CN1365286A - 治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方法 - Google Patents

Abstract

描述了治疗慢性HBV感染的方法和药盒。使用了含有HBV的PreS2+S抗原,以及可代谢性油佐剂的组合物。

Description

治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方法

发明领域

本发明涉及治疗慢性乙型肝炎病毒(“HBV”)感染和疾病的免疫治疗剂。

发明背景

85％以上儿童HBV感染变成慢性。成人中1-5％急性HBV感染不能治愈，也变为慢性感染。慢性感染可导致慢性活动性肝炎(20-50％的病例)、肝硬化或甚至肝功能衰竭(10-20％的病例)，在某些情况下导致肝癌(1-3％的病例)。肝脏损伤主要是对感染的肝细胞的细胞免疫应答引起的。

仅在美国就有约一百万HBV的慢性携带者。全世界有300,000,000以上的慢性携带者。许多慢性携带者在泛太平洋地区(即台湾、日本、南亚)和非洲。

引起慢性HBV感染的机制尚不清楚。乙型肝炎e-抗原(“HBeAg”或“HBe”，前核心多肽)的存在与活动性病毒复制有关，是感染性增加和严重性的指标。虽然如果患者是抗-HBe阳性预后较好，但是急性和慢性感染的恢复都与产生针对乙肝表面抗原(“HBsAg”或“HBs”)的抗体有关。随着中和性抗-HBs抗体的出现，HBsAg消失是感染清除的指标。然而，对抗HBs的自发性血清转化现象极其罕见。虽然每年有10％的患者经历了HBeAg到抗-HBe的自发血清转化，但是由HBs血清转化成抗HBs每年仅发生在约1％的患者中。

虽然已有治疗慢性HBV的疗法，但是大多数范围和效力都有限。干扰素治疗仅在3-5％患者中导致抗HBs血清转化。另外，干扰素治疗非常昂贵，可能具有严重的副作用，而且必须每日皮下注射。

更新的抗病毒药物，如拉米夫定可减少病毒负荷，但仅在少数病人中导致抗HBs血清转化。另外，它们必须长期使用-中断会导致病毒重新出现，使得可能需要终生治疗-而且可能出现耐药性突变株。

也已有免疫疗法。一些免疫疗法基于抗体的施用。当单独使用抗HBs抗体(“HBIG”)时，可具有治疗作用，如肝脏移植对HBV感染所证明的那样。蛋白质设计实验室(Protein Design Labs)正致力于使用人源化抗HBs抗体作Ig灌注治疗。

其他免疫疗法基于抗原施用。一种基于抗原的免疫疗法利用了酵母表达的HBsAg和油/水乳液加RIBI和QS-21(SmithKline Beecham)。目前正在进行慢性感染的二期试验。另一种利用PreS1+PreS2+S/明矾(Medeva)。还有另一种(现在正进行150个病人的免疫疗法试验)使用PreS2+S/明矾(Institut Pateur)。另一种基于抗原的免疫疗法利用核心蛋白衍生的肽，用于诱导细胞毒性T淋巴细胞应答(Cytel)。

仍然需要能改善慢性HBV感染的强效免疫疗法。

发明简述

在一方面，本发明涉及治疗慢性HBV感染的方法，包括施用一种组合物，该组合物含有HBsAg的重组PreS2+S蛋白质和一种可代谢的油佐剂，和可任选的抗病毒药物或化合物。

另一个方面，本发明涉及一种免疫治疗药盒，它包括HBsAg的PreS2+S蛋白质、一种可代谢的油佐剂和可任选的抗病毒药物或化合物。

附图简述

图1描述了具有感兴趣的限制性位点的HBV基因组和用于制备表达质粒的接头。

图2示意性描述了该克隆策略。

图3a-b、4a-b和5a-b描述了三个病人的HBe/抗HBe(a)和血清ALT/HBV DNA(b)结果，第二个病人显示短时突发加剧。

发明详述

本发明的实施可采用(除非另外说明)病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学的常规方法和本领域的重组DNA技术。这些技术在文献中已有全面论述，见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)；DNAcloning：A Practical Approach，卷I&II(D.Glover编)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell ScientificPublications)和Fundamental Virology，第二版，卷I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe编)。

本发明涉及基于抗原的免疫疗法，用于治疗慢性HBV感染。如本文所用的“治疗”包括改善和/或消除HBV感染，并刺激对其的免疫应答，优选抗-HBsAg或抗-HBe应答。人HBV是感染鸟类和哺乳类物种的嗜肝性DNA病毒的嗜肝DNA病毒科的成员。外膜相关抗原HBsAg可诱导中和性保护抗体应答。HBsAg由三种相关蛋白质组成，它们具有共同的氨基酸序列-S、preS2+S和preS1+PreS2+S。

本发明中所用的含抗原的组合物含有HBV的PreS2+S抗原和一种可代谢性油佐剂。在一个实施例中，PreS2+S抗原是在中国仓鼠卵巢细胞中重组产生的。在另一个优选例中，该可代谢性油佐剂是下文所述的佐剂MF59。

在本发明的方法中，将上述组合物施给个体。可任选的，在施用该含抗原的组合物之前、同时或之后施用一种抗病毒药物。在含抗原的组合物之前施用抗病毒药物的时间可从1个月到24个月之间。慢性HBV患者中有大群感染的肝细胞。由于肝脏损伤主要是由于对受感染肝细胞的细胞免疫应答引起的，已建议在其他治疗前延长抗病毒治疗，以减少受感染肝细胞的数量(Genome，J.Clin.Invest.102(5)：867-868，1988年9月)。另外，用抗病毒药物降低循环性HBsAg的水平可通过减少游离抗原量，来减少免疫治疗开始后抗原-抗体复合物沉积的可能性。

可对存在慢性HBV感染的个体施用有效量的前述组合物。本文所用的术语“有效量”指实现治疗所要的目的，而没有不良副作用(如中毒、刺激或过敏反应)所需的量。虽然个体的需要可能不同，确定制剂有效量的最佳范围是在本领域技术人员能力范围内的。人用剂量也不难从动物研究中推导出(Katocs等，第27章于Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版，Gennaro编，Mack PublishingCo.Easton，PA，1990)。通常，提供有效量的制剂所需的剂量(可由本领域技术人员调节)随几种因素而变化，包括年龄、健康、生理状况、体重、接受者所患疾病或异常的种类或程度、治疗频率、同时治疗(如果需要)的性质、所需效果的性质和范围(Nies等，第三章于：Goodman&Gilman’s The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，第9版，Hardman等编，McGraw-Hill，New York，NY，1996)。考虑的剂量范围为大约5-100微克。

还应考虑可能需要多次施用该组合物。给药之间的时间由给药数量而定。例如，如果给药两次，第一次可在第0月，第二次分别在第1、2或6月。另外，可间隔一月给药。多次给药之间的时间不难由本领域技术人员决定。在一个实施例中给药8次。

本文所用的术语“给药”包括但不限于透皮、胃肠道外、皮下、肌肉内、口腔和局部递送。任何途径给药的共同要求是有效且传递方便。在一个优选例中，肌肉内施用该组合物。

公开本发明方法的目的是改善慢性HBV感染。这种改善可通过例如用核酸试验测定血液中HBV DNA的减少；用常规试验测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的减少；或用常规试验测定转胺酶的短期突发增高。优选本发明的治疗将导致抗-HBe的出现和HBsAg的同时下降/消失，更优选的是出现抗HBs同时伴有HBs的下降/消失。所有这些都可用常规免疫试验测定。对于本发明而言，正常ALT水平定为女性约6-34IU/L，男性约6-43IU/L。

本文所用的术语“可代谢性油佐剂”指含有对所施用的个体无毒，且可被个体代谢的油性佐剂，该油优选约6-30个碳原子，包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃及其对应的酸和醇、醚或酯，及其混合物。该油可以是任何可被宿主动物机体代谢的植物油、鱼油、动物油或合成制备的油，它们可被施用的宿主动物的身体代谢，对个体无毒。宿主动物通常是哺乳动物，优选是人。矿物油和类似的有毒石油馏出油明确的排除在本发明之外。

植物油的示范性来源包括坚果、种子和谷物。花生油、豆油、椰子油、橄榄油这些最常见的油是坚果油的例子。种子油包括红花油、棉籽油、葵花子油、芝麻油等。在谷物类中，玉米油是最容易得到的，但也可用其他谷物油如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。

获得植物油的技术已得到了良好开发并且是熟知的。这些和其他类似的油的组分可在例如Merck Index和关于食物、营养和食品技术的原材料中找到。

虽然6-10个碳的甘油和1，2-丙二醇的脂肪酸酯在种子油中天然不存在，但它们可通过水解、分离和酯化合适的来自坚果和种子油的起始材料制备。这些产品可以NEOBEE(PVO International INc.，Chemical Specialties Division，416Division Street，Boongon，NJ)的商品名和其他厂商购得。

还可在本发明的佐剂和免疫原性组合物中使用来自任何动物来源的油。动物油和脂肪通常在生理温度下是固态的，因为它们以甘油三酯形式存在，而且比鱼或植物油的饱和度高。然而，可从动物脂肪通过部分或完全皂化甘油三酯(其提供了游离脂肪酸)获得脂肪酸。哺乳动物奶的脂肪和油是可代谢的，因此可用于本发明的实施。从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其他方法是本领域熟知的。

许多鱼含有不难回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡是几种可在本文中使用的鱼油的例子。可以5碳异戊二烯单元生物化学方法合成许多支链油，通常称作萜。鲨鱼肝油含有分枝的不饱和萜，称作鲨烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烷，在本文中是特别优选的。角鲨烯(鲨烯的饱和类似物)也是特别优选的油。鱼油(包括鲨烯和角鲨烯)不难从商品来源获得，或可用本领域已知的方法获得。

这些佐剂和免疫原性组合物的油组分将以约0.5％-20％体积，优选不大于约15％，特别是约1％-12％的量存在。最优选的是采用约1％-4％油。

EP 0 399 843 B1描述了本文所考虑的可代谢性油佐剂，在此引入以供参考。优选佐剂是比专利中和Ott等“MF59，人用疫苗的明智和强大的佐剂的设计和评价”第10章，pp.277-296，Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Michael F.Powell和Mark J.Newman编，Plenum Press，New York，1995(在此引入以供参考)描述的MF59。特别是，MF59如下配制：4.3％w/v的鲨烯、0.5％w/v的Tween 80、0.5％Span 85和400微克/毫升的MTP-PE(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-[1，2-二棕榈基-锡-甘油酯-3-3(羟基磷酰氧基)]乙酰胺)。MF59的作用机制似乎是产生强CD4⁺T细胞应答。

该佐剂还可以含有乳化和/或免疫刺激剂。在药物科学中通常使用许多数量的乳化和悬浮剂。这些包括天然衍生的物质如树胶、植物蛋白质、基于糖的聚合物如海藻酸盐和纤维素等。某些在碳骨架上具有羟基或其他亲水取代基的氧聚合物或聚合物具有表面活性，如聚乙烯吡啶酮、聚乙烯醇和甘油醚基的单或多功能化合物。长链脂肪酸衍生的化合物形成可用于本发明的第三组乳化和悬浮剂。只要无毒，可用前述任何一种表面活性剂。

示范性免疫刺激剂包括能提高宿主免疫力的合成性佐剂，如左旋咪唑和异丙肌苷。左旋咪唑是四咪唑的左旋异构体，其通过T-细胞依赖性机制加强体液和细胞免疫力。异丙肌苷，一种含有肌苷、腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷的嘌呤前体的复合物，能促进T细胞有丝***。促吞噬肽(Tuftsin)，一种4个氨基酸的肽(Thr-Lys-Pro-Arg)与免疫球蛋白(Ig)重链中的一序列同源，主要刺激巨噬细胞。

本文所用的术语“个体”指动物，通常是哺乳动物，优选人。

本文所用的术语“约”指±10％。

本文所用的术语“一个”和“该”指单个或多个。

本文所用的“慢性HBV感染”通常指已持续超过急性阶段的HBV感染。慢性感染可能是儿童或成年期内获得的慢性疾病引起的。疾病引起的慢性感染通常可通过HBSAg的存在和ALT水平的异常，以及伴有或不伴有可检测水平的HBeAg来鉴定。正常的ALT水平通常范围是10-32U/L(女性9-24U/L，婴儿的正常范围是成人的两倍)(网页：On Hepatitis C International，“实验室血液检测”7/10/98修改)。然而慢性感染还包括具有正常ALT的无症状的携带者；开始用抗病毒药物，如干扰素治疗，使病毒降低到可检测水平以下的病人；和肝脏移植后的病人，他们正在继续抗病毒治疗或接受Ig灌注。急性感染后持续超过6个月的HBsAg是慢性感染的特点。已在慢性感染的病人中记录到有抗病毒T细胞应答缺陷(Boni等，J.Clin.Invest.，102(5)：968-975，1998年9月)。

本文所用的术语“抗病毒剂”或“抗病毒化合物”包括但不限于干扰素和核苷类似物，包括拉米夫定。拉米夫定已被用于减少慢性HBV导致的肝脏损伤，可以每个病人可每天口服25-300毫克剂量，直到1年。然而合适的抗病毒药物的剂量将具体取决于如药剂和病人。

已显示含有重组HBV PreS2+S抗原(10微克)和可代谢性水包油佐剂MF59的疫苗能增强其在成年人中的免疫原性(Poland等，37届ICAAC，p.216，1997年9月28日-10月1日)。施用一剂疫苗后，89％测试个体产生了血清保护性抗HBs滴度。100％的测试个体在两次注射后受到保护。另外，PreS2+S/MF59疫苗的几何平均抗体滴度比含有铝作为佐剂的对照疫苗高100倍(Poland等，见上)。本发明人预测可用相似的组合物作为免疫治疗剂治疗慢性HBV感染。

实施例1

制备了含有重组PreS2+S和水包油佐剂MF59的组合物。如下制备了重组PreS2+S。Hyclone提供了全部培养液和补充剂。

通过用两个接头***S+PreS2基因，构建了重组质粒pKSVAdPreS-BglII(图1-2)。构建该重组表达***中使用的克隆载体是Pharmacia的pKSV-10。pKSV-10载体长7.2kb，克隆位点是BglII。如Valenzuela等，Nature，280：815-819，1979年8月30日(在此引入以供参考)所述，分离得到病毒DNA。用HhaI部分消化病毒基因组DNA的约1880个bp的EcoRI/BglII片段，分离得到1230bp的EcoRI/HhaI片段。设计了接头与EcoRI/HhaI片段连接，形成BglII/BglII片段，用于克隆入pKSV-10。然后将pKSV-10/BglII与Pre S BglII/BglII片段连接，得到DNA质粒载体pKSVAdPreS-BglII。然后转化感受态细胞HB101。筛选得到转化株，进行大量制备。

将dhfr序列***pSV7d构建了克隆载体pSV7d/AML-dhfr(Stibbe等，Virology，123：436-442，1989，在此引入以供参考)。用pKSVAPres-BglII和pAML/dhfr共转染DG44(dhgr-)CHO细胞(Urlaub等，PNAS USA，77：4216-4220，1980，从Chiron的Dr.Leslie Rall于1985年9月以传代数约100获得)。然后，在24孔微量滴定板中培养48个克隆。用Abbott ELISA法筛选克隆，用氨甲蝶呤选择扩增命名为PKSVAdPres 16的高产克隆，最终得到克隆PKSVAdPreS 16-12-80-30(缩写为HEP 30细胞)。扩增HEP 30细胞，制备主/工作(Master/Working)细胞库，命名为HBV B30细胞。

克隆HBV B30主细胞库的细胞，在补充了6％透析的FBS和50μM氨甲蝶呤(MTX)的DME/F12培养液中扩增。扩增后通过几步(在3升旋转烧瓶中FBS浓度从6％到2％逐步下降)使细胞适应MTX-DMEM/F12培养液。适应后，将细胞接种在3L的搅拌灌流容器中，用DMEM/F12，2％FBS灌流。

然后将一些灌流细胞在50μM MTX的存在下亚克隆培养于DMEM/F12 10％FBS培养液中，在2％FBS和2μM MTX存在下通过多次振摇烧瓶传代，使其适应于HBV生产培养液。在第14代，测试亚克隆的生产性，以亲本培养物小试管冻存(保藏在Chiron细胞培养物保藏中心，编号为CMCC11336)。将这些细胞中的一些在DM122培养液中融化，然后在补充了200mM L-谷氨酰胺、1mM(1∶500)MTX的DM122培养液中扩增。当细胞密度达到4.0-8.0×10⁵活细胞/毫升时，将细胞在DM122、含10％人血清蛋白(w/v)+7.5％(v/v)DMSO中浓缩到1.0×10⁹，等分到1毫升/试管，产生新的HBV Master细胞库(MBVMK001)。以1℃/分钟将这些细胞冷冻到-96℃，然后储藏在≤-176℃。

如Ott等(见上，在此引入以供参考)所述，制备了作为无菌水包油乳液的MF59。将0.25毫升体积抗原中的10微克PreS2+S与0.25毫升MF59混合，最终剂量是0.5毫升。下文表1和2列出了该疫苗的成分。

                        表1

                      HBV抗原组合物

        成分                        每最终剂量中的量

PreS2+S抗原                         0.02毫克

氯化钠，USP                         3.80毫克

柠檬酸钠，二水合物，USP             2.15毫克

柠檬酸，一水合物，USP               0.04毫克

聚山梨醇酯80(Tween 80^TM)           0.01毫克

注射用水                            足量

pH范围6.0-7.0

                      表2

                MF59佐剂组合物

成分                            每最终剂量中的量

鲨烯                            9.75毫克

聚山梨醇酯80(Tween 80^TM)       1.18毫克

三油酸山梨醇酯(Span 85^TM)      1.18毫克

二水柠檬酸钠，USP               2.15毫克

一水柠檬酸，USP                 0.04毫克

注射用水                        足量

pH6.4

实施例2

将500微升实施例1所述组合物肌肉内注射到13个病人的三角肌中，这些病人通过持续存在HBsAg6个月以上而确定患有慢性HBV。8个病人HBe阳性。全部13个病人血清ALT升高(高于1.2×ULN，即正常上限)，没有代偿失调的肝脏疾病证据。在第0、1、2和6个月给药。通过测定HBV DNA、血清ALT水平降低，HBeAg水平降低，以及第二次给药一个月后出现抗-HBe抗体而确定有效。用bDNA法测定了HBV DNA(Chiron和Chen等，J.Virol.Methods，53(1)：131-7，1995年5月，在此完整引入以供参考)。用如下的化学发光免疫试验测量了HBeAg、抗-HBe、HBsAg和抗HBs水平。另见美国专利号5,395,752，在此引入以供参考。以光密度单位(s/co)报道了结果。

为了测定HBeAg，将100微升血清人抗-HBe的乳液100微升偶联有乳磁性颗粒(600微克/毫升)的混合，37℃培育18分钟。加入100微升与DMAE(二甲基吖啶酯，300 30,000,000相对光单位，“RLU”每毫升)偶联的人抗-HBe，37℃培育18分钟。用缓冲液洗涤该颗粒3次，然后测定化学发光。所用的缓冲液具有下列成分：50mM TRIS，pH8.0；500mM氯化钾；0.09％叠氮化钠；1mM EDTA；0.05％Tween20；和1.75％BSA，巯基修饰，用MILLIPAK-60 0.22微米滤器单位过滤。

为了测定HBsAg，用上述缓冲液1/100稀释100微升血清，将其与100微升偶联于顺磁颗粒(对于抗体浓度分别为280微克/毫升和150微克/毫升)的小鼠抗-HBs(特异性结合HBsAg的抗“a”中和表位)以及与小鼠抗-HBs(抗“a”，75.0纳克/毫升)偶联的(用上述缓冲液稀释)50微升DMAE混合，37℃培育18分钟。用缓冲液洗涤颗粒3次，然后测定化学发光。

为了测定抗-HBe，将50微升血清和100微升重组HBeAG SOD融合蛋白(50纳克/毫升)(见例如Choo等，Science，1989，244，359-362，在此引入以供参考)以及100微升偶联于乳胶磁性颗粒(600微克/毫升)的人抗HBe混合，37℃培育36分钟。加入与DMAE(300×10E 6 RLU/毫升)偶联的100微升人抗-HBe，37℃培育18分钟。用缓冲液洗涤颗粒3次，然后测定化学发光。所用的缓冲液具有下列组分：100mM硼酸缓冲液，pH8.9；0.09％叠氮化钠；5mM EDTA；0.05％TWEEN 20；和0.2％明胶(鱼)，用MILLIPAK-60、0.22微米滤器单元过滤。

用标准酶免疫试验法测定抗-HBs(Abbott)。

在8个最初HBe阳性的病人中，4个在3-4次注射后诱导了HBeAg水平的显著下降和抗-HBe抗体的产生，伴有HBV DNA和血清ALT的下降。图3a-b、图4a-b和图5a-b描述了3个病人的数据。还在几个病人中诱导了抗-HBs抗体的显著水平，包括最初不存在HBe的病人(见例如表3-5，抗-HBs栏)。8个病人中的两个显示血清ALT在研究过程中显著增加。两者都被治愈。

进一步随访后，13个病人中过半产生了抗-HBsAg。4个病人的血清转化成抗HBe，4个血清转化病人中3个变成HBV DNA阴性。

实施例3

将500微升实施例1所述的组合物和100毫克拉米夫定在0时施给病人。实施例所述的另500微升组合物和另100毫克拉米夫定在1个月时施用。测定抗HBs滴度，以及检测第二次给药1个月后HBs的存在，来确定效果。如果可检测的HBs仍然存在，进行第三次给药。重复该过程，直到不再检测到HBs。

实施例4

将100毫克拉米夫定在0时开始施给病人，并每日一剂连续给药。将500微升实施例1所述的组合物在第1、2、3和7月肌肉内注射给病人。测定HBeAg和抗HBe滴度，并在施用实施例1的组合物后1月检测HBV DNA来确定效果。如果仍然存在可检测的HBe，进一步施用实施例1的组合物。如果在再一次给药后1月仍可检测到HBe的存在，进行另一次给药。重复该过程，直到检测不到HBe。

实施例5

将500微升实施例1所述的组合物在0时施给病人。1月时施给该病人100毫克拉米夫定。测定抗HBs滴度，并在施用实施例1的组合物后1月检测HBs和HBe的存在，以确定效果。如果仍然存在可检测的HBs，第二次施用实施例1的组合物。如果仍可检测到HBs或HBe的存在，进行第三次给药。重复该过程，直到检测不到HBs。

实施例6

每日施用100毫克拉米夫定6个月。将500微升实施例1所述的组合物在第7、8、9和13月施给病人。如果存在可检测的HBs或HBe，进一步给药。

实施例7

材料：

ChironHBV/MF59：抗原：CHO细胞产生和纯化的重组HBV PreS2+S(20微克/剂量)。佐剂：MF59，显微液化的水包油乳液。以分开的小管提供抗原和MF59，在注射时混合。肌肉内注射每剂总体积0.5毫升。时间表包括在0-、1-、2-和6-月施用4次(表6)。

拉米夫定(Epivir，Glaxo Wellcome)：病人必须在开始ChironHBV/MF59治疗前已治疗了至少1个月。拉米夫定此后(即第四次注射后1个月)以ChironHBV/MF59治疗前的剂量水平(每日100毫克-300毫克)持续7个月。

效力测定：在本研究结束时，测定具有下列参数的病人比例：HBsAg消失或减少，HBeAg消失和抗HBs或抗HBe血清转化。用ChironHBV/MF59预先治疗后HBV DNA水平和血清ALT/AST的变化将在ChironHBV/MF59治疗期间和之后进行总结。对于本公开内容，所得到的效力数据限于所选的时间点，未进行全面分析。

方法：

将含有重组PreS2+S抗原和MF59的组合物(一种水包油佐剂)，即ChironHBV/MF59)(表2)施给患有慢性HBV感染，接受拉米夫定的病人。病人在0、1、2、6月肌肉内接受4次ChironHBV/MF59注射。病人在ChironHBV/MF59注射的6个月内持续用拉米夫定治疗，并在第四剂后再接受拉米夫定1个月，然后停用拉米夫定。

合格病人包括慢性HBV感染病人(通过至少6个月血清HBsAg阳性和筛选检测HBsAg阳性的历史确定)，其具有代偿性肝脏疾病，正接受拉米夫定或是筛选时开始拉米夫定治疗的候选人。在筛选时用拉米夫定治疗的病人在施用第一剂ChironHBV/MF59前至少接受了拉米夫定治疗一个月。这些病人以其研究前的剂量继续接受拉米夫定(100-300毫克/日)。筛选时未接受拉米夫定治疗的病人开始ChironHBV/MF59之前，至少治疗至少一个月。这些病人以100毫克/日的批准剂量接受拉米夫定。参与病人中排除了根据病史、体检、临床实验室评估或先前肝脏活体检查有证据显示患有代偿性差或晚期肝脏疾病的所有病人。

可能的病人在正式加入研究前1-8周内经历了最初筛选，期间采取了他们的病历、体格检查和血和尿样。在筛检时获得了下列HBV感染的血清学和病毒学参数(定性和定量测定)数据：HBsAg、HBeAg、抗HBs和抗HBe。其他试验包括：肝功能检测(LFT)：ALT、AST、碱性磷酸酶、胆红素(总的和直接)、凝血酶原时间、总蛋白质和白蛋白；全血计数(CBC)；和尿的蛋白质、血液分析和粪便。用聚合酶链式反应(PCR)定量测定HBV DNA水平。如果有证据证明在筛选前或在筛选时(根据提高的HBV DNA水平)有拉米夫定耐药性突变株，排除这类病人。筛选调查时其他临床实验室测试包括：抗HCV抗体、抗HIV抗体和肝炎δ抗体。将这些抗体任一阳性的病人从参加者中排除出去。

除了包括和排除的标准外，在本研究筛选调查时未接受拉米夫定治疗的可能合格病人必须符合下列额外的标准才能合格：血清ALT比正常上限高1.2倍，用bDNA试验测定HBV DNA高于0.7MEq/毫升。筛选调查时收集的血样获得了这些实验值。

符合所有包括标准并且无任何排除标准(包括临床实验测试的结果)的病人回来接受其首次肌肉内注射。每次注射后观察30分钟，观察其是否有局部和全身反应症状。他们填写日记卡片，描述注射后7日的局部(如注射部位疼痛、发热、红斑、硬化等)和全身(如疲劳、不舒服、发热、发冷、肌肉疼痛、关节痛、恶心、头痛、皮疹)反应。病人保持记日记卡片，记录医疗问题和7日期间服的药物。如果在实验中任何时间，病人经历任何可能与治疗相关的不寻常、严重或重度不良事件，让他们立即来诊所就诊。在第二、三和四次注射(如分别为1个月、2个月和6个月)前14日让病人看医生，以在接受下一次注射前进行临床实验测试(LFT、尿分析、肌酸)检查。

第一次注射ChironHBV/MF59七个月后停止施用拉米夫定。在7.5、8、9、10.5个月时病人回医院作临床和实验室随访。

在实验过程中从ChironHBV/MF59开始到最终访问监测所有不良事件(AE)。记录了整个实验中所用的全部处方药物。

病人数量：计划和实际招募为24人。所有病人接受4次ChironHBV/MF59注射。

                    表6

                 注射发生日免疫#1：#免疫的                   24(100％)免疫#2：                  第一次免疫接种后天数平均                      31.7中位数                    28.0标准误差                  11.3最小                      21最大                      66数目                      24免疫#3：                  第一次免疫接种后天数平均                      60.7中位数                    56.0标准误差                  12.4最小                        51最大                        94数目                        24免疫#3：                    第二次免疫接种后天数平均                        29.0中位数                      28.0标准误差                    3.2最小                        23最大                        39数目                        24免疫#4：                    第一次免疫接种后天数平均                        180.0中位数                      180.5标准误差                    9.1最小                        168最大                        198数目                        24免疫#4：                    第二次免疫接种后天数平均                        148.3中位数                      148.0标准误差                    11.4最小                        119最大                        168数目                        24免疫#4：                    第三次免疫接种后天数平均                        119.3中位数                      120.0标准误差                    11.5最小

                表7

     筛选时病人统计和病人特征特征                        病人数目(总共24个病人)HBsAg：阳性                        24(100％)抗HBs：阴性                         20(83％)阳性                         4(17％)HBeAg：阴性                         9(38％)阳性                         14(58％)其他                         1(4％)抗HBe：阴性                         15(65％)阳性                         8(33％)其他                         1(4％)丙肝：阴性                         24(100％)肝炎δ感染：阴性                         24(100％)HIV感染无反应性                     24(100％)ALT(U/L)平均                         69.5中位数                       49.0标准误差                     64.7最小                         17最大                         276数目                         24

结果总结

病人特征和统计：病人平均年龄42岁(27-63岁)。24个病人中20人(83％)男性。13个病人(54％)是亚裔，9(38％)个是高加索人，1人是美国黑人，一人是混血儿。在招募时，14(58％)人HBeAg阳性，而8(33％)人抗HBe阳性(用EIA和Abbott检测)；一个病人的数据未得到，另一个病人两者都是阴性。招募时平均血清ALT水平70IU/L(范围17-276IU/L)(表7)。使用拉米夫定的平均持续时间在接受第一次注射ChironHBV/MF59之前是7.7个月(范围1-33个月)(表7)。24个病人中16人在参加该试验前接受了拉米夫定外的其他治疗。这些治疗包括干扰素(包括干扰素-a和CIFN形式)、法昔洛韦(famciclovir)和乙肝疫苗(CV-1899)(表9)。

在2000年1月1日，所有24名病人接受了全部4次ChironHBV/MF59注射。已跟踪了22名病人中断拉米夫定至少2个月。在这22个病人中，5个病人的数据收集至10.5个月，而两个病人完成了整个研究(第12月)。

                表8

            拉米夫定施用招募前拉米夫定持续时间：        月

平均                        7.67

中位数                      5.35

标准误差                    7.78

最小                        0.9

最大                        33.3

数目                        24使用拉米夫定的总持续时间：       月

平均                        14.46

中位数                      12.25

标准误差                    7.72

最小                        7.6

最大                        40.3

数目                        24

                表9

  试验前除了拉米夫定外的肝炎治疗治疗                        病人干扰素                      101，601，602干扰素α                    201，203，204，208，401，402，403，404，501干扰素(CIFN(共同序列干扰素))202法昔洛韦                    102，602乙肝疫苗(CV-1899)           101，207

临床实验室评价：尽可能广泛的收集了研究前血清ALT水平的历史信息。每个病人所得数据的时间和数量不同。许多病人随着时间变化ALT水平广泛波动，包括在接受拉米夫定前的研究中ALT水平显著提高。在24个病人中，9个记录有研究前肝炎突发加剧的症状，血清ALT水平峰值为700IU/L以上。这9个病人中的ALT水平峰值中位数是1035IU/L，范围是782IU/L-3116IU/L。

血清ALT水平在大部分病人中，在筛选时或在参加研究的最初7个月中正常或稍过高(小于正常上限的2倍)。这可预期到，因为在此期间所有病人都接受拉米夫定。在两个病人(205和601)中，血清ALT水平持续不正常，研究中接受拉米夫定时记录的最高ALT水平分别是112IU/L和119IU/L。两个病人都在接受拉米夫定时用bDNA试验检测到HBV DNA，病人601显示接受拉米夫定时HBV DNA水平显著升高，提示可能产生了拉米夫定耐药性突变株。

表10和11总结了血清ALT水平的数据。表10显示拉米夫定中断后24个病人中22的最高ALT水平，其数据直到最近调查才得到。在10个病人中，最高ALT值低于50IU/L。6个病人的最高ALT值在50-100IU/L之间，5个病人的最高值在101-200IU/L之间，一个病人(502)具有峰ALT值＞200IU/L，峰水平为1870IU/L。在12个最高ALT水平大于50IU/L的病人中，中断拉米夫定后最高的ALT值与招募入该研究之前记录的最高历史值相当(表11)。除了一个病人(502)，所有病人在中断拉米夫定后具有最高ALT水平，其比记录的研究前最高值低(22个病人中的10个)或相当(22个病人中的1个)。

病人502显示拉米夫定中断后早期病毒感染复发，在10.5个月时缓解。中断拉米夫定治疗后一个月(第8个月)，HBV DNA水平升高至511mEq/毫升，ALT水平升高至63IU/L，表明发生了早期病毒感染复发。中断拉米夫定治疗后两个月(第9个月)，病人502的ALT水平峰值为1870IU/L，然而，HBV DNA的水平下降到118mEq/毫升。第9个月后，病人502的ALT水平在10.5个月时稳定下降到46IU/L。

                   表10

       中断拉米夫定后最高Alt水平最高ALT水平(拉米夫定治  病人数          病人编号疗中断后期间)           (N＝22)≤50IU/L                10        101，102，201，202，203，207，403，404，50

                              5,60251IU/L-100IU/L     6    204，206，401，501，503，601101IU/L-200IU/L    5    205，402，504，603，604＞200IU/L          1    502

                        表11拉米夫定治疗中断后最高ALT水平大于50IU/L的病人的研究前最高ALT水

          平和拉米夫定中断后最高ALT水平病人编号    研究前最高血清ALT水平    拉米夫定治疗中断后随访期(N＝12)     (IU/L)                   间血清最高ALT水平(IU/L)204         342                      54205         141                      144206         271                      52401         328                      77402         400                      125501         112                      57502         810                      1870503         62                       53504         924                      167601         339                      69603         299                      130604         285                      155

定量HBV DNA评价：获得有限数量时间点的定量HBV DNA水平数据。三个病人(402、504和601)在接受拉米夫定时HBV DNA显著增加(＞100倍)。这种增加的可能原因是出现了对拉米夫定有耐药性的HBV逃逸突变株。将进行这些样品的HBV基因定型。得到了16个于第8和第9月测定了HBV DNA水平的病人关于在拉米夫定中断治疗后病毒复发的早期信息。这16个病人中，七人(401、403、404、501、503、504、505)在第8或9个月(拉米夫定中断后一或两个月)的HBV DNA水平在bDNA试验检测水平以下。其中一个病人(504)在拉米夫定治疗同时可能产生了逃逸突变株(第7月时HBV DNA水平是577MEq/ml)，但是他在随访期间后来变成HBV DNA阴性。其余9个测定了HBV DNA的病人在中断拉米夫定治疗后具有可检测的HBV DNA。

                         表12

   研究前和末次注射后的最高HBeAg水平和抗HBe水平

         研究前最高水平               研究后最高水平病人

HBeAg(IU/ml)  抗HBe(IU/ml)   HBeAg(IU/ml)  抗HBe(IU/ml)101    16.4          1.6            30.2          1.8102    0.2           9.9            ＜0.1         46.4201    ＜0.1         41.5           ＜0.1         47.0202    ＜0.1         36.9           ＜0.1         24.2203    ＜0.1         5.2            ＜0.1         5.7204    1.0           4.5            1.9           3.2205    ＜0.1         122.6          ＜0.1         137.3206    1.9           5.7            18.4          2.7207    9.7           2.9            18.9          2.4208    3.3           4.6            17.8          2.5401    ＜0.1         44.1           ＜0.1         68.8402    0.2           4.1            0.4           4.2403    ＜0.1         419.7          ＜0.1         355.5404    1.2           5.0            ＜0.1         4.5501    ＜0.1         261.9          ＜0.1         338.2502    1.4           4.3            13.0          2.8503    0.2           62.1           1.1           17.1504    1.9           3.8            3.8           2372.0505    3.1           4.4            ＜0.1         30.7601    14.7          1.8            17.6          1.8602    2.9           4.3            ＜0.1         5.2603    ＜0.1         274.2          ＜0.1         162.0604    ＜0.1         165.1          ＜0.1         205.5

定量HBeAg和抗HBe评价：评价了关于HBeAg和抗HBe水平量的改变的有限数据。用内部EIA测定了HBeAg和抗HBe滴度。内部HBeAg试验的检测下限与商品EIA(Abbott)相等。在14个筛选时HBeAg阳性的病人(即＞0.1)中，4个病人(102、404、505和602)在末次注射后HBeAg低于检测极限。这4个病人中的两个(102和505)抗HBe滴度也显著增加(大于4倍)。

上述实施例是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。本领域技术人员将认识到各修改都在如附加权利要求中举例说明的本发明精神和范围内。

全部参考文献在此引入以供参考。

Claims (21)

1.一种治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括施给个体有效量的组合物，所述组合物含有PreS2+S抗原和可代谢性油佐剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以每剂约5-100微克施用PreS2+S抗原。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以每剂约20微克施用PreS2+S抗原。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原1次以上。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原8次。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原4次。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染改善。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染被消除。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过测定血清组分浓度的降低来确定HBV感染的改善，所述组分选自HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBsAg和HBeAg。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过测定血清组分浓度的增加来确定HBV感染的改善，所述组分选自抗HBs和抗HBe。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，通过测定血清ALT浓度降到正常水平来确定HBV感染的改善。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PreS2+S抗原是在中国仓鼠卵巢细胞中重组产生的。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可代谢性油佐剂是MF59。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括施用抗病毒药物或化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒药物是拉米夫定。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定约100-300毫克。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定约100毫克。

18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒药物在施用PreS2+S抗原前至少施用一个月。

19.一种治疗慢性乙型肝炎感染的药盒，其特征在于，该药盒包括一种含有重组PreS2+S抗原的组合物，所述药盒还含有抗病毒药物或化合物，和含有可代谢性油佐剂的组合物。

20.如权利要求20所述的药盒，其特征在于，所述可代谢性油佐剂是MF59。

21.如权利要求19或20任一项所述的药盒，其特征在于，重组PreS2+S抗原在中国仓鼠卵巢细胞中产生。

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