CN100359015C - 多肽激素磷酸盐沉着因子 - Google Patents

多肽激素磷酸盐沉着因子 Download PDF

Info

Publication number
CN100359015C
CN100359015C CNB998063614A CN99806361A CN100359015C CN 100359015 C CN100359015 C CN 100359015C CN B998063614 A CNB998063614 A CN B998063614A CN 99806361 A CN99806361 A CN 99806361A CN 100359015 C CN100359015 C CN 100359015C
Authority
CN
China
Prior art keywords
phosphatonin
polypeptide
sequence
polynucleotide
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB998063614A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1308677A (zh
Inventor
彼得·罗维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University College London
Original Assignee
University College London
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9810681.8A external-priority patent/GB9810681D0/en
Application filed by University College London filed Critical University College London
Publication of CN1308677A publication Critical patent/CN1308677A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100359015C publication Critical patent/CN100359015C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的人蛋白，称phosphatonin，以及编码该蛋白的聚核苷酸。本发明还提供载体、宿主细胞、抗体和该人蛋白的重组生产方法。本发明还涉及诊断和治疗与这种新的人蛋白相关的疾病的方法。

Description

多肽激素磷酸盐沉着因子
发明领域
本发明涉及一种参与磷酸盐代谢调节的多肽。更具体地说，本发明涉及一种新的多肽，即转移性肿瘤分泌的磷酸盐沉着因素(MEPE)或“phosphatonin”。本发明还涉及编码phosphatonin多肽的基因和聚核苷酸，以及载体，宿主细胞，phosphatonin多肽的抗体，及其重组生产方法。本发明还提供检测磷酸盐代谢相关性疾病的诊断方法，治疗此类疾病的治疗方法。本发明还涉及鉴定phosphatonin活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。
本发明所引用的文献(包括生产商的说明等)都为本发明所参考。
发明背景
在细胞基本活动和骨矿化所必需的许多过程中，磷酸盐具有重要作用。尤其是，骨骼矿化依赖于体内磷酸盐和钙的调节，一旦体内磷酸盐-钙平衡被破坏，就会对骨骼健康造成严重影响。在肾内，磷酸盐被动进入肾小球滤液而流失，并由一种钠(Na+)依赖性磷酸盐协同转运者积极地重吸收。在小肠内，磷酸盐是从食物中吸收的。已发现小肠内表达一种钠(Na+)依赖性磷酸盐协同转运者，目前已被克隆(Hilfiker，PNAS 95(24)(1998)，14564-14569)。肝、皮肤和肾与维生素D3转化为其活性代谢产物钙三醇有关，钙三醇对维持磷酸盐代谢平衡和骨矿化具有积极作用。
缺乏维生素D会造成儿童佝偻病和成人骨软化。这两种情况都以前骨质即骨的基质钙化不全为特征。还有一些饮食以外的情况会导致如下佝偻病，包括X染色体联锁的耐维生素D性血磷酸盐过少性佝偻病(HYP)，遗传性伴有尿钙过多的血磷酸盐过少性佝偻病(HHRH)，Dent′s病，包括某些类型的肾病性Fanconi综合症，肾病性1-α-羟化酶缺乏(VDDR I)，1，25-二羟基维生素D3受体缺陷(终末器官抗性，VDDR II)，和瘤原性血磷酸盐过少性骨软化(OHO)。因此，许多病的特征被归结为磷酸盐吸收紊乱、维生素D代谢紊乱和骨矿化紊乱。最近，克隆了一个基因(PHEX)，并发现X染色体联锁的磷酸盐过少性佝偻病患者的该基因有缺陷(Francis，自然遗传(Nat.Genet.)11(1995)，130-136；Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)97(1996)，345-352；Rowe，人类遗传6(1997)，539-549)。PHEX基因是一种II型糖蛋白，并属于Zn金属内肽酶家族(M13)。PHEX的功能是加工一种参与磷酸盐体内平衡和骨骼矿化的因子(Rowe，实验肾脏学(Exp.Nephrol).5(1997)，355-363；Rowe，当前肾脏学和高血压领域的观点(Current Opinion in Nephrology & Hypertension)7(4)(1998)，367-376)。和瘤原性血磷酸盐过少性骨软化(OHO)与HYP有许多类似之处，两者的病理生理有重迭之处，但原发性缺陷不同(Rowe，实验肾脏学(Exp.Nephrol).5(1997)，355-363；Rowe，当前肾脏学和高血压领域的观点(Current Opinion inNephrology & Hypertension)7(4)(1998)，367-376；Drezner在矿物质代谢性单写性骨病的原因(Primer on Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism)(Favus，M.J.编)184-188(美国骨矿物质研究协会(Am.Soc.Bone and Min.Res.)，Kelseyville，CA，1990)。成人骨软化相当于佝偻病，肿瘤-获得性骨软化的一个重要特征是骨的软化。软化后的骨发生变形，造成弓形腿及其他家族性佝偻病相关的变化。磷酸盐血清含量低和维生素D代谢异常也是HYP的重要特征。肿瘤获得性骨软化很少见，而且这些肿瘤大多是间质源肿瘤，虽然也曾报道过一些其他类型的肿瘤(Rowe，实验肾脏学(Exp.Nephrol.)5(1997)，355-363；Francis，Baillieres临床内分泌学与代谢(Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism)11(1997)，145-163；Ioakimides，类风湿杂志(The J.Rheumatology)21(6)(1994)，1162-1164；Lyles，国际医学报(Ann.Intern.Med.)93(1980)，275-278；Rowe，Hum.Genet.94(1994)，457-467；Shane，骨矿物质研究杂志(Journal of Bone and MineralResearch)12(1997)，1502-1511；Weidner，癌症(Cancer)59(1987)，1442-1442)。在可能时手术摘除肿瘤后症状消失而且骨愈合，这提示了循环磷酸盐沉着因子在发病中的作用。而且，裸鼠肿瘤异种移植(Miyauchi，临床内分泌与代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)67(1988)，46-53)，给大鼠和狗输注盐溶液提取物(Aschinberg，儿科杂志(J.Pediatr.)91(1977)，56-60；Popovtzer，临床研究(Clin.Res.)29(1981)，418A(Abstract))和使用人和动物肾细胞系的肿瘤条件培养基(TCM)，都证实这种肿瘤分泌一种循环磷酸盐沉着因子。
虽然已证实X联锁性佝偻病的原发性缺陷是突变的Zn金属内肽酶(PHEX)，但存在与循环磷酸盐沉着因子相关的证据(Ecarot，骨矿物质研究杂志(J.BoneMiner.Res.)7(1992)，215-220；Ecarot，骨矿物质研究杂志(J.Bone Miner.Res.)10(1995)，424-431；Morgan，国际医学文献(Arch.Intern.Med.)134(1974)，549-552；Nesbitt，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)89(1992)，1453-1459；Nesbitt，骨矿物质研究杂志(J.Bone Miner.Res.)10(1995)，1327-1333；Nesbitt，内分泌学(Endocrinology)137(1996)，943-948；Qiu，基因研究(Genet.Res.)，Camb.62(1993)，39-43；Lajeunesse，肾脏研究(Kidney Int.)50(1996)，1531-1538；Meyer，骨矿物质研究杂志(J.Bone Miner.Res)4(4)(1989)，523-532；Meyer。骨矿物质研究杂志(J.BoneMiner.Res.)4(1989)，493-500)。HYP与OHO的病理生理有重迭，提出了这样一种可能性，即，在正常机体内，肿瘤因子受到PHEX基因产物的加工。而且，蛋白酶解加工可能通过降解这尚未确定的磷酸盐沉着因子或通过激活磷酸盐保存级联发挥作用(Carpenter，北美儿科临床学(Pediatric Clinics of North America)44(1997)，443-466；Econs，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)273(1997)，F489-498；Glorieux，儿科文献(Arch.Pediatr.)4(1997)，102s-105s；Grieff，当前肾脏学和高血压领域的一些观点(Current Opinion in Nephrology & Hypertension)6(1997)，15-19；Hanna，当前内分泌学和代谢中的治疗方法(Current Therapy in Endocrinology &Metabolism)6(1997)，53 3-540；Kumar，肾脏移植(Nephrol.Dial.Transplant.)12(1997)，11-13；Takeda，Ryoikibetsu Shokogun Shirizu(1997)，656-659)。因此，克隆并揭示肿瘤-磷酸盐沉着因子的特征是确立肿瘤性骨软化与家族性X联锁性佝偻病以及其他磷酸盐代谢疾病之间联系的前提条件。
Rowe等(1996)曾报道过56和58kDa的候选蛋白，它们可能介导了OHO中的肾缺陷(Rowe，骨(Bone)18(1996)，159-169)。一名OHO患者接受肿瘤摘除治疗，用其术前和术后的抗血清进行Western印迹鉴定肿瘤条件培养基蛋白。然而，公众尚不能得到所述肿瘤细胞和抗血清。
在实验肾脏学(Exp.Nephrol.)5(1997)，335-363的一篇论文中，Rowe论述了前述疾病与PHEX基因的作用(过去称PEX基因)。PHEX基因的产物经鉴定是一种Zn金属蛋白酶。在家族性佝偻病等疾病中，缺陷PHEX产生不剪切的phosphatonin，后者下调钠依赖性磷酸盐协同转运者，上调肾线粒体24-羟化酶。然而，Rowe(1997)未报道phosphatonin的纯化。因此，公众无法获得phosphatonin的原料。而且，此前从未能进行过phosphatonin的纯化、鉴定和特征描述。
因此，需要一种调节磷酸盐代谢的多肽，因为这种调节的失调可能与血磷酸盐过少或过多性疾病有关，这些疾病包括骨软化，特别是骨质疏松和肾衰竭。而且，需要对此类多肽进行鉴定和特征描述，它们可能参与所述紊乱的检测、预防和/或矫正，因而可能对这些疾病的诊断有用。
发明概述
本发明涉及新的phosphatonin多肽，和编码它的聚核苷酸。而且，本发明涉及载体、宿主细胞、抗体，和重组生产多肽和聚核苷酸的方法。本发明还提供检测与所述肽相关的疾病的诊断方法，治疗这些疾病的治疗方法。本发明还涉及鉴定phosphatonin结合伙伴的筛选方法。
附图说明
图1：(a)和(b)分别显示伴刀豆蛋白A柱上的低亲和性和高亲和性蛋白峰的层析图。
图2：伴刀豆蛋白A柱上的阳离子交换层析。
图3：计算机对PHOSPHATONIN上亲水性和疏水性的预测。
图4：计算机对PHOSPHATONIN上抗原性的预测。
图5：计算机对PHOSPHATONIN上柔性(flexibility)的预测。
图6：计算机对PHOSPHATONIN二级结构表面可能情况的预测。
图7：计算机对PHOSPHATONIN二级结构的预测。
图8：分离到的最大MEPE克隆(pHO11.1)的完整cDNA序列(SEQ ID NO.1)和氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。分离到的其余5个克隆包括在这个最大克隆中，全部克隆都与克隆载体pBSCPT SK II-同框。用于PCR的引物加深表示，共430个残基和1655bp。原核表达载体pCal-n-EK含有全部框内残基，从MEPE的V残基到1291-93bp处的MEPE终止密码子TAG。单个聚腺苷酸化序列AA{T/U}AAA下加有双划线。波浪线表示的是与DMA-1、DSSP和OPN共有的局部同源性区域(MEPE基序C末端)，椭圆包围的是RGD残基，实线框内的是糖胺聚糖结合位点，单下划线表示的是酪氨酸激酶位置，虚线框内的是N-糖基化基序。有关包括酪蛋白激酶II、蛋白激酶C等在内的基序全表，参见表1。
图9：MEPE的二级结构GCG-肽-结构。一级氨基酸骨架用中间的线条表示，曲折处表示预测的转角区。分别以椭圆和菱形表示亲水性和疏水性，标出了RGD基序。用带茎的椭圆表示N-糖基化位置(C末端)，一级骨架上的波形区表示α螺旋。
图10：不同量MEPE存在下，磷酸盐吸收的直方图：A：92ng/ml，B：300ng/ml，C：500ng/ml，D：1000ng/ml。胆碱框代表以胆碱氯代替NaCl得到的作为对照的非Na依赖性结果。误差线表示SEM，C和D中MEPE与对照之间差异的P值＜0.001。实验A(92ng/ml)中，P＜0.05，实验B300ng/ml中，P＜0.01。A和B中的N是4，C和D中的N分别是5和6。在Newman-Keuls多重比较试验后采用Anova。
图11：给予MEPE与磷酸盐吸收的剂量曲线，带有SEM误差线。
图12：用“sim”和Ilanview算法和软件工具进行序列相似性分析(Duret，Comput.Appl.Biosci.12(1996)，507-510)。每次计算中，空距扣分设定为12，延伸扣分设定为4。A的比较基质是“PAM40”，B和C的分别是BLOSUM62(参见，Duret，Comput.Appl.Biosci.12(1996)，507-510；Huang，Comput.Appl.Biosci.8(1992)，155-165；Huang，Comput.Appl.Biosci.(1990)6，373-381)。A中的相似性阈值是70％，B和C中是40％。各蛋白质图上加深表示的块在A中代表80％以上序列同源性，在B和C中表示62％以上同源性。注意，在MEPE与DSSP的比较中(A)，DSSP中有5个块与MEPE中的一个基序(DSSESSDSGSSSES)序列同源性超过80％。在DMA-1和OPN与MEPE的比较中(B和C)也有类似的序列同源性，MEPE是这三种蛋白质的共同特征。
图13：DSSP与MEPE的Antheprot数据分析点阵比较(Deleague，G.蛋白质分析软件：Antheroplot V2.5e.Microsoft group.(7 Passage du Vercours 69-367 VercorsLyon Cedex 07，1997))。在严谨性较低的比较(A)中，阅读窗设定为13作为筛选参数，B中阅读窗设定为15。颜色显示的是单一矩阵(unity matrix)分值，坐标图所示。MEPE基序的C末端残基具有80％以上的同源性，并由条纹形式显示了该基序的重复特征。
图14：含有phosphatonin融合结构的重组质粒p1BL21和p6XL1。Lacl：lac启动子；LIC：不依赖于连接的克隆序列)；EK：肠激酶剪切位点；Thrombin(凝血酶靶序列)；Amp：氨苄青霉素抗性；Cal肽：钙调肽序列；phosphatonin：phosphatonin编码序列。
本发明的详细描述
因为需要诊断和治疗与人体内磷酸盐代谢紊乱相关的疾病的方法，本发明的课题提供调节磷酸盐代谢的工具与方法，这对于治疗骨矿质和肾脏性疾病特别有用。
上述课题是通过以权利要求书所述为特征的实施方案而解决的。因此，本发明内容之一是关于分离的具有phosphatonin活性的多肽。
除非另作说明，本发明术语的定义参见“多语种生物技术术语汇编：(IUPAC推荐)”，Leuenberger，H.G.W.，Nagel，B.和Kolbu，H.编，(1995)，Helvetica ChimicaActa，CH-4010 Basle，Switzerland，ISBN 3-906 390-13-6。为了帮助理解本说明书中的某些术语，提供以下定义。
“治疗”在此指获得所需的药理学或生理学效果。所述的效果可能是完全或部分预防疾病或症状的发生，和/或是部分或完全治愈某疾病和/或该疾病所致的副作用。“治疗”在此包括对哺乳动物尤其是人进行的对某疾病的各种治疗方式：(a)在易患病但尚未诊断出患病的个体中防止疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。本发明的目的是治疗患有磷酸盐代谢紊乱相关疾病的患者。因此，本发明的治疗包括预防、抑制或缓解各种与磷酸盐代谢紊乱相关的病症。
本发明中，“分离的”表示从其源环境(例如，天然物质所在的天然环境)中分离出的物质，因此通过“人的加工”而不同于其天然状态。例如，一段分离的聚核苷酸可以是相关载体或组合物的一部分，或者可以包含在细胞内但仍是“分离的”，因为相关载体、组合物或具体细胞并非该聚核苷酸原来所在的环境。
本发明的分离的phosphatonin多肽的分子量一般约53-60kDa，58-60kDa更好，这是用SDS-PAGE测定的，具体地说是用12.5％的凝胶，pH8.6，TRIS-甘氨酸SDS缓冲液测定的，参见实施例1。pH7，4-12％梯度凝胶，MOPS电泳缓冲液进行的bis-tris-SDS-PAGE可能测得约200kDa的分子量。在这样的凝胶上也可能看到53-60kDa的低分子量条带。多肽一般已糖基化，最好包含基本纯的phosphatonin。
出人意料的是，我们发现可以按照实施例1所述的方案从Saos-2细胞(ECACC 89050205，欧洲细胞培养物保藏中心)获得。因此，本发明的另一方面提供了Saos-2细胞或HTB-96细胞用于生产phosphatonin的用途。其他转化或无限繁殖细胞系可能能够过表达phosphatonin，例如转化的成骨细胞或骨细胞系。
本发明还描述并克隆了一个基因，它可能编码上述来自肿瘤的磷酸盐沉着因子(即phosphatonin或MEPE)(转移性肿瘤分泌的磷酸盐沉着因子)。为了概括，用对肿瘤条件培养基(TCM)磷酸盐沉着因子特异的抗血清，对抽提自OHO肿瘤的mRNA构建的λZAPII-cDNA文库进行表达筛选。该蛋白是糖基化的，在SDS-PAGE电泳中分为两条带(58-60kDa)，表明可能发生拼接或翻译后剪切。所克隆的cDNA编码一个430残基的蛋白质(SEQ ID NO：2)，长1655bp(SEQ ID NO：1)。该基因有完整的3′末端，部分5′末端缺失。含有10个β-半乳糖苷酶残基的该融合蛋白在人肾细胞系(CL8)中强效抑制Na+依赖性磷酸盐协同转运者。二级结构预测证实，该蛋白具有高度亲水性，具有很小的疏水区，不含半胱氨酸残基。其中有许多螺旋区域，在羧基端有两个不同的N-糖基化基序。一个重要特征是具有与骨桥蛋白中发现的相同结构的一段细胞结合序列。该基序毗邻的蛋白酶解位点可能造成对特定整联蛋白(例如骨桥蛋白中的那些)受体特异性的改变。MEPE序列筛选震颤数据库(tremble database)还显示与牙质phosphoryn(DPP)的序列同源性。具体地说，MEPE与DPP、牙质基质蛋白1(DMA-1)和骨桥蛋白(OPN)C末端的部分残基具有惊人的同源性。MEPE的该区域含有成串的天冬氨酸和丝氨酸残基重复(DDSSESSDSGSSSESD)，与DPP、DMA-1和OPN的同源性分别为80％、65％和62％。而且，如果考虑残基的理化特征，同源性上升至93％，表明彼此具有相同或相关的生物功能。需要注意的还有，MEPE中该结构基序与酪蛋白激酶II磷酸化基序重叠。佝偻病中骨骼酪蛋白激酶II活性缺陷，造成骨桥蛋白磷酸化不良(Rifas，Calcif.Tissue Int.61(1997)，256-259)。因此，目前认为酪蛋白激酶II缺陷与骨基质矿化不良有关(Rifas，Ioc.cit.)。
牙质phosphoryn(DPP)是牙质唾液酸磷酸蛋白(DSSP)剪切产物的一部分，另一部分是牙质唾液酸蛋白(DSP)(MacDougall，J.Biol.Chem.272(1997)，835-842)。特别有意义的是，DSSP、MDA-1、OPN和MEPE的是含RGD的磷酸-糖蛋白，具有特有的结构相似性，并在骨-齿矿化中起主要作用(Linde，Crit.Rev.Oral Biol.Med.4(1993)，679-728)。
本发明所述新的OHO肿瘤产生的磷酸盐沉着因子(又名phosphatonin或MEPE)通过调节Na+依赖性磷酸盐协同转运者、维生素D代谢和骨的矿化来维持骨矿质的体内平衡。
诚如后文的详细描述，我们分离到一段聚核苷酸，它编码本发明的多肽；参见实施例2。phosphatonin的氨基酸序列和核苷酸序列参见图8(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。因此，本发明多肽具有图8所示的氨基酸序列，或选性地包括不影响其活性的突变或缺失。这样的突变包括一个或多个氨基酸的取代，尤其是同系氨基酸取代，一个或多个氨基酸的增加，特别是在N或C末端。缺失包括N或C末端的缺失。以天然氨基酸或合成氨基酸取代都可以。还包括经化学修饰或酶修饰的多肽。而且，片段肽，化学合成或生物方法获得的，修饰或非修饰的，都包括在本发明范围内。
因此，本发明是关于phosphatonin多肽或其免疫活性和/或生物学活性片段，编码其所含氨基酸序列的聚核苷酸选自：
(a)编码至少含氨基酸序列SEQ ID NO：2(图8)的该多肽成熟形式的聚核苷酸；
(b)含编码序列SEQ ID NO：1(图8)，编码至少该多肽成熟形式的聚核苷酸；
(c)聚核苷酸(a)或(b)所编码的多肽因其氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸取代、缺失和/或增加而衍生得到的多肽的编码聚核苷酸；
(d)含有与(a)至(c)中任一聚核苷酸杂交的互补链的聚核苷酸；
(e)所编码的多肽与(a)至(d)中任一聚核苷酸所编码的多肽具有60％或更高氨基酸序列一致性的聚核苷酸；
(f)所编码的多肽能够调节磷酸盐代谢的聚核苷酸，该多肽含有(a)至(e)中任一聚核苷酸所编码多肽的片段或带表位部分；
(g)编码phosphatonin多肽的带表位部分的聚核苷酸，所述的带表位部分包含SEQ ID NO：2(图8)中的1-40，141-180和/或401-429氨基酸残基；
(h)包含(a)至(g)任一聚核苷酸中至少15个核苷酸，并编码一段能调节磷酸盐代谢的多肽的聚核苷酸；
(i)编码能调节磷酸盐代谢的多肽的聚核苷酸，该多肽含有(a)至(h)中任一聚核苷酸所编码多肽的细胞和/或糖胺聚糖结合基序和/或骨矿化基序；
(j)因遗传密码子简并性产生的(a)至(i)中任一聚核苷酸的简并性聚核苷酸。
在此，phosphatonin“聚核苷酸”表示具有SEQ ID NO：1中核酸序列的分子，或编码本发明phosphatonin多肽的分子。例如，phosphatonin聚核苷酸可含有全长cDNA，包括5′端和3′端的非翻译区和编码区，该核酸序列的片段、表位、结构域和变异体。
此外，phosphatonin“多肽”在此指具有以上广义聚核苷酸经翻译产生的氨基酸序列的分子。
phosphatonin“聚核苷酸”还包括能在严谨性杂交条件下与SEQ ID NO：1中的序列或其互补序列杂交的聚核苷酸。“严谨性杂交条件”指：在溶液(50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑鱼***DNA)中42℃培养过夜，然后约65℃在0.1×SSC中洗涤滤膜。其他合适的杂交条件参见实施例。
本发明还考虑在低严谨性杂交条件下与phosphatonin“聚核苷酸”杂交的核酸分子。通过调节甲酰胺浓度(甲酰胺百分比越低，严谨性越低)、盐条件或温度来改变杂交严谨性和信号检测。例如，低严谨性杂交条件包括：在含6×SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑鱼***覆盖DNA的溶液中37℃培养过夜，然后约50℃在1×SSPE、0.1×SDS中洗涤滤膜。此外，为了进一步降低严谨性，严谨性杂交后可在更高的盐浓度(例如，5×SSC)下进行洗涤。注意，可通过在杂交试验中加入和/或换用其他降低背景的覆盖剂来改变上述条件。典型的覆盖剂包括Denhardt′s试剂，BLOTTO，肝素，变性鲑鱼***DNA和市售专利制剂。加入特定的封闭剂可能需要改变前述杂交条件，因为有相容性问题。当然，仅与polyA+序列(例如序列表中cDNA的3′端polyA+段)或其T(或U)残基互补延伸杂交的聚核苷酸不包括在“聚核苷酸”定义内，因为此类聚核苷酸会与任一含polyA延伸段或其互补序列的核酸分子杂交(例如，双链cDNA克隆)。
所述phosphatonin聚核苷酸可由各种聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸构成，可以是非修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，phosphatonin聚核苷酸可以是单链和双链DNA，单链区与双链区混合的DNA，单链与双链RNA，单链区与双链区混合的RNA，DNA与RNA的杂交分子，该分子可以是单链，更多情况下是双链或单链区与双链区混合。此外，phosphatonin聚核苷酸可以具有包含RNA或DNA或以上两者的三链区。phosphatonin聚核苷酸还可以包含出于稳定性或其他原因修饰过的碱基或DNA或RNA骨架。“修饰”碱基包括，例如，三苯甲基碱基和肌苷等罕见碱基。可对DNA或RNA进行多种修饰；因此，“聚核苷酸”包括化学、酶法或代谢修饰形式。
phosphatonin多肽可由氨基酸通过肽键或修饰肽键彼此连接而成，即，肽等电子排列体，并可含有20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。所述的phosphatonin多肽可通过天然过程修饰，例如翻译后加工，或用本领域熟知的化学方法修饰。上述修饰的描述可参见基础教科书和更详细的专论，以及大量研究文献中。修饰可以在phosphatonin多肽内任意位置进行，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基末端或羧基末端。可以理解，在一给定phosphatonin多肽内，可能在几个位点存在相同或不同程度的同类型的修饰。而且，一给定phosphatonin多肽可能含有许多类型的修饰。phosphatonin多肽可以经(例如)遍在蛋白化而分支，或者是有或没有分支的环状。环状、分支或分支环状phosphatonin多肽可能来自翻译后的天然加工，或由合成法制造。修饰包括：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂类或脂类衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、配制、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟化、碘代、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、pegylation、蛋白酶解、磷酸化、异戊二烯基化、外消旋化、硒代、硫酸盐化、通过RNA介导在蛋白质中加入氨基酸例如精氨酸化，和遍在蛋白化；参见，例如，PROTEINS-STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰(POST-TRANSLATION COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson编，Academic Press，NewYork(1983)，ps.1-12；Seifter，Meth.酶(Enzymol.)182(1990)：626-646，Rattan，纽约科学协会学报(Ann.NY Acad.Sci.)663(1992)；48-62。例如，phosphatonin可能先表达成蛋白前体，然后经过对前体序列的加工，前体序列可被切成两段或更多段，并因(例如)形成了例如氢键而仍然结合在一起。对phosphatonin多肽前体蛋白甚至其成熟形式的加工和/或剪切可通过剪切位点处的一个或多个氨基酸缺失来实现。可以理解，所有上述形式的phosphatonin蛋白都包括在术语“phosphatonin多肽”、“多肽”或“蛋白质”内。
“SEQ ID NO：1”是phosphatonin聚核苷酸序列，“SEQ ID NO：2”是phosphatonin多肽序列。
“具有生物学活性”的phosphatonin多肽指，在后文特定生物试验(剂量依赖或非剂量依赖)中测定，表现出的生物学活性与phosphatonin多肽相似但不一定完全相同的多肽。如果存在剂量依赖，不要求与phosphatonin多肽活性完全相同，而是某一活性具有与phosphatonin多肽基本相同的剂量依赖性(即，与phosphatonin多肽相比，候选肽表现出更高的活性，或者，活性不低于75％，不低于90％更好，最好不低于97％)。
“免疫活性”或“生物学活性”本发明phosphatonin多肽的片段、类似物和衍生物，保留了主要的免疫学特征，即，本发明的聚核苷酸包括编码如下蛋白质或肽的所有核苷酸序列，所述的蛋白质或肽具有一个或多个表位的至少部分一级和/或二级结构构像，所述表位能特异性地与前述聚核苷酸所编码的phosphatonin蛋白的独特抗体反应。较好的是，本发明聚核苷酸编码的肽和蛋白被与phosphatonin多肽上一表位特异性反应的抗体所识别，所述表位包含SEQ IDNO：2中的氨基酸残基20-30、100-130、145-160、300-310、320-340或380-430，或如后文所述的phosphatonin多肽上的一个表位。残基380-430肽/抗体对于研究矿化过程特别有用，残基145-160用于研究受体配体相互作用，残基20-30和100-130用于研究磷酸盐调节。
较好的是，本发明phosphatonin多肽的免疫活性phosphatonin肽片段、类似物和衍生物能够在哺乳动物，特别是小鼠或大鼠内引发免疫反应。
在本发明一优选实施例中，phosphatonin多肽的生物学活性在于能够调节磷酸盐代谢，即具有“phosphatonin活性”。
phosphatonin活性
“能够调节磷酸盐代谢”在此表示对象内有无本发明的phosphatonin多肽(即其水平)调节着Na+依赖性磷酸盐协同转运者、维生素D代谢和/或骨矿化。根据所述活性被本发明多肽上调还是下调，“能够调节磷酸盐代谢”分为“phosphatonin活性”和“反phosphatonin活性”。
phosphatonin活性可用常规试验来测定，例如下调钠依赖性磷酸盐协同转运者和/或上调肾25-羟基维生素D3-24-羟化酶和/或下调肾25-羟基-D-1α羟化酶。各种情况下，相关酶活性的调节可直接或间接受到phosphatonin的影响；例如，测定磷酸盐的放射性Na依赖性吸收。这些活性可用合适的肾细胞系，例如CL8或OK(ECACC91021202，欧洲细胞培养物保藏中心)进行试验。一种合适的实验方法参见Rowe等(1996)。phosphatonin活性还可以通过在组织培养物内促进成骨细胞介导的矿化的能力来衡量；参见，例如，Santibanez，Br.J.Cancer 74(1996)，418-422；Stringa，Bone 16(1995)，663-670；Aronow，J.Cell Physiol.143(1990)，213-221；或参见后文实施例。
本发明的另一方面内容提供一种上述多肽的生物学活性片段。不管理论上如何，phosphatonin被认为可能以聚合激素的形式发挥作用，它可以在体内被切成一段或多段片段，至少其中部分片段具有生物学活性，例如激素活性。“体内”被认为表示phosphatonin可被蛋白酶解剪切，例如被PHEX基因产物剪切，产生至少一种功能片段。在一优选实施例中，包含生物学活性片段的多肽能够因具有(例如)前述phosphatonin活性或后文所述的反phosphatonin活性而调节磷酸盐代谢。所述生物活性片段可以是N末端、C末端或中间片段。含生物学活性片段的多肽还可以含有其他氨基酸序列，只要其生物学活性不受影响。
较好的是，所述生物学活性片段具有一个细胞结合基序，宜含RGD。如后文所述，该基序可能参与受体和/或骨矿化基质相互作用。较好的是，生物学活性片段具有糖胺聚糖结合基序，最好具有SGDG(SEQ ID NO：3)。糖胺聚糖的结合使片段类似于蛋白聚糖。已知蛋白聚糖与骨的生物学活性，特别是细胞信号传递有关。后文将对这些基序进行详细论述。
本发明实施例之一中，含生物学活性片段的多肽具有phosphatonin活性。不管理论上如何，该活性据推断存在于未经PHEX金属蛋白酶剪切的phosphatonin和携有PHEX金属蛋白酶剪切位点例如ADAVDVS(SEQ ID NO：4)的生物学活性片段，估计剪切发生在残基VD(残基235和236之间)。生物学活性片段可能包含图8氨基酸序列的至少前236个残基，该PHEX金属蛋白酶剪切位点因而包含在该片段中。此类具有phosphatonin活性的多肽及其片段可用于治疗血磷酸盐过多。
相关蛋白
本发明的进一步研究发现，phosphatonin(MEPE)、牙质基质蛋白-1(DMP1)、牙质唾液酸磷酸蛋白(DSSP；更具体地说是牙质phosphoryn的C末端)、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨桥蛋白(OPN)之间具有许多独特的相似性。具体地说，上述基质蛋白都具有RGD基序，都被糖基化，天冬氨酸和丝氨酸含量异常高。酪蛋白激酶II磷酸化基序是他们的共同特征并有彼此同源的局部区域。Lanview-sim分析Swissport软件(Duret，LALNVIEW：用于配对序列对齐的图象观察器。Computi.Biosci.12(1996)，507-510)，通过phosphatonin与DSSP之间的点阵比较图形显示了高同源性区域。该基序在DSSP的牙质phosphoryn(DP)部分重复了5次(图12)，与phosphatoninC末端具有80％的同源性。根据理化参数，同源性预测可达93％，该序列同系物也存在于所述的其他骨/牙质分子中，序列类似性分别为60-65％。在该同一区域，DMA-1和phosphatonin之间还具有延伸的序列同源性，如表2和以下序列比较所示：
408  SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG 429  MEPE(SEQ ID NO：5)
443  SSRSKEDSN-STESKSSSEEDG 463 DMA-1(SEQ ID NO：6)
牙质唾液酸磷酸蛋白(DSSP)是一种含RGD的大糖蛋白，体内经剪切产生牙质唾液酸蛋白(DSP)和牙质phosphoryn(DP)两种蛋白(MacDougall，J.Biol.Chem.272(1997)，853-842)。DSP是N末端的肽，DP是C末端的肽，两者原先被认为来自不同的基因。phosphatonin与DSSP的高严谨性和低严谨性统计点阵比较显示在图13中。“基序-同源物”(DSSESSDSGSSSES(SEQ ID NO：7)在DSSP中的重复特征及其惊人的同源性清楚地显示在两张图中。该基序在MEPE中只在C末端出现1次。而且，清楚地显示DSSP(或DP部分)的C末端总体序列相似性较低。因此认为现在发现了一个新的“独特”特征，该特征可能与骨-齿基质类蛋白内的骨-矿质相互作用有关。
总之，所述各蛋白都似乎与骨矿质或齿胞外基质形成完整的结合，并且，这些相互作用据信是通过整联蛋白/RGD结合介导的。而且，新的区域性基序(富含丝氨酸和天冬氨酸)对磷酸钙相互作用有利。所以，这支持这一假设，phosphatonin的C末端参与骨矿质的体内平衡，N末端影响肾磷酸盐调节。总之，这些蛋白质的共同特征包括：
1.相似结构中的RGD基序；
2.糖蛋白；
3.富含丝氨酸和天冬氨酸；
4.酪氨酸激酶和蛋白激酶基序；
5.独特的富含天冬氨酸-丝氨酸的MEPE基序(在DPP内重复)；
6.大量磷酸化基序和肉豆蔻酸化基序；
7.表明剪切和/或不同拼接的证据；
8.都与骨或齿胞外基质相结合。
因此，在本发明一优选实施例中，phosphatonin多肽具有上述骨矿质基序，较好的是，氨基酸序列SEQ ID NO：5或7，或DMP1、DSSP、BSP、OPN或DMA-1蛋白中与此对应的氨基酸序列。
生物学活性片段
本发明另一实施例中，含生物学活性片段的多肽具有与phosphatonin相反的活性，可能适合治疗血磷酸盐过少性情况。该实施例中，多肽能够直接或间接上调钠依赖性磷酸盐协同转运者和/或下调25-羟基维生素D3-24羟化酶和/或上调肾25-羟基-D-1α羟化酶。该活性又称“反phosphatonin活性”。然而，“反phosphatonin活性”并不排除所述活性是真phosphatonin在磷酸盐代谢中的主要活性之一的可能性。此类“反phosphatonin活性”也可用合适的肾细胞系例如CL8或OK(ECACC91021202，欧洲细胞培养物保藏中心)和Rowe等(1996)的方法方便地试验测定；还可参见前文所述和后文实施例中的方法。因此，根据前文或后文(例如实施例)所述的的方法，可方便地测定本发明phosphatonin多肽的phosphatonin活性或“反phosphatonin活性”。较好的是，片段是PHEX金属蛋白酶酶解剪切phosphatonin而得到的。如Rowe等所述(1997)，已经克隆了PHEX基因，并发现它编码一种Zn金属肽酶。同样，不管理论上如何，具有上述活性的生物学活性片段据信缺失图8氨基酸序列的至少部分N末端或C末端，较好的是至少缺失C末端起至推定的残基235/236处的PHEX金属蛋白酶剪切位点。因此，该多肽含有最好不超过图8氨基酸序列的前235个氨基酸残基。
根据实施例4的解释，本发明的phosphatonin多肽是用一个表达文库克隆的，其中靶cDNA与β半乳糖苷酶的一部分融合。在由此获得的cDNA中不包括N末端的甲硫氨酸。然而，据推断，真phosphatonin的氨基酸序列具有N末端的甲硫氨酸。因此，在本发明phosphatonin多肽实施例之一中，多肽的氨基酸序列具有加到N末端的Met。
另一实施例中，本发明多肽可以是融合蛋白的一部分。后文有该实施例的详细描述。
本发明还提供编码所述phosphatonin多肽的聚核苷酸。这样的聚核苷酸可以是DNA，例如cDNA，或RNA，例如mRNA，或任何其他形式的核酸，包括合成或修饰的衍生物，它们可以以一段连续序列编码多肽，也可以以被***序列打断的多段序列编码多肽。不论以何种形式存在，所述聚核苷酸都是分离的聚核苷酸，因为它已从天然所处的状态中分离出来。本发明这部分内容的基础是人phosphatonin基因的克隆。在一优选实施例中，所述的聚核苷酸包含图8的核苷酸序列，并或选性地包含不影响所编码多肽活性的一个或多个突变或缺失。这样的突变包括因遗传密码子简并性造成的突变，和前文所述造成氨基酸突变或缺失的各种核苷酸突变。因此，运用分子生物学常规技术，可利用图8的核苷酸序列产生编码本发明所用多肽的合适的聚核苷酸序列。如前文所述，本发明还包括缺失C末端或N末端后续核苷酸的phosphatonin聚核苷酸，后文对此有详细描述。
本发明聚核苷酸序列的延长
如实施例4所述，用表达文库所得的phosphatonin聚核苷酸可能不是完整5′末端的全长序列。因此，用部分核苷酸序列和各种本领域已知的检测例如启动子和调节元件等上游序列的方法，可延长编码phosphatonin多肽的聚核苷酸序列。Gobinda，(PCR Methods Applic.2(1993)，318-322)揭示了用通用引物，通过“限制性位点”聚合酶链反应(PCR)，直接检索与已知基因座毗邻的未知序列。首先，用接头序列的引物和已知区的特异性引物扩增基因组DNA。用同一接头序列的引物和比前一引物更靠内的另一个特异性引物对扩增所得片段进行第二轮PCR。用合适的RNA聚合酶转录各轮PCR的产物，并用逆转录酶测序。
可用反向PCR，用根据已知区域的不同引物扩增或延长序列(Triglia，NucleicAcids Res.16(1988)，8186)。可用OLIGO4.06引物分析软件(1992，NationalBiosciences Inc.，Plymouth MN)或其他合适的程序来设计引物，长度以22-30个核苷酸为宜，GC含量最好不低于50％，与靶序列退火结合的温度以约68-72℃为宜。该方法在基因已知区域内用多种限制性酶产生一段合适片段。然后通过分子内连接反应环化，用作PCR的模板。
捕捉PCR(Lagerstrom，PCR Methods Applic.1(1991)，111-119)是一种PCR扩增(例如)人酵母人造染色体DNA中与已知序列毗邻的DNA片段的方法。捕捉PCR也需要在PCR前通过限制性酶消化和连接将一段工程化的双链序列***DNA分子的未知部分内。
检索未知序列的另一方法是Parker所述的方法(Nucleic Acids Res.19(1991)，3055-3060)。此外，可用PCR，套组引物和PromoterFinder文库进行基因组DNA的行军PCR(PromoterFinderTM Clontech(Palo Alto CA))。该方法不需要筛选文库，并可用于寻找内含子/外显子接头。用于筛选全长cDNA的文库最好经大小选择而包含较大的cDNA。而且，优选随机引发文库，因为它们含有更多包含基因5′和上游区域的序列。如果寡聚d(T)文库不能获得全长cDNA，则随机引发的文库特别有用。而且，还可直接检测引物延伸产物的序列。基因组文库可用于延伸到5′非翻译调控区内。可用毛细管电泳分析大小或证实测序结果或PCR产物的核苷酸序列；参见，例如，Sambrook，同上。快速测序***可获自Perkin Elmer，BeckmannInstruments(Fullerton CA)，以及其他公司。
计算机辅助鉴定phosphatonin多肽及其编码基因
可用BLAST2，即基本局部对比查找工具(Basic Local Alignment SearchTool)(Altschul，Nucleic Acids Res.，25(1997)，3389-3402；Altschul，J.Mol.Evol.，36(1993)，290-300；Altschul，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)，查找局部序列对比。BLAST既可找到核苷酸对比也可找到氨基酸对比，由此确定序列相似性。因为对比的局部性，BLAST在确定确切匹配或鉴定同系物中特别有用。BLAST算法输出结果的基本单位是高分节段对(HSP)。一个HSP包括任意但等长的两个序列片段，它们的局部对比率最大，其对比分值符合或超过使用者设定的阈值或限值。BLAST搜索查询序列和数据库序列之间的HSP，估算找到的任意匹配的统计学显著性，只报道满足使用者选定显著性阈值的匹配。参数E确立报道数据库序列匹配的统计学显著性阈值。E是一个HSP(或一组HSP)在全数据库搜索中出现频率的期望上限。任一匹配性满足E的数据库序列报道在程序的输出结果中。
使用BLAST(Altschul，1997，1993和1990，同上)的类似计算机技术被用于在核苷酸数据库，例如GenBank或EMBL中搜索全同或相关的分子。该方法比基于多层膜的杂交法快得多。而且，计算机搜索的灵敏度可调节，以确定任一具体的匹配是精确匹配还是类似。搜索的基础是如下得出的乘积分值：
Figure C9980636100181
而且还考虑两序列的相似程度和匹配序列的长度。例如，乘积分值40，是误差1-2％以内的精确匹配；70，则是精确匹配。类似分子的鉴定通常是选择乘积分值15-40之间的那些，更低的分值可作为相关序列。
有关本发明phosphatonin聚核苷酸和多肽及其分子衍生物的其他应用，将在后文详细论述。
phosphatonin聚核苷酸和多肽
参见实施例4，从癌源性血磷酸盐过少性骨软化患者体内摘取脑膜磷酸盐沉着-间充质-肿瘤，从中抽提mRNA建立cDNA文库，从中分离出phosphatonin。
phosphatonin核苷酸序列SEQ ID NO：1由获自相关DNA克隆的部分同源(“重叠”)序列组装而成。重叠序列被拼装成一段高丰余性(各核苷酸位置有3-5段重叠序列)的连续序列，最后得到序列SEQ ID NO：1。因此，SEQ ID NO：1和翻译得到的SEQ ID NO：2足够准确，适合许多本领域已知和后文所述的用途。例如，SEQ ID NO：1可用于设计核酸杂交探针，检测包含在SEQ ID NO：1内的核酸序列。此类探针还可以与生物样品中的核酸分子杂交，因而可进行本发明所述的法医鉴定和诊断方法。同理，多肽SEQ ID NO：2可用于产生与phosphatonin特异性结合的抗体。但是，测序反应产生的DNA序列会含有测序误差。这些误差是所得DNA序列中的误鉴定核苷酸，或是核苷酸的***或缺失。错误***或缺失的核苷酸会改变推定氨基酸序列的读码框。此时，推定氨基酸序列将不同于实际氨基酸序列，即使产生的DNA序列与实际DNA序列的一致性可能超过99.9％(例如，一个1000碱基开放式读码框内一个碱基的***或缺失)。
因此，对于那些要求核苷酸序列或氨基酸序列准确性的应用来说，本发明不仅提供所得的核苷酸序列SEQ ID NO：1和推定的翻译所得氨基酸序列SEQ IDNO：2，而且提供了克隆核苷酸序列SEQ ID NO：1对应的cDNA和基因组DNA的有用工具。所得phosphatonin克隆的核苷酸序列可用已知方法进行克隆测序方便地进行鉴定。然后，可由这些cDNA或基因组克隆验证推定的phosphatonin氨基酸序列。而且，要直接确定所得克隆编码的蛋白质的氨基酸序列，还可以通过肽测序，或在合适的宿主细胞内表达蛋白，收集蛋白，根据本发明所述方法测定其序列和功能。
本发明还涉及对应于SEQ ID NO：1的phosphatonin基因。phosphatonin基因可用已知方法，用本文公开的序列信息来分离。此类方法包括根据所揭示的序列制备探针和引物，鉴定或扩增来自相应基因组原料的phosphatonin基因。
本发明还提供phosphatonin的同种类似物。可用本发明所提供的序列制备合适的探针或引物，在合适的核酸来源中筛选所需的类似物。
因此，由于提供了编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1及其他核苷酸序列，所以能够从其他物种分离到全同或相似的编码phosphatonin蛋白的核酸分子，尤其是从人以外的哺乳动物分离直向同源phosphatonin基因。“直向同源”在此表示，来自同一始祖基因，经特化过程得到的存在于不同物种的同源序列。直向同源基因所负责的功能可能相同，可能不同；参见，例如，“生物信息学导引”汇编，Trends Suppliment 1989，Elsevier Science。
可用任意合适的方式制备phosphatonin多肽。所述多肽包括分离的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成的多肽，综合以上方法产生的多肽。制备所述多肽的方法是本领域所熟知的。
所提供的phosphatonin多肽最好呈分离的形式，而且最好是基本纯的。重组产生的多肽，包括分泌多肽，可用Smith和Johnson，Gene 67(1988)，31-40中所述的一步法基本纯化。也可以用已知方法产生抗phosphatonin蛋白的本发明抗体，用该抗体从天然或重组来源中纯化phosphatonin多肽。
聚核苷酸与多肽变异体
“变异体”指与phosphatonin聚核苷酸或多肽不同，但保留了其主要活性例如前述免疫学或(更好的是)生物学活性的聚核苷酸或多肽。一般，从总体上说，变异体与phosphatonin聚核苷酸或多肽十分相似，并在许多区域全同。
这样的聚核苷酸包括编码前述phosphatonin蛋白片段、类似物或衍生物的那些，尤其是直向同源基因，它们通过分别或综合的氨基酸和/或核苷酸缺失、***、取代、增加和/或重组，或本领域已知的任意其他修饰而不同于前述氨基酸序列或其核苷酸序列。本发明在核酸分子内引入这些修饰的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。所有这些本发明蛋白的片段、类似物和衍生物只要前述主要免疫学和/或生物学特性未受影响，它们都包括在本发明范围内。
本文中的“变异体”表示，所述聚核苷酸的核苷酸及其编码的氨基酸序列在一个或多个核苷酸位置不同于前述phosphatonin的聚核苷酸和多肽，但与所述核酸分子高度同源。同源性理解为指序列一致性至少40％，50％以上为佳，60％以上更好，70％以上，80％以上，90％以上，甚至95％则还要好。与前述核酸分子序列的差异来自于，例如：核苷酸取代、缺失、增加、***和/或重组；参见前述文献。同源性可能还表示相关核酸分子或其编码的蛋白在功能和/或结构上是相当的。与前述核酸分子同源或由其衍生的核酸分子是，例如，所述核酸分子的变异，代表着具有相同生物学功能，尤其是编码生物学功能相同或基本相同的蛋白的功能的修饰。它们可以是天然变异，例如来自其他哺乳动物的序列，或是突变。所述突变可自然发生，或用诱变技术获得。等位变异可以是自然发生的等位变异体和合成或基因工程产生的变异体；参见文献同上。
核苷酸序列与本发明参照核苷酸序列的“一致性”在95％以上的聚核苷酸表示，该聚核苷酸序列中相对编码phosphatonin多肽的参照核苷酸序列的每100个核苷酸有至多5处突变，除此之外，其核苷酸序列与参照序列相同。换言之，要获得与参照序列一致性在95％以上的聚核苷酸，参照序列中至多5％的核苷酸可被缺失或替代，或者，可在参照序列中***至多其核苷酸总数5％的核苷酸。查询序列可以是完整的SEQ ID NO：1序列，或是本文所述的ORF(开放读码框)或任一片段。
实践中，某特定核酸分子或多肽与本发明核酸序列的一致性至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％还是99％，一般可用已知的计算机程序来测定。测定查询序列(本发明序列)与研究序列之间最佳整体匹配性，又称总体序列对比的一种优选方法可采用根据Brutlag等的算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6(1990)，237-245)。在序列对比中，查询序列和研究序列都是DNA序列。RNA序列可通过将U转换成T来比较。所述总体序列对比的结果是一致性百分比。用于DNA序列FASTDB对比法中计算一致性百分比的优选参数是：矩阵＝一元，k-重数＝4，错配扣分＝1，连接扣分＝30，随机化组长度＝0，截断分值＝1，空距扣分＝5，空距大小扣分＝0.05，阅读窗大小＝500或研究核苷酸序列长度，取两者中较短者。
如果研究序列因为5′或3′缺失而不是因为内部缺失而比查询序列短，必须对结果进行人工校正。这是因为，FASTDB程序在计算一致性百分比时不将5′或3′的截断计算在内。对于相对查询序列在5′或3′截短的研究序列来说，一致性百分比的校正为：计算查询序列中对应于研究序列5′和3′的、没有参与匹配和对比的碱基数占查询序列碱基总数的百分比。一个核苷酸是否匹配/对正，由FASTDB序列对比结果来确定。然后从前文用FASTDB程序和特定参数计算的一致性百分比中扣除这一百分比，从而得到最终一致性百分比分值。本发明采用这一校正后的分值。为了人工校正本发明一致性分值，只计算FASTDB对比所显示的，没有与查询序列匹配/对比的研究序列5′和3′以外的碱基。
例如，一段90碱基的研究序列与一段100碱基的查询序列对比，以测定一致性百分比。缺失发生在研究序列的5′末端，因此，FASTDB对比不显示这5′前10个碱基的匹配/对比。这10个没有配对的碱基代表着序列的10％(5′和3′端没有匹配的碱基数/查询序列总碱基数)，因此从FASTDB程序算得的一致性百分比中扣除10％。如果剩余的90％碱基完全匹配，最终的一致性百分比就将是90％。另一实施例中，一段90碱基的研究序列与一段100碱基的查询序列比较。这次，缺失是内部缺失，所以研究序列的5′和3′端没有未与查询序列匹配/对比的碱基。此时，不对FASTDB算得的一致性百分比进行人工校正。在此重申，只有研究序列5′和3′端没有与查询序列匹配/对比的碱基要进行人工校正。本发明不进行其他校正。
氨基酸序列与本发明问询氨基酸序列的“一致性”在95％以上的多肽表示，该研究多肽的氨基酸序列中相对问询氨基酸序列的每100个氨基酸有至多5处氨基酸改变，除此之外，其氨基酸序列与查询序列相同。换言之，要获得氨基酸序列与查询序列一致性在95％以上的多肽，研究序列中至多5％的氨基酸可被***、缺失、增加或替代。参照序列的这些改变可以发生在氨基末端或羧基末端，或在两末端之间的任意位置，它们或者各自分散在参照序列残基之中，或者形成一个或多个连续的组。
实践中，某特定多肽或多肽与(例如)氨基酸序列SEQ ID NO：2的一致性至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％还是99％，一般可用已知的计算机程序来测定。测定查询序列(本发明序列)与研究序列之间最佳整体匹配性，又称总体序列对比的一种优选方法可采用根据Brutlag等的算法的FASTDB计算机程序(Comp.App.Biosci.6(1990)，237-245)。在序列对比中，查询序列和研究序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述总体序列对比的结果是一致性百分比。用于氨基酸序列FASTDB对比法中计算一致性百分比的优选参数是：矩阵＝PAM0，k-重数＝2，错配扣分＝1，连接扣分＝20，随机化组长度＝0，截断分值＝1，阅读窗大小＝序列长度，空距扣分＝5，空距大小扣分＝0.05，阅读窗大小＝500或研究核苷酸序列长度，取两者中较短者。
如果研究序列因为N或C末端缺失而不是因为内部缺失而比查询序列短，必须对结果进行人工校正。这是因为，FASTDB程序在计算总体一致性百分比时不将N或C末端的截短计算在内。对于相对查询序列在N或C末端截短的研究序列来说，一致性百分比的校正为：计算查询序列中对应于研究序列N或C末端的、没有与对应研究残基匹配和对比的残基数占查询序列残基总数的百分比。一个残基是否匹配/对正，由FASTDB序列对比结果来确定。然后从前文用FASTDB程序和所述参数计算的一致性百分比中扣除这一百分比，从而得到最终一致性百分比分值。本发明采用这一校正后的分值。为了人工校正本发明一致性分值，只计算FASTDB对比所显示的，没有与查询序列匹配/对比的研究序列N或C末端以外的碱基。
例如，一段90氨基酸残基的研究序列与一段100残基的查询序列对比，以测定一致性百分比。缺失发生在研究序列的N末端，因此，FASTDB对比不显示这N末端前10个残基的匹配/对比。这10个没有配对的残基代表该序列的10％( N或C末端没有匹配的残基数/查询序列总残基数)，因此从FASTDB程序算得的一致性百分比中扣除10％。如果剩余的90％残基完全匹配，最终的一致性百分比就将是90％。另一实施例中，一段90残基的研究序列与一段100残基的查询序列比较。这次，缺失是内部缺失，所以研究序列的N或C末端没有未与查询序列匹配/对比的残基。此时，不对FASTDB算得的一致性百分比进行人工校正。在此重申，只有研究序列N或C末端没有与查询序列匹配/对比的残基要进行人工校正。本发明不进行其他校正。
phosphatonin变异体可包括编码区、非编码区或以上两区中的改变。特别好的是，聚核苷变异体包含产生沉默取代、增加或缺失，但不改变所编码多肽的特性或活性。优选的是遗传密码子简并性造成沉默取代而产生的核苷酸变异体。而且，优选的还包括具有任意方式组合的5-10、1-5或1-2个氨基酸取代、缺失或增加的变异体。产生phosphatonin聚核苷酸变异体可出于许多目的，例如，为了优化特定宿主内的表达(将人RNA中的密码子改变成大肠杆菌等细菌宿主所偏好的密码子)。
天然phosphatonin变异体又称“等位基因变异体”，指占据生物体染色体上特定位置的某基因多种不同形式中的一种。(Gene II，Lewin，B.ed.，John Wiley &Sons，New Youk(1985)及更新版)。这些等位基因变异体可具有聚核苷酸和/或多肽水平上的差异。或者，可用诱变技术或直接合成产生非天然变异体。
用已知的蛋白质工程和重组DNA技术方法，可产生变异体以改善或改变phosphatonin多肽的特性。例如，可缺失蛋白质N或C末端的一个或多个氨基酸而不损失其生物学功能。Ron.J.Biol.Chem.268(1993)，2984-2988的作者报道了突变KGF蛋白，即使在缺失了3、8或27个氨基末端氨基酸残基后，它们仍保留了肝素结合活性。与此相似，γ干扰素在缺失了羧基端的8-10个氨基酸残基后，活性升高10倍(Dobeli，J.Biotechnology 7(1988)，199-216)。
而且，大量证据表明，变异体一般都保留与天然蛋白相似的生物学功能。例如，Gayle及其同事(J.Biol.Chem.268(1993)；22105-22111)对人细胞因子IL-1a进行了全面的突变研究。他们以随机诱变产生了超过3500种IL-1a变异体，每个变异体总长中平均约2.5个氨基酸改变。对每一个可能的氨基酸位置检测到多种突变，研究者发现，“大多数分子可以被改变而对两种(结合或生物学)活性几乎没有影响”；参见Abstract。实际上，在被检测的3500种氨基酸序列中只有23种独特氨基酸序列产生了活性与野生型明显不同的蛋白质。
而且，即使N或C末端一个或多个氨基酸缺失改变或损失了一种或多种生物学功能，其他生物学功能仍然能够被保留。例如，如果没有从N末端或C末端缺失掉该蛋白的大多数残基，缺失变异体可能保留诱导和/或结合识别该蛋白的抗体的能力。某蛋白缺失了N或C末端的特定多肽是否保留这样的免疫活性可通过本发明所述和本领域已知的常规方法来测定。而且，用PESTFIND程序(Rogers，科学(Science)234(1986)，364-368)可鉴定到PEST序列(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸)，他们特征性地存在于不稳定蛋白质中。可去除phosphatonin蛋白质中的这些序列以提高其稳定性和该蛋白的某些活性。本发明在核酸分子内引入这些修饰的方法是本领域所熟知的。
因此，本发明还包括表现出主要生物学活性的phosphatonin多肽变异体。这类变体包括根据本领域已知通用规则的缺失、***、反向、重复和取代，对活性几乎没有影响。例如，有关如何制造表型沉默氨基酸取代的指导可参见Bowie科学(Sience)247(1990)，1306-1310，作者在其中指出，有两种主要策略用于研究一段氨基酸序列对改变的耐受性。第一种策略靠自然选择在进化过程中发现氨基酸取代的耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可以发现保守的氨基酸。这些保守氨基酸可能对蛋白质的功能十分重要。相比之下，氨基酸位置发生的取代能被自然选择所耐受，说明这些位置对蛋白质的功能不重要。因此，耐氨基酸取代的位置可被修饰，而仍然维持蛋白质的生物学活性。
第二种策略利用基因工程在某克隆基因的特定位置引入氨基酸改变，以鉴定对蛋白质功能来说的重要区域。例如，可采用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(在分子内每个残基处引入一个单丙氨酸突变)。(Cunningham和Wells，科学(Science)244(1989)，1081-1085)。然后可测定所得突变分子的生物学活性。
如作者所述，这两种策略揭示，蛋白质对氨基酸取代具有惊人的耐受性。作者还说明了蛋白质内某氨基酸位置上哪种氨基酸改变可能被允许。例如，大多数隐蔽氨基酸残基(蛋白质三级结构中)需要非极性侧链，而极少数表面侧链的特征是普遍保守的。而且，可耐受的保守性氨基酸取代包括脂族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酰胺残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg和His的替换；芳族残基Phe、Tyr和Trp的替换；和小氨基酸残基Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替换。
除保守性氨基酸取代之外，phosphatonin变异体还包括(i)一个或多个非保守性氨基酸取代，所取代的氨基酸残基可以是或不是遗传密码子所编码的，或(ii)用一个或多个有取代基的氨基酸残基取代，或(iii)成熟多肽与其他化合物，例如提高多肽稳定性和/或溶解度的化合物(例如聚乙二醇)的融合体，或(iv)多肽与附加氨基酸(例如IgG Fc融合区肽、前导序列或分泌序列、或协助纯化的序列)的融合体。根据本文说明，这些变异多肽都是本领域技术人员知道的。例如，phosphatonin多肽变体中带电氨基酸残基被其他带电或中性氨基酸残基取代，可产生特性被改良(例如凝聚减少)的蛋白质。药物制剂的凝聚因为凝聚体的免疫原性既降低活性又加速清除；参见，例如，Pinckard，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)2(1967)，331-340；Robbins，糖尿病(Diabetes)36(1987)，838-845；Cleland，Crit.Rev.药物载体***(Therapeutic Drug Carrier Systems)10(1993)，307-377。
聚核苷酸和多肽片段
本发明中，“聚核苷酸片段”指具有SEQ ID NO：1所含核酸序列的短聚核苷酸。短聚核苷酸片段的长度最好至少15nt，至少20nt更好，至少30nt，甚至至少40nt还要好。“长至少20nt”的片段指包含核苷酸序列SEQ ID NO：1所含cDNA序列中20或20个以上相邻碱基。这些核苷酸片段可用作诊断探针或引物，如本文所述。当然，更大的片段(例如，50、150、500、600、1000核苷酸)更好。
而且，phosphatonin聚核苷酸片段的代表性例子包括：序列为SEQ ID NO：1中约核苷酸1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、601-650、651-700、701-750、751-800、801-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300或1301-1350的片段。“约”包括比上述范围在各末端或两末端大或小几个(5、4、3、2或1个)核苷酸。较好的是，这些片段编码具有生物学活性的多肽。更好的是，这些聚核苷酸可用作本发明所述的探针或引物。
本发明中，“多肽片段”指包含在SEQ ID NO：2中的短氨基酸序列。蛋白质片段可以是“独立”的，或者包含在一个较大的多肽内作为该多肽的一部分或一个区域，最好是一个单独的连续区。本发明多肽片段的代表性例子包括从约1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、301-320、321-340、341-360、361-380、381-400和401-421号氨基酸至编码序列区的片段。而且，多肽片段可以长约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个氨基酸。“约”包括比上述范围在各末端或两末端大或小(几个(5、4、3、2或1个)氨基酸。
优选的多肽片段包括氨基或羧基末端或两末端连续缺失残基的phosphatonin蛋白。例如，可从phosphatonin多肽的氨基末端缺失1-60间任意数量的氨基酸。同理，可从phosphatonin多肽的羧基末端缺失1-30间任意数量的氨基酸。而且，上述氨基和羧基末端缺失的各种组合更好。同理，也优选编码这些phosphatonin多肽片段的聚核苷酸片段。
特别是，phosphatonin多肽的N末端缺失可表示为通式m-430，其中m是整数2-416，对应于SEQ ID NO：2中氨基酸残基的位置。
优选的还有以结构域或功能域为特征的phosphatonin多肽或聚核苷酸片段。本发明的优选实施例包括具有α螺旋和α螺旋形成区(“α区”)，β平面和β平面形成区(“β区”)，转角和转角形成区(“转角区”)，卷曲或卷曲形成区(“卷曲区”)，亲水区，疏水区，α两亲区，β两亲区，柔性区，表面形成区，底物结合区和高抗原性指数区的片段。如附图所示，这些优选区域包括Garnier-Robsonα区、β区、转角区和卷曲区，Chou-Fasmanα区、β区和转角区，Kyte-Doolittle亲水区和疏水区，Eisenbergα和β两亲区，Karplus-Schulz柔性区，Emini表面形成区，和Jameson-Wlof高抗原性指数区。本发明特别重视属于保守区的SEQ ID NO：2的多肽片段，并在附图中给予显示。而且，本发明还包括编码这些区域的聚核苷酸片段。
其他优选的是生物学活性的phosphatonin片段。生物学活性片段是那些表现出与phosphatonin多肽相似但不一定全同的生物学活性的片段。生物学活性片段可增强某一需要的活性，或减弱某一不需要的活性。
然而，许多聚核苷酸序列，例如EST序列，是公众能够得到的，并可通过序列数据库获得。其中某些可能与SEQ ID NO：1相关，并在本发明构思前已为公众所知。较好的是，这些相关片段被分别排除在本发明范围之外。列出每条相关序列是十分麻烦的。
因此，排除在本发明之外的一段或多段聚核苷酸含有通式a-b表示的核苷酸序列，其中的a是对应SEQ ID NO：1中1-1655的任一整数，b是整数15-1655，a和b都对应于SEQ ID NO：1所示核苷酸残基的位置，b≥a+14。
表位和抗体
本发明中，“表位”指动物(例如大鼠、家兔、人、小鼠(包括携带人免疫球蛋白基因并产生人抗体分子的转基因小鼠)等)体内具有抗原性或免疫原性的phosphatonin多肽片段。本发明一优选实施例是关于包含一个表位的phosphatonin多肽片段，以及编码该片段的聚核苷酸。蛋白质分子上可被抗体结合的区域称为“抗原性表位”。相比之下，“免疫原性表位”指蛋白质上激发抗体应答反应的部分；参见，例如，Geysen，美国科学协会年报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81(1983)；3998-4002。起表位作用的片段可用各种已知方法来产生；参见，例如，Houghten，美国科学协会年报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(1985)，5131-5135和美国专利4,631,211。
本发明中，抗原性表位的序列宜包含至少7个氨基酸，9个更好，最好是约15-30个。抗原性表位可用于产生与之特异性结合的抗体，包括单克隆抗体；参见，Wilson，细胞(Cell)37(1984)，767-778；Sutcliffe，科学(Science)219(1983)，660-666。
同样，免疫原性表位也可通过本领域熟知的方法用于诱生抗体；参见，例如，Sutcliffe，同上；Wilson，同上；Chow，美国科学协会年报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82(1985)，910-914；和Bittle，遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol.)66(1985)，2347-2354。较好的免疫原性表位包括可溶性蛋白。免疫原性表位可与一载体蛋白，例如白蛋白，一起提供给动物***(例如家兔或小鼠)，或者，如果它足够长(至少约25个氨基酸)则不需要载体。然而，已有显示，短至8-10个氨基酸的免疫原性表位足以产生抗体，该抗体至少能够结合变性多肽内的线性表位(例如，在Western印迹中)。
用获自人类基因组来源中心(http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepage.html)的计算机程序GCG-肽-结构(Rice，EGCG包的程序手册，Cambridge，CB10 1RQ England：Hinxton Hall；1995)发现，SEQ ID NO：2在图4所示的氨基酸区域具有抗原性。因此，这些区域可用作表位来产生抗SEQ ID NO：1所编码蛋白的抗体。
本发明中，“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)包括完整的分子和抗体片段(例如，Fab和F(ab′)2片段)，它们能特异性地结合蛋白。Fab和F(ab′)2片段没有完整抗体的Fc片段，与完整抗体相比，从循环中被清除更快，非特异性组织结合较少；参见，例如，Wahl，J.Nucl.Med.24(1993)，316-325。因此，优选这些片段，以及FAB或其他免疫球蛋白表达文库的产物。本发明的抗体还包括嵌合、单链、人源化抗体和人抗体，来自噬菌体展示、携带人免疫球蛋白基因和/或人染色体的转基因小鼠、分离自人体的免疫细胞、人免疫细胞的体外或活体免疫，或任何其他可行的方法。
另一实施例中，本发明涉及与本发明phosphatonin聚核苷酸互补链杂交的核酸分子，它编码所述蛋白的突变体，该突变体丧失了蛋白的免疫活性，更好的是丧失了生物学活性。该实施例可能对于产生所述phosphatonin蛋白的显性等位突变体有用。所述突变体最好来自前述野生型蛋白氨基酸序列中氨基酸残基1-5或5-10的取代、缺失和/或增加。
载体、宿主细胞和蛋白质的产生
本发明还涉及含phosphatonin聚核苷酸的载体，宿主细胞，和多肽的重组生产。载体可以是例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒。逆转录病毒可以是能够复制的或是复制缺陷的。后一种情况中，病毒只有在互补性宿主细胞内才能增殖。
phosphatonin聚核苷酸可与带有选择标记的载体连接而在宿主内增殖。通常，通过例如磷酸钙沉淀或与带电脂类形成复合体而将质粒载体引入。如果载体是病毒，可用合适的包装细胞系进行体外包装，然后引入宿主细胞。
***的phosphatonin聚核苷酸应与合适的启动子，例如λ噬菌体的PL启动子、大肠杆菌的lac、trp、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTR启动子等操作性连接。本领域技术人员知道还有其他合适的启动子。表达构建物还含有转录起始和转录终止位点，以及转录区内用于翻译的核糖体结合位点。构建物所表达的转录本的编码部分宜包括开始处的翻译起始密码子和位于待译多肽终端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如前所述，表达载体最好具有至少一个选择标记。这类标记包括用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，和用于大肠杆菌及其他细菌内培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适的宿主例如但不限于：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞合适的培养基和条件是本领域已知的。用于细菌的优选载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，购自QIAGEN，Inc.；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，购自Stratagene Cloning Systerms，Inc.；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，购自Pharmacia Biotech，Inc.。优选的真核载体包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG，购自Stratagene；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL，购自Pharmacia。其他合适的载体是本领域熟练技术人员所知道的。
而且，还可以用这样哺乳动物细胞：其基因组已经含有一个前述编码phosphatonin多肽的核酸分子，但因为(例如)启动子弱而不表达或表达方式不佳，在该哺乳动物细胞内引入一段表达调控序列，例如强启动子，使之紧靠编码所述phosphatonin多肽的内源核酸分子，从而诱导多肽的表达。
本文中，“表达调控序列”指这样的核酸分子：它可以因整合到细胞基因组内紧靠phosphatonin编码基因而增加该phosphatonin多肽的表达。此类调控序列包括能诱导或启动phosphatonin基因表达的启动子、增强子、失活静息子内含子序列、3′UTR和/或5′UTR编码区、蛋白质和/或RNA稳定元件、编码调节蛋白的核酸分子(例如转录因子)，或其他已知可激活基因表达和/或增加基因产物量的基因表达调控元件。所述表达调控序列的引入增强和/或诱导了phosphatonin多肽的表达，结果增加了细胞内phosphatonin多肽的含量。因此，本发明旨在更始和/或增加phosphatonin多肽表达。
可用磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子性脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法将构建物引入宿主细胞。此类方法可参见标准实验室手册，例如Davis，分子生物学基本方法(Basic Methods In MolecularBiology)(1986)。特别注意的是，实际上，phosphatonin多肽可由不含重组载体的宿主细胞表达。
可用众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化phosphatonin多肽，这些方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀，酸萃取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和性层析，羟基磷灰石层析和外源凝集素层析。最好，采用高压液相层析(HPLC)进行纯化。
还可以从以下物质中回收phosphatonin多肽：天然原料的纯化产物，包括体液、组织和细胞，可以是直接分离的或是培养的；化学合成产物；重组法由细菌、酵母、高级植物、昆虫和哺乳动物细胞等原核或真核宿主产生的产物。根据重组生产所用的宿主，phosphatonin可能糖基化，可能非糖基化。此外，有时因为宿主介导的加工，phosphatonin可能含有一个起始(修饰的)甲硫氨酸。因此，本领域众所周知的是，由翻译起始密码子编码的N末端的甲硫氨酸在真核细胞内翻译后被高效率地从各种蛋白上去除。虽然，在大多数原核细胞内，有些蛋白N末端的甲硫氨酸也能被去除，但是原核细胞的这种去除过程效率不高，取决于N末端甲硫氨酸所共价连接的氨基酸的性质。
一个特别好的实施例中，本发明涉及分离phosphatonin多肽的方法，包括以下步骤：
(a)培养肿瘤-条件培养基或骨肉瘤细胞，在血清补充培养基(DMEMEagles/10％FCS/谷胺酰胺/抗真菌素(DMFCS))中培养至铺满；
(b)上述细胞隔天在无血清培养基DMEM Eagles/谷胺酰胺/抗真菌素(DM)中培养5小时；
(c)收获无血清条件培养基，与细胞分离，在pH7.2，0.06M磷酸钠和0.5MNaCl(PBS)中平衡条件培养基；
(d)将(c)获得的培养基上样到平衡过的伴刀豆蛋白A琼脂糖柱上；
(e)用PBS彻底洗柱；
(f)用加有0.5M α-甲基-D吡喃葡萄糖的PBS洗伴刀豆蛋白A柱；
(g)对(f)得到的洗脱物质进行阳离子交换层析；
(h)用0.5M NaCl洗脱含phosphatonin多肽的组份。
实施例1描述了以上方法。
本发明的另一主题是制备phosphatonin多肽的方法，包括：培养本发明所述的宿主细胞，它们因为含有本发明的载体或聚核苷酸或外源调控序列而能够在许可多肽表达的条件下表达所述多肽，和从培养物中回收由此产生的多肽。可以理解，用例如本领域已知的体外翻译实验，可在无细胞***内表达所述蛋白。
于是，本发明的另一实施例是关于本发明聚核苷酸所编码，或用以上方法产生的phosphatonin多肽或其免疫活性和/或生物学活性片段。PHEX金属肽酶酶解剪切以上phosphatonin多肽得到的类似phosphatonin多肽也包括在本发明范围内。
本领域熟练技术人员可以看出，本发明的蛋白质还可以与前述其他部分相偶连，用于例如药物制导和造影。这样的偶连可以是在蛋白表达后与结合位点化学偶连，或者，偶连产物可以通过基因工程在DNA水平引入本发明蛋白内。然后在合适的宿主***内表达此类DNA，收集表达的蛋白，并根据需要进行复性。
磷酸盐代谢的调节
如前所述，本发明的phosphatonin多肽能以不同方式调节磷酸盐的代谢。因此，实施例之一中，本发明涉及至少具有以下活性之一的phosphatonin多肽：
(a)能够下调钠依赖性磷酸盐协同转运；
(b)能够上调肾25-羟基维生素D3-24-羟化酶；和/或
(c)能够下调肾25-羟基-D-1-α-羟化酶。
另一实施例中，本发明涉及至少具有以下活性之一的反-phosphatonin活性的phosphatonin多肽：
(a)能够上调钠依赖性磷酸盐协同转运；
(b)能够下调肾25-羟基维生素D3-24-羟化酶；和/或
(c)能够上调肾25-羟基-D-1-α-羟化酶。
在本发明一特别优选的实施例中，phosphatonin多肽含有前述骨矿质基序，并上调骨的矿化。
本发明另一实施例涉及丧失至少上述活性之一的phosphatonin多肽。这样的多肽可以是本发明phosphatonin多肽的突变体，并可用于(例如)研究phosphatonin编码基因内突变的影响。具体地说，此类突变体可用于开发能够补偿野生型phosphatonin生物学活性之一丧失所致缺陷的药物。最好用后文所述的筛选法来研究此类phosphatonin多肽的突变体。
phosphatonin抗体
而且，如前所述，本发明提供phosphatonin多肽，这样就能够产生phosphatonin特异性抗体。在这方面，用杂交瘤能够产生分泌各种抗体的细胞系，所述抗体针对所需的各种产生免疫应答的物质。然后可从杂交瘤的细胞质中获取编码免疫球蛋白轻链和重链的RNA。mRNA的5′末端部分可用于制备用来***表达载体的eDNA。然后，编码抗体或其免疫球蛋白链的DNA可在细胞内表达，最好是在哺乳动物细胞内表达。根据不同的宿主细胞，可能需要用复性技术来获得正确的抗体构像。如有必要，可用常规的盒式诱变或本文所述的其他蛋白质工程方法在DNA内制造点突变来优化结合。
因此，本发明还涉及特异性识别本发明phosphatonin多肽的抗体。
本发明一优选实施例中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人抗体或人源化抗体、灵长源化抗体、嵌合抗体，或它们的片段，它们特异性结合所述的肽或多肽，还包括双特异性抗体、合成抗体、抗体片段，例如Fab、Fv或scFv片段等，或以上所述抗体的化学修饰衍生物。产生抗体的一般方法是本领域熟知的，并可参见，例如，Kohler和Milstein，自然(Nature)256(1975)，494和J.G.R.Hurrel编的“单克隆杂交瘤抗体：方法与应用”，CRC Press Inc.，Boco Raron，FL(1982)，和L.T.Mimms等，病毒学(Virology)176(1990)，604-619。而且，前述肽的抗体或其片段可用以下文献中的方法获得：Harlow和Lane“抗体，实验室手册”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988。
为了在实验动物内产生抗体，可通过注射本发明多肽或具有免疫原性的其片段或寡肽或衍生物免疫山羊、家兔、大鼠、小鼠等宿主。产生和加工多克隆抗体的技术是本领域众所周知的，并可参见，例如，Mayer和Walker编辑的“细胞和分子生物学中的免疫化学方法”(“Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology″)，Academic Press，London(1987)。还可以从动物，最好是哺乳动物中获得多克隆抗体。纯化抗体的方法在本领域众所周知，包括，例如，免疫亲和性层析。根据宿主种类，各种佐剂或免疫学载体可用于增强免疫反应。此类佐剂包括但不限于：Freund氏完全或不完全佐剂，例如氢氧化铝等矿物胶，和表面活性剂，例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油性乳液和二硝基酚。本发明肽可与之交联的载体的例子是匙孔蛭血蓝蛋白(KLH)。
嵌合抗体的生产参见，例如，WO89/09622。人源化抗体的产生参见，例如，EP-A1-0239400和WO90/07861。本发明所用的另一种抗体来源是异基因抗体。产生异基因抗体(例如在小鼠内产生人抗体)的一般原理参见，例如，WO91/10741、WO94/02602、WO96/3409和WO96/33735。
在一优选实施例中，本发明抗体的亲和力至少约10-7M，至少约10-8M为佳，至少约10-9M更好，至少约10-10M最好。另一方面，如果要激发phosphatonin活性，phosphatonin抗体的结合亲和性约10-5M-1，最好不超过107M-1，如果要抑制phosphatonin活性，最好高至1010M-1或以上。
phosphatonin聚核苷酸的用途
上述phosphatonin聚核苷酸可以多种方式用作反应试剂。以下描述是举例，使用的是已知技术。
由于目前根据实际序列信息(重复多态性)几乎得不到新的染色体标记试剂，所以不断需要鉴定新的染色体标记。phosphatonin相关聚核苷酸(基因组和/或cDNA)可用于进行限制性分析，参见Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)94：5(1994)，457-467；Benham，基因组(Genomics)12(1992)，368-376；Gillett，人类遗传(Hum.Genet.)60(3)(1996)，201-211；Rowe，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22(23)(1994)，5135-5136。具体地说，使用微卫星DNA(Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)94：5(1994)，457-467；Rowe，核酸研究(Nucleic Acids Res.)22(23)(1994)，5135-5136；Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)93(1994)，291-294；Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)91(1993)，571-575；Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)97(1996)，345-352；Rowe，人类遗传(Hum.Genet.)89(1992)，539-542)，用放射性-融合-基因-转移杂交体和ALU-PCR(Benham，基因组(Genomics)12(1992)，368-376)分离信息标记，可作为高信息性方法进行快速分离而筛选出phosphatonin及其衍生物遗传病。以上方法已经在PHEX(MEPE被认为是PHEX的底物)基因图谱和定位中获得成功，大量的突变分析已经揭示了PHEX生物活性所必需的结构区和基序(Rowe，Hum.分子遗传(Mol.Genet.)6(1997)，539-549；Rowe，实验肾脏学(Exp.Nephrol.)5(1997)，355-363；Rowe，当前肾脏学与高血压领域内的一些观点(Current Opinion in Nephrology &Hypertension)7(4)(1998)，367-376；Rowe，临床和实验肾脏学(Clinical andExperimental Nephrology)2(3)(1998)，183-193)，同样的方法也可用于phosphatonin。最近已经开发出了高效的基因组宽联锁和筛选技术，它们依赖于单核苷酸多态性(SNP)，并将凝胶测序与高密度变异检测DNA芯片联用(Wang，科学(Science)280(1998)，1077-1082)。最近，Cambridge，Massachusetts，USA的Whitehead Institute的基因组研究中心在英特网上公开了SNP数据( http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html)。这一基于新的寡核苷酸阵列的高效方法将成为分子表达分析、多态性和基因分型以及疾病治疗的未来途径(Wang，科学(Science)280(1998)，1077-1082；Chee.科学(Science)274(1996)，610-614；Gentalen，核酸研究(Nucleic Acids Res.)27(1999)，1485-1491；Hacia，核酸研究(Nucleic Acids Res.)26(1998)，3865-3866；Lipshutz，自然遗传(Nat.Genet.)21(1999)，20-24；Fan，Eur.J.人类遗传(Hum.Genet.)6(1998)，134)。有了本发明MEPE的序列信息，就可用以上新方法和新技术来确定所述区域的位置。可用常规技术确定序列在哪一特定染色体上，或染色体上哪一特定区域。这包括，与染色体展开的原位杂交，流式分选染色体制备，或人工染色体构建，如酵母人工染色体，细菌人工染色体，细菌P1构建或单个染色体cDNA文库，参见Price(血液学综述(Blood Rev.)7(1993)，127-134)和Trask(现代遗传学(Trends Genet.)7(1991)，149-154)。染色体展开荧光原位杂交技术参见Verma，(1998)人染色体：基础技术手册(Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques)，Pergamon Press，NewYork NY，等。染色体制剂的荧光原位杂交及其他物理染色体图谱技术可与其他基因图谱信息相关联。科研界可从以下网址获得详细的图谱信息：人类基因组图谱工程UK负责的 http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepge.html，美国国立卫生研究院(NIH)负责的国家生物信息中心(NCBI) http://www.ncbi.nim.nih.gov/，Cambridge，Massachusetts，USA的生物医学研究Whitehead Institute(Whitehead-MIT)的基因组研究中心( http://www.genome.wi.mit.edu/)。而且，还可以通过Genethon(法国政府建立)的 http://www.genethon.fr./genethon.en.html获得覆盖整个人类基因组的全面的微卫星图谱和相关谱图工具。性染色体图谱(seminal map)已公开在科学(Science)和自然(Nature)上(参见，例如，Dib，Nature 380(1996)，152-154)，但有关最新信息，需查询网上。确定编码phosphatonin多肽的基因在染色体物理图谱上的位置与特定特征(例如磷酸盐过少或过多性疾病)之间的关联有助于界定与该特征相关的DNA区域。本发明的核苷酸序列可用于检测正常、携带或病发个体基因序列间的差异。而且，本发明所述的工具和方法还可用于标记协助的动物繁殖。本发明的核苷酸序列还可用于检测正常、携带或病发个体间因转位、颠倒等产生的染色***置差异。
至少，本发明的phosphatonin聚核苷酸可用作Southern凝胶上的分子量标记，检测某细胞类型中有无特定mRNA的诊断探针，寻找新聚核苷酸时“扣除”已知序列的探针，用于挑选和制造与“基因芯片”或其他支持体连接的寡聚物，用DNA免疫技术产生抗DNA抗体，和作为抗原激发免疫反应。
phosphatonin多肽和抗体的用途
以上phosphatonin多肽和抗体具有多种用途。以下仅是举例，使用的是已知技术。
phosphatonin多肽可通过基于抗体的技术检测生物样品中的蛋白质水平。例如，可用经典免疫组织学方法研究蛋白在组织内的表达；参见，例如，Jalkanen，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101(1985)，976-985；Jalkanen，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)105(1987)，3087-3096)。用于检测蛋白基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫试验，例如酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫试验(RIA)。合适的抗体试验标记是本领域已知的，包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶，放射性同位素，例如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99m Tc)，荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。
除了检测生物样品内蛋白质水平外，还可以体内造影检测蛋白质。用于体内蛋白造影的抗体标记包括可被X光摄影、NMR或ESR测得的那些。拿X摄影来说，合适的标记包括放射性同位素，例如钡和铯，它们能发出可被测得的射线，但对研究对象没有明显损伤。NMR和ESR的合适标记包括具有可测特性射线的那些，例如锝，它可以通过标记相关杂交瘤的营养物(nutrients)而搀入抗体。
将用合适的可测造影分子(例如131I、112In、99m Tc等放射性同位素，放射性-半透明物质，或可被核磁共振测知的物质)标记的蛋白特异性抗体或抗体片段引入(例如，胃肠外，皮下或腹膜内)哺乳动物。可以理解，研究对象的大小和所用的造影***将决定产生诊断图象所需的造影分子的量。如果是放射性同位素用于人，照射的发射量一般是约5-20毫居里的99m Tc。然后标记抗体或抗体片段将优势性地在含特定蛋白的细胞部位累积。体内肿瘤造影参见，例如，Burchiel，“放射性标记的抗体及其片段的免疫药学动力学″，第13章，肿瘤造影：癌症的放射学检测(Tumor Imaging：The Radiochemical Detection of Cancer)，Burchiel和Rhodes编，Masson Publishing Inc.(1 992)。
因此，本发明提供一种疾病的诊断方法，它包括(a)检测phosphatonin多肽在细胞或组织内的表达，或检测个体体液中phosphatonin或其活性片段或表位的水平；(b)将上述基因表达水平与一标准基因表达水平比较，被测phosphatonin多肽基因表达水平相对标准表达水平提高或降低指示某种疾病。
而且，phosphatonin多肽可用于治疗疾病。例如，可给予患者phosphatonin多肽，试着提高或降低血清磷酸盐水平和/或改善受损的骨形成(X-联锁的血磷酸盐过少性佝偻病，癌源血磷酸盐过少性骨软化，肾衰竭，骨质疏松、肾性骨营养不良，等)。它能够激活或抑制其受体，从而上调或下调钠依赖性磷酸盐协同转运者的表达。此外，phosphatonin基因的启动子和/或增强子可用于基因治疗，以治疗磷酸盐代谢紊乱性疾病，例如X联锁的血磷酸盐过少性佝偻病。而且，骨矿质流失性疾病中因发生不明继发性或原发性改变(例如，与妇女绝经、骨质疏松、年老相关)所致的MEPE基因失调和/或翻译后修饰失当，辅助激素替代疗法的激素(和/或受体或激素的活化剂-拮抗剂)补充将恢复磷酸盐和骨矿质的平衡。MEPE生物学活性的一种重要特征，因而也是疾病治疗的一个重要特征，是这一推论：N-末端序列调节肾的磷酸盐吸收，而C末端(尤其是前述MEPE基序相关区域)是骨正常矿化和发育的先决条件。
在肾移植后，慢性血磷酸盐过多，或者有时是血磷酸盐过少，是造成主要临床并发症的重要特征。例如，曾报道，将正常的肾移植给男性HYP患者，在正常的被移植肾内发生了病理性生理改变，从而发生“佝偻型”肾磷酸盐漏失(Morgan，Arch.国际医学(Intern.Med.).134(1974)，549-552)。临床使用切除N末端的MEPE片段可有效抵抗血磷酸盐过少。相比之下，引起血磷酸盐过多的肾移植可用完整的重组MEPE或以独特N末端残基构建的活性衍生肽来治疗。可用MEPE、MEPE衍生肽、受体拮抗剂-活化剂(能够经修饰而提高作用强度和特异性的肽)治疗的其他疾病包括肾性骨营养不良、肾中毒、佩吉特(Pagets)骨病、常染色体性佝偻病、某些形式的肾Fanconi综合征。而且，如果在一定范围的组织(例如小肠，等)和肾内表达受体，就有可能治疗晚期肾病患者(即，肾功能完全丧失)。
同样，phosphatonin多肽的抗体也可用于治疗疾病。例如，给予phosphatonin多肽的抗体可以结合多肽和减少其过量产生。同样，给予抗体也可以激活多肽，例如通过与多肽结合和将其剪切成另一种活性形式。
至少，phosphatonin多肽可作为分子量标记，用于本领域熟知的SDS-PAGE凝胶，或用于分子筛凝胶过滤柱。phosphatonin多肽还可用于产生抗体，然后用抗体测定重组细胞内的蛋白表达，以此作为评价宿主细胞转化的一种方法。
而且，phosphatonin聚核苷酸和多肽可在用于试验测定一种或多种生物学活性。如果phosphatonin聚核苷酸和多肽表现出特定活性，可能phosphatonin参与了与这种活性相关的疾病。phosphatonin因此可用于治疗该相关疾病。
phosphatonin基因的调控序列
本发明还涉及一段启动子调控序列，它自然调节编码本发明phosphatonin多肽的聚核苷酸或与之同源的聚核苷酸的表达。用本领域常规技术能够分离出天然调节上述DNA序列表达的启动子调控序列。例如，熟练技术人员可用上述核酸分子作为探针筛选人基因组DNA克隆在噬菌体或细菌载体中构建而成的基因组文库。这样的文库是，例如，由人血细胞制备的基因组DNA，剪切成5-50kb的片段，克隆在λGEM11(Promega)中构建而成。纯化与探针杂交的噬菌体。从中抽提DNA并测序。例如，实施例11用标记的cDNA探针筛选了人基因组P1文库(Genomic System，Inc.)。分离出与编码上述phosphatonin蛋白的基因对应的基因组序列后，就能够通过本领域熟知的转录融合或翻译融合将异源DNA序列与启动子或其调控序列融合。为了鉴定这些phosphatonin基因的调控序列和特定元件，可将5′上游基因组片段克隆在luc、gfp或GUS编码区等标记基因之前，所得的嵌合基因可转染细胞或动物进行临时或稳定表达。转基因动物或转染哺乳动物细胞内含有本发明调控序列调控之下的标记基因，将观察到的其表达方式与实施例10所述phosphatonin基因的表达方式相比较，从而揭示启动子及其调控序列的边界。通常，所述调控序列是重组DNA分子(如前述载体)的一部分。本发明还涉及用调控序列或含本发明调控序列的DNA分子或载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞；参见前文。
诊断磷酸盐代谢性疾病
本发明还涉及药物基因组法选择用于磷酸盐代谢紊乱患者的药物或前药，以及可能用于药物治疗的候选物质。因此，本发明的发现为开发新药用于药理干预提供了选择，旨在恢复发生了遗传改变的phosphatonin蛋白的功能。而且，本发明还设想了一种基因疗法。
因此，本发明提供一种诊断疾病的方法，它包括：
(a)测试个体细胞或体液内phosphatonin基因的表达水平；和
(b)将上述phosphatonin基因表达水平与标准phosphatonin基因表达水平比较，所测phosphatonin基因表达水平相比标准表达水平的提高或降低指示例如在肾或骨***，或其他组织内磷酸盐代谢紊乱。
更具体地说，本发明涉及一种诊断对象与磷酸盐代谢紊乱相关的病理状况或其易患性的方法，包括：
(a)测定编码phosphatonin的聚核苷酸内是否发生了突变；和
(b)根据有否所述突变诊断病情或易患性。
本发明还涉及一种诊断对象与磷酸盐代谢紊乱相关的病理状况或其易患性的方法，包括：
(a)测定生物样品内phosphatonin多肽或其突变体是否表达或表达量；和
(b)根据所述多肽是否表达或其表达量诊断病情或易患性。
显然，前述核酸探针和抗体适合用于上述方法。
以上诊断方法还可用来确定所述疾病的状态。与本发明相关的“病理状况”包括：基因、mRNA、蛋白或转录调控元件(例如启动子/增强子)序列带有突变、缺失或与野生型正常基因产物相比回影响基因整体活性的任意其他改变。该术语包括蛋白的翻译后修饰。
本发明一优选实施例中，所述对象中的所述状态反映了某种形式的磷酸盐代谢紊乱。而且，较好的是，在本发明方法中，所述对象的所述状态是在胎儿或新生儿状态下，用例如羊水诊断术测定的。
对于胎儿、新生儿或成人阶段(潜在)磷酸盐代谢紊乱状态的特定分析将进一步揭示，例如，与各阶段相关的特定疾病状态。例如，希望用本发明的方法能够揭示X联锁的血磷酸盐过少性佝偻病(XHL)或瘤原性血磷酸盐过少性骨软化(OHO)的病因。根据这一认识，将可以开发和测试新的药学活性药物。根据研究目的，本发明方法还可用于多种动物。因此，优选实施例之一中，所述动物是小鼠。该实施例对于基础研究特别有用，可更清除地理解调节磷酸盐代谢的不同蛋白之间功能上的相互关系。另一实施例中，所述动物是人。该实施例设想了诊断和治疗性应用。
上述方法的优选实施方式中还包括一步药物治疗新生儿以消除或缓解磷酸盐代谢中的紊乱。磷酸盐代谢紊乱或对其疾病易患性的早期诊断特别有利，而且在医疗上相当重要。该优选实施例可用来诊断coronar villi期，即胚胎植床前的状态。而且，用本发明方法可通过羊水诊断来诊断疾病状态。运用本发明各种方法早期诊断磷酸盐吸收和/或重吸收中的紊乱可以直接在出生后、临床症状出现前给予治疗。
对X联锁的佝偻病患者和瘤源性骨软化患者(肿瘤摘除前，或者，如果不可能摘除肿瘤)的治疗是高剂量钙三醇或1，25-二羟基维生素D3(即市售的Roche的Rocaltrol；详细信息查询网址：http://www.rochecanada.com/rocaltrol.pml.e.html)，并口服磷酸盐补充剂(磷酸二氢钠和/或磷酸)。有时也用维生素D类似物(例如二氢速甾醇)，而且据报道，加用噻嗪利尿剂，如氢***和阿米洛利可进一步减少磷和钙的尿流失(Alon，儿科学(Paediarics)75(1985)，754-763)。有关当前治疗方法的全面论述参见(Carpenter，北美儿科临床(Pediatric Clinics of North America)44(1997)，443-466)。在幼儿中，需要通过折断畸形四肢骨来进行骨重接(骨切开术)，而且，上述药物疗法会造成严重的呕吐和腹泻。当前的治疗方法无法很好的治疗与家族性相关的发育缺陷。
用phosphatonin和/或phosphatonin肽衍生物替代上述药物治疗能够矫正临床症状和发育缺陷，但没有不良副作用，而且不需要骨切开术。
前述方法的另一优选实施方式中，还包括将功能性和表达性phosphatonin基因引入磷酸盐代谢紊乱患者或易患者的细胞。在这部分和本说明书全文中，“功能性”phosphatonin基因指所编码蛋白具有前述生物学活性的phosphatonin多肽部分或完全一级结构构像的基因。如果检测到突变phosphatonin的表达，就可以判断所述表达与磷酸盐代谢紊乱的发生或持续相关。因此，就可以采用其他或附加步骤来降低表达的水平，从而降低突变phosphatonin的水平，或将其消除。这可以通过(例如)用生物学手段至少部分消除突变基因的表达，例如使用核糖酶、反义核酸分子或抗该蛋白突变体的胞内抗体。而且，可以开发出降低相关突变基因表达的药物产品。
结合活性
本发明还涉及鉴定phosphatonin多肽结合伙伴的方法，这包括：
(a)令本发明phosphatonin多肽与待筛选化合物接触；和
(b)测定化合物是否影响多肽的活性。
phosphatonin多肽可用来筛选与phosphatonin结合的蛋白，或筛选phosphatonin与之结合的蛋白。phosphatonin与分子的结合可能激活(活化剂)、提高、抑制(拮抗剂)或降低被结合phosphatonin或分子的活性。此类分子的例子有抗体、寡核苷酸、蛋白质(例如受体)或小分子。
较好的是，所述分子与phosphatonin的天然配体密切相关，例如，是配体的片段或天然底物、配体、结构或功能类似物；参见，例如，Coligan，当前免疫学方法(Current Protocols in Immunology)1(2)(1991)；第5章。同样，所述分子可与phosphatonin所结合的天然受体密切相关，或者，至少是可被phosphatonin结合的受体的片段(例如活性位点)。以上两种情况中，所述分子可用已知技术特别设计；参见，上述文献。
较好的是，此类分子的筛选包括产生合适的以分泌蛋白形式或在细胞膜上表达phosphatonin的细胞。优选细胞包括哺乳动物细胞、酵母、果蝇或大肠杆菌。然后，让表达phosphatonin的细胞(或含有被表达多肽的细胞膜)与可能含所述分子的测试化合物接触，观察结合，以及phosphatonin或分子活性的激发或抑制。
以上试验可在通过标记检测结合的试验，或涉及与标记竞争者竞争的试验中只检测候选化合物与phosphatonin的结合。该试验也可以测试候选化合物是否因与phosphatonin结合而产生某种信号。
或者，可用无细胞***、固定在固相支持体上的多肽/分子、化合物文库或天然产物混合物进行试验。试验的步骤可以只是将候选化合物与含phosphatonin溶液混合，测定phosphatonin/分子的活性或结合，并就测得活性或结合与标准比较。
较好的是，ELISA可用单克隆或多克隆抗体测定样品(例如生物样品)中的phosphatonin水平或活性。抗体可以通过与phosphatonin直接或间接结合，或通过与phosphatonin竞争底物来测定phosphatonin水平或活性。
以上各种试验都可用作着或预后标记。用这些方法发现的分子可通过激活或抑制phosphatonin/分子用于治疗疾病或在患者中产生某种特定的效果(例如，提高血液中的磷酸盐水平)。而且，这些试验可发现能抑制或增强经适当处理的细胞或组织中phosphatonin的产生。
所以，本发明包括鉴定与phosphatonin结合的化合物的方法，包括：
(a)候选结合性化合物与phosphatonin共孵育；和
(b)测定是否发生结合。
本发明还包括鉴定活化剂/拮抗剂的方法，包括：
(a)候选化合物与phosphatonin共孵育；
(b)如前所述测定生物学活性；和
(c)确定phosphatonin的生物学活性是否被改变。
如前所述，本发明的聚核苷酸和多肽为开发可能是phosphatonin或其基因的抑制剂或活化剂的模拟化合物提供了基础。可以理解，本发明还提供了基于细胞的大量筛选(HTS)所述抑制剂和活化剂候选化合物的筛选方法。
本发明还涉及鉴定并获得治疗磷酸盐代谢紊乱的候选药物的方法，包括：
(a)在磷酸盐代谢许可性条件下，在能够应磷酸盐吸收而产生可测信号的物质存在下，将本发明多肽或表达所述多肽的细胞与所述候选药物接触；和
(b)检测来自磷酸盐代谢信号的有无或是否增加，信号的存在或增加指示是推定药物。
例如，可用肾细胞系CL8、原代人肾细胞或原代人成骨细胞，用Rowe，1996；(同上)所述方法测定放射性Na+依赖性磷酸盐吸收和/或维生素D代谢。
而且，可用抽提自(a)中所述细胞的聚A+RNA或总RNA，与磷酸盐转运者基因(NPTII，等)、肾24-羟化酶、α羟化酶、PTH或骨桥蛋白序列互补的寡核苷酸引物，用聚合酶链反应来测定这些基因的表达。
此外，还可以用von kossa染色来测定原代人成骨细胞的矿化。该方法包括，
例如：
●使用Clonetics推荐的培养基补充剂和条件，培养原代人成骨细胞(得自Clonetics-Biowhitaker)至铺满；
●给用于矿化实验的细胞补充磷酸盐供体β-磷酸盐甘油酯；给对照补充氢可的松-11-半琥珀酸酯；
●给实验细胞补充β-磷酸盐甘油酯和MEPE 25ng/ml；
●不断更换培养基并培养3周后，根据Clonetics所述用von kossa染料(AgNO3；银盐沉淀)染色成骨细胞，测定骨的矿化。
●而且，还包括以下测定试验：
●大鼠灌注实验，测定phosphatonin对肾磷酸盐吸收的影响；
●测定一系列相关基因在人肾细胞系CL8中的表达，以及补充MEPE的影响，
例如：
●Na+磷酸盐转运者，
●24和1-α羟化酶，
●骨桥蛋白和骨钙蛋白；
●与MEPE和PEHX共转染COS细胞；
●用含有前述基序至少其一的肽片段进行生物试验研究。因此，另一种检测方法包括用现有方法测定蛋白激酶C、酪蛋白激酶II，酪氨酸激酶或其他受phosphatonin及衍生肽影响的信号传导路径。而且，后文实施例所述的方法稍加改动既可用于上述筛选方法。
候选药物可以是一种化合物或多种化合物。“多种化合物”在本发明方法中应理解成可能相同可能不同的许多物质。
所述化合物或多种化合物可化学合成或微生物法产生和/或含于，例如，样品中，例如植物、动物或微生物的细胞抽提物。而且，所述化合物可以是本领域已知但不知其能够抑制或激活磷酸盐代谢中的phosphatonin多肽或其他组分的化合物。反应混合物可以是无细胞抽提物，或含有细胞或组织的培养物。适合本发明方法的***对本领域熟练技术人员来说是显而易见的，例如，参见，Albert等，细胞的分子生物学(Molecular Biology of Cell)，第三版(1994)，以及后文实施例。例如，多种化合物可加入反应混合物、培养基，注入细胞，或以其他方式给予转基因动物。可用于本发明方法的细胞或组织宜为，后文实施例所述的宿主细胞、哺乳动物细胞或非人转基因动物。
如果在本发明方法中鉴定到一种含化合物或多种化合物的样品，可以从鉴定为含能够抑制或激活phosphatonin的化合物的原样品中分离出该化合物，或者，如果样品含多种化合物，可以进一步区分原样品以减少每份样品中不同物质的数量，然后对原样品的小份重复鉴定方法。根据样品的复杂性，前述步骤可进行多次，直到用本发明方法鉴定，样品只含一定数量或仅一种物质。较好的是，所述样品含化学和/或物理性质相似的物质，最好是同一种物质。
可用本发明方法测试和鉴定的化合物可以是表达文库，例如cDNA表达文库，肽，蛋白质，核酸，抗体，小有机化合物，激素，拟肽，PNA等(Milner，自然医学(Nature Medicine)1(1995)，879-880；Hupp，细胞(Cell)83(1995)，237-245；Gibbs，细胞(Cell)79(1994)，193-198；和前述文献)。而且，可鉴定编码推定是phosphatonin蛋白调节者或对本发明phosphatonin蛋白具有正或下调作用的基因，例如用***诱变，用本领域已知的基因定向载体(例如，定向于细胞核、线粒体或细胞质内表达的pShooter质粒系列：pEF/myc/nuc、pCMV/myc/nuc、pEF/myc/mito、pCMV/myc/mito、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，和定向于哺乳动物细胞表面表达重组蛋白的pDISPLAY表达载体。以上载体都可以从Invitrogen(http://www.invitrogen.com/))获得。
确定某化合物是否能够抑制或激活phosphatonin蛋白，可通过(例如)测定Na+依赖性磷酸盐吸收或骨矿化来进行；参见前文。这也可以通过监测本发明中与化合物接触的细胞的表型特征，并将其与野生型细胞比较。在另一实施例中，所述特征可与接触了已知能够或不能抑制或激活phosphatonin多肽的化合物的细胞比较。
鉴定并得到所述化合物后，最好将其制成治疗学上认可的形式。因此，本发明还涉及生产治疗剂的方法，这包括：
(i)合成足量本发明方法中步骤(b)获得或鉴定到的化合物或其类似物或衍生物，以向患者提供治疗有效量的所述制剂；和/或
(ii)将本发明方法中步骤(b)获得或鉴定到的化合物或其类似物或衍生物与药学上认可的载体混合。
制备化学衍生物和类似物的方法是本领域众所周知的，参见，例如，Beilstein，有机化学手册(Handbook of Organic Chemistry)，Springer edition New York Inc.，175 Fifth Avenue，New York，N.Y.10010 U.S.A.和有机化学合成(OrganicSynthesis)，Wiley，New York U.S.A.。而且，可以用已知方法合成和测试所述衍生物和类似物的效果。参见前文和后文。
总之，本发明提供了鉴定因能直接/间接活化phosphatonin而能够调节磷酸盐代谢的化合物的方法。因此，本发明方法所鉴定的可能是phosphatonin活性抑制剂和活性剂的化合物也属于本发明范围内。
以上所述显示，本发明主要涉及含至少一种前述聚核苷酸、核酸分子、载体、蛋白质、调控序列、重组DNA分子、抗体或化合物的组合物。较好的是，所述组合物含以下成分，例如：缓冲液，防冻剂等，这些成分并不天然地与本发明化合物相关，但同样适合特定的用途。
较好的是，所述组合物被用作药物、诊断工具或试剂盒。实施例6和实施例7对药物组合物有更详细的描述。例如，前述生物活性片段可用作药物治疗磷酸盐代谢紊乱，例如X联锁的佝偻病和骨软化以及其他骨矿质代谢疾病。本发明还提供phosphatonin和PHEX金属肽酶联合制剂，作为药物同时、各自或先后使用。用这种方式，PHEX金属肽酶可用于剪切phosphatonin产生活性phosphatonin片段用于治疗前述磷酸盐代谢疾病。虽然上述疾病在人类中尤其重要，其他哺乳动物也可用本发明方法进行治疗。
本发明首次提供了没有污染的，基本分离或基本纯形式的phosphatonin。没有污染(如SDS和或其他干扰蛋白)的天然phosphatonin和天然phosphatonin片段能够调节磷酸盐代谢，并能提供药物组合物中的活性成分，用于治疗与磷酸盐代谢紊乱相关的疾病。
因此，本发明涉及用本发明phosphatonin多肽或编码并能表达所述多肽的DNA、其抗体、活化剂/激动剂、抑制剂/拮抗剂或结合伙伴用于制备治疗磷酸盐代谢紊乱的药物的用途。
具体地说，本发明涉及具有phosphatonin活性的phosphatonin多肽或编码并能表达所述多肽的DNA、其抗体、活化剂、抑制剂/拮抗剂或产生phosphatonin活性的结合伙伴，用于制备治疗血磷酸盐过多症中的用途，最好是在肾透析/预透析中治疗肾病性骨营养不良、血磷酸盐过多症，治疗甲状旁腺机能亢进或囊状纤维性骨炎。
另一实施例中，本发明涉及本发明具有反phosphatonin活性的phosphatonin多肽或编码并能表达所述多肽的DNA、本发明的抗体、本发明的核酸分子或抑制剂/拮抗剂用于制备治疗血磷酸盐过少症的药物的用途，最好是制备治疗X联锁的血磷酸盐过少性佝偻病、伴有尿钙过多的遗传性血磷酸盐过少性佝偻病(HHRH)、矿质过少性骨损伤、青少年矮小、瘤原性血磷酸盐过少性骨软化、肾病性磷酸盐漏失、肾病性骨营养不良、骨质疏松、耐维生素D性佝偻病、终末器官抗性、肾病性Fanconi综合症、常染色体性佝偻病、Paget′s病、肾衰竭、肾小管酸中毒、囊性纤维化或口炎性腹泻的药物。
本发明一优选实施例中，具有反phosphatonin活性的phosphatonin多肽或编码并能够表达它的DNA、本发明的抗体、本发明的核酸分子或本发明的抑制剂/拮抗剂被用于制造治疗骨矿质流失性疾病的药物。
在一优选实施例中，本发明涉及phosphatonin多肽和PHEX金属肽酶用于制造一种联合制剂的用途，联合制剂同时、各自或先后使用，以治疗磷酸盐代谢紊乱。
实施例6更详细地描述了上述用途和方法。
另一实施例中，本发明涉及能够过表达phosphatonin的转化成骨细胞或骨细胞系用于生产和分离phosphatonin的用途。
以下实施例向本领域熟练技术人员充分公开了如何实施本发明的各项内容，但不是对本发明范围的限定，也不代表或暗示以下是发明人所进行过的所有或仅有实验。虽然努力确保数据(例如量、温度等)的准确性，但仍需考虑存在着试验误差和偏差。若非另作说明，份数都是重量份数，分子量都是重均分子量，温度都是摄氏度。
实施例1：从肿瘤中纯化phosphatonin
从患者体内取出具有磷酸盐沉着表达的间充质肿瘤，提取以下样品：
A：纯肿瘤组织样品，两粒大豌豆大小，放在含DMEM Eagles/10％FCS/谷氨酰胺/抗菌素抗真菌剂Gibco-BRL的2ml试剂瓶内。
B：硬膜下肿瘤样品，同样大小或可能较小。放在与A相同的介质中。
C：异常硬膜样品：硬的白色物质：放在与A相同的介质中。
D：肿瘤粘液样品。
样品的加工：
第1天：
用消毒手术刀将各样品切成0.5cm的小块。各取一半样品放入冷冻试管，N2(1)下急冻。收集组织周围的液体(DMEM/10％FCS，等)，也冷冻。将各样品的另一半加入DMEM Eagles/10％FCS/谷氨酰胺/抗真菌剂另加胶元酶A10.2mg/ml(～15ml)，37℃过夜。
第2天：
1.在补充血清的DMEM中培养过夜后，大多数细胞成为RBC，只看到很少的粘附细胞。室温下离心沉淀细胞，收集上清液并立即冷冻(～15ml)。
2.将沉淀重悬于10ml补充抗生素/抗真菌剂的DMEM Eagles(中瓶)中，再培养8小时10分钟。
3.如步骤1所述收集无血清上清液(～10ml)，将细胞重悬于含10％FCS等的DMEM EAG中(～15ml)，继续培养。上清液保存于-80℃。
第6天：
1.经第2天的培养后，如第2天步骤1所述离心沉淀细胞。收集10％FCS样品并冷冻。
2.如第2天所述将细胞沉淀重悬于无血清DMEM中，静置4小时。
3.与第2天步骤3相同。
第7天：
1.硬膜下肿瘤培养物已经发展成无数含细胞集落的点，粘附在塑料组织培养板上。在这些息肉状***下面是一层成纤维细胞样细胞，从肿瘤样结构的下面迅速散开。这一层似乎是锚着息肉状肿瘤的基质。这些在硬膜样品中没有看到，该样品该阶段似乎没有细胞，但含有纤维样编织状结构。
2.离心沉淀培养物，收集上清液(10％FCS)。然后将沉淀置于一侧。
3.培养板然后在10ml胰蛋白酶EDTA溶液Gibco/BRL PBS 1/10稀释液中培养～15分钟。然后剧烈拍打培养板，并加入5ml FCS。
4.然后将重悬细胞加入步骤2获得的沉淀中，重悬并离心沉淀。弃去上清液。
5.然后将细胞接种在18ml 10％FCS Eagles平板培养基中培养，其中补充有谷氨酰胺抗生素抗真菌素(用大培养瓶)。
6.最后将细胞培养在37℃的CO2中。
第9天：
1.肿瘤细胞和部分硬膜下细胞成为无数细胞集落，形状与胰蛋白酶处理前的细胞相同。部分细胞集落很大，肉眼就可看到。
2.收集血清补充培养基，保存。用大瓶，每瓶加18ml培养基(DMEM 10％FCS抗真菌素/抗生素/谷氨酰胺)。
第13天：
1.冷冻细胞(～15ml)，保存在falcons即10％FCS DMEM条件培养基中。
2.在11∶10am将细胞重悬于无血清DMEM Eags(～11ml)，37℃(CO2培养箱)培养6小时。
3.然后离心沉淀细胞，收集上清液(无血清对照培养基)。在留下的细胞中加10％FCS DMEM EAG。
第16天：
重复以上过程，收集数周的肿瘤条件培养基(TCM)。或者，收集Saos-2细胞(ECACC 89050205)或U-2 OS细胞(ATCC HTB-96)的TCM。
phosphatonin的纯化
伴刀豆蛋白A琼脂糖亲和性层析：
1.在3ml TCM中加入1M磷酸钠pH7.2和5M NaCl，得到最终浓度0.06M磷酸钠pH7.2，0.5M NaCl加0.01％叠氮钠。
2.Con A琼脂糖(Pharmacia目录号：17-0440-01)，来时处于20％乙醇中，先用数倍柱体积的水洗柱，然后以层析缓冲液平衡。用Con A充填小的C10/10柱(Pharmacia目录号：10mm的C10/10)，至5.5cm高度(约4.3-5.0ml体积)。以最大流速0.5ml/min进行平衡。
3.然后利用重力将样品(调节至pH7.2磷酸钠/0.5M NaCl/0.01％叠氮钠)上柱，重复3次。因为样品有色所以能看到其在柱中通过。然后收集非结合物质，保存备作参比。
4.然后连接Waters LC***，用数倍柱体积的上样缓冲液洗涤样品。
5.上样和洗涤后，用磷酸钠缓冲液60mM pH7.2/0.5M NaCl/0.5Mα-甲基-D-吡喃葡萄糖/0.01％叠氮化物缓冲液洗脱。参见图1a。测得一单峰，收集该峰。
6.然后洗柱至基线即约40ml最大体积，然后放置过夜。
7.甲基葡糖苷缓冲液中孵育过夜后，洗出第二个峰(见图1b)，位于～5ml处。
8.收集第二峰，用0.05M乙酸透析，然后冷冻干燥。伴刀豆蛋白峰A1(低亲和性)和伴刀豆蛋白峰A2(高亲和性)都能在人肾细胞(CL8)系中强效抑制Na+依赖性磷酸盐协同转运和维生素D代谢。有关高亲和性组分，人肾细胞系(CL8)和试验条件，参见Rowe等，1996。另一种已知的适合进行试验的细胞系是OK细胞系，保藏号为ECACC910210202。
用HiTrap SP阳离子交换1ml柱(目录号：17-1151-01：Pharmacia)阳离子交换 层析：
1.将冷冻干燥的蛋白溶于0.05M乙酸铵pH5中，上样到已平衡的1ml HiTrapSP琼脂糖阳离子交换柱上。
2.柱在上样前通过水洗进行平衡，然后加5体积起始缓冲液(0.02M乙酸铵，pH5)。
3.如下洗脱样品：
 编号  时间(min)  流速(ml/min)  ％乙酸铵，pH5  ％乙酸铵/0.5M NaCl pH5
 1  0.5  100  0
 2  15  0.5  25  75
 3  20  0.5  0  100
 4  25  0.5  0  100
 5  35  0.5  100  0
 6  50  0.5  100  0
得到一个单峰，然后用0.05M乙酸透析样品，并冻干；参见图2。
重悬于20μl 10mM磷酸盐缓冲液pH7.2后，分成等份重悬在SDS-PAGE样品缓冲液中(最终浓度＝125mM TRIS-HCL pH6；2.5％甘油；0.5％w/v SDS；5％β-巯基乙醇；0.01％溴酚蓝)，煮沸(5min)，冷却，然后进行SDS PAGE凝胶(12.5％)电泳(参见色层谱)，分离出55kD的双带(参见Rowe等，1996)。伴刀豆蛋白A和阳离子带也都是凝聚体形式的。所有组分，包括肿瘤条件培养基，都在人肾细胞系(1/1000diln.)中强烈抑制Na+依赖性磷酸盐协同转运，并改变维生素D代谢。有关测定磷酸盐转运和维生素D代谢方法的详细描述参见Rowe等，1996。所有纯化程式都在计算机千年软件编程的waters HPLC/FPLC***上进行。活性最强的是OHO肿瘤的伴刀豆蛋白A1组分。用抗术前抗血清来筛选固定化的纯化组分。该组分还在人肾细胞系(CL8)中强烈抑制NaPi，并影响维生素D代谢。
实施例2：用术前/术后抗血清筛选肿瘤条件培养基(TCM)和纯化组分：加糖蛋 白筛选
有关患者的术前/术后抗血清参见Rowe等，1996。只有术前抗血清检测到纯化组分和TCM中的激素，用加强化学发光剂成功进行了TCM和纯化组分的Western和糖蛋白检测。将蛋白标记生物素化，并加上链霉亲和素过氧化物酶偶联物标签。箭头表示凝聚体和活性糖蛋白。术后血清和家兔免疫前血清没有检测到任何组分。而且，只有分泌磷酸盐沉着因子的肿瘤呈阳性。培养基和皮肤对照呈阴性。Con A1、Con A2和CA1样品的特征是在人肾细胞系(CL8)中强烈抑制NaPi和改变维生素D代谢的能力。所有纯化组分都有凝聚成一种SDS-PAGE上低移率形式的倾向。而且，纯化组分和TCM活性组分高度糖基化。糖基化程度的测定为：在PVDF膜上高碘酸盐氧化固定化的蛋白质，然后进行糖基部分的生物素化。然后用连有辣根过氧化酶的链霉亲和加强化学发光剂筛选。活性形式(抑制NaPi)与58-60kDa组分相关。纯化蛋白的另一种有效方法是用中性pH7的SDS-PAGE***，用4-12％Bis-Tris凝胶，用MOPS电泳缓冲液。预制凝胶可向Novex购买。
实施例3：用4-12％聚丙烯酰胺梯度Bis-Tris凝胶，用MOPS电泳缓冲液的中 性SDS-PAGE(Novex的Nu-PAGE***)：激素迁移率降低
在该***上，一种糖基化激素组分迁移率降低，走到～200kDa处。还可以在58-60kDa处看到更低分子量形式。出现～200kDa的蛋白可能是因为蛋白的等电点(中性pH下电荷不同)和糖基部分与凝胶基质的相互作用。而且，在梯度凝胶的顶端，由于丙烯酰胺浓度低(4-12％梯度)，高分子量组分的电-印迹效率提高。组分在该***中运行提高了分子的纯度和均一性。用该***进行Western印迹，包括以下样品(用术前抗血清，加强化学发光剂筛选印迹)：1：蛋白质标记；2：颅内肿瘤细胞系OHO：3：毗邻肿瘤的硬膜下细胞；4：靠近硬膜下的硬膜细胞；5：HTB6细胞系；6：Saos-2细胞系；7：培养基对照；8：皮肤成纤维细胞对照；9：线性皮脂痔息肉瘤。结果显示，痔息肉瘤在SDS-PAGE中性凝胶上～200kDa处展现一条特异性磷酸盐沉着条带。
实施例4：phosphatonin的克隆与测序
1.文库的构建
切取患者的肿瘤(BD，Rowe等，1996)，用标准方法抽提mRNA。用逆转录酶复制mRNA成cDNA，然后克隆到噬菌体载体λ-ZAP II uni(购自Stratagene Ltd.，Unit 140，Cambridge Science Park，Milton Road，Cambridge，CB4 4GF UK)。克隆是单向的，基因5′端连T3启动子，并紧靠一个EcoRI位点。cDNA的3′端紧靠一个细菌T7启动子上游的Xho-1位点。简而言之，将切取自BD患者的肿瘤切成1mm的块，用链霉亲和素-磁性珠顺磁性颗粒技术(PolyATract***Promega)直接抽提聚A+RNA。mRNA纯化后，用Stratagene的cDNA合成试剂盒生成cDNA模板。在cDNA中加入接头引物产生5′EcoRI相容性cDNA末端和Xho相容性3′末端，这有助于强制定向克隆到λ-ZAP II uni噬菌体载体内。接种在大肠杆菌XLl-Bluemrf上并扩增重组噬菌体。原代克隆总数800000，其中6％为野生型。
2.用术前抗血清筛选
将cDNA噬菌体文库接种在NZY琼脂板上培养，用IPTG诱导β-半乳糖苷酶操纵子。然后将表达的融合蛋白转移到hybond-C膜(Amersham)上，用患者的术前抗血清筛选膜。所用抗血清参见(Rowe等，1996)。用前，抗血清用大肠杆菌裂解物和全血充分预吸附，降低噪音信号水平。抗患者BD术前血清的家兔抗血清(Rowe，Bone(18)1996)用正常人血清和大肠杆菌裂解物成分预吸附，以去除大肠杆菌抗体和背景人血清中的抗体。简而言之，在大肠杆菌全裂解物(Stratagene)中加5张直径80mm的硝酸纤维素滤膜，将第二组5张滤膜浸在正常人血清(10ml)中。各张滤膜依次用以下溶液室温下孵育10min：250ml以1％BSA按1∶1000稀释的抗家兔术前抗血清；20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl(TBS)；0.02％NaN3。然后，用预吸附的术前抗血清(pre-Anti-op)筛选cDNA文库。噬菌体λ-ZAPII uni OHO cDNA克隆平板培养在大肠杆菌XL1-Blue mrf上，37℃培养3小时。然后在产生的噬斑上盖以用10mM IPTG预孵育的hybond-N+滤膜，42℃培养3小时。然后，取下滤膜，用补充了Tween 20(TBST)的TBS洗涤，用含1％BSA和0.02％NaN3的TBS4℃封闭过夜。然后将pre-Anti-op加到封闭后的滤膜上，室温下放置1小时。按照Stratagenes picoublueTM免疫筛选试剂盒所述，洗涤滤膜，与山羊抗家兔碱性磷酸酶偶联物孵育，然后用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯/氮蓝四唑显示。筛选了约600,000个克隆后，挑选出了9个阳性克隆，进行二级和三级筛选。噬菌体克隆用ExAssist辅助噬菌体拯救成为噬菌粒，克隆到E coli SOLR细胞中。ExAssist辅助噬菌体和SOLR细胞购自Stratagenes Ltd.，Suite 140，CambridgeScience Park，Milton Road，Cambridge，CB4 4GF，UK。
3.测序克隆：
制备噬菌粒，并测定DNA序列。9个克隆都测序。三级筛选后，用无菌中空刺针挑取阳性噬菌体空斑。将含有溶菌斑的琼脂块加到0.5ml补充了0.02％氯仿的SM缓冲液中，4℃过夜。如Stratagenes所述，用ExAssist噬菌体进行噬菌体克隆的拯救和向BSCPT SKII-噬菌粒的转化。用于纯化噬菌粒的宿主细胞是Ecoli SOLR细胞。用标准方法制备噬菌粒DNA(Rowe，Nulciec Acids Res.22(1994)，5134-5136)，用ABI荧光剂自动测序法和标准载体特异性引物测序。其中6个克隆重叠，与细菌的β-半乳糖苷酶启动子同框，得到具有相同重叠DNA序列的相邻/重叠表位和表达蛋白。最长的测序克隆含其他5个克隆cDNA序列之和，见图8。这是phosphatonin的全序列(氨基酸/cDNA)。共克隆了430个氨基酸残基(SEQID NO：2)，1655bp的DNA序列(SEQ ID NO：1)。二级结构预测显示是一种高度亲水性蛋白，COOH末端糖基化，氨基末端具有一段细胞结合三肽(RGD)，见图8。该蛋白还具有高度抗原性，具有许多主螺旋结构域(图10)。用BLAST对现有数据库的全面筛选没有发现与已知基因或蛋白序列的统计学相关同源性。
4.重组人phosphatonin的纯化
分离的cDNA克隆的形式是Bscpt SKII-载体(Stratagene载体)中的获救噬菌粒，且含于SOLR大肠杆菌宿主细胞内。用IPTG诱导β-半乳糖苷酶启动子，获得了融合蛋白的低水平表达。phosphatonin克隆融合产物在Western印迹中与术前抗血清反应。将其亚克隆到pCAL-n-EK载体(Stratagene载体)中可提高该融合蛋白的表达和活性(见后文)。含人phosphatonin的构建物含于大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS)细胞(购自Stratagene)内。IPTG对融合蛋白的诱导高得多，通过对细胞裂解液的钙调蛋白亲和性层析可获得基本纯的蛋白质。在Ca2+存在下，带有融合标签的重组phosphatonin与钙调蛋白树脂结合。然后用EGTA洗涤释放phosphatonin融合蛋白。用肠激酶去除小的细菌融合标签，留下纯的人phosphatonin。
4a.phosphatonin在pCAL-n-EK载体内的亚克隆
将完整的phosphatonin(MEPE)推导cDNA序列(根据最大cDNA克隆pOHO11.1推导)亚克隆到原核表达质粒pCAL-n-EK(Stratagene载体)中，将该构建物分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和大肠杆菌XL1-Blue mrf(菌株来自Stratagene)中。按照Stratagene AffinityTM克隆和蛋白质纯化试剂盒(目录号：#214405和#214407)，进行不依赖于连接的克隆(LIC)。根据phosphatonin序列的5′和3′末端设计引物，带有附加的突出接头序列(粗体表示接头)：
正向5′：GACGACGACAAG.GTGAATAAAGAATATAGTATCAGTAA3′
接头                             (SEQ IN NO：8)
反向5′：GGAACAAGACCCGT.CTAGTCACCATCGCTCTCACT3′
接头                              (SEQ IN NO：8)
PCR扩增产物包括编码第一个缬氨酸起至phosphatonin终止密码子(图8)，外加接头序列的DNA序列。用Pfu聚合酶和dATP处理PCR片段，产生接头序列的5′突出端。培养细胞并添加IPTG诱导融合蛋白表达。PCR条件：预变性；95℃3min，20轮变性循环；95℃45sec，59℃退火60sec，72℃2min，然后72℃最后延伸7min；然后4℃冷却。用Perkin Elmer 9600热循环仪编程进行PCR，并用以下PCR缓冲液(PB)：10mM Tris-HCl，pH8，50mM KCl，1μM引物，200μMdNTPs。在PB缓冲液中补充2mM MgCl2。对于不依赖于连接的克隆(LIC)，然后如Stratagene所述，用pfu聚合酶和dATP处理扩增产物，并直接与带有互补接头突出段的线性化pCAL-n-EK质粒载体退火结合。然后将构建物转化到感受态的大肠杆菌XL1-Blue mrf宿主细胞和感受态的大肠杆菌BL21(DE3)中。在氨苄青霉素平板上挑出克隆，制备质粒并测序。图14显示了载体和融合构建物的总结。用大肠杆菌XL1-Blue mrf宿主实现了质粒的高拷贝数。用大肠杆菌BL21(DE3)获得了重组蛋白的高表达。
4b.用钙调蛋白亲和件树脂纯化phosphatonin
可采用Stratagene(目录号：214406)所述的方法。phosphatonin特异性残基的上游序列中含有一段钙调蛋白结合序列。在钙存在下，将钙调蛋白加入粗细胞裂解液，让蛋白发生结合。然后用含钙缓冲液洗涤该浆状物，在Tris缓冲液(50mMTris-HCl，pH0)中加EGTA 2ml，用其洗脱phosphatonin融合蛋白。然后用位点特异性蛋白酶EK消化，去除钙调蛋白结合蛋白标签，留下纯的重组人phosphatonin。较好的是，该方法可如下进行(有关缓冲液组成参见后文表格)：
1.按照Stratagene有关pCAL-n-EK载体(目录号：214405)的方案培养和诱导细胞，用含质粒p1BL21的BL23(DE3)大肠杆菌宿主细胞；见图14。
2.按照Stratagene的方案但用CCBB-II作为重悬缓冲液(来自500ml的细胞沉淀重悬在10ml CCBB-II中)制备蛋白质裂解液。必需进行30sec的超声波脉冲处理和随后的4min冰冷却。将含有细胞的试管保持在冰上进行超声波处理。
3.超声波处理后，10000g离心沉淀细胞，倒出上清液。大多数重组MEPE留在上清液(蛋白质-裂解液)中。
4.然后用VIVASCIENCE VIVASPIN(目录号：VS1521，称30,000 MWCO PES)浓缩仪浓缩蛋白质-裂解液，分子量截断值为30000。来自500ml细胞的8ml上清液浓缩至3.2ml(2.5倍浓缩)。不宜进一步浓缩。
5.对由190-200ml细胞制备的蛋白质-裂解液(约1.3ml蛋白质-裂解液)，加1ml平衡过的钙调蛋白树脂(按照Stratagene所述，用CCBB-II缓冲液平衡树脂)。
6.悬浮液4℃转动过夜。
7.然后离心沉淀悬浮液(eppendorf离心机上约3000rpm离心2min)，去除上清液，将树脂重悬于1ml CCBB-II缓冲液中。
8.再次离心沉淀树脂，弃去第一次的洗液。如此再重复2次(共用CCBB-II洗涤3次)。
9.然后，用WB-III洗一次；注意，包括最后洗涤缓冲液在内的缓冲液都不能含除垢剂。用于生物试验的细胞对即使微量的除垢剂也非常敏感。WB-III除不含蛋白酶抑制剂之外与CCBB-II都相同。
10.用EB-I缓冲液(1ml)进行2次洗脱非特异性蛋白。
11.用EB-II(1ml)2-3次洗脱MEPE。
12.用flowgen 10K microsep浓缩仪4℃浓缩蛋白。一般，3ml MEPE洗脱液可在2小时内浓缩至约170μl。
13.在SDS-PAGE凝胶上电泳测定样品的纯度和含量后，将其分成多份冷冻于-80℃。需避免反复冻融。
缓冲液：
组分 CCBB-II  WBII  EBI  EBII
Tris-HCl，pH8 50mM  50mM  50mM  50mM
NaCl 300mM  300mM  150mM  1mM
乙酸镁 1mM  0  0  0
咪唑 1mM  0  0  0
CaCl<sub>2</sub> 2mM  2mM  0  0
蛋白酶抑制剂w/o EDTA 是  否  否  否
GGTA 0  0  4mM  4mM
使用时，每10ml加1片蛋白酶抑制剂片(Boehringer Mannheim)，蛋白酶抑制剂w/o EDTA(目录号：1836 170)。最后用1M NaCl，EGTA(4mM)缓冲液洗脱后，phosphatonin纯度超过95％。
实施例5：phosphatonin的结构
1.一级结构和基序：
图8显示了该蛋白质的一级结构和核酸序列。分离到的MEPE的最大cDNA克隆有1655bp，含有完整的基因3′和聚A+尾和一段聚腺苷酸化序列(AA[T/U]AAA)(图8)。发现一个430残基的开放读码框，它与分离到的其他较小的MEPE cDNA克隆重叠，并有延伸，预计Mr是47.3kDa，pl是7.4。最适共有起始密码子(kozak，Nucleic Acids Res.15(1987)，8125-8148)出现在第255bp，虽然此前另有2个甲硫氨酸。附加的5′序列可能丢失而需要确定更早的起始密码子和延伸的5′非翻译序列。GCG-二级结构预测显示，该蛋白有很强的亲水性，有3个弱疏水区(图9)。该蛋白的糖基化基序在残基382和385(NNST)，和残基383-386(NSTR)。在残基161-164还有一个糖胺聚糖结合位置(SGDG)。非糖基化分子量约54kDa，与纯化的糖基化形式很接近(58-60kDa)。有许多磷酸化位点(表1)，这些可能与激素或其片段的生物学活性相关。
表1
 (图8上的)位点  基序
蛋白质激酶C磷酸化  8-10  SNK
 77-79  TPR
 118-120  THR
 203-205  TKK
 228-230  TAK
 311-313  STR
 312-314  TRK
 319-321  SNR
 384-386  STR
 403-405  SNR
 408-410  SSR
 409-411  SRR
酪蛋白激酶II磷酸化  8-11  SNKE
 139-142  SDFE
 177-180  TGPD
 194-197  SEAE
 199-202  THLD
 224-227  TRDE
 228-231  TAKE
 238-241  SLVE
 325-328  TLNE
 423-426  SSSE
 425-428  SESD
 427-430  SDGD
cAMP-&cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化  405-408  RRFS
酪氨酸激酶磷酸化  40-47  KLHDQEEY
肉豆蔻酰化  16-21  GLRMSI
 143-148  GSGYTD
 119-224  GNTIGT
 266-271  GSQNAH
 291-296  GSSDAA
  315-320   GVDHSN
  389-394   GMPQGK
  酰胺化   370-373   HGRK
  RGD   152-154   RGD
  糖胺聚糖结合位点   161-165   SGDG
  Asu-糖基化   382-386   NNST
  383-387   NSTR
该蛋白的一个重要特征是残基152-154处的细胞结合序列(RGD)。通常，Arg-Gly-Asp序列参与受体相互作用，在纤连蛋白中则为细胞表面受体与特定整联蛋白的结合所必需。更值得注意的是，该基序存在于某些形式的胶原蛋白(骨基质蛋白)、血纤蛋白原、玻连蛋白、von Willebrand因子(VWF)、蛇蜕皮素和圆盘粘菌素(discoidin)中。很可能，phosphatonin的这部分与受体和/或骨矿物基质的相互作用有关。而且，这种相互作用介导了：
1.骨的矿化(成骨细胞)。
2.Na依赖性磷酸盐协同转运者基因表达调节。
3.24羟化酶和/或1α羟化酶基因表达调节(肾)。
4.骨和牙质矿化基质相互作用和通过成核作用调节矿物质沉淀。
残基161-164处的糖胺聚糖结合序列(SGDG)对于骨矿物质的结合和相互作用具有重要意义。有关蛋白聚糖在骨中信号传导中的作用文献记载甚多。很可能，该分子的这一部分对前述生物活性(第1-4点)也很重要，尤其对成骨细胞介导的骨的矿化来说。
RGD基序位于一个预测的转角区(Garnier预测Antheprot)，两侧是两个β平面(残基134-141和172-178)。预测平面结构两侧是两个延长α螺旋区(121-132和196-201)。总体结构，预测的转角和RGD细胞结合序列与骨桥蛋白的相似。该蛋白还有一系列蛋白激酶C、酪蛋白激酶II、酪氨酸激酶和cAMP/cGMP-依赖性蛋白激酶的预测的磷酸化基序。还发现MEPE具有大量N-肉豆蔻酰化位点，这些位点似乎是含RGD磷酸糖蛋白(骨桥蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、h-整联蛋白结合蛋白、牙质-唾液酸磷酸蛋白、牙质-基质-蛋白-1、骨-唾液酸蛋白-II和纤连蛋白)的特征之一。和在骨桥蛋白中一样(37％)，天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸的含量异常得高(26％)。特别重要的是，MEPE序列中完全没有半胱氨酸残基，表明半胱氨酸-半胱氨酸二硫桥对该分子的二级结构没有作用。MEPE序列筛选震颤数据库(tremble database)后显示与牙质phosphoryn(DPP)的序列同源性。MEPE的C末端具有一段富含天冬氨酸和丝氨酸残基的序列(残基414-427)，与DPP中的一段重复基序几乎完全相同(同源性80％)(图26A和图26B)。MEPE基序(DDSSESSDSGSSSESD)与DSP基序(SDSSDSSDSSSSSDSS)的理化比较使同源性上升到93％。在MEPE中，MEPE基序只在C末端出现一次(残基414-427)，而类似物DSP则在DSP残基位点686-699，636-646和663-677反复出现。而且，在576-589和800-813的DSP中还发现两段与MEPE基序同源性80％的相关序列DSSDSSDSNSSSDS和DSSDSSDSSNSSDS。骨桥蛋白中也发现一段同源性60％的类似基序(残基101-116)(DDSHQSDESHHSDESD)，而且，该同源区内有一个酪蛋白激酶II磷酸化位点(图12)。X联锁的佝偻病存在骨骼酪蛋白激酶II活性缺陷(Rifas，Ioc.cit)。虽然骨桥蛋白的MEPE基序在中间而不是C末端，据报道，骨桥蛋白的体内剪切产生一种MEPE基序位于C末端的肽(Smith，J.Biol.Chem.271(1996)，28485-28491)。还在DMA-1的残基408-429处发现了与C末端MEPE基序同源的另一序列(SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG)。图12以“llanview″统计图的形式显示DSSP、DMA-1和OPN中MEPE基序的局部序列同源性，表2列出了序列对比中的相似性。
表2
MEPE与DSSP
MEPE的上游序列：
411 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
686 DSSDSSDSSSSSDS  699    (SEQ ID NO：13)
414 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
633 DSSDSSDSSSSSDS  646    (SEQ ID NO：13)
413 DDSSESSDSGSSSES 427    (SEQ ID NO：10)
551 DDSSDSSDSSDSSDS 565    (SEQ ID NO：14)
414 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
576 DSSDSSDSNSSSDS  589    (SEQ ID NO：15)
414 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
663 DSSDSSDSSSSSDS  677    (SEQ ID NO：13)
414 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
752 DSSESSDSSNSSDS  765    (SEQ ID NO：16)
414 DSSESSDSGSSSES  427    (SEQ ID NO：7)
800 DSSDSSDSSNSSDS  813    (SEQ ID NO：17)
MEPE与骨桥蛋白：
MEPE的上游序列：
413 DDSSESSDSGSSSESD 428        (SEQ ID NO：11)
101 DDSHQSDESHHSDESD 116        (SEQ ID NO：18)
骨桥蛋白与DSSP：
骨桥蛋白的上游序列：
106 SDESHHSDESD 116             (SEQ ID NO：19)
638 SDSSSSSDSSD 648             (SEQ ID NO：20)
106 SDESHHSDESD 116             (SEQ ID NO：19)
846 SDSSDSSDSSD 857             (SEQ ID NO：21)
106 SDESHHSDESD 116             (SEQ ID NO：19)
857 SDSSDSSDSSN 878             (SEQ ID NO：22)
MEPE与DMA-1
MEPE的前端序列：
408 SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG 429  (SEQ ID NO：12)
443 SSRSKEDSN-STESKSSSEEDG 463  (SEQ ID NO：23)
值得注意的是基序在DSSP C末端或牙质-phosphoryn部分的重复出现。图1 3显示高严谨和低严谨条件下MEPE与DSSP的点-矩阵序列比较，显示出DSSP中富含天冬氨酸-丝氨酸的MEPE基序的重复出现。
DPP由一个较大的蛋白翻译后剪切产生，即牙质唾液酸磷酸蛋白(DSSP)被剪切成DPP和牙质唾液酸蛋白(DSP)两种蛋白。MEPE和骨桥蛋白与牙质唾液酸磷酸蛋白的牙质phosphoryn(DPP)部分有相当的同源性，与牙质唾液酸蛋白部分(DSP)则没有同源性(图13)。值得注意的是，DPP和MEPE中，RGD基序、酪蛋白激酶II磷酸化基序和N-糖基化位点紧密排列(图13)。而且，所有与DSSP相关的蛋白激酶C位点都集中在与MEPE重叠的区域(牙质phosphoryn部分)，DSP部分则没有。
2.二级结构
图3至6显示疏水性/亲水性、抗原性、柔性和细胞表面结构可能性的肽结构GCG预测结果。这些图显示对一级结构氨基酸序列的肽结构GCG预测分析。疏水性和亲水性分别以三角和椭圆代表。382-386处的糖基化基序以茎环表示。图6中的糖基化符号更清楚。蛋白转角以代表一级氨基酸序列的线形表示。α-螺旋、卷曲和平面结构以局部波浪线表示(图7较为详细)。计算机预测是用HGMP资源中心，Cambridge(Rice，1995)EGCG包程序说明中的GCG软件进行的。(Cambridge，CB10 1RQ，England：Hinxton Hall)。一惊人特征是没有Sistine残基和高度的亲水性，只有4个低疏水性指数的小位点(残基48-53，59-70，82-89和234-241)。该蛋白没有用antheorplot软件预测二级结构所推导的跨膜特征。而且，该蛋白具有高度的抗原性和柔性(图4和5)。二级结构总体特征显示是一种胞外分泌蛋白，这与提出的该蛋白功能相符。图7显示，phosphatonin的螺旋、平面结构，转角和卷曲区。其根据是用antheorplot v2.5e软件包的Garnier分析所做的预测。各部分中的4条线(由上至下)代表了一级氨基酸序列的螺旋、卷曲、平面和转角的概率。最下方的图是相同数据的条码形式。值得注意的是高螺旋含量，特别是在NH2末端，也靠近C末端，这可能与功能有关。
实施例6：phosphatonin和phosphatonin片段的医学用途
许多疾病可用本发明的多肽进行治疗。
X联锁的佝偻病(血磷酸盐过少症)(HYP)：
X联锁的血磷酸盐过少性佝偻病是最常见的遗传性骨矿物质代谢疾病(Rowe，1997)。phosphatonin生物活性片段(例如PHEX剪切而得的)和未剪切的激素将在该病的治疗中起重要作用。本发明克隆和描述的蛋白预计与其肾内同种受体相互作用，从而抑制肾Na-依赖性磷酸盐协同转运者(NaPi)的表达，并直接或间接上调肾24羟化酶。还预计下调肾1α羟化酶的表达(直接/间接)。经PHEX剪切后或其他翻译后修饰后，该激素的衍生片段具有相反的生物功能(上调NaPi，下调肾24羟化酶，上调肾1α羟化酶)。预计含RGD细胞结合残基(152-154)的片段参与受体相互作用，但其他肽衍生物也可能介导引起不同生物活性的配体受体相互作用。而且，phosphatonin衍生物还在矿物质减少性骨损伤的正常化中起重要作用。预计这是由于介导改变了成骨细胞介导的骨质矿化，和矫正骨矿化基质蛋白(骨桥蛋白/骨钙素)表达/磷酸化异常所致。RGD细胞结合序列和糖胺聚糖结合基序可能是功能性核形成和羟基磷灰石和骨矿物质结晶所必需的。
影响发育是HYP的主要特征，当前的疗法是不合适的。给予phosphatonin衍生片段而不是无机磷酸盐加维生素D可纠正这种错误。
因此，phosphatonin衍生片段的应用作用包括：
1.矫正血磷酸盐过少症(NaPi，最好是肾内的)；
2.24-羟化酶1α羟化酶活性正常化(肾内的)；
3.骨的矿化和骨的修复(矫正/预防佝偻病)；
4.消除骨痛症状；
5.纠正发育阻滞。
瘤原性血磷酸盐过少性骨软化(OHO)：
OHO的临床特征与HYP相似。包括肾磷酸盐漏失，1，25-二羟基维生素D3(钙三醇)循环水平低，碱性磷酸酶升高，骨矿化不全(在成人中则表现为全面骨软化(骨软化))和磷酸盐血清含量低。HYP与OHO的病理生理学明显重叠。佝偻病中，缺陷是无功能PHEX基因。然而，OHO中则是循环中的未加工phosphatonin。肿瘤通常很难找到，要切除可能极端困难和危险。如果不宜切除肿瘤，则控制磷酸盐代谢和骨矿化成为至关重要。给予患者PHEX以剪切激素是危险的，因为其他循环激素和蛋白也会受非特异性剪切的影响。取而代之的是，可以设计具有高度受体亲和性和生物活性的phosphatonin片段，这样，它们就能够有效地与未加工的肿瘤产生的循环激素竞争。
其他佝偻病或磷酸盐过少性病症：
有许多原因会引起HYP和OHO之外的佝偻病，最常见的包括维生素D异常，但也包括诸如血磷酸盐过少、肾小管酸中毒、某些药物的使用、口炎性腹泻、囊性纤维化，等。使用phosphatonin片段或phosphatonin本身可有效治疗这些疾病。以下简单论述了其中几种(可用全激素治疗造成血磷酸盐过少的疾病)。
肾移植和肾性骨营养不良
肾移植的一慢性特征是发生肾磷酸盐漏失(血磷酸盐过少)和骨矿化失常。phosphatonin片段可治疗该疾病，且没有目前药物的副作用。
骨营养不良(骨病的并发症)一般是由慢性肾衰(肾病)引起的。除非进行透析，肾衰会造成死亡(肾病晚期)。所以，骨营养不良患者一般接受透析治疗。这种骨病，又称“肾性骨营养不良”，常见于接受长期血透析的患者。大多数慢性肾衰患者发生继发性甲状旁腺机能亢进，伴以组织学发现囊性纤维性骨炎。该病的特征是儿童，尤其是极幼儿童发育不良和严重的骨畸形。肾性骨营养不良的病因与磷酸盐积累有关(血磷酸盐过多)及其对钙和钙三醇代谢的作用有关，还包括代谢性酸中毒、细胞因子和甲状旁腺素降解的影响。治疗方法包括限制饮食磷摄入，磷酸盐结合剂，和使用维生素D的活性代谢产物。在这种情况中，增加未加工激素是调控磷酸盐水平的高效手段，将导致骨愈合。如果phosphatonin的受体在包括肾脏的一系列组织内表达，则有可能用于治疗肾病晚期患者(即，完全丧失肾功能)。
骨质疏松/骨矿物质流失：
绝经后的妇女容易发生骨矿物质流失，最后危及骨骼健康。虽不知道病因，但很可能与遗传和环境因素的复杂相互作用有关。目前的研究注重于完善数据模型来分析诸如骨质疏松等多因素疾病。
使用phosphatonin衍生片段可通过有效逆转骨矿物质流失而协助治疗该病。而且，可以修饰生物活性肽来提高其作用的效力和特异性。
骨佩吉特病(变形性骨炎)：
骨佩吉特病是因为骨重塑协调障碍。即，骨的矿化(由成骨细胞介导)与骨的重吸收(由破骨细胞介导)不同步。出现破骨细胞过度的重吸收(主要在早期重吸收阶段)，骨髓被纤维组织和结构破坏的小梁所替代。虽然不知道其病因，但给予phosphatonin的肽衍生物可能有助于该病的治疗。
与肾以外组织内NaPi失调相关的疾病：
钠依赖性磷酸盐协同转运者(NaPi)不仅在肾内而且在许多其他组织内表达。目前记述了三种类型的NaPi：I型、II型和III型，据称，它们都在肾内表达。在肾以外组织内，III型普遍表达(Murer，欧洲生理学杂志(Eur.J.Physiol.)433(1997)379-389；Kavanaugh，肾脏研究(Kidney Int.)49(1996)956-963)，I型除肾之外在肝和脑内表达(Hilfiker，PNAS 95(1998)，14564-14569)。另一方面，II型被认为只在肾的近曲小管内表达。
虽然已知肾的近曲小管内表达全部上述三种类型，但普遍认为，II型在该部位的磷酸盐重吸收中起着最重要的作用。这已由编码II型NaPi的基因(Npt2)被灭活的失能小鼠所证实。纯合突变体(Npt2-/-)表现为尿中磷酸盐***增加，血磷酸盐过少，1，25-二羟基维生素D血清浓度升高及其他伴有尿钙过多的遗传性血磷酸盐过少性佝偻病(HHRH)的典型症状(Beck，PNAS 95(1998)，5372-5377)。由于哺乳动物内磷酸盐体内平衡的调节主要决定于肾，因此认为，三种类型中，II型NaPi在全身性磷酸盐体内平衡中起着最重要的作用。而且，以上事实，结合实施例中CL8细胞系试验结果说明，在肾内受phosphatonin调节的NaPi主要是II型。
肾衰患者主要临床问题之一是血磷酸盐过多。若能控制这种过量的血清磷酸盐将具有极大的临床价值。因此，能够下调NaPi和降低血磷酸盐水平的phophatonin，其片段或衍生物有着潜在的价值。在发展性肾衰患者中(在所谓肾病晚期(ESRD)之前)，用phosphatonin下调肾内的NaPi表达将是有价值的。
然而，一旦上述患者进入ESRD并丧失了大部分肾功能，phosphatonin将失去其在肾内的作用部位，因为肾小球将不再分泌磷酸盐。在此疾病阶段，潜在价值在于控制消化道内饮食磷酸盐的吸收。消化道，尤其是小肠，是从饮食中吸收磷酸盐进入循环的唯一场所。因此，这是肾功能丧失后控制磷酸盐吸收的又一个主要目标。
据报道，已经从小鼠的小肠克隆了II型NaPi的一种亚类，IIb型(Hilfiker，PNAS 95(1998)14564-14569)。虽然还不知道phosphatonin是否能影响小肠内IIb型NaPi，但有理由预计，小肠内的IIb型NaPi在来自饮食的磷酸盐吸收中起着重要作用，而且phosphatonin可能是其上调和下调最重要的因子。
实施例7：药物组合物
可配制含有本发明多肽和可选的药学上认可的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。此类组合物中过组分的确切性质和含量可凭经验确定，并在一定程度上取决于组合物的给予方式。给予患者的方式包括口服、颊侧、舌下、局部(包括眼内)、直肠、***、鼻子和胃肠外(包括静脉、动脉、肌内、皮下和关节内)。为了避免不期望的蛋白酶解，优选胃肠外途径。
本发明分子的合适剂型取决于所治疾病、给药途径和患者年龄及体重等因素。例如，对胃肠外给药来说，每日0.1μg-1.5mg/kg本发明分子适合治疗一般成人。更合适的可能是约1-150μg。因此，可以看出，对于成人可每日给予约0.01-100mg剂量的活性多肽，一般是0.1-10mg。
例如，适合胃肠外给药的组合物一般含本发明分子溶于认可的载体，最好是水性载体中所成的溶液。可采用多种水性载体，例如：水、缓冲水溶液、0.4％盐溶液、0.3％甘油，等。此类溶液最好是消过毒的，且没有凝聚体或其他颗粒物质。所述组合物可含有药学上认可的缓冲液以调节pH或改变毒性，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠，等。此类制剂中所述分子的浓度范围较宽，例如约0.5％以下至15或20％(重量)，可由熟练技术人员进行适当选择。
典型的药物组合物参见Remington药物科学(Remington′s PharmaceuticalScience)，15th版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980)。例如，注射用组合物可含1ml无菌缓冲水溶液和50mg本发明分子。典型的输注用组合物可含250ml无菌Ringer溶液和150mg本发明分子。制备组合物的方法是本领域熟练技术人员所公知的。配制和给予多肽类药物组合物的方法是本领域熟练技术人员所公知的，并可参见P.Goddard的高级药物传递论述(Advanced DrugDelivery Reviews)，6(1991)，103-131。
实施例8：phosphatonin(MEPE)及其编码基因的进一步描述
瘤原性骨软化患者(BD、ND、EM和DS)的临床特征
现有文献中已对患者BD进行了描述(Rowe，骨(Bone)18(1996)，159-169)，并曾公开过一例患者ND(David，神经外科杂志(J.Neurosug.)84(1996)，288-292)。两患者都表现出典型的瘤原性骨软化，表现为低血清磷酸盐和放射性骨软化和低血清1,25维生素D3。患者BD(44岁的妇女)和患者ND(66岁的妇女)在分别去除了左鼻腔(血管周皮细胞瘤)和颅内空间(间充质周皮细胞瘤样肿瘤)的肿瘤后，症状大部分缓解。患者ND在20年内接受过3次手术，每次术后都缓解。
肿瘤条件培养基：
术后立即采取BD、ND和EM的肿瘤样品。将样品制成约1mm的切片，部分冷冻于液氮中。其余的肿瘤组织切片按先前所述组织培养(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)。简而言之，样品用胶原酶消化过夜，然后交替地在有和无血清(DMEM培养基)存在下培养。对于患者ND，再采集硬膜下周围和硬膜样品，如上所述进行处理。而且，在摘除肿瘤的当日获取患者BD的对照皮肤成纤维细胞培养物，并用处理肿瘤样品的方法进行处理。患者BD的样品标记为：1：肿瘤条件培养基(TCM-BD)；2：皮肤条件培养基(SCM-BD)。患者ND的样品标记为：1：肿瘤条件培养基(TCM-ND)；2：硬膜下条件培养基(SDCM-ND)；3：硬膜条件培养基(DCM-ND)；4：颅内肿瘤周围液(FST-ND)。所有样品都采集自细胞于无血清DMEM培养基中培养的培养循环，除非在以上缩写上方加上“补充血清”。
TCM的伴刀豆蛋白A亲和层析
按实施例1所述进行患者ND的肿瘤条件培养基(TCM)的伴刀豆蛋白A亲和层析，结果分离出高亲和性组分和低亲和性组分(分别是HCA和LCA)。HCA和LCA都用α-甲基-D-吡哺葡萄糖(0.5M)洗脱缓冲液洗脱。简而言之，对Wangner，遗传比较内分泌学(Gen.Comp.Endocrinol.)63(1986)，481-491中的方法加以改进，用伴刀豆蛋白A亲和层析进行TCM蛋白的部分纯化。20％乙醇中的伴刀豆蛋白A琼脂糖(Pharmacia编号：17-0440-01，14ml)先用数倍柱体积的水洗涤，然后在运行缓冲液( CRB；0.06M磷酸钠，pH7.2和0.5M NaCl)中平衡。将平衡后的浆状物装入12mm×115mm的Pharmacia螺纹头柱内，以0.4ml/min流速加入3倍柱体积的CRB运行缓冲液(FPLC/HPLC millenium Waters层析***)。然后在柱内加入以CRB缓冲液平衡的条件培养基(10ml)，任其结合。然后，用数倍体积的CRB上样缓冲液洗柱，然后以0.2ml/min流速加入磷酸钠洗脱缓冲液(ERB；60mMpH7.2/0.5M NaCl/0.5M α-甲基-D-吡喃葡萄糖/0.01％叠氮化物)(40ml)洗脱结合的蛋白。柱在ERB缓冲液中培养过夜，然后ERB缓冲液以0.2ml/min流速第二次通过，洗出高亲和性蛋白。高和低伴刀豆蛋白A亲和性TCM蛋白的洗脱特征相同，在约1.6柱体积处产生单一对称峰。峰LCA为峰HCA总量的1/3，ND患者的10ml肿瘤条件培养基中获得1μgHCA物质。
TCM和伴刀豆蛋白A组分的SDS-PAGE
SDS-PAGE分离肿瘤条件培养基、条件培养基和伴刀豆蛋白A亲和性峰(HCA和LCA)，并在Sybr橙染色后显示。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用Novex NuPAGETM电泳***进行，该***包括：4-12％Bis-Tris丙烯酰胺梯度凝胶(pH6.4)，和MOPS-SDS(50mM 3-[N-吗啉代]戊烷磺酸；50mM Tris碱；3.5mM SDS；1.0mMEDTA；pH7.7)运行缓冲液。200伏恒压电泳50min。样品在NuPAGE LDS缓冲液(10％甘油；1.7％Tris碱；1.7 Tris-HCl；2％十二烷基硫酸锂；二硫苏糖醇50mM；0.015％EDTA；0.075％Serva蓝G250；0.025％苯酚红；pH7.5最终浓度)中70℃变性10min。按照生产商所述在上电泳室中加入NuPAGE抗氧化剂。电泳后，凝胶在含SYPRO橙的7.5％乙酸中孵育染色。用Bio-Rad FluorImager凝胶显影***在UV光源下观察蛋白质。HCA和LCA组分染色呈阳性，分别为56kDa和200kDa的蛋白质，特征相同。来自患者ND颅内肿瘤、硬膜下(紧靠患者肿瘤)和硬膜的条件培养基中含有跨50-80kDa的数条主条带。所有制剂中都含有约66kDa处的主带，肿瘤和硬膜下样品中还有约200kDa处的一种较弱的高分子量成分。肿瘤样品中约200kDa的相对强度最高，硬膜样品中则没有。肿瘤和硬膜样品中有一组约55-60kDa的扩散带，硬膜条件培养基中则没有(患者ND)。来自皮肤和培养基对照的条件培养基都没有蛋白染色。患者BD和EM的条件培养基情况与此相似，但没有200kDa的高分子量蛋白。
患者LA和SL的非磷酸盐沉着肿瘤组织和皮肤对照都有66kDa带，且都在50-60kDa处有扩散染色带。伴刀豆蛋白A亲和层析峰HCA和LCA富含200kDa高分子量蛋白，还含50-66kDa的蛋白。来自骨细胞系HTB96和SaOs2的条件培养基产生的蛋白特征与来自OHO患者ND的肿瘤条件培养基的几乎完全相同。SaOs2中的200kDa带的强度比之来自脑肿瘤(患者ND)、硬膜下(患者ND)的TCM和HTB96的CM相对较弱。
TCM和纯化组分的免疫印迹和糖蛋白染色
为了进行Western印迹，通过水下(submarine)电泳将蛋白质转移到PVDF膜(Amersham)上。SDS-PAGE电泳后，凝胶在转移缓冲液(25mM Tris-HCl；0.38M甘油；0.2％SDS(TB))中室温下平衡1h。PVDF膜切割成一定大小，在甲醇中略微漂洗，在蒸馏水中洗涤，然后在TB中平衡。然后，将平衡后的凝胶和PVDF膜夹在滤纸之间，放在盒中，然后将盒子放入含TB缓冲液的Hoeffer***水下电印迹仪中，用温差环流冷却仪保持于4℃冷却。然后转移蛋白：将夹心多层的PVDF端至于阴极，0.4A(45V)恒流电泳45min。分别按照加强化学发光试剂盒(Amersham；ECL+)或钙调蛋白亲和性检测试剂盒(Stratagene)的方法，用1/1 000稀释的术前抗血清，术后抗血清或与碱性磷酸酶偶联的钙调蛋白筛选印迹。用Bio-RadFluoImaging***检测化学发光，并摄影，用前文克隆检测中论述过的比色***(Stratagene)观察钙调蛋白亲和性结合。用生物素化的分子量标记作为内部对照评价转移和分子量。将与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素加入第二抗体(与HRP偶联的山羊抗家兔IgG)，以促进通过化学发光观察生物素化的标记。
OHO患者的磷酸盐沉着肿瘤条件培养基(TCM)的Western印迹在用预吸收的术前抗血清筛选时显示化学发光阳性带。非磷酸盐沉着性肿瘤、皮肤组织对照和培养基对照在用预吸收的术前抗血清筛选时都为阴性。而且，所有TCM和条件培养基样品在用术后抗血清筛选时都呈阴性。
用预吸收的术前抗血清筛选患者ND和骨肉瘤细胞系HTB96和SaOS2的TCM蛋白，显示位于约54-57kDa和约200kDa处的两条免疫阳性带。患者ND肿瘤样品和毗邻硬膜下组织的54-57kDa信号比脑硬膜样品条件培养基的强得多，而且，硬膜条件培养基中没有200kDa的染色带。HCA和LCA伴刀豆蛋白A组分都具有很强的200kDa带信号，54-57kDa的信号虽然弱但仍然可见。细胞系HTB96和SaOS2也具有相同的阳性带，但SaOS2条件培养基的200kDa带信号比TCM和HTB96弱。
皮肤条件培养基(患者ND和BD)和对照在用术后抗血清筛选时呈阴性(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)。重组MEPE(rec-MEPE)用预吸收术前抗血清染色呈阳性，这可能与加入的rec-MEPE所竞争所致。用Sybr-橙染色，和用预吸收术前抗血清筛选rec-MEPE，观察到一条54-57kDa的阳性带。这和患者ND的肿瘤条件培养基和骨肉瘤细胞系HTB96和SaOS2中的55-57kDa带(预吸收术前Western筛选)大小相同。重组MEPE在N末端有一个附加的4.5kDa CBP标签，这降低了其迁移率，造成在SDS-PAGE凝胶上的表观分子量升高。因此，肿瘤产生的蛋白与rec-MEPE大小相同可能是由于对肿瘤产生的MEPE的翻译后修饰(可能是糖基化)。
OHO患者BD和EM的TCM Western印迹在略低分子量处(48-52kDa)含有主要的预吸收术前抗血清阳性带，和一个55-57kDa处与rec-MEPE共迁移的条带。在61、75、80和93kDa处还有其他的更高分子量带(信号较弱)。
在所有样品中，在用预吸收术前抗血清筛选时，66kDa处的主要SYBR-橙染色蛋白带都呈阴性。对一式两份糖蛋白用术前抗血清筛选时得到相同结果，54-57kDa和200kDa带染色阳性证实，这些蛋白是糖基化的。按照前述方法，用SDS-PAGE分离蛋白质，并转印到PVDF膜上。用检测糖蛋白的免疫印迹试剂盒(Bio-Rad)进行特异性的糖蛋白检测，加入Amersham的生物素化标记作为内部对照。简而言之，转移后，膜用10mM高碘酸钠在乙酸钠/EDTA缓冲液中所成的溶液处理，以氧化糖基部分。然后，在PBS中洗涤印迹，在乙酸钠/EDTA缓冲液中与酰肼一起室温孵育60分钟。滤膜然后用TBS洗涤3次(10min)。用加强化学发光试剂盒(Amersham)和链霉亲和素辣根过氧化物酶，用前述方法进行封闭和检测。不使用第一抗体和第二抗体山羊抗家兔HRP。
结论：预吸收术前抗血清特异性检测到瘤原性血磷酸盐过少性骨软化-TCM蛋白。测得的主要蛋白分成3种分子量大小范围：48-52kDa，54-57kDa和200kDa。所有OHO-TCM样品的54-57kDa蛋白都呈阳性，而且，用预吸收术前抗血清测得的蛋白在筛选糖蛋白时呈染色阳性。非OHO肿瘤对照组织和培养基在用预吸收术前抗血清筛选时呈阴性。
实施例9：由pCAL-n-EK载体表达MEPE融合蛋白
将完整的cDNA编码序列亚克隆到实施例4a所述的pCAL-n-EK中。如前所述，用术前抗血清和与碱性磷酸酶偶联的钙调蛋白筛选Western印迹，确认IPTG引入大肠杆菌宿主BL21(DE3)产生的融合构建物。具有细菌CBP标签(4.5kDa的钙调蛋白结合性肽)的该融合蛋白含有钙调蛋白肽、肠激酶位点和凝血酶位点，根据SDS-PAGE推断为56kDa。这大致符合预计分子量(约48kDa)。如前所述用钙调蛋白亲和性层析纯化蛋白。术前抗血清与纯化的融合蛋白构建物预培养，减弱了筛选TCM Western印迹中看到的55-57kDa信号，但不消除200kDa带。未能完全消除55-57kDa信号可能是因为新生MEPE-蛋白(TCM)中的高抗原性糖基化部分被特异性地识别，而rec-MEPE的细菌融合构建物中则没有这部分。融合蛋白可溶于水性Tris缓冲液，在纯化的各步骤都不需要使用除垢剂。
实施例10：组织表达(RT/PCR和Northern分析)
用MEPE cDNA筛选含聚A+RNA的Northern印迹，没有测得与胃、甲状腺、脊髓、***、气管、肾上腺、骨髓、心脏、脑、肺、肝、骨骼肌、肾和胰脏的杂交(Clontech MTN-印迹I和II)。在Northern分析中，用特异性内部引物(Pho433-11 1F和PHO877-111R)扩增得到的MEPE cDNA筛选含有以下聚A+RNA的印迹(MTNTM和MTNTM III)：1：心脏；2：脑；3：胎盘；4：肺；5：肝；6：骨骼肌：7：肾；8：胰脏；9：胃；10：甲状腺；11：脊髓；12：***；13：气管；14：肾上腺；15：骨髓。图8中突出显示了Pho433-111F和PHO877-111R的引物序列(核苷酸433-456(SEQ ID NO：24)和核苷酸877-900(SEQ ID NO：25))，采用以下PCR条件：预变性：95℃3min；30轮变性循环：95℃45sec；退火：63℃30sec；聚合：72℃45sec；最后72℃延伸7min，然后冷却至4℃。使用最终浓度为2mM MgCl2的PCR缓冲液(PB)。然后用水下琼脂糖电泳分辨出444bp的MEPE cDNA扩增产物，溴乙锭染色显示，用玻璃珠纯化(Gene-clean II试剂盒Bio101 INC)。用Amersham的MegaPrime标记试剂盒，以α-P32dCTP(3000ci/mmol)放射性标记纯化的DNA。一般获得5×109cpm/μg的比活性。用公知方法(Rowe，Hum.Genet.97(1996)，354-352)进行印迹的杂交(60℃)和预杂交(60℃)，如下进行严谨性洗涤：1：室温下用2×SSC 0.1％SDS 30min洗涤2次，60℃用0.1×SSC0.1％SDS 30min洗涤2次。滤膜与胶片在-80℃接触7天，然后显影胶片。虽然以cDNA为模板，发现脑、肾、肝和胰脏有低水平的表达，但来自肾上腺、脑、十二指肠、心脏、肾、肝、肺、皮肤、脾脏、胸腺、甲状腺、扁桃体的总人RNA用RT/PCR和MEPE特异性引物时并不扩增。为了进行该实验，抽提以下人组织的总RNA：1：胸腺；2：脑；3：睾丸；4：十二指肠；5：心脏；6：皮肤；7：肝；8：扁桃体；9：脾脏；10：甲状腺；11：肾上腺；12：肺；13：肾；14：OHO肿瘤组织；15：人原代成骨细胞。另获取大鼠原代成骨细胞的总RNA。用逆转录酶-PCR和Perkin Elmer-Roche RNA PCR试剂盒，用上述MEPE内部引物(Pho433-111F和PHO877-111R)复制总RNA。简而言之，将1μg总RNA溶于20μl10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，5mM MgCl2，1mM dNTPs，1单位/μl核糖核酸酶抑制剂，2.5单位/μl MULV逆转录酶，0.75μM下游引物(PHO877-111R)。以上混合物37℃保温10分钟。加入上游引物(Pho433-111F)、dNTPs、MgCl2和AmpliTaq DNA聚合酶，最终浓度分别为0.15μM、200μMH 2.5单位/100μl，总体积为100μl。用Perkin Elmer热循环仪(9700***)进行PCR，程序设定如下：预变性：95℃，3min；35轮变性：95℃，45sec；退火：65℃，30sec；聚合：72℃，45sec；最后延伸：72℃，7min，冷却至4℃。用琼脂糖凝胶电泳分辨扩增产物，用Southern印迹验证，并测序。同样，来自一系列非OHO肿瘤(***癌、肺癌I、结肠腺癌I、肺癌II、***癌、结肠腺癌II、卵巢癌、胰腺癌；Clontech人肿瘤组#K1422-1)的一组归一化的cDNA都呈MEPE PCR阴性，只有结肠腺癌、卵巢癌和***癌中有极低水平的表达(以放射性标记的MEPE cDNA对RT-PCR扩增产物进行Southern筛选后测得)。截然相反的是，用MEPE引物进行的RT-PCR扩增患者BD、DM、EM和DS的OHO肿瘤的聚A+RNA，表现出高水平的表达(相对甘油醛3-磷酸酯脱氢酶和运铁蛋白进行归一化)。OHO患者的非磷酸盐沉着性肿瘤和对照组织(皮肤和肿瘤毗邻物质)的聚A+RNA，CL8人肾细胞系，人原代成骨细胞(购自Clonetics H-OST，参见材料)和抽提自线性皮脂腺痔综合征患者的预测肿瘤息肉的聚A+RNA(息肉的TCM在人肾细胞系CL8中不抑制磷酸盐的吸收)都不能扩增用MEPE特异性引物。用购自Clonetics的心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰脏的cDNA(人组I#K1420-1)作为模板进行MEPR引物PCR，可在脑、肝、肺和胰脏内检测到低水平的表达。对MEPE引物扩增带进行测序显示与MEPE cDNA完全同源，用MEPE cDNA对扩增带进行的Southern筛选证实了测序结果。所有OHO患者的OHO模板聚A+RNA都扩增出预计的480bp带和下方的190bp带。测序和Southern放射自显影证实上方带与MEPE序列完全同源，Southern筛选证实下方带是一种MEPE衍生物。在低水平表达的正常组织和非OHO肿瘤中没有下方带。这说明，交替剪接可能与肿瘤衍生的MEPE相关。全部RT/PCR和PCR实验都相对G3PDH和运铁蛋白归一化。
总之，只在OHO肿瘤样品中发现MEPE的高表达(根据mRNA水平测定)，脑、肝、肾和11种非OHO肿瘤中3种中有极低水平的表达(可能是异位表达。11种肿瘤的8种MEPE mRNA表达呈阴性(RT/PCR)，全部结果都相对G3PDH和运铁蛋白RT/PCR引物作归一化。
实施例11：Southern分析(基因组印迹)
常染色体佝偻病家族的固定化DNA的基因印迹(Rowe，Hum.Genet.91(1993)，571-575)分别用PstI、 EcoRI、 PvuII和MspI消化，如前所述用放射性标记的MEPE cDNA筛选。用已知方法(Rowe，Hum.Genet.93(1994)，291-294)用抽提自血液的DNA的基因组消化产物进行Southern分析。16名家族成员接受筛选，其中一人的PstI印迹显示一条11bk带和一条4kb的多形性带。EcoRI、PvuII和MspI印迹分别呈单条6kb、6.5kb和4kb带阳性，证明了该基因的人类起源。因为没有基因信息，所以无法推断在这一常染色体佝偻病家族中，该基因是否与该疾病相分离。
实施例12：人肾细胞系CL8中的磷酸盐吸收：补充TCM和MEPE
用已知方法(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)以人肾细胞系CL8进行磷酸盐和葡萄糖吸收实验。简而言之，在24格平底组织培养板(Falcon 3047)中，将细胞培养在确定成分培养基(DM)中，直至铺满或培养过夜。然后用补充了纯化融合蛋白或伴刀豆蛋白亲和性纯化的TCM的DM替换原DM，37℃培养过夜。然后测定P32和C14甲基葡萄糖的吸收(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)。
如现有记述所述，将TCM(1/20稀释)加入人肾细胞系显著降低Na依赖性磷酸盐吸收(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)。又如现有记述所述，TCM与术前抗血清预培养可避免这种抑制，但术后抗血清则不能(Rowe，Bone 18(1996)，159-169)。加入40ng/ml的高和低伴刀豆蛋白A亲和性纯化组分(HCA和HLA)也抑制Na+依赖性磷酸盐吸收(NaPi)。在TCM和伴刀豆蛋白A组分中，抑制都特异性针对磷酸盐吸收，而不影响Na+依赖性α-甲基-D-葡萄糖的吸收。以上作用都呈剂量依赖性。
用钙调蛋白亲和性层析纯化的MEPE融合蛋白进行相同的实验。出人意料的是，重组MEPE不抑制Na+依赖性磷酸盐协同转运者，而以剂量依赖性方式增加磷酸盐的吸收(参见图24)。1000ng/ml时观察到双倍的磷酸盐吸收(p＜0.001)。以上实验证明，在人肾细胞系CL8中，MEPE融合蛋白特异性增加Na+依赖性磷酸盐协同转运者。
虽然以上通过具体实施例对本发明进行了描述，但本领域熟练技术人员应该明白，可进行许多符合本发明范围和构思的改变和等效替换。而且，根据特定的情况、材料、物质组成、方法步骤，可进行许多修正，以实现本发明的目的、构思或范围。所有这些修改都包括在所附权利要求的范围之内。
本发明参考了在发明背景、详细描述和实施例部分引用的各篇文献(包括专利、专利申请、杂志论文、摘要、实验室手册、教科书等)。而且，附上序列表以供参考。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：University College London
(B)街道：Rowland Hill Street
(C)城市：London
(D)郡：无
(E)国家：英国
(F)邮政编码：NW3 2PF
(ii)发明名称：一种新的肽激素phosphatonin
(iii)序列数量：25
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release.#1.0，Version 1.30版(EPO)
(2)SEQID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1655bp
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：非
(ix)特征：
(A)名称/代号：CDS
(B)位置：1..1290
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
GTG AAT AAA GAA TAT AGT ATC AGT AAC AAA GAG AAT ACT CAC AAT GGC   48
Val Asn Lys Glu Tyr Ser Ile Ser Asn Lys Glu Asn Thr His Asn Gly
  1               5                  10                  15
CTG AGG ATG TCA ATT TAT CCT AAG TCA ACT GGG AAT AAA GGG TTT GAG   96
Leu Arg Met Ser Ile Tyr Pro Lys Ser Thr Gly Asn Lys Gly Phe Glu
             20                  25                  30
GAT GGA GAT GAT GCT ATC AGC AAA CTA CAT GAC CAA GAA GAA TAT GGC   144
Asp Gly Asp Asp Ala Ile Ser Lys Leu His Asp Gln Glu Glu Tyr Gly
         35                  40                  45
GCA GCT CTC ATC AGA AAT AAC ATG CAA CAT ATA ATG GGG CCA GTG ACT   192
Ala Ala Leu Ile Arg Asn Asn Met Gln His Ile Met Gly Pro Val Thr
     50                  55                  60
GCG ATT AAA CTC CTG GGG GAA GAA AAC AAA GAG AAC ACA CCT AGG AAT   240
Ala Ile Lys Leu Leu Gly Glu Glu Asn Lys Glu Asn Thr Pro Arg Asn
 65                  70                  75                  80
GTT CTA AAC ATA ATC CCA GCA AGT ATG AAT TAT GCT AAA GCA CAC TCG   288
Val Leu Asn Ile Ile Pro Ala Ser Met Asn Tyr Ala Lys Ala His Ser
                 85                  90                  95
AAG GAT AAA AAG AAG CCT CAA AGA GAT TCC CAA GCC CAG AAA AGT CCA   336
Lys Asp Lys Lys Lys Pro Gln Arg Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro
            100                 105                 110
GTA AAA AGC AAA AGC ACC CAT CGT ATT CAA CAC AAC ATT GAC TAC CTA   384
Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu
        115                 120                 125
AAA CAT CTC TCA AAA GTC AAA AAA ATC CCC AGT GAT TTT GAA GGC AGC   432
Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser
    130                 135                 140
GGT TAT ACA GAT CTT CAA GAG AGA GGG GAC AAT GAT ATA TCT CCT TTC   480
Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe
145                 150                 155                 160
AGT GGG GAC GGC CAA CCT TTT AAG GAC ATT CCT GGT AAA GGA GAA GCT   528
Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala
                165                 170                 175
ACT GGT CCT GAC CTA GAA GGC AAA GAT ATT CAA ACA GGG TTT GCA GGC   576
Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly
            180                 185                 190
CCA AGT GAA GCT GAG AGT ACT CAT CTT GAC ACA AAA AAG CCA GGT TAT   624
Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His Leu Asp Thr Lys Lys Pro Gly Tyr
        195                 200                 205
AAT GAG ATC CCA GAG AGA GAA GAA AAT GGT GGA AAT ACC ATT GGA ACT   672
Asn Glu Ile Pro Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gly Asn Thr Ile Gly Thr
    210                 215                 220
AGG GAT GAA ACT GCG AAA GAG GCA GAT GCT GTT GAT GTC AGC CTT GTA   720
Arg Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Val Asp Val Ser Leu Val
225                 230                 235                 240
GAG GGC AGC AAC GAT ATC ATG GGT AGT ACC AAT TTT AAG GAG CTC CCT   768
Glu Gly Ser Asn Asp Ile Met Gly Ser Thr Asn Phe Lys Glu Leu Pro
                245                 250                 255
GGA AGA GAA GGA AAC AGA GTG GAT GCT GGC AGC CAA AAT GCT CAC CAA   816
Gly Arg Glu Gly Asn Arg Val Asp Ala Gly Ser Gln Asn Ala His Gln
            260                 265                 270
GGG AAG GTT GAG TTT CAT TAC CCT CCT GCA CCC TCA AAA GAG AAA AGA   864
Gly Lys Val Glu Phe His Tyr Pro Pro Ala Pro Ser Lys Glu Lys Arg
        275                 280                 285
AAA GAA GGC AGT AGT GAT GCA GCT GAA AGT ACC AAC TAT AAT GAA ATT   912
Lys Glu Gly Ser Ser Asp Ala Ala Glu Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ile
    290                 295                 300
CCT AAA AAT GGC AAA GGC AGT ACC AGA AAG GGT GTA GAT CAT TCT AAT   960
Pro Lys Asn Gly Lys Gly Ser Thr Arg Lys Gly Val Asp His Ser Asn
305                 310                 315                 320
AGG AAC CAA GCA ACC TTA AAT GAA AAA CAA AGG TTT CCT AGT AAG GGC   1008
Arg Asn Gln Ala Thr Leu Asn Glu Lys Gln Arg Phe Pro Ser Lys Gly
                325                 330                 335
AAA AGT CAG GGC CTG CCC ATT CCT TCT CGT GGT CTT GAT AAT GAA ATC    1056
Lys Ser Gln Gly Leu Pro Ile Pro Ser Arg Gly Leu Asp Asn Glu Ile
            340                 345                 350
AAA AAC GAA ATG GAT TCC TTT AAT GGC CCC AGT CAT GAG AAT ATA ATA    1104
Lys Asn Glu Met Asp Ser Phe Asn Gly Pro Ser His Glu Asn Ile Ile
        355                 360                 365
ACA CAT GGC AGA AAA TAT CAT TAT GTA CCC CAC AGA CAA AAT AAT TCT    1152
Thr His Gly Arg Lys Tyr His Tyr Val Pro His Arg Gln Asn Asn Ser
    370                 375                 380
ACA CGG AAT AAG GGT ATG CCA CAA GGG AAA GGC TCC TGG GGT AGA CAA    1200
Thr Arg Asn Lys Gly Met Pro Gln Gly Lys Gly Ser Trp Gly Arg Gln
385                 390                 395                 400
CCC CAT TCC AAC AGG AGG TTT AGT TCC CGT AGA AGG GAT GAC AGT AGT    1248
Pro His Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser
                405                 410                 415
GAG TCA TCT GAC AGT GGC AGT TCA AGT GAG AGC GAT GGT GAC            1290
Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp Gly Asp
            420                 425                 430
TAGTCCACCA GGAGTTCCCA GCGGGGTGAC AGTCTGAAGA CCTCGTCACC TGTGAGTTGA  1350
TGTAGAGGAG AGCCACCTGA CAGCTGACCA GGTGAAGAGA GGATAGAGTG AAGAACTGAG  1410
TGAGCCAAGA ATCCTGGTCT CCTTGGGGGA ATTTTTGCTA TCTTAATAGT CACAGTATAA  1470
AATTCTATTA AAGGCTATAA TGTTTTTAAG CAAAAAAAAA TCATTACAGA TCTATGAAAT  1530
AGGTAACATT TGAGTAGGTG TCATTTAAAA ATAGTTGGTG AATGTCACAA ATGCCTTCTA  1590
TGTTGTTTGC TCTGTAGACA TGAAAATAAA CAATATCTCT CGATGATAAA AAAAAAAAAA  1650
AAAAA                                                              1655
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：430氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Val Asn Lys Glu Tyr Ser Ile Ser Asn Lys Glu Asn Thr His Asn Gly
  1               5                  10                  15
Leu Arg Met Ser Ile Tyr Pro Lys Ser Thr Gly Asn Lys Gly Phe Glu
             20                  25                  30
Asp Gly Asp Asp Ala Ile Ser Lys Leu His Asp Gln Glu Glu Tyr Gly
         35                  40                  45
Ala Ala Leu Ile Arg Asn Asn Met Gln His Ile Met Gly Pro Val Thr
     50                  55                  60
Ala Ile Lys Leu Leu Gly Glu Glu Asn Lys Glu Asn Thr Pro Arg Asn
 65                  70                  75                  80
Val Leu Asn Ile Ile Pro Ala Ser Met Asn Tyr Ala Lys Ala His Ser
                 85                  90                  95
Lys Asp Lys Lys Lys Pro Gln Arg Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro
            100                 105                 110
Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu
        115                 120                 125
Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser
    130                 135                 140
Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala
                165                 170                 175
Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly
            180                 185                 190
Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His Leu Asp Thr Lys Lys Pro Gly Tyr
        195                 200                 205
Asn Glu Ile Pro Glu Arg Glu Glu Asn Gly Gly Asn Thr Ile Gly Thr
    210                 215                 220
Arg Asp Glu Thr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Val Asp Val Ser Leu Val
225                 230                 235                 240
Glu Gly Ser Asn Asp Ile Met Gly Ser Thr Asn Phe Lys Glu Leu Pro
                245                 250                 255
Gly Arg Glu Gly Asn Arg Val Asp Ala Gly Ser Gln Asn Ala His Gln
            260                 265                 270
Gly Lys Val Glu Phe His Tyr Pro Pro Ala Pro Ser Lys Glu Lys Arg
        275                 280                 285
Lys Glu Gly Ser Ser Asp Ala Ala Glu Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Ile
    290                 295                 300
Pro Lys Asn Gly Lys Gly Ser Thr Arg Lys Gly Val Asp His Ser Asn
305                 310                 315                 320
Arg Asn Gln Ala Thr Leu Asn Glu Lys Gln Arg Phe Pro Ser Lys Gly
                325                 330                 335
Lys Ser Gln Gly Leu Pro Ile Pro Ser Arg Gly Leu Asp Asn Glu Ile
            340                 345                 350
Lys Asn Glu Met Asp Ser Phe Asn Gly Pro Ser His Glu Asn Ile Ile
        355                 360                 365
Thr His Gly Arg Lys Tyr His Tyr Val Pro His Arg Gln Asn Asn Ser
    370                 375                 380
Thr Arg Asn Lys Gly Met Pro Gln Gly Lys Gly Ser Trp Gly Arg Gln
385                 390                 395                 400
Pro His Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser
                405                 410                 415
Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp Gly Asp
            420                 425                 430
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：4氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Ser Gly Asp Gly
  1
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Ala Asp Ala Val Asp Val Ser
  1               5
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser
  1               5                  10                  15
Ser Ser Glu Ser Asp Gly
             20
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Ser Ser Arg Ser Lys Glu Asp Ser Asn Ser Thr Glu Ser Lys Ser Ser
  1               5                  10                  15
Ser Glu Glu Asp Gly
             20
(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
GACGACGACA AGGTGAATAA AGAATATAGT ATCAGTAA                              38
(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：35bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GGAACAAGAC CCGTCTAGTC ACCATCGCTC TCACT                                  35
(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser
  1               5                  10                  15
(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Ser Asp
  1               5                  10                  15
(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
Ser Ser Arg Arg Arg Asp Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Gly Ser
  1               5                  10                  15
Ser Ser Glu Ser Asp Gly
             20
(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
Asp Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser
  1               5                  10                  15
(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Asn Ser Ser Ser Asp Ser
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
Asp Ser Ser Glu Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn Ser Ser Asp Ser
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu Ser Asp
  1               5                  10                  15
(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu Ser Asp
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp
  1              5                  10
(2)SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asp Ser Ser Asn
  1               5                  10
(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Ser Ser Arg Ser Lys Glu Asp Ser Asn Ser Thr Glu Ser Lys Ser Ser
  1               5                  10                  15
Ser Glu Glu Asp Gly
             20
(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
GGTTATACAG ATCTTCAAGA GAGAG                               25
(2)SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线性
(ii)分子类型：其他核酸
(A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(iii)假设：是
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
GTTGGTACTT TCAGCTGCAT CACT                                 24

Claims (16)

1.一种上调钠依赖性磷酸盐协同转运的多肽，所含多肽由选自以下所述的聚核苷酸编码：
(a)编码至少含氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽中氨基酸1至236的聚核苷酸；
(b)含SEQ ID NO：1所示编码序列中编码至少该多肽的氨基酸1至236的聚核苷酸；
(c)在严谨条件下与(a)或(b)所述聚核苷酸杂交且编码的多肽上调钠依赖性磷酸盐协同转运的聚核苷酸，所述严谨条件包括42℃，50％甲酰胺，5×SSC，所述SSC包含750mM NaCl和75mM柠檬酸钠，50mM磷酸钠，pH7.6，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性鲑鱼***DNA；
(d)所编码的多肽与(a)或(b)所述聚核苷酸所编码的多肽具有90％或更高一致性的聚核苷酸，而且，该聚核苷酸所编码的多肽上调钠依赖性磷酸盐协同转运；
(e)编码phosphatonin多肽的带表位部分的聚核苷酸，所述的带表位部分包含SEQ ID NO：2中的1-40，141-180和/或401-429氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的多肽，其具有在SDS-PAGE上测得的60kDa分子量或具有在pH7的bis-tri SDS-PAGE上测得的200kDa分子量。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，它是糖基化和/或磷酸化的。
4.根据权利要求1所述的多肽，它是自保藏号为ECACC 89050205的Saos-2细胞纯化得到的。
5.一种聚核苷酸，它编码权利要求1至4中任一项中所述的多肽。
6.根据权利要求5所述的聚核苷酸，包括RNA或DNA。
7.一种载体，它含有权利要求5或6所述的聚核苷酸。
8.一种宿主细胞，用权利要求5或6所述的聚核苷酸，权利要求7所述的载体经基因工程构建而成，或者该细胞是通过在宿主细胞内引入一段表达调控序列介导权利要求1至4中任一项所述多肽的基因的表达而得到的。
9.一种生产权利要求1至3中任一项所述多肽的方法，包括：培养权利要求8所述的宿主细胞，和从培养物中回收所述聚核苷酸所编码的多肽。
10.一种抗体，它特异性结合权利要求1至4中任一项所述的多肽。
11.一种组合物，它包含权利要求1至4中任一项所述的多肽。
12.一种组合物，它包含权利要求5或6所述的聚核苷酸。
13.一种组合物，它包含权利要求7所述的载体。
14.一种组合物，它包含权利要求10所述的抗体。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的组合物，它是一种药物组合物，还包含药学上认可的赋形剂、稀释剂或载体。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的组合物，它是一种诊断用组合物，还包含检测工具。
CNB998063614A 1998-05-18 1999-05-18 多肽激素磷酸盐沉着因子 Expired - Lifetime CN100359015C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9810681.8 1998-05-18
GBGB9810681.8A GB9810681D0 (en) 1998-05-18 1998-05-18 Hormone
GBGB9819387.3A GB9819387D0 (en) 1998-05-18 1998-09-04 Polypeptide
GB9819387.3 1998-09-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1308677A CN1308677A (zh) 2001-08-15
CN100359015C true CN100359015C (zh) 2008-01-02

Family

ID=26313705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998063614A Expired - Lifetime CN100359015C (zh) 1998-05-18 1999-05-18 多肽激素磷酸盐沉着因子

Country Status (13)

Country Link
US (6) US6818745B1 (zh)
EP (1) EP1086225B1 (zh)
JP (1) JP4424575B2 (zh)
CN (1) CN100359015C (zh)
AT (1) ATE354656T1 (zh)
AU (1) AU765349B2 (zh)
CA (1) CA2329054C (zh)
DE (1) DE69935220T2 (zh)
DK (1) DK1086225T3 (zh)
ES (1) ES2281964T3 (zh)
MX (1) MXPA00011272A (zh)
TW (1) TWI227734B (zh)
WO (1) WO1999060017A2 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818745B1 (en) 1998-05-18 2004-11-16 University College London Polypeptide hormone phosphatonin
GB9810681D0 (en) * 1998-05-18 1998-07-15 Royal Free Hosp School Med Hormone
PT1230369E (pt) * 1999-11-04 2008-02-15 Univ London Fosfatonina uma hormona polipeptídica
EP1130098A3 (en) * 2000-02-29 2003-09-10 Pfizer Products Inc. Mammalian osteoregulins
AU2001245953A1 (en) * 2000-03-24 2001-10-08 Genzyme Corporation Oncogenic osteomalacia-related gene 1
GB0008936D0 (en) * 2000-04-11 2000-05-31 Glaxo Group Ltd Vectors
US20030175808A1 (en) * 2000-06-21 2003-09-18 Tomofumi Kurokawa Novel protein and dna thereof
EP1310554B1 (en) 2000-08-11 2010-05-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Polypeptides controlling phosphoric acid metabolism, calcium metabolism, calcification and vitamin d metabolism and dnas encoding the same
US6911425B2 (en) * 2000-08-16 2005-06-28 Acologix, Inc. Integrin binding motif containing peptides and methods of treating skeletal diseases
PT1313440E (pt) * 2000-08-16 2008-10-22 Acologix Inc Produtos dentífricos que contêm um péptido que potencia o crescimento dos ossos
CN100519584C (zh) 2001-12-28 2009-07-29 麒麟医药株式会社 抗成纤维细胞生长因子23的抗体
US7622438B1 (en) 2005-07-18 2009-11-24 Acologix, Inc. Protein formulation for promoting hard tissue formation
AU2006285127A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 Acologix, Inc. Regulation of mineral and skeletal metabolism
WO2007032560A1 (ja) * 2005-09-15 2007-03-22 Osaka University 新規モノクローナル抗体及びその用途
WO2007032559A1 (ja) * 2005-09-15 2007-03-22 Osaka University 新規モノクローナル抗体及びその用途
US7825217B2 (en) * 2006-09-15 2010-11-02 University Of Kansas Medical Center Polypeptides for bone mineralization
DK2117578T3 (en) 2007-01-22 2015-07-20 Orthotrophix Inc Peptide composition and method for promoting cartilage formation
US7883705B2 (en) 2007-02-14 2011-02-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti FGF23 antibody and a pharmaceutical composition comprising the same
EP2393470B1 (en) 2009-02-06 2017-04-05 The Regents of The University of California Calcium-binding agents induce hair growth and/or nail growth
CA3089655A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995014772A1 (fr) * 1993-11-12 1995-06-01 Kenichi Matsubara Signature genique

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5015628A (en) * 1986-06-12 1991-05-14 The University Of Melbourne Anticariogenic phosphopeptides
US5340934A (en) * 1989-11-03 1994-08-23 The United States Of Americas As Represented By The Secretary Of Health & Human Services CDNA sequences of human bone matrix proteins
GB9203958D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Norske Stats Oljeselskap Catalytic multi-phase reactor
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US6103709A (en) * 1993-12-23 2000-08-15 The Regents Of The University Of California Therapeutically effective 1α,25-dihydroxyvitamin D3 analogs and methods for treatment of vitamin D diseases
US5770565A (en) * 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
US6027592A (en) * 1995-06-06 2000-02-22 Gillette Canada Inc. Dental floss
US6300062B1 (en) * 1995-07-13 2001-10-09 Biora Ab Enamel matrix related polypeptide
US5837674A (en) * 1996-07-03 1998-11-17 Big Bear Bio, Inc. Phosphopeptides and methods of treating bone diseases
CA2300194A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Children's Medical Center Corporation Osteopontin coated surfaces and methods of use
US6146655A (en) * 1997-08-29 2000-11-14 Softy-Flex Inc. Flexible intra-oral bandage and drug delivery system
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
WO1999043844A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reciprocal subtraction differential display
US6673900B2 (en) * 1999-11-04 2004-01-06 University College London Polypeptide hormone-phosphatonin
US6818745B1 (en) * 1998-05-18 2004-11-16 University College London Polypeptide hormone phosphatonin
US7098185B2 (en) * 1998-05-18 2006-08-29 University College London Polypeptide hormone phosphatonin
US6045780A (en) * 1998-06-22 2000-04-04 Shemberg Marketing Corporation Toothpaste composition
AUPP893999A0 (en) 1999-03-01 1999-03-25 Csl Limited Synthetic peptides containing protective epitopes for the treatment and prevention of periodontitis associated with porphyromonas gingivalis
US6145655A (en) 1999-10-04 2000-11-14 Tsai; Allan Lens cleaning kit
EP1130098A3 (en) * 2000-02-29 2003-09-10 Pfizer Products Inc. Mammalian osteoregulins
AU2001245953A1 (en) * 2000-03-24 2001-10-08 Genzyme Corporation Oncogenic osteomalacia-related gene 1
PT1301196E (pt) 2000-07-19 2004-04-30 Univ Texas Estimulacao do crescimento osseo com derivados peptidicos de trombina
US6911425B2 (en) * 2000-08-16 2005-06-28 Acologix, Inc. Integrin binding motif containing peptides and methods of treating skeletal diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995014772A1 (fr) * 1993-11-12 1995-06-01 Kenichi Matsubara Signature genique

Also Published As

Publication number Publication date
EP1086225B1 (en) 2007-02-21
US20080113428A1 (en) 2008-05-15
US6818745B1 (en) 2004-11-16
WO1999060017A3 (en) 2000-03-09
JP2002515232A (ja) 2002-05-28
DE69935220D1 (de) 2007-04-05
US7473771B2 (en) 2009-01-06
US20080097082A1 (en) 2008-04-24
CA2329054A1 (en) 1999-11-25
US20070185010A1 (en) 2007-08-09
US7459300B2 (en) 2008-12-02
AU4362499A (en) 1999-12-06
US20050014187A1 (en) 2005-01-20
US7655760B2 (en) 2010-02-02
CA2329054C (en) 2011-03-08
MXPA00011272A (es) 2003-04-22
ES2281964T3 (es) 2007-10-01
US20070184461A1 (en) 2007-08-09
US7271151B2 (en) 2007-09-18
JP4424575B2 (ja) 2010-03-03
TWI227734B (en) 2005-02-11
DE69935220T2 (de) 2007-11-15
EP1086225A2 (en) 2001-03-28
DK1086225T3 (da) 2007-05-21
AU765349B2 (en) 2003-09-18
ATE354656T1 (de) 2007-03-15
WO1999060017A2 (en) 1999-11-25
CN1308677A (zh) 2001-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100359015C (zh) 多肽激素磷酸盐沉着因子
CN1446227B (zh) 新型成纤维细胞生长因子(fgf23)及其使用方法
US6673900B2 (en) Polypeptide hormone-phosphatonin
JP5208021B2 (ja) 新規ポリペプチドホルモンフォスファトニン
US20040053389A1 (en) Novel polypeptide hormone phosphatonin
JP2009159974A (ja) 新規ポリペプチドホルモン・フォスファトニン
TWI246535B (en) A novel polypeptide hormone phosphatonin
GB2339572A (en) Regulation of phosphate transport
CN100358917C (zh) 肿瘤标志物及其用途
CA2437364A1 (en) Proteins and nucleic acids encoding same

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20080102