pH值至5.8后再添加1.8g/L甘露糖)中，密度为100-200粒种子/皿，4℃春化3天，再移入培养室在恒温(22℃)，24小时光照(光强度为30-40μmol.m^-2.s^-1)下培养，一周后筛选真叶健康(呈深绿色)，根伸长至培养基中的植株，转至含1.8g/L甘露糖的MS培养基中，培养10天后移入土壤，转基因植株有明显的根产生和苗的生长，而非转基因对照没有正常的根产生和苗生长。

4)转基因植株的检测

再对经筛选获得的转基因再生拟南芥进行葡糖醛酸糖苷酶活性染色实验，以非转基因植株为对照，检测方法与实施例3相同，结果经筛选获得的转基因拟南芥中的gusA可正确表达，呈现蓝色，筛选率达80％。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1358

<212>DNA

<213>克拉维乳酸酵母(Kluyveromyces lactis)

<400>1

ctcgagtacc atgccacagc ttttcaggtt agatgctggc ttccagcagt acgattgggg 60

taagatcggt tcatcctctg cagttgctca gtttgctgct cattcagacc catcagtaaa 120

aattgatgaa cagaaaccat atgccgaact atggatgggt actcatcata aggttccatc 180

ttataatcat gatactaaag aatcgttgcg tgatttgatt gaagctgatc cagttggaat 240

gttgggtcaa ggcaacgtcg acaagtttgg ttctatgaag gaattaccat tcttgtttaa 300

agttttatcc attaaaaaag tgttatctat ccaagcccat ccagataagg ctttagctaa 360

agtcttacat ttcaacgatc ctgccaatta tcctgatgat aaccacaaac cggaaatggc 420

gttggcagtc accgattttg aaggtttctg tggattcaag ccattggaag agattgcaga 480

tgagttgcaa cgtatcccag aattgagaaa tatcgttggg gatgaagttt ccgaaacttt 540

tatcaacaat attaacccag aggcagtgaa ggattctgct gatgatgcca agaacaagaa 600

actcttgcaa caagtattca gtaaagttat gaacgcttct gataaagtgg tggtagaaaa 660

cgcacgtgcg ttgatcaaga gagctcatga atctcctgct gatttcaaca aggacacatt 720

gccacaactc ttaatagact tgaatgaaca gttcccagat gatgttggtt tgttctgtgg 780

tgggttactt ctaaaccatt gtaacttgaa agcaggtgaa gcaatcttct tgagagcgaa 840

ggacccacac gcgtacattt ctggtgacat catcgaatgt atggctgctt ctgataacgt 900

cgttagagca ggtttcacac caaagttcaa ggacgttaaa aacttggtcg aaatgttgac 960

atacacttac gattccgtcg aaaaacaaaa gatgtctcca gaaaactttg aaagatcttc 1020

tggccaaggt aaatctgttc tatttaatcc accaattgag gagtttgcag tattgtacac 1080

caccttccag gatggtgtcg gtacgagaca ctttgagggt ttacacggtc cttccattgt 1140

gatcaccacc aagggtaacg gtttcatcaa gacaggtgat ttgaaattga aagcggaacc 1200

gggttttgtc ttcttcatcg cacctggaac tgaagtcgac ttcattgcag acgacaccga 1260

ctttaccaca tacagagcat ttgtcgaacc aaattaaata aatgttttga gaaccacaat 1320

caaagaaaca gtatgatctg tcgatcgaca agctcgag 1358

<210>2

<211>428

<212>PRT

<213>克拉维乳酸酵母(Kluyveromyces lactis)

<400>2

Met Pro Gln Leu Phe Arg Leu Asp Ala Gly Phe Gln Gln Tyr Asp Trp

1 5 10 15

Gly Lys Ile Gly Ser Ser Ser Ala Val Ala Gln Phe Ala Ala His Ser

20 25 30

Asp Pro Ser Val Lys Ile Asp Glu Gln Lys Pro Tyr Ala Glu Leu Trp

35 40 45

Met Gly Thr His His Lys Val Pro Ser Tyr Asn His Asp Thr Lys Glu

50 55 60

Ser Leu Arg Asp Leu Ile Glu Ala Asp Pro Val Gly Met Leu Gly Gln

65 70 75 80

Gly Asn Val Asp Lys Phe Gly Ser Met Lys Glu Leu Pro Phe Leu Phe

85 90 95

Lys Val Leu Ser Ile Lys Lys Val Leu Ser Ile Gln Ala His Pro Asp

100 105 110

Lys Ala Leu Ala Lys Val Leu His Phe Asn Asp Pro Ala Asn Tyr Pro

115 120 125

Asp Asp Asn His Lys Pro Glu Met Ala Leu Ala Val Thr Asp Phe Glu

130 135 140

Gly Phe Cys Gly Phe Lys Pro Leu Glu Glu Ile Ala Asp Glu Leu Gln

145 150 155 160

Arg Ile Pro Glu Leu Arg Asn Ile Val Gly Asp Glu Val Ser Glu Thr

165 170 175

Phe Ile Asn Asn Ile Asn Pro Glu Ala Val Lys Asp Ser Ala Asp Asp

180 185 190

Ala Lys Asn Lys Lys Leu Leu Gln Gln Val Phe Ser Lys Va1 Met Asn

195 200 205

Ala Ser Asp Lys Val Val Val Glu Asn Ala Arg Ala Leu Ile Lys Arg

210 215 220

Ala His Glu Ser Pro Ala Asp Phe Asn Lys Asp Thr Leu Pro Gln Leu

225 230 235 240

Leu Ile Asp Leu Asn Glu Gln Phe Pro Asp Asp Val Gly Leu Phe Cys

245 250 255

Gly Gly Leu Leu Leu Asn His Cys Asn Leu Lys Ala Gly Glu Ala Ile

260 265 270

Phe Leu Arg Ala Lys Asp Pro His Ala Tyr Ile Ser Gly Asp Ile Ile

275 280 285

Glu Cys Met Ala Ala Ser Asp Asn Val Val Arg Ala Gly Phe Thr Pro

290 295 300

Lys Phe Lys Asp Val Lys Asn Leu Val Glu Met Leu Thr Tyr Thr Tyr

305 3l0 315 320

Asp Ser Val Glu Lys Gln Lys Met Ser Pro Glu Asn Phe Glu Arg Ser

325 330 335

Ser Gly Gln Gly Lys Ser Val Leu Phe Asn Pro Pro Ile Glu Glu Phe

340 345 350

Ala Val Leu Tyr Thr Thr Phe Gln Asp Gly Val Gly Thr Arg His Phe

355 360 365

Glu Gly Leu His Gly Pro Ser Ile Val Ile Thr Thr Lys Gly Asn Gly

370 375 380

Phe Ile Lys Thr Gly Asp Leu Lys Leu Lys Ala Glu Pro Gly Phe Val

385 390 395 400

Phe Phe Ile Ala Pro Gly Thr Glu Val Asp Phe Ile Ala Asp Asp Thr

405 410 415

Asp Phe Thr Thr Tyr Arg Ala Phe Val Glu Pro Asn

420 425

Claims

1.磷酸甘露糖异构酶基因作为转基因植物筛选标记的应用；其中，所述磷酸甘露糖异构酶基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2所示蛋白序列的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：筛选的步骤是，将目标基因及其启动子和终止子连接入含有所述磷酸甘露糖异构酶基因的植物双元表达载体中，得到目标基因的转基因植株筛选载体，再将该载体转化植物，经甘露糖筛选，得到转基因植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述载体中还含有甘露糖异构酶基因的启动子和终止子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述启动子为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、Actin启动子或Ubiquitin启动子；所述终止子为Tnos终止子或T35S终止子。

5.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于：所述筛选的步骤具体是，将所述目标基因的转基因植株筛选载体转化植物愈伤组织，再将经转化的愈伤组织置于含甘露糖的愈伤组织筛选培养基上筛选出抗性愈伤组织，然后将抗性愈伤组织置于含甘露糖的再生培养基上进行再分化，随后对分化出根和芽的转基因苗进行培养，得到目标基因的转基因植株；所述含甘露糖的愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5-8mg/L，6-苄氨基嘌呤0-0.5mg/L，激动素0-0.5mg/L，水解酪蛋白0.5-2g/L，蔗糖0-15g/L，甘露糖10-30g/L和抗生素，所述抗生素为羧苄青霉素或噻孢霉素；含甘露糖的再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-BA 0.1-0.5mg/L，激动素0.1-0.5mg/L，蔗糖0-15g/L，甘露糖5-20g/L和抗生素，所述抗生素为羧苄青霉素或噻孢霉素。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述含甘露糖的愈伤组织筛选培养基中羧苄青霉素的浓度为250mg/L；所述含甘露糖的再生培养基中羧苄青霉素的浓度为250mg/L。

7.根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于：所述筛选的步骤具体是，将所述目标基因的转基因植株筛选载体转化植物繁殖器官，并收获种子，再将萌发后的种子置于含甘露糖的筛选培养基上进行筛选，得到目标基因的转基因植株；所述含甘露糖的筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加了甘露糖1.5-2.0g/L。

8.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。