CN100352502C - 能通过免疫防治ⅰ型糖尿病的重组蛋白和重组基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能用于预防和治疗I型糖尿病的重组蛋白及其重组基因。将源于分枝杆菌(Mycobacterium bovine)的热休克蛋白HSP65基因与人HSP60的一段抗原表位P277连接，产生的重组蛋白可不需添加佐剂直接用于免疫。该重组蛋白通过注射途径和粘膜免疫途径都能刺激机体产生针对P277的抗体，显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能起到防治I型糖尿病的作用。同时本发明提供的重组基因也可用于转基因动物或植物和重组微生物，使它们作为生产该重组蛋白的工厂或制作口服疫苗。

Description

能通过免疫防治Ⅰ型糖尿病的重组蛋白和重组基因

技术领域

在医学领域中，可以用疫苗来预防自身免疫性疾病，本发明是一种重组蛋白，能用于预防和治疗I型糖尿病的发生。

背景技术

I型糖尿病，或称胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，是一种具家族遗传性的自身免疫性疾病，患者以青少年居多。主要表现为胰岛β细胞的大部分被破坏和胰岛素的绝对缺乏。目前尚无有效的治疗方法，患者需终生依靠胰岛素，十分痛苦。1992年后，我国一些地区根据WHO diamond Project计划，在统一方法和标准下，对15岁以下儿童IDDM的发病率进行了调查，据收集到的已发表的11个地区的资料中，1988年到1995年期间我国儿童IDDM的年发病率在0.19/10万～1.26/10万，多数地区年发病率在0.5/10万～0.9/10万。自20世纪80年代起，儿童IDDM的发病在我国有不断增高的趋势。

一般情况下，自身免疫性疾病可通过免疫注射疾病相关的自身抗原来治疗。目前已经从IDDM病人血清中检测出许多自身抗体，其中重要的有胰岛细胞抗体(islet cell antibody，ICA)，胰岛素抗体(insulin antibody，IA)，抗热休克蛋白60((heat shockprotein 60，HSP60)抗体，抗谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)抗体等。由此进一步验证引起疾病的自身抗原有胰岛细胞表面抗原-512(ICA-512)，胰岛素，HSP60，GAD，此外可能存在的还有胰岛素受体，羧肽酶H，外周蛋白。当存在多种可能的抗原时，确定其中的优势抗原尤为重要。热休克蛋白(HSP)是所有的细胞，包括原核细胞和真核细胞在受到温度的突然增高和其他理化因素的刺激产生应激反应后而形成的一种高度保守蛋白，具有很强的免疫原性，与多种自身免疫性疾病相关，其中与IDDM相关的为HSP60家族。HSP60是IDDM中极其重要的一个抗原，迄今为止，未见有报道称由HSP60引发IDDM，倒是有许多文献表明，用此种抗原免疫机体能使其在下一次遇到该抗原时对其产生耐受性，阻止自身免疫性疾病的发生。有人把人工合成的多肽固定在聚乙烯材料上，来进行HSP60的线性抗体表位扫描，发现糖尿病儿童组的血清中特异性针对P277的抗体水平显著高于健康儿童组。

P277多肽是存在于人HSP60蛋白上437-460的一段特异性多肽，是在IDDM中发挥作用的特异片段，序列为：VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。有文献报道了一次随机的，双盲的二期临床实验，实验结果表明，P277能挽救机体内未受损的胰岛β细胞的功能(即使机体已表现出明显的临床症状)，使其能继续释放内源性的胰岛素。至于P277的作用机理，可以通过一种抗原能调控机体对其它抗原反映的现象(亦称“旁路抑制”理论)来解释，即一种抗原在炎症部位激活抑制炎症因子的Th2型细胞因子可关闭Th1细胞对附近抗原的反应，这也是目前对此较为成熟与合理的解释。在鼠和人中，与胰岛β细胞决定簇作用的主要为CD4⁺T细胞，而CD4⁺T细胞按其分泌的细胞因子不同又分为Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要分泌IL2和IFN-γ，前者能有效刺激T细胞增值，后者为炎症因子，能引起阻止发炎并诱导B细胞产生IgG2α抗体。而且由于77％的Th1细胞具有细胞毒作用，它可以溶解呈递自身移植抗原的β细胞，从而使抗体生成降低，降低体液免疫。Th2细胞分泌IL-2和IL-10，能降低Th1效应。IL-4促进β细胞产生IgG1抗体，抑制Th1产生前炎症因子。IL-10通过影响抗原呈递细胞和巨噬细胞释放前炎症因子而抑制Th1活性。至于p277为什么能诱导这种变化，现在认为关键在于P277本身的抗原特性，结构等，因为T细胞表型的分化受不同抗原刺激产生不同的结果。因此可考虑用此作为免疫疫苗来预防和治疗I型糖尿病。疫苗的方法可以克服传统的口服或注射胰岛素及器官移植等方法的诸多缺点，更重要的是它能挽救未损伤的β细胞，使其继续释放内源性的胰岛素。

然而，P277作为只具有20几个氨基酸的多肽，免疫原性很弱，这在一定程度上限制了其作用的发挥。通常，多肽疫苗需要加入佐剂，才能激发机体产生足够强的免疫应答。许多常用的佐剂，如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等仅能用于动物，不能用于人体；人体可用的佐剂目前仅有铝佐剂，而这种佐剂常常对多肽疫苗不能起到强化免疫原性的作用。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的热休克蛋白65(MT-HSP65)具有“在位”佐剂的功能，可以非特异性刺激T细胞或作用于巨噬细胞，起到呈递特异性抗原的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种不需添加佐剂，能通过粘膜免疫防治I型糖尿病的重组蛋白。

本发明的另一目的是提供编码该重组蛋白的基因。

本发明的再一目的是提供生产该该重组蛋白的方法。

本发明的还有一个目的是该重组蛋白的用途及其给药途径。

在本发明的第一方面，提供了一种能通过免疫防治人I型糖尿病的重组蛋白，这种重组蛋白不需要添加佐剂，而且能通过粘膜免疫。这种重组蛋白是将结核分枝杆菌的HSP65(MT-HSP65)和P277多肽形成融合蛋白HSP65-P277。MT-HSP65具有“在位”佐剂的功能，将抗原表位多肽P277与HSP65融合表达，能强化P277的免疫原性，不需添加佐剂就能激发机体产生强烈免疫应答，可以通过粘膜给药来防治人的I型糖尿病。利用鼻粘膜给药进行粘膜免疫简便易行，药物经鼻粘膜部丰富毛细血管吸收后直接进入体循环，使药物不良反应的发生机率大为降低，体液免疫是粘膜免疫效应的主要过程，即产生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，sIgA的多聚体结构能增强其对抗原的亲和力，而且sIgA表面特殊的糖成分或糖链有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。通过鼻粘膜给药还可免受胃肠道中酶的破坏和肝脏对药物的首过清除效应，有利于提高生物利用度和血药浓度，可极大地减少药物用量。同时IgG，IgM和IgE等免疫球蛋白在粘膜反应中也起着不可忽视的重要作用。除了鼻粘膜给药，该重组蛋白还可以考虑口服这种给药途径。

本发明的第二方面，是提供编码该重组蛋白的基因，现有的基因重组蛋白疫苗相对价格高，接种也必须到医院，目前要让所有的人都接受显然十分困难。如把此重组基因片断HSP65-P277导入动物体内，就可以获得大量表达这种重组蛋白的转基因动物，并能通过该动物分泌的奶，产的蛋或其他组织提取获得此种重组蛋白，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，一只转基因的动物就相当于建一座大型制药厂，大大降低现有的生产成本。或只要食用这种转基因动物的乳汁或鸡蛋等就可获得I型糖尿病的保护。如把该基因整合到某些植物的基因组中，用植物表达作为疫苗的重组蛋白不须纯化，可直接口服，在运输中不须冷冻保存转基因植物，价廉易行。如把HSP65-P277的基因转入到番茄，香蕉中，就可以吃个番茄或香蕉就可防治I型糖尿病，这就使我们有了更多的选择，不用去医院，无需注射，只要在家吃个几个番茄或服用几粒这种番茄加工制成的药物胶囊，就可以在体内产生抗I型糖尿病的抗体，常吃可使体内持续抗体维持在一个较高水平，增强了对I型糖尿病的抵抗。

在本发明的第三方面，是提供生产该抗人I型糖尿病重组蛋白的方法，其技术路线详述如下：

1.P277基因的设计与获得

P277是人HSP60上的一段⁴³⁷VLGGG VALLR VIPALDSLTPANED⁴⁶⁰，该序列是HSP60对IDDM发挥作用的特异片段。我们将442和447位的C(半胱氨酸)用V(缬氨酸)来置换，以增强肽段的稳定性，两者具有相同的免疫特性。根据多肽P277氨基酸序列，选择原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，分别作为上游、下游引物，并在上游引物5’端加上限制性核酸内切酶BamHI的酶切位点，下游引物5’端加上终止密码子和限制性核酸内切酶HindIII的酶切位点，两条引物互补序列为20个碱基，通过聚合酶链式反应(PCR)法获得P277多肽基因的核苷酸序列。

2.HSP65基因的设计与获得

在不改变HSP65氨基酸序列的前提下，选用原核和真核生物均适用的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，从市售的卡介苗提取的DNA中通过PCR法获得HSP65基因的核苷酸序列，5’端添加了NcoI的识别位点，3’端添加了NheI和BglII的识别位点。

3.pED-P277重组基因工程菌的构建

P277基因经BamHI、HindIII切割***经BamHI、HindIII切割的pED质粒载体中，组成融合表达的重组质粒pED-P277，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。

4.pED-HSP65-P277重组基因工程菌的构建

HSP65基因经NcoI、BglII切割***经NcoI、BamHI切割的pED-P277中，组成融合表达的重组质粒pED-HSP65-P277，重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组基因工程菌。

5.工程菌发酵及重组HSP65-P277融合蛋白的获得

以液体LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下：温度37℃，pH6.8-7.2。发酵后离心收集工程菌，经溶菌酶和DNA水解酶作用，离心取上清获得可溶性蛋白，硫酸铵分级沉淀，35％-45％硫酸铵分级沉淀中含有目的融合蛋白且杂蛋白较少，沉淀重新溶解脱盐后经阴离子交换柱层析纯化，用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，可以判断纯化的HSP65-P277的纯度。

在本发明的第四方面是该重组蛋白的用途，如上所述，此种重组蛋白能用于防治人I型糖尿病的发生。我们选用国际上通用的I型糖尿病的动物模型NOD(non-obese diabetic mouse，NOD)小鼠，随机分成六组，每组十只，分别是空白对照组，HSP65腹腔注射组，HSP65-P277腹腔注射组，HSP65鼻腔粘膜免疫组，HSP65-P277鼻腔粘膜免疫组，卵清蛋白滴鼻对照组。分别于4周龄，7周龄，10周龄3次免疫，每月测小鼠体内血糖水平及相应的抗体滴度。结果显示，通过两种给药途径HSP65和HSP65-P277都可以不同程度的抑制NOD小鼠糖尿病的发生，这可能由于HSP高度保守，MT-HSP65和人的HSP60中含有相似的抗原表位，当以可溶性的方式注射免疫或粘膜免疫时都可以诱导机体产生免疫耐受，从而起到降低针对胰岛β细胞的免疫损伤来防治糖尿病的发生。这样一来MT-HSP65不仅具有“在位”佐剂的功能，同时本身还具有抗I型糖尿病的作用，将它与P277组成重组蛋白，明显优于单独使用P277，更有利于防治I型糖尿病的发生。我们通过初步药效学实验表明了此重组蛋白HSP65-P277对I型糖尿病的发生有明显的降低作用，同时我们也证明了此重组蛋白可以通过粘膜免疫。

附图说明

图1重组蛋白HSP65-P277的全基因序列(1707bp)及氨基酸序列(569aa)

图2重组质粒pED-P277和pED-HSP65-P277结构图。

图3 PED-HSP65-P277 C端部分基因测序结果。

图4 SDS-PAGE电泳显示HSP65-P277的融合表达。1.标准分子量蛋白；2.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.载荷pED质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；4.载荷pED-HSP65-P277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导前)；5.载荷pED-HSP65-P277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)；6.载荷pET28a-HSP65质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白(乳糖诱导后)。

图5 SDS-PAGE电泳显示pED-HSP65-P277重组基因工程菌乳糖诱导后5小时菌体裂解后上清不同饱和浓度的硫酸铵分级沉淀。1.标准分子量蛋白；2.菌体裂解上清30％饱和度的硫酸铵沉淀；3.菌体裂解上清40％饱和度的硫酸铵沉淀；4.菌体裂解上清45％饱和度的硫酸铵沉淀。

图6 SDS-PAGE电泳显示HSP65-P277蛋白的纯化.1.标准分子量蛋白；2.乳糖诱导5小时后载荷pED-HSP65-P277质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；3.分离的HSP65-P277；6.分离的HSP65。

图7 ELISA测定结果显示融合蛋白HSP65-P277腹腔注射和粘膜免疫都能诱发小鼠产生抗P277的抗体。图例：■HSP65-P277腹腔注射组；□HSP65-P277鼻粘膜免疫组

图8 Western blot检测结果显示HSP65-P277能诱发NOD小鼠产生抗P277抗体。A：蛋白转膜后用丽春红染色显示相应的蛋白条带；B：杂交后显色结果。1.标准分子量蛋白；2.氧化态rhVEGF-P277；3.还原态rhVEGF-P277；4.氧化态rhVEGF；5.还原态rhVEGF。

图9各组小鼠免疫后不同月龄血清中血糖的含量。结果显示：HSP65-P277粘膜免疫和腹腔注射可以显著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65两种免疫途径的NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。图例： HSP65腹腔注射组；

HSP65-P277腹腔注射组；

HSP65-P277鼻粘膜免疫组；

对照组；-×-HSP65鼻粘膜免疫组；

卵清蛋白滴鼻对照组

图10各组小鼠不同时期糖尿病发生率，结果显示：HSP65-P277腹腔注射效果最好，至8月龄时NOD鼠尚无糖尿病的发生，HSP65-P277粘膜免疫的小鼠亦能显著降低糖尿病的发生；HSP65对NOD小鼠糖尿病的发生也有一定的预防作用。图例： 对照组；■卵清蛋白滴鼻对照组；

HSP65腹腔注射组；□HSP65-P277腹腔注射组(发病率为一直为0，图中未显示出图形)；

HSP65-P277鼻粘膜免疫组； HSP65鼻粘膜免疫组

具体实施方式

材料：

(1)菌株与质粒：

宿主菌E.col i BL21(Escherichia coli BL21)是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

卡介苗由上海生物制品公司生产，该制品中含有牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)。

质粒pED由本实验室构建并保存。

质粒pET28a-HSP65由本实验室构建并保存，HSP65蛋白也由本实验室分离纯化。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；PCR回收试盒和琼脂糖胶回收试剂盒为华舜生物工程公司产品。

(3)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spting Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。

玉米浆培养基含有：玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。

(5)Cellouse-DEAE DE-52为Whatman公司产品。

(6)辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗为武汉博士德公司产品。

(7)3、3`、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(Sigma)公司产品。

(8)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。

(9)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。

(10)测定血清中血糖浓度的仪器为Hitachi Automatic Analyzer(Model-7150，Tokyo，Janpan)。

方法

分子生物学操作方法

质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，ManiatisT.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。

实施例1 HSP65-P277多肽基因的设计、合成和克隆

根据MT-HSP65基因和P277多肽基因的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机的辅助下设计出4条寡核苷酸片段。首先通过PCR法合成P277多肽基因，将该基因克隆到pED的L-ansB-C基因的C端，转化大肠杆菌得到重组质粒命名为pED-P277。再以pET28a-HSP65质粒为模板，通过PCR的方法获得MT-HSP65基因，将该基因替换pED-P277中的L-ansB-C基因，转化大肠杆菌得到重组质粒命名为PED-HSP65-P277。具体方法如下：

4条寡核苷酸：

P1：  5’GCTGGATCCAGTTCTGGGTGGTGGCGTTGCTCTGCTGCGCGTTATCCCGGCTCTGG 3’

P2：  5’GTCAAGCTTAATCTTCGTTAGCCGGGGTCAGGGAGTCCAGAGCCGGGATAACGCGC 3’

P3：  5’TTG ACC ATG GCC AAG ACA ATT GCG TAC 3’

P4：  5’TAA AAG ATC TGC GCT AGC GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’

通过PCR获得P277多肽基因：将寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互为引物和模板，94℃，30秒，58℃，30sec，72℃，30sec，共30个循环；72℃，10min。将扩增获得的PCR产物经试剂盒纯化后用限制性核酸内切酶BamH1和HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pED质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含连有P277多肽基因的重组质粒pED-P277。

通过PCR获得HSP65多肽基因：以P3为上游引物，P4为下游引物，pET28a-HSP65质粒为模板，经94℃变性5min，然后以94℃变性1min、62℃复性1min、72℃延伸2min共进行35个循环后，再72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化后用限制性核酸内切酶NcoI和BglII消化，与用NcoI和BamH I消化的pED-P277质粒连接，其中BglII和BamHI为同尾酶，连接产物转化大肠杆菌BL21，所获得的转化子中含HSP65-P277融合蛋白基因的重组质粒pED-HSP65-P277，其质粒图谱见图2。

实施例2 HSP65-P277基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒pED-HSP65-P277转化大肠杆菌BL21。从生长有不同转化子平板上挑取单菌落接种含有50ug/ml卡那霉素LB液体培养基，于37℃恒温振荡培养过夜，按1％比例转接种入新鲜的玉米浆液体培养基(50ug/ml卡那霉素)中，37℃培养4小时后，加入终浓度为0.5mmol/L的α-乳糖诱导大肠杆菌表达T₇RNA聚合酶，继续培养从而表达融合蛋白HSP65-P277。诱导后每隔1小时取少量菌液，离心回收菌体，SDS-PAGE电泳再经薄层扫描显示已经实现了HSP65-P277多肽基因的融合表达。融合蛋白在诱导后5小时达到稳定的最大表达量，融合蛋白占细菌总蛋白的40％左右，结果见图6。

实施例3重组蛋白HSP65-P277的分离纯化

诱导表达后的工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(pH8.0，50mM磷酸盐缓冲液，0.02％溶菌酶)中，37℃搅拌30分钟，加入DNase将DNA消化至溶液不粘稠为止，离心回收上清，用硫酸铵分级沉淀，目的蛋白主要在35％-45％硫酸铵沉淀中，见图5。将沉淀的融合蛋白重新溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，透析脱盐，离心后取上清进行阴离子交换柱层析，DEAE纤维素DE-52柱(2×60cm)，用PBS/NaCl梯度洗脱，分部收集进行SDS-PAGE电泳检测，HSP65-P277在120-150mmolNaCl处的洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度，见图6。

实施例4 HSP65-P277重组蛋白的免疫原性研究

选用4周龄雌性NOD小鼠，随机分成6组分别为PBS腹腔注射对照组、HSP65腹腔注射实验组、HSP65-P277腹腔注射实验组、HSP65鼻腔粘膜免疫实验组、HSP65-P277鼻腔粘膜免疫实验组和卵清蛋白鼻腔粘膜免疫对照组，每组各10只。分别腹腔注射或鼻腔粘膜免疫对应的蛋白50ug/只(PBS对照组50ulPBS/只)，HSP65、HSP65-P277和卵清蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂。以后每隔3周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。每次免疫后3周内眦取血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存。

用纯化的重组人血管内皮生长因子121和p277的融合蛋白(rhVEGF-p277)4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100ul含50ug融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于pH7.5的PBS中)稀释50倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.1％Tween-20)和自来水间隔洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。PBST和自来水间隔洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3、3`、5、5`-四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色30分钟后，加入50μl 2MH₂SO₄终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。结果见图6。结果表明，HSP65-P277腹腔免疫和鼻腔粘膜免疫都能诱发小鼠产生特异的抗P277抗体。

实施例5抗P277特异抗体的Western检测

将纯化后的rhVEGF、还原态rhVEGF-P277和氧化态rhVEGF-P277用15％SDS-PAGE电泳后，于30V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。实施例5和例6中所得抗血清稀释20倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释400倍的羊抗小鼠或兔IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以以pH7.5 TBS缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，pp.888-898。NOD小鼠血清Western blot法检测结果见图8。氧化态rhVEGF-P277(泳道2)由于其链间二硫键的作用，部分蛋白质形成二聚体，在PAGE胶上表现为分子量分别为17kD和34kD的双条带，还原态rhVEGF-P277(泳道1)为单体，在胶上表现为分子量为16kD的单条带。由于NOD小鼠血清中有抗P277抗体的存在，因此可以分别和膜上16kD和32kD的rhVEGF-P277蛋白带杂交，但不和rhVEGF杂交(泳道4和5)，证实了HSP65-P277实验组能诱发NOD小鼠产生特异的抗P277的抗体。

实施例5 HSP65-P277重组蛋白的药效学研究

选用4周龄雌性NOD小鼠，随机分成6组分别为PBS腹腔注射对照组、HSP65腹腔注射实验组、HSP65-P277腹腔注射实验组、HSP65鼻腔粘膜免疫实验组、HSP65-P277鼻腔粘膜免疫实验组和卵清蛋白鼻腔粘膜免疫对照组，每组各10只。分别腹腔注射或鼻腔粘膜免疫对应的蛋白50ug/只(PBS对照组50ulPBS/只)，HSP65、HSP65-P277和卵清蛋白都用PBS溶解，不加其他佐剂。以后每隔3周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。每次免疫后3周内眦取血一次，以后每月取血一次。血量为0.5-0.8ml，离心，取血清5小时内用全自动生化分析仪测定血糖含量。

结果见图9。结果显示：HSP65-P277粘膜免疫和腹腔注射可以显著降低NOD小鼠血糖含量，HSP65两种免疫途径的NOD小鼠的血糖也有不同程度的降低。以血糖浓度≥11.1mmol/l判为糖尿病。结果见图10。结果表明重组蛋白HSP65-P277腹腔注射效果最好，至8月龄时NOD鼠尚无糖尿病的发生，粘膜免疫亦可以显著降低NOD小鼠糖尿病的发生。HSP65对NOD小鼠糖尿病的发生也有一定的预防作用。

Claims (4)

1.一种不需要佐剂的、具有预防人I型糖尿病作用的重组蛋白HSP65-P277，其特征在于该重组蛋白是将源于牛结核分枝杆菌(Mycobacteriium bovine)的热休克蛋白HSP65和人HSP60的抗原表位P277的基因融合的方法获得的。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白HSP65-P277，其特征在于该重组蛋白HSP65-P277的P277序列是VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED。

3.一种制备权利要求1所述的重组蛋白HSP65-P277的方法，包括用化学合成法和PCR法扩增获得人p277和结核分枝杆菌HSP65的编码序列DNA，将这些DNA分步***表达载体，在大肠杆菌中表达出可溶性融合蛋白，经硫酸铵分级沉淀纯化、阴离子交换树脂DEAE纤维素纯化，得到防治I型糖尿病的重组蛋白HSP65-P277。

4.权利要求1所述的重组蛋白HSP65-P277在制备用于诱发机体产生抗P277抗体的药物中的用途。

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