CH704227B1

CH704227B1 - Method for obtaining reprogrammed target cells.

Info

Publication number: CH704227B1
Application number: CH00524/12A
Authority: CH
Inventors: Ilham Mohammed Saleh Saeed Abuljadayel
Original assignee: Tristem Trading Cyprus Ltd
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2015-05-15
Also published as: JP6073135B2; EP2490702A1; IL218902A0; RU2635317C2; KR101766203B1; TN2012000157A1; AU2009354350B2; RU2012120713A; AU2009354350A1; KR20120099686A; CN102647989A; UA109265C2; WO2011048350A1; CA2781522A1; CU20120063A7; JP2013508343A; IL218902A; MX2012004522A; CU24006B1; MA33740B1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production qui comporte de cellules cibles reprogrammées, par un procédé qui comprend: portant de cellules déterminées, la trans-différenciation de ces cellules pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées, pour l’administration des cellules cibles trans-différenciées à un patient. Les cellules cibles trans-différenciées réparent ou régénèrent du tissu ou des cellules chez le patient.The present invention relates to a production method which comprises reprogrammed target cells, by a method which comprises: carrying specific cells, the trans-differentiation of these cells to obtain trans-differentiated target cells, for the administration of trans target cells -differentiated to a patient. The trans-differentiated target cells repair or regenerate tissue or cells in the patient.

Description

Description Description

References References

[0001 ] Tous les documents cités ou référencés dans les documents cités ici, en même temps que les instructions, descriptions, spécifications de produits, et fiches de produits de fabricants, pour tout produit mentionné ici ou dans tout document incorporé ici à titre de référence, sont ainsi incorporés ici à titre de référence, et peuvent être utilisés dans la mise en pratique de la présente invention. [0001] All documents cited or referenced in the documents cited here, together with the instructions, descriptions, product specifications, and product sheets from manufacturers, for any product mentioned here or in any document incorporated here by way of reference , are thus incorporated herein by reference, and may be used in the practice of the present invention.

Domaine de la présente invention Field of the present invention

[0002] La présente invention peut être utilisée pour traiter divers troubles, maladies ou états chez un patient en utilisant des cellules reprogrammées, comme des cellules rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées. Le procédé comporte, portant de cellules déterminées, la rétro-différenciation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles rétro-différenciées. Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend, portant de cellules déterminées, la transdifférenciation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées. Les cellules cibles rétro-différenciées ou trans-différenciées réparent ou régénèrent du tissu ou des cellules chez le patient. [0002] The present invention can be used to treat various disorders, diseases or conditions in a patient using reprogrammed cells, such as retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated cells. The method comprises, carrying determined cells, the retro-differentiation of the determined cells to obtain retro-differentiated target cells. In some embodiments, the method comprises, carrying determined cells, transdifferentiating the determined cells to obtain trans-differentiated target cells. The retro-differentiated or trans-differentiated target cells repair or regenerate tissue or cells in the patient.

Arrière-plan technologique Technological background

[0003] Des cellules souches sont caractérisées par leur aptitude à se renouveler elles-mêmes par une division cellulaire mitotique, et à se différencier dans une gamme diverse de types de cellules spécialisées. Les deux grands types de cellules souches de mammifères sont des cellules souches embryonnaires, qui sont isolées de la masse de cellules internes de blastocystes, et des cellules souches adultes que l’on trouve dans des tissus adultes. Lors du développement d’un embryon, les cellules souches peuvent se différencier en tout tissu embryonnaire spécifique. Dans des organismes adultes, des cellules souches et des cellules progénitrices régénèrent des cellules spécifiques, et maintiennent la rotation normale d’organes régénérables, comme le sang, la peau ou des tissus intestinaux. [0003] Stem cells are characterized by their ability to renew themselves through mitotic cell division, and to differentiate into a diverse range of specialized cell types. The two main types of mammalian stem cells are embryonic stem cells, which are isolated from the mass of internal blastocyst cells, and adult stem cells, which are found in adult tissue. During the development of an embryo, stem cells can differentiate into any specific embryonic tissue. In adult organisms, stem cells and progenitor cells regenerate specific cells, and maintain the normal rotation of regenerable organs, such as blood, skin or intestinal tissue.

[0004] Les cellules souches sont abondantes lors du développement d’un embryon, bien que la quantité de cellules souches diminue lorsque le développement progresse. Au contraire, un organisme adulte contient un nombre limité de cellules souches qui sont confinées dans certains compartiments du corps. [0004] Stem cells are abundant during the development of an embryo, although the amount of stem cells decreases as development progresses. On the contrary, an adult organism contains a limited number of stem cells which are confined to certain compartments of the body.

[0005] Les applications thérapeutiques de cellules souches ont pour potentiel de modifier des traitements pour de multiples maladies ou troubles. Bien que certaines thérapies par cellules souches adultes, comme des greffes de moelle osseuse, existent déjà, les chercheurs en médecine anticipent l’utilisation de cellules souches pour traiter une plus large variété de maladies, y compris le cancer, la maladie de Parkinson, des blessures de la moelle épinière, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose en plaques, et des troubles musculaires, entre autres. De telles thérapies tirent avantage de la capacité des cellules souches à se différencier en types de cellules qui sont nécessaires pour traiter la maladie. [0005] Therapeutic applications of stem cells have the potential to modify treatments for multiple diseases or disorders. Although some adult stem cell therapies, such as bone marrow transplants, already exist, medical researchers anticipate the use of stem cells to treat a wider variety of diseases, including cancer, Parkinson's disease, spinal cord injuries, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, and muscle disorders, among others. Such therapies take advantage of the ability of stem cells to differentiate into cell types that are needed to treat disease.

[0006] Cependant, il existe une incertitude concernant le succès d’un traitement de telles maladies en utilisant des cellules souches, de même que des problèmes concernant la facilité d’obtention des cellules souches. Par exemple, des cellules souches hématopoïétiques sont extraites habituellement par isolement depuis la moelle épinière, du sang périphérique mobilisé par facteur de croissance, ou du sang de cordon ombilical (placenta). Des cellules souches hématopoïétiques peuvent également être préparées à partir de cellules souches embryonnaires (ES), qui sont extraites à partir d’embryons obtenus en utilisant des techniques de fécondation in vitro. Cependant, une extraction depuis ces sources est lourde et parfois dangereuse, et peut devoir faire face à des problèmes éthiques. En outre, le nombre de cellules souches qui peuvent être obtenues par ces sources est limité. De plus, les cellules souches peuvent rencontrer une difficulté à se différencier en cellules nécessaires pour traiter la maladie. [0006] However, there is uncertainty regarding the success of treating such diseases using stem cells, as well as concerns regarding the ease of obtaining stem cells. For example, hematopoietic stem cells are usually extracted by isolation from the spinal cord, peripheral blood mobilized by growth factor, or umbilical cord (placenta) blood. Hematopoietic stem cells can also be prepared from embryonic stem cells (ES), which are extracted from embryos obtained using in vitro fertilization techniques. However, extraction from these sources is cumbersome and sometimes dangerous, and may face ethical issues. In addition, the number of stem cells that can be obtained from these sources is limited. Additionally, stem cells may have difficulty differentiating into cells needed to treat the disease.

Résumé de la présente invention Summary of the present invention

[0007] La présente invention concerne un procédé pour obtenir des cellules reprogrammées pour réparer du tissu, ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient. Par exemple, la présente invention peut permettre l'utilisation de cellules rétro-différenciées, obtenues par rétro-différenciation de cellules différenciées ou déterminées, pour réparer du tissu ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient. La présente invention peut permettre également l'utilisation de cellules trans-différenciées, obtenues par trans-différenciation de cellules différenciées ou déterminées, pour réparer du tissu ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient. The present invention relates to a method for obtaining reprogrammed cells to repair tissue, or regenerate tissue or cells in a patient. For example, the present invention may allow the use of retro-differentiated cells, obtained by retro-differentiation of differentiated or determined cells, to repair tissue or regenerate tissue or cells in a patient. The present invention can also allow the use of trans-differentiated cells, obtained by trans-differentiation of differentiated or determined cells, to repair tissue or regenerate tissue or cells in a patient.

[0008] La demande est basée, en partie, sur la découverte par le demandeur que des cellules déterminées ou somatiques obtenues depuis un patient peuvent être reprogrammées pour avoir pour résultat des cellules de lignages différents, et ces cellules reprogrammées peuvent être administrées au patient pour réparer ou régénérer des tissus ou des cellules. Des exemples du processus de reprogrammation comportent une rétro-différenciation et une trans-différenciation. [0008] The application is based, in part, on the discovery by the applicant that determined or somatic cells obtained from a patient can be reprogrammed to result in cells of different lineages, and those reprogrammed cells can be administered to the patient for repair or regenerate tissues or cells. Examples of the reprogramming process include retro-differentiation and trans-differentiation.

[0009] Par conséquent, les demandeurs ont découvert que des cellules déterminées peuvent subir une reprogrammation pour avoir comme résultat des cellules d’un lignage différent. Par exemple, des cellules déterminées peuvent subir une rétro-différenciation pour avoir comme résultat des cellules rétro-différenciées, c’est-à-dire des cellules qui sont moins différenciées, comme des cellules souches pluripotentes, et que ces cellules souches rétro-différenciées peuvent être [0009] Therefore, applicants have discovered that particular cells can be reprogrammed to result in cells of a different lineage. For example, particular cells can undergo reverse differentiation to result in retro-differentiated cells, that is, cells that are less differentiated, such as pluripotent stem cells, and that these retro-differentiated stem cells can be

2 administrées au patient pour réparer ou régénérer des tissus ou cellules. Comme autre exemple, des cellules déterminées obtenues chez un patient peuvent subir une trans-différenciation pour avoir comme résultat des cellules trans-différenciées, c’est-à-dire des cellules d’un lignage différent de celui des cellules déterminées, et que ces cellules trans-différenciées peuvent être administrées au patient, pour réparer ou régénérer des tissus ou des cellules. 2 administered to the patient to repair or regenerate tissues or cells. As another example, specific cells obtained from a patient may undergo trans-differentiation to result in trans-differentiated cells, i.e. cells of a different lineage from that of the determined cells, and these Trans-differentiated cells can be administered to the patient, to repair or regenerate tissues or cells.

[0010] La présente invention peut être utilisée également dans un procédé de réparation ou de régénération d’un tissu ou de cellules d’un lignage cellulaire chez un patient en administrant au patient des cellules reprogrammées, en particulier, dans un procédé pour réparer ou régénérer du tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) rétro-différencier les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles rétro-différenciées, et (iii) administrer les cellules cibles rétro-différenciées au patient, dans lequel les cellules cibles rétro-différenciées se redifférencient en cellules du lignage cellulaire. Ces cellules redifférenciées peuvent avoir le même lignage cellulaire que les cellules déterminées, ou un lignage différent. The present invention can also be used in a method of repairing or regenerating a tissue or cells of a cell line in a patient by administering to the patient reprogrammed cells, in particular, in a method for repairing or regenerating tissue or cells of a cell lineage in a patient, comprising the steps of (i) obtaining determined cells, (ii) back-differentiating the determined cells to obtain back-differentiated target cells, and (iii) administering the retro-differentiated target cells to the patient, wherein the retro-differentiated target cells redifferentiate into cells of the cell lineage. These redifferentiated cells may have the same cell lineage as the determined cells, or a different lineage.

[0011 ] La présente invention peut être utilisée également dans un procédé pour réparer ou régénérer un tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) trans-différencier les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées, et (iii) administrer les cellules cibles trans-différenciées au patient. The present invention can also be used in a method for repairing or regenerating a tissue or cells of a cell lineage in a patient, comprising the steps of (i) obtaining determined cells, (ii) trans-differentiating cells determined to obtain trans-differentiated target cells, and (iii) administering the trans-differentiated target cells to the patient.

[0012] Dans certains modes de réalisation, le patient peut souffrir d’une maladie, d’un trouble ou d’un état comprenant, mais sans s’y limiter, une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie β, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, la sclérose en plaques, une insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, des blessures de la colonne vertébrale, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, une dystrophie cristalline/cécité, le diabète, et la stérilité. Ainsi, dans certains modes de réalisation, les cellules reprogrammées peuvent être des cellules de moelle osseuse qui traitent une anémie aplasique, la leucémie, un lymphome, ou le virus d’immunodéficience humaine (VIH) chez le patient. [0012] In some embodiments, the patient may suffer from a disease, disorder or condition including, but not limited to, bone marrow failure, hematological conditions, aplastic anemia , β-thalassemia, diabetes, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, spinal cord injury, muscular dystrophy, kidney disease, multiple sclerosis, congestive heart failure, hepatitis virus C, HIV virus, head trauma, spinal injury, lung disease, depression, non-obstructive azoospermia, andropause, menopause and infertility, rejuvenilization, scleroderma ulcers, psoriasis, wrinkles, cirrhosis of the liver, autoimmune disease, alopecia, retinitis pigmentosa, crystal dystrophy / blindness, diabetes, and infertility. Thus, in some embodiments, the reprogrammed cells can be bone marrow cells which treat aplastic anemia, leukemia, lymphoma, or human immunodeficiency virus (HIV) in the patient.

[0013] Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées, telles que des cellules rétro-différenciées, des cellules cibles trans-différenciées, ou des cellules différenciées peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules germinales pluripotentes, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches neuronales, des cellules souches épithéliales, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules souches endodermiques et neuroectodermiques, des cellules germinales, des cellules souches extra-embryonnaires et embryonnaires, des cellules du rein, des cellules épithéliales alvéolaires, des cellules endodermiques, des neurones, des cellules ectodermiques, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des ovocytes, des spermatozoïdes, des cellules hématopoïétiques, des hépatocytes, de la peau/ des cellules de kératine, des mélanocytes, des cellules osseuses/ostéocytes, des cellules auditives internes/du bulbe épineux, des cellules de cartilage/chondrocytes, des cellules grasses/adipocytes, des cellules squeletto-musculaires, des cellules endothéliales, des cellules du muscle cardiaque/cardiomyocytes, et des tropoblastes. [0013] In certain embodiments, the reprogrammed target cells, such as retro-differentiated cells, trans-differentiated target cells, or differentiated cells can include, but are not limited to, pluripotent stem cells, cells pluripotent germ cells, hematopoietic stem cells, neuronal stem cells, epithelial stem cells, mesenchymal stem cells, endodermal and neuroectodermal stem cells, germ cells, extraembryonic and embryonic stem cells, kidney cells, cells alveolar epithelial, endodermal cells, neurons, ectodermal cells, islets of Langerhans, acinar cells, oocytes, sperm, hematopoietic cells, hepatocytes, skin / keratin cells, melanocytes, cells bone / osteocytes, internal auditory cells / spinous bulb, cartilage cells / chondrocytes, fat cells / adipocytes, skeletal muscle cells, endothelial cells, cardiac muscle cells / cardiomyocytes, and tropoblasts.

[0014] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont obtenues depuis du sang ou des tissus concernés, y compris la moelle épinière. Les cellules déterminées peuvent être obtenues à partir du sang complet, et/ou peuvent être obtenues par aphérèse. Le sang peut être du sang mobile ou immobile. De telles cellules déterminées comportent, mais ne sont pas limitées à celles-ci, des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des mégacaryocytes, des monocytes, des érythrocytes, des granulocytes, des mastocytes, des lymphocytes, des leucocytes, des plaquettes, des globules rouges. En variante, les cellules déterminées peuvent être obtenues depuis du tissu neuronal provenant du système nerveux central ou du système nerveux périphérique, du tissu musculaire, ou du tissu épidermique et/ou dermique provenant de la peau. [0014] In some embodiments, the determined cells are obtained from blood or from relevant tissues, including the spinal cord. The determined cells can be obtained from whole blood, and / or can be obtained by apheresis. The blood can be mobile or immobile blood. Such specific cells include, but are not limited to, T cells, B cells, eosinophils, basophils, neutrophils, megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, granulocytes, mast cells, lymphocytes , leukocytes, platelets, red blood cells. Alternatively, the determined cells may be obtained from neural tissue from the central nervous system or the peripheral nervous system, muscle tissue, or epidermal and / or dermal tissue from the skin.

[0015] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont obtenues depuis le sang ou le tissu d’un patient. Dans certains modes de réalisation, le patient chez lequel les cellules déterminées sont obtenues, et auquel les cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées ou des cellules cibles trans-différenciées, sont administrées, est le même patient. [0015] In some embodiments, the determined cells are obtained from the blood or tissue of a patient. In some embodiments, the patient in whom the determined cells are obtained, and to whom the reprogrammed target cells, such as retro-differentiated target cells or trans-differentiated target cells, are administered is the same patient.

[0016] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont rétro-différenciées en mettant en contact les cellules déterminées avec un agent. Par exemple, les cellules déterminées peuvent être mises en incubation avec l’agent. Dans certains modes de réalisation, l’agent coopère avec un récepteur qui sert de milieu à la capture, la reconnaissance ou la présentation d’un antigène à la surface des cellules déterminées. Le récepteur peut être un antigène MHC de classe I ou un antigène MHC de classe II. Dans certains modes de réalisation, l’antigène de classe I est un récepteur HLA-A, un récepteur HLA-B, un récepteur HLA-C, un récepteur HLA-E, un récepteur HLA-F ou un récepteur HLA-G, et ledit antigène de classe II est un récepteur HLA-DM, un récepteur HLA-DP, un récepteur HLA-DQ ou un récepteur HLA-DR. [0016] In some embodiments, the determined cells are retro-differentiated by bringing the determined cells into contact with an agent. For example, the determined cells can be incubated with the agent. In some embodiments, the agent cooperates with a receptor which serves as a medium for the capture, recognition or presentation of an antigen on the surface of determined cells. The receptor can be an MHC class I antigen or an MHC class II antigen. In some embodiments, the class I antigen is an HLA-A receptor, an HLA-B receptor, an HLA-C receptor, an HLA-E receptor, an HLA-F receptor, or an HLA-G receptor, and said class II antigen is an HLA-DM receptor, an HLA-DP receptor, an HLA-DQ receptor or an HLA-DR receptor.

[0017] Dans certains modes de réalisation, l’agent peut être un anticorps lié au récepteur, comme un anticorps monoclonal lié au récepteur. Dans certains modes de réalisation, l’anticorps est un anticorps monoclonal CR3/43 ou un anticorps monoclonal TAL 1 B5. Dans des modes de réalisation supplémentaires, l’agent module l’expression de gène MHC, comme l’expression de gène MHC de classe Γ et/ou l’expression de gène MHC de classe ll<+>. [0017] In some embodiments, the agent may be an antibody bound to the receptor, such as a monoclonal antibody bound to the receptor. In some embodiments, the antibody is a CR3 / 43 monoclonal antibody or a TAL 1 B5 monoclonal antibody. In additional embodiments, the agent modulates MHC gene expression, such as MHC class Γ gene expression and / or MHC class II <+> gene expression.

3 [0018] Dans certains modes de réalisation, les cellules rétro-différenciées peuvent subir une différenciation dans une étape séparée. Par exemple, les cellules rétro-différenciées peuvent être redifférenciées en mettant en contact les cellules rétro-différenciées avec des facteurs de croissance comprenant, mais sans s’y limiter, un facteur de croissance de fibroblastes basique, un facteur de croissance épidermique, un facteur de croissance hématopoïétique de macrophages-granulocytes, un facteur de cellules souches, des interleukines-1 , -3, -6, et -7, un facteur de croissance de fibroblastes basique, un facteur de croissance épidermique, un facteur de croissance hématopoïétique de granulocytes-macrophages, un facteur de croissance hématopoïétique de granulocytes, de l’érythropoïétine, un facteur de croissance de cellules souches et des protéines morphogénétiques osseuses. Les cellules cibles redifférenciées résultantes peuvent ensuite être administrées à un patient. [0018] In some embodiments, the retro-differentiated cells can undergo differentiation in a separate step. For example, retro-differentiated cells can be redifferentiated by contacting retro-differentiated cells with growth factors including, but not limited to, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor, macrophage-granulocyte hematopoietic growth factor, stem cell factor, interleukins-1, -3, -6, and -7, basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor, hematopoietic granulocyte growth factor -macrophages, hematopoietic granulocyte growth factor, erythropoietin, stem cell growth factor and bone morphogenetic proteins. The resulting redifferentiated target cells can then be administered to a patient.

[0019] Dans des modes de réalisation de la présente invention, les cellules déterminées peuvent être trans-différenciées en mettant en culture les cellules déterminées dans des conditions de culture particulière. Par exemple, les cellules déterminées peuvent être mises en culture dans des types particuliers de milieux de culture en association avec les agents de rétro-différenciation. Des exemples de ces milieux de culture peuvent comprendre du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), du milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (IMDM), etc. Ces milieux de culture peuvent également comprendre un agent promoteur de différenciation comme des vitamines et/ou des suppléments minéraux, de l’hydrocortisone, de la déxaméthasone, du β-mercaptoéthanol, etc. De plus, des conditions de culture supplémentaires comprennent l’utilisation de chélateurs ou d’antibiotiques, une culture à certaines températures ou certains niveaux de dioxyde de carbone ou d’oxygène, et une culture dans certains récipients. Les conditions de culture peuvent déterminer le type de cellules cibles trans-différenciées en résultant. [0019] In embodiments of the present invention, the determined cells can be trans-differentiated by culturing the determined cells under particular culture conditions. For example, the determined cells can be cultured in particular types of culture media in combination with retro-differentiation agents. Examples of such culture media may include Dulbecco's Modified Minimum Essential Eagle's Medium (DMEM), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), etc. These culture media can also include a differentiation promoter such as vitamins and / or mineral supplements, hydrocortisone, dexamethasone, β-mercaptoethanol, etc. Additionally, additional growing conditions include the use of chelators or antibiotics, cultivation at certain temperatures or levels of carbon dioxide or oxygen, and cultivation in certain vessels. Culture conditions can determine the type of trans-differentiated target cells resulting.

[0020] Un aspect de la présente invention est par conséquent un procédé d’obtention de cellules cibles. Le procédé comporte la reprogrammation des cellules déterminées. Ces processus sont décrits dans cette demande. Dans certains modes de réalisation, le procédé peut comporter la rétro-différenciation de cellules déterminées. Dans d’autres modes de réalisation, le procédé peut comporter la trans-différenciation de cellules déterminées. Dans encore d’autres modes de réalisation, le procédé peut comporter la rétro-différenciation de cellules déterminées, et ensuite la redifférenciation des cellules rétro-différenciées, [0020] One aspect of the present invention is therefore a method of obtaining target cells. The method involves reprogramming the determined cells. These processes are described in this request. In some embodiments, the method may include retro-differentiating selected cells. In other embodiments, the method can include the trans-differentiation of selected cells. In yet other embodiments, the method may include retro-differentiation of determined cells, and then redifferentiation of the retro-differentiated cells,

[0021 ] Un autre aspect est l’utilisation d’une ou plusieurs cellules cibles reprogrammées dans la préparation d’un médicament pour réparer ou régénérer un tissu ou des cellules d’un lignage de cellules chez un patient, ou pour traiter une maladie ou une blessure de tissu Another aspect is the use of one or more reprogrammed target cells in the preparation of a medicament for repairing or regenerating tissue or cells of a cell lineage in a patient, or for treating disease or tissue injury

[0022] Un procédé pour traiter une maladie ou une blessure tissulaire chez un patient en ayant besoin est également décrit. Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’obtention de cellules déterminées, la reprogrammation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles reprogrammées, et l’administration des cellules cibles reprogrammées au patient. Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles peuvent être reprogrammées via une rétro-différenciation, trans-différenciation et/ou redifférenciation. Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules cibles sont des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles transdifférenciées et/ou des cellules cibles redifférenciées. Les processus pour obtenir les cellules déterminées et reprogrammer les cellules déterminées sont tels que décrits dans la présente demande. [0022] A method for treating tissue disease or injury in a patient in need thereof is also described. In some embodiments, the method includes obtaining determined cells, reprogramming the determined cells to obtain reprogrammed target cells, and administering the reprogrammed target cells to the patient. In some embodiments, target cells can be reprogrammed via retro-differentiation, trans-differentiation and / or redifferentiation. In particular embodiments, the target cells are retro-differentiated target cells, transdifferentiated target cells and / or redifferentiated target cells. The processes for obtaining the determined cells and reprogramming the determined cells are as described in the present application.

[0023] Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles transdifférenciées ou des cellules cibles redifférenciées, peuvent être administrées via une injection, implantation ou perfusion. Ces cellules peuvent être administrées par injection parentérale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intraoculaires, orale, ou transdermique, ou par injection dans du liquide rachidien. Dans certains modes réalisation, les cellules cibles rétro-différenciées ou les cellules cibles trans-différenciées sont administrées dans une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique peut comprendre les cellules cibles rétro-différenciées ou les cellules cibles trans-différenciées, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. [0023] In some embodiments, the reprogrammed target cells, such as retro-differentiated target cells, transdifferentiated target cells, or redifferentiated target cells, can be administered via injection, implantation, or infusion. These cells can be administered by parenteral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraocular, oral, or transdermal injection, or by injection into spinal fluid. In some embodiments, the retro-differentiated target cells or the trans-differentiated target cells are administered in a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition can comprise the retro-differentiated target cells or the trans-differentiated target cells, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.

[0024] Un aspect de la présente invention est la composition pharmaceutique pour administrer les cellules cibles reprogrammées, comme des cibles rétro-différenciées ou des cellules cibles trans-différenciées. La composition pharmaceutique peut comporter un ou plusieurs types de cellules cibles, et au moins un porteur pharmaceutiquement acceptable. Facultativement, la composition pharmaceutique peut comprendre des adjuvants et/ou d’autres excipients adaptés pour une administration à un patient. [0024] One aspect of the present invention is the pharmaceutical composition for delivering reprogrammed target cells, such as retro-differentiated targets or trans-differentiated target cells. The pharmaceutical composition may include one or more types of target cells, and at least one pharmaceutically acceptable carrier. Optionally, the pharmaceutical composition can include adjuvants and / or other excipients suitable for administration to a patient.

[0025] Un autre aspect de la présente invention est un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) reprogrammer les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles reprogrammées, et (iii) facultativement, combiner les cellules cibles reprogrammées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées sont combinées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Dans d’autres modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées ne sont pas combinées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Les processus pour obtenir des cellules déterminées et reprogrammer les cellules déterminées sont tels que décrits dans la présente demande. Another aspect of the present invention is a method of preparing a pharmaceutical composition or a medicament, comprising the steps of (i) obtaining determined cells, (ii) reprogramming the determined cells to obtain cells. reprogrammed targets, and (iii) optionally, combining the reprogrammed target cells with one or more pharmaceutical excipients. In some embodiments, the reprogrammed target cells are combined with one or more pharmaceutical excipients. In other embodiments, the reprogrammed target cells are not combined with one or more pharmaceutical excipients. The processes for obtaining determined cells and reprogramming the determined cells are as described in the present application.

[0026] On doit noter que dans cette description, et en particulier dans les revendications et/ou des paragraphes, des termes comme «comporte», «compris», «comportant» et analogues, peuvent avoir la signification qui leur est attribuée dans la loi américaine sur les brevets; ils peuvent ainsi signifier «inclut», «inclus», «incluant», et analogues; et que des It should be noted that in this description, and in particular in the claims and / or paragraphs, terms such as "comprises", "included", "comprising" and the like, may have the meaning assigned to them in the US patent law; they can thus mean "includes", "included", "including", and the like; and that

4 termes comme «consistant essentiellement en» et «constitué essentiellement de» ont la signification qui leur est attribuée dans la loi américaine sur les brevets, par exemple, ils autorisent des éléments qui ne sont pas indiqués explicitement, mais excluent des éléments que l’on trouve dans la technique antérieure, ou qui affectent une caractéristique basique ou nouvelle de la présente invention. Terms such as "consisting essentially of" and "consisting essentially of" have the meanings ascribed to them in United States patent law, for example, they allow elements which are not explicitly stated, but exclude elements which the found in the prior art, or which affect a basic or novel feature of the present invention.

[0027] Ces modes de réalisation ainsi que d’autres sont décrits ou apparaissent dans la description détaillée qui suit, et sont soutenus par celle-ci. [0027] These and other embodiments are described or appear in the following detailed description, and are supported by it.

Brève description des dessins Brief description of the drawings

[0028] La description détaillée qui suit, donnée uniquement à titre d’exemple, mais non prévue pour limiter la présente invention, des modes spécifiques de réalisation décrits, peut être comprise en association avec les dessins annexés, sur lesquels: The following detailed description, given only by way of example, but not intended to limit the present invention, of the specific embodiments described, can be understood in conjunction with the accompanying drawings, in which:

5 des cellules reprogrammées autologues (vues inférieures), les ventricules présentent une diminution des paramètres d’atrophie du cerveau comme une réduction de ventricule et une dilatation du sillon, avec une amélioration de l’hématome. In autologous reprogrammed cells (lower views), the ventricles show a decrease in brain atrophy parameters such as ventricular reduction and sulcus dilation, with improvement in hematoma.

La fig. 19b représente des vues d’IRM supplémentaires du cerveau du patient avant (vues supérieures) et après (vues inférieures) traitement. Fig. 19b shows additional MRI views of the patient's brain before (upper views) and after (lower views) treatment.

La fig. 20 représente des radiographies pulmonaires d’un patient souffrant d’une maladie des poumons avant (radiographie de gauche) et après (radiographie de droite) un traitement avec des cellules reprogrammées autologues. Après traitement, le patient présente une amélioration du volume des poumons et une réduction de la dimension de la lésion, comme indiqué par une diminution des zones hypodenses. Fig. 20 shows chest x-rays of a patient with lung disease before (left x-ray) and after (right x-ray) treatment with autologous reprogrammed cells. After treatment, the patient presents an improvement in the volume of the lungs and a reduction in the size of the lesion, as indicated by a decrease in hypodense areas.

La fig. 21 montre des niveaux d’hormones sexuelles, pour l’hormone de stimulation folliculaire (fsh), la lutéostimuline (1 h), la progestérone (pro), et la testostérone (test,) chez des patients souffrant d’une azoospermie non obstructive, et traités avec des cellules reprogrammées autologues. Les niveaux montrent une augmentation importante de testostérone libre avec une augmentation de la dimension des testicules (données non indiquées), déterminée par ultrasons. Fig. 21 shows levels of sex hormones, for follicular stimulating hormone (fsh), luteostimulin (1 h), progesterone (pro), and testosterone (test,) in patients with non-obstructive azoospermia , and treated with autologous reprogrammed cells. The levels show a significant increase in free testosterone with an increase in the size of the testes (data not shown), determined by ultrasound.

La fig. 22 montre une sensibilité rétinienne et une déficience visuelle chez un patient souffrant d’une vision défectueuse avant (partie supérieure) et après (partie inférieure) traitement avec des cellules reprogrammées autologues. Dans les résultats de sensibilité rétinienne, la zone orange indique une sensibilité rétinienne diminuée. Dans les résultats de déficience visuelle, les zones blanches indiquent une vision normale, et les zones rose, orange et noire indiquent une déficience visuelle accrue. Après traitement, le patient ressent une amélioration de son champ visuel, les zones orange dans les résultats de sensibilité rétinienne avant traitement étant devenues vertes, et blanches après traitement, et les zones noires dans les résultats de déficience visuelle avant traitement étant devenues blanches après traitement. Fig. 22 shows retinal sensitivity and visual impairment in a patient with impaired vision before (upper part) and after (lower part) treatment with autologous reprogrammed cells. In retinal sensitivity results, the orange area indicates decreased retinal sensitivity. In visual impairment results, white areas indicate normal vision, and pink, orange, and black areas indicate increased visual impairment. After treatment, the patient feels an improvement in their visual field, with the orange areas in the pre-treatment retinal sensitivity results turning green, and white after treatment, and the black areas in the pre-treatment visual impairment results having turned white after treatment. .

Description détaillée Définitions Detailed Description Definitions

[0029] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellules déterminées» indique des cellules qui affichent un caractère différencié. Ces cellules sont souvent considérées comme matures et spécifiques. Des exemples comprennent des globules blancs, des globules rouges, des cellules épithéliales, des neurones, et des chondrocytes. [0029] As used herein, the term "specific cells" denotes cells which display a differentiated trait. These cells are often considered mature and specific. Examples include white blood cells, red blood cells, epithelial cells, neurons, and chondrocytes.

[0030] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellule indéterminée» indique des cellules qui n’affichent pas un caractère mature différencié. Ces cellules sont souvent considérées comme immatures et non spécifiques. Un exemple d’une cellule indéterminée est une cellule souche, qui est une cellule immature qui est capable d’un auto-renouvellement (division sans limite) et d’une différenciation (spécialisation). [0030] As used herein, the term "indeterminate cell" denotes cells which do not display a mature differentiated trait. These cells are often considered immature and nonspecific. An example of an indeterminate cell is a stem cell, which is an immature cell that is capable of self-renewal (unlimited division) and differentiation (specialization).

[0031 ] Tel qu’utilisé ici, le terme «reprogrammation» indique un processus par lequel une cellule déterminée d’un premier lignage cellulaire est transformée en une cellule d’un type de cellule différent. Ce type de cellule différent peut être d’un lignage cellulaire différent. Une reprogrammation peut survenir par des processus comme une rétro-différenciation, une trans-différenciation ou une redifférenciation. [0031] As used herein, the term "reprogramming" indicates a process by which a specific cell of a first cell line is transformed into a cell of a different cell type. This different type of cell may be from a different cell lineage. Reprogramming can occur through processes such as retro-differentiation, trans-differentiation, or redifferentiation.

[0032] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellule reprogrammée» est une cellule qui a subi une reprogrammation d’une cellule déterminée. Une cellule reprogrammée peut comprendre une cellule rétro-différenciée, une cellule transdifférenciée et/ou une cellule redifférenciée. [0032] As used herein, the term "reprogrammed cell" is a cell that has undergone reprogramming of a particular cell. A reprogrammed cell can include a retro-differentiated cell, a transdifferentiated cell and / or a redifferentiated cell.

[0033] Tel qu’utilisé ici, le terme «rétro-différenciation» est le processus par lequel une cellule déterminée, c’est-à-dire une cellule spécifique mature, revient à un stade cellulaire plus primitif. Une «cellule rétro-différenciée» est une cellule qui résulte d’une rétro-différenciation d’une cellule déterminée. [0033] As used herein, the term "retro-differentiation" is the process by which a particular cell, i.e., a specific mature cell, reverts to a more primitive cellular stage. A "retro-differentiated cell" is a cell that results from the retro-differentiation of a specific cell.

[0034] Tel qu’utilisé ici, le terme «trans-différenciation» indique le processus par lequel une cellule déterminée d’un premier lignage cellulaire est transformée en une autre cellule d’un type de cellule différent. Dans certains modes de réalisation, une trans-différenciation peut être une combinaison d’une rétro-différenciation et d’une redifférenciation. «Une cellule trans-différenciée» est une cellule qui résulte d’une transe-différenciation d’une cellule déterminée. Par exemple, une cellule déterminée, comme une cellule de sang complet peut être trans-différenciée en un neurone. [0034] As used herein, the term "trans-differentiation" indicates the process by which a particular cell of a first cell line is transformed into another cell of a different cell type. In some embodiments, trans-differentiation can be a combination of back-differentiation and redifferentiation. "A trans-differentiated cell" is a cell that results from the trance-differentiation of a specific cell. For example, a specific cell, such as a whole blood cell can be trans-differentiated into a neuron.

[0035] Tel qu’utilisé ici, le terme «redifférenciation» indique le processus par lequel une cellule déterminée ou une cellule rétro-différenciée se différencie en une cellule spécifique plus mature. «Une cellule redifférenciée» indique une cellule qui résulte d’une redifférenciation d’une cellule déterminée ou d’une cellule rétro-différenciée. Si une cellule redifférenciée est obtenue par redifférenciation d’une cellule rétro-différenciée, la cellule redifférenciée peut être du même lignage, ou d’un lignage différent, que la cellule déterminée qui a subi une rétro-différenciation. Par exemple, une cellule déterminée, comme un globule blanc, peut-être rétro-différenciée pour former une cellule rétro-différenciée comme une cellule souche pluripotente, et ensuite la cellule rétro-différenciée peut-être redifférenciée pour former un lymphocyte, qui est du même [0035] As used herein, the term "redifferentiation" indicates the process by which a particular cell or a retro-differentiated cell differentiates into a specific more mature cell. "A redifferentiated cell" indicates a cell that results from a redifferentiation of a specific cell or a retro-differentiated cell. If a redifferentiated cell is obtained by redifferentiating a retro-differentiated cell, the redifferentiated cell may be of the same lineage, or a different lineage, as the specific cell that has undergone reverse differentiation. For example, a particular cell, such as a white blood cell, can be retro-differentiated to form a retro-differentiated cell like a pluripotent stem cell, and then the retro-differentiated cell can be redifferentiated to form a lymphocyte, which is from even

7 lignage que le globule blanc (cellule déterminée), ou redifférenciée pour former un neurone, qui est d’un lignage différent du globule blanc (cellule déterminée). 7 lineage than the white blood cell (determined cell), or redifferentiated to form a neuron, which is of a different lineage from the white blood cell (determined cell).

[0036] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellules cible» est une cellule qui est obtenue pour administration à un patient afin de réparer ou de régénérer du tissu ou des cellules. Par exemple, une cellule cible peut être une cellule cible reprogrammée, comme une cellule cible rétro-différenciée ou une cellule cible trans-différenciée, de telle sorte que la cellule cible rétro-différenciée ou transdifférenciée est administrée au patient. [0036] As used herein, the term "target cells" is a cell that is obtained for administration to a patient in order to repair or regenerate tissue or cells. For example, a target cell can be a reprogrammed target cell, such as a retro-differentiated target cell or a trans-differentiated target cell, such that the retro-differentiated or transdifferentiated target cell is delivered to the patient.

Cellules déterminées Determined cells

[0037] Comme décrit ci-dessus, des cellules déterminées de la présente invention sont des cellules qui affichent un caractère différencié. La cellule déterminée peut comporter tous composants qui sont concernés par une présentation, une capture ou une reconnaissance d’antigène. Par exemple, la cellule déterminée peut être une cellule MHC de class Γ et/ou une cellule MEC de classe ΙΓ. [0037] As described above, specific cells of the present invention are cells which display a differentiated character. The determined cell can include all components that are involved in antigen presentation, capture or recognition. For example, the determined cell can be an MHC cell of class Γ and / or an MEC cell of class ΙΓ.

[0038] La cellule déterminée peut également être toute cellule dérivée ou pouvant être dérivée d’une cellule non différenciée. Ainsi, dans un mode de réalisation, la cellule déterminée est également une cellule non différenciée. Par conséquent, à titre d’exemple, la cellule déterminée peut être une cellule souche lymphoïde ou une cellule souche myéloïde, qui est différenciée par rapport à une cellule souche pluripotente. The determined cell can also be any cell derived or capable of being derived from an undifferentiated cell. Thus, in one embodiment, the determined cell is also an undifferentiated cell. Therefore, by way of example, the determined cell may be a lymphoid stem cell or a myeloid stem cell, which is differentiated from a pluripotent stem cell.

[0039] Des cellules déterminées peuvent être dérivées d’une matière biologique, comme du sang ou des tissus concernés, y compris de la moelle épinière ou du sang de cordon ombilical, du tissu neuronal provenant du système nerveux central ou du système nerveux périphérique, du tissu musculaire, ou du tissu d’épiderme et/ou de derme provenant de la peau (par exemple au moyen d’un frottis buccal). La matière biologique peut avoir une origine post-natale. [0039] Specific cells can be derived from biological material, such as blood or relevant tissues, including spinal cord or umbilical cord blood, neuronal tissue from the central nervous system or the peripheral nervous system, muscle tissue, or epidermis and / or dermis tissue from the skin (eg by means of a mouth smear). Biological material can have a post-natal origin.

[0040] La matière biologique peut être obtenue en utilisant des procédés connus dans la technique qui sont adaptés pour le type du tissu. Des exemples comprennent, mais sans s’y limiter, une excision, un prélèvement par aiguille, un essuyage, et une aphérèse. Biological material can be obtained using methods known in the art which are suitable for the type of tissue. Examples include, but are not limited to, excision, needle removal, wiping, and apheresis.

[0041 ] Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules déterminées proviennent de sang complet ou de produits traités de celui-ci, comme le plasma ou la couche leucocyto-plaquettaire, puisque leur prélèvement chez des sujets peut être effectué avec le minimum de surveillance médicale. Des échantillons de sang sont typiquement traités avec des anticoagulants comme de l’héparine ou du citrate. Des cellules dans l’échantillon biologique peuvent être traitées pour enrichir certains types de cellule, supprimer certains types de cellule ou dissocier des cellules d’une masse de tissu. Des procédés utiles pour purifier et séparer des cellules comprennent une centrifugation (comme une centrifugation en gradient de densité), une cytométrie en flux et une chromatographie d’affinités (comme l’utilisation de billes magnétiques comprenant des anticorps monoclonaux sur des marqueurs de surface de cellule ou une méthode d’adhérence sur plastique) (voir VetteseDadey, The Scientist 1999, pages 13 à 21 ). A titre d’exemple, une séparation Ficoll-Hypaque est utile pour enlever des érythrocytes et des granulocytes afin de laisser des cellules mononucléaires, comme des lymphocytes et des monocytes. In particular embodiments, the determined cells originate from whole blood or from products treated thereof, such as plasma or buffy coat, since their collection from subjects can be carried out with the minimum of supervision medical. Blood samples are typically treated with anticoagulants such as heparin or citrate. Cells in the biological sample can be processed to enrich certain types of cells, remove certain types of cells, or dissociate cells from a mass of tissue. Useful methods for purifying and separating cells include centrifugation (such as density gradient centrifugation), flow cytometry, and affinity chromatography (such as the use of magnetic beads comprising monoclonal antibodies on surface markers of cell or plastic adhesion method) (see VetteseDadey, The Scientist 1999, pages 13 to 21). For example, a Ficoll-Hypaque separation is useful for removing erythrocytes and granulocytes to leave mononuclear cells, such as lymphocytes and monocytes.

[0042] Des exemples de cellules déterminées qui peuvent être dérivées du sang comprennent, mais sans s’y limiter, des cellules CFC-T, des cellules CFC-B, des cellules CFC-Eosine, des cellules CFC-Bas, des cellules CFC-Bas, des cellules CFC-GM, des cellules CFC-M, CFC-MEG, des cellules BFC-E, des cellules CFC-E, des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des monocytes, des mégacaryocytes, et des érythrocytes. Examples of specific cells which may be derived from blood include, but are not limited to CFC-T cells, CFC-B cells, CFC-Eosine cells, CFC-Bas cells, CFC cells -Bas, CFC-GM cells, CFC-M cells, CFC-MEG, BFC-E cells, CFC-E cells, T cells, B cells, eosinophils, basophils, neutrophils, monocytes , megakaryocytes, and erythrocytes.

[0043] Des cellules déterminées provenant du sang peuvent être identifiées par leur expression d’antigènes particuliers. Par exemple, les cellules B sont des cellules CD19<+>, CD21<+>, CD22<+>and DR<+>. Les cellules T sont des cellules CD2<+>, CD3<+>, et CD4<+>ou CD8<+>. Les lymphocytes immatures sont des cellules CD4<+>et CD8<+>cells. Les cellules T activées sont des cellules DR<+>. Les cellules tueuses naturelles (NKs) sont des cellules CD56<+>et CD16. Des lymphocytes T sont des cellules CD7<+>. Les leucocytes sont des cellules CD45<+>. Les granulocytes sont des cellules CD13<+>et CD33<+>. Les cellules monocytes macrophages sont des cellules CD14<+>et DR<+>. [0043] Specific cells from blood can be identified by their expression of particular antigens. For example, B cells are CD19 <+>, CD21 <+>, CD22 <+> and DR <+> cells. T cells are CD2 <+>, CD3 <+>, and CD4 <+> or CD8 <+> cells. Immature lymphocytes are CD4 <+> and CD8 <+> cells. Activated T cells are DR <+> cells. Natural killer cells (NKs) are CD56 <+> and CD16 cells. T lymphocytes are CD7 <+> cells. Leukocytes are CD45 <+> cells. Granulocytes are CD13 <+> and CD33 <+> cells. Macrophage monocyte cells are CD14 <+> and DR <+> cells.

[0044] Dans certains modes de réalisation, la cellule déterminée peut être un lymphocyte B (activé ou non activé), un lymphocyte T (activé ou non-activé), une cellule du lignage monocyte macrophage, une cellule nucléée capable d’exprimer des antigènes de classe I ou II, une cellule qui peut être induite pour exprimer des antigènes de classe I ou II, ou une cellule énucléé (c’est-à-dire une cellule qui ne contient pas de noyau, comme un globule rouge). In some embodiments, the determined cell may be a B lymphocyte (activated or not activated), a T lymphocyte (activated or not activated), a cell of the macrophage monocyte lineage, a nucleated cell capable of expressing class I or II antigens, a cell that can be induced to express class I or II antigens, or an enucleated cell (that is, a cell that does not contain a nucleus, such as a red blood cell).

[0045] Dans des modes de réalisation en variante, la cellule déterminée peut être sélectionnée parmi l’un quelconque d’un groupe de cellules comprenant des lymphocytes granulaires larges, des lymphocytes nuis et des cellules tueuses naturelles, chacune exprimant les récepteurs de surface de cellule CD56 et/ou CD16. [0045] In alternate embodiments, the determined cell can be selected from any of a group of cells comprising large granular lymphocytes, harmful lymphocytes and natural killer cells, each expressing the surface receptors of CD56 and / or CD16 cell.

[0046] Puisque les cellules déterminées sont essentiellement des cultures primaires, il peut être nécessaire d’ajouter aux populations de cellules des nutriments adaptés pour maintenir une viabilité. Des conditions de culture adaptées sont connues de l’homme du métier. Néanmoins, un traitement de population de cellules est initié de préférence dès que possible après prélèvement d’échantillons biologiques chez le patient, typiquement en moins de 12 heures, de préférence en moins de deux à quatre jours. La viabilité cellulaire peut être vérifiée en utilisant des techniques bien connues, comme une exclusion de bleu trypan ou de iodure de propidium. Since the determined cells are essentially primary cultures, it may be necessary to add suitable nutrients to populations of cells to maintain viability. Suitable culture conditions are known to those skilled in the art. Nonetheless, cell population treatment is preferably initiated as soon as possible after collection of biological samples from the patient, typically in less than 12 hours, preferably in less than two to four days. Cell viability can be verified using well known techniques, such as exclusion of trypan blue or propidium iodide.

8 Cellules rétro-différenciées 8 Retro-differentiated cells

[0047] Une rétro-différenciation est un type de processus de reprogrammation par lequel des structures et fonctions de cellules sont modifiées progressivement pour donner naissance à des cellules moins spécifiques. Une rétro-différenciation peut survenir naturellement, les cellules pouvant subir une différenciation inverse limitée in vivo en réponse à une détérioration de tissu. En variante, une rétro-différenciation peut être induite en utilisant des procédés décrits dans la demande US numéro de série 08/594 164, maintenant brevet US 6 090 625; la demande US numéro de série. 09/742 520, maintenant brevet US 7 1 12 440; la demande US numéro de série 10/140 978, maintenant brevet US 7 220 412; la demande US numéro de série 10/150 789, maintenant brevet US 7 410 773; et la demande US numéro de série 09/853 188, qui sont incorporés ici en totalité à titre de référence. Retro-differentiation is a type of reprogramming process whereby structures and functions of cells are gradually altered to give rise to less specific cells. Retro-differentiation can occur naturally, where cells may undergo limited reverse differentiation in vivo in response to tissue damage. Alternatively, retro-differentiation can be induced using methods described in US application serial number 08 / 594,164, now US Patent 6,090,625; request US serial number. 09 / 742,520, now US Patent 7,124,440; US application serial number 10/140,978, now US patent 7,220,412; US application serial number 10 / 150,789, now US patent 7,410,773; and US application serial number 09/853188, which are incorporated herein in full by reference.

[0048] Des cellules rétro-différenciées de la présente invention peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, des cellules souches myéloïdes, des cellules souches neuronales, des cellules satellites squeletto-musculaires, des cellules souches épithéliales, des cellules souches endothermiques, des cellules souches mésenchimateuses, et des cellules souches embryonnaires. [0048] Retro-differentiated cells of the present invention can include, but are not limited to, pluripotent stem cells, lymphoid stem cells, myeloid stem cells, neuronal stem cells, skeletal-muscle satellite cells, skeletal-muscle satellite cells, epithelial stem cells, endothermic stem cells, mesenchimatous stem cells, and embryonic stem cells.

[0049] Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules déterminées proviennent du sang, et sont rétro-différenciées pour former des cellules rétro-différenciées du lignage cellulaire hématopoïétique. Les exemples de ces cellules rétro-différenciées comprennent, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, et des cellules souches myéloïdes. In particular embodiments, the determined cells originate from the blood, and are retro-differentiated to form retro-differentiated cells of the hematopoietic cell lineage. Examples of such retro-differentiated cells include, but are not limited to, pluripotent stem cells, lymphoid stem cells, and myeloid stem cells.

[0050] Les cellules indéterminées peuvent être rétro-différenciées en mettant en contact des cellules avec un agent qui coopère de manière opérationnelle avec les cellules. Les cellules sont ensuite incubées de manière à permettre à ces cellules qui sont entrées en collaboration opérationnelle avec l’agent de progresser à travers le processus de rétro-différenciation, et de devenir en définitif indifférenciées. Indeterminate cells can be retro-differentiated by bringing cells into contact with an agent which operably cooperates with the cells. The cells are then incubated in such a way as to allow these cells which have entered into operational collaboration with the agent to progress through the process of retro-differentiation, and ultimately to become undifferentiated.

[0051 ] L’étape de mise en contact peut comprendre l’agent venant en contact avec des antigènes de surface sur la cellule déterminée. L’agent peut agir en contact direct ou en contact indirect avec la cellule déterminée. Un exemple de contact direct est lorsque la cellule déterminée a au moins un récepteur de surface de cellule sur sa surface de cellule, comme une chaîne β ayant des régions homologues (des régions que l’on trouve couramment avec la même fréquence ou une fréquence similaire) telles que celles que l’on peut trouver sur des cellules B, et où l’agent vient en contact direct avec le récepteur de surface de cellule. Un autre exemple est lorsque la cellule déterminée a un récepteur de surface de cellule sur sa surface de cellule, comme une chaîne a ayant des régions homologues à celles que l’on peut trouver sur des cellules T, et où l’agent vient en contact directement avec le récepteur de surface de cellule. [0051] The contacting step can include the agent coming into contact with surface antigens on the determined cell. The agent can act in direct contact or in indirect contact with the determined cell. An example of direct contact is when the determined cell has at least one cell surface receptor on its cell surface, such as a β chain having homologous regions (regions that are commonly found with the same or similar frequency ) such as those that can be found on B cells, and where the agent comes in direct contact with the cell surface receptor. Another example is when the determined cell has a cell surface receptor on its cell surface, such as an α chain having regions homologous to those which can be found on T cells, and the agent comes in contact. directly with the cell surface receptor.

[0052] Un exemple de contact indirect est lorsque la cellule déterminée a au moins deux récepteurs de surface de cellule sur sa surface de cellule, et un contact de l’agent avec le premier récepteur affecte l’autre récepteur, ce qui induit alors une rétro-différenciation de la cellule déterminée. An example of indirect contact is when the determined cell has at least two cell surface receptors on its cell surface, and contact of the agent with the first receptor affects the other receptor, which then induces a retro-differentiation of the determined cell.

[0053] L’agent pour la rétro-différenciation de la cellule déterminée peut être un composé ou une composition chimique. Par exemple, l’agent peut être capable de venir en contact avec un récepteur de surface de cellule situé sur la surface de la cellule déterminée. Dans certains modes de réalisation, l’agent vient en contact de manière opérationnelle avec un récepteur présent sur la surface de la cellule déterminée - lequel récepteur peut être exprimé par la cellule déterminée, comme un récepteur qui est capable d’être exprimé par la cellule déterminée. The agent for the retro-differentiation of the determined cell can be a compound or a chemical composition. For example, the agent may be able to come into contact with a cell surface receptor located on the surface of the determined cell. In some embodiments, the agent operatively comes into contact with a receptor present on the surface of the determined cell - which receptor may be expressed by the determined cell, such as a receptor which is capable of being expressed by the cell. determined.

[0054] Par exemple, les agents peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, un quelconque ou plusieurs parmi de l’adénosine monophosphate cyclique (cAMP), une molécule CD4, une molécule CD8, une partie ou la totalité d’un récepteur de cellule T, un ligand (fixé ou libre), un peptide, un récepteur de cellule T (TCR), un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal, ou un anticorps polyclonal. Des facteurs de croissance peuvent également être utilisés, comme des facteurs de croissance hématopoïétique, par exemple de l’érythropoïétine et des facteurs stimulateurs de colonies de granulocytes-monocytes (GM-CSF). [0054] For example, agents can include, but are not limited to any one or more of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), a CD4 molecule, a CD8 molecule, part or all of a receptor cell, ligand (fixed or free), peptide, T cell receptor (TCR), antibody, cross-reactive antibody, monoclonal antibody, or polyclonal antibody. Growth factors can also be used, such as hematopoietic growth factors, for example erythropoietin and granulocyte-monocyte colony stimulating factors (GM-CSF).

[0055] Si l’agent est un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal, alors l’agent peut être un quelconque ou plusieurs parmi un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal lié à un quelconque ou plusieurs parmi: la chaîne β d’un antigène MHC de classe II, la chaîne β d’un antigène MHC HLA-DR, la chaîne a d’un antigène MHC de classe I or de classe II, la chaîne a d’un antigène HLA-DR, la chaîne a et β d’un antigène MHC de classe II ou d’un antigène MHC de classe I. Un exemple d’anticorps est CR3/43 (fourni par Dako). If the agent is an antibody, a cross-reactive antibody, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, then the agent can be any one or more of an antibody, a cross-reactive antibody, a monoclonal antibody or a. polyclonal antibody linked to any one or more of: the β chain of an MHC class II antigen, the β chain of an MHC HLA-DR antigen, the α chain of a class I or class II MHC antigen, the α chain of an HLA-DR antigen, the α and β chain of an MHC class II antigen or an MHC class I antigen. An example of an antibody is CR3 / 43 (supplied by Dako).

[0056] Le terme «anticorps» peut comprendre les divers fragments (qu’ils proviennent d’une technologie de clivage protéolitique ou recombinante) et dérivés qui conservent une activité de liaison, comme les anticorps Fab, F(ab<'>)2et scFv de même que des imitations ou des bioisostères de ceux-ci. Sont également inclus comme anticorps des variants conçus génétiquement dans lesquels certaines des séquences d’acides aminés ont été modifiées, par exemple par un remplacement de résidus d’acides aminés pour améliorer la liaison, ou dans lesquels les anticorps ont été réalisés dans une espèce différente de l’organisme dont on souhaite que les cellules soient traitées selon les procédés de la présente invention, afin de diminuer la possibilité de réaction immune contraire (un exemple de ceci est des anticorps monoclonaux de souris «humanisées»). The term “antibody” can include the various fragments (whether they come from a proteolytic or recombinant cleavage technology) and derivatives which retain a binding activity, such as the Fab, F (ab <'>) 2 and antibodies. scFv as well as imitations or bioisosteres thereof. Also included as antibodies are genetically engineered variants in which some of the amino acid sequences have been altered, for example by replacement of amino acid residues to improve binding, or in which the antibodies have been made in a different species. of the organism whose cells it is desired to be treated according to the methods of the present invention, in order to decrease the possibility of an adverse immune reaction (an example of this is monoclonal antibodies from "humanized" mice).

9 [0057] Les agents utilisés pour réaliser la conversion d’une cellule déterminée en une cellule rétro-différenciée peuvent agir de préférence de manière extracellulaire par rapport à la cellule déterminée. Par exemple, la cellule déterminée peut comporter un récepteur qui peut être mis en contact opérationnel avec l’agent, et l’agent vient en contact opérationnel avec le récepteur. [0057] The agents used to effect the conversion of a determined cell into a retro-differentiated cell may preferably act extracellularly with respect to the determined cell. For example, the determined cell may have a receiver that can be put into operational contact with the agent, and the agent comes into operational contact with the receiver.

[0058] Par exemple, le récepteur peut être un récepteur de surface de cellule. Des exemples spécifiques de récepteurs de surface de cellule comprennent, mais sans s’y limiter, des récepteurs MHC de classe I et de classe II. Le récepteur peut comporter un composant a et/ou un composant β, comme c’est le cas pour des récepteurs MHC de classe I et de classe II. [0058] For example, the receptor can be a cell surface receptor. Specific examples of cell surface receptors include, but are not limited to, MHC class I and class II receptors. The receptor may include an α component and / or a β component, as is the case for MHC class I and class II receptors.

[0059] Le récepteur peut comporter une chaîne β ayant des régions homologues, par exemple au moins les régions homologues de la chaîne β de HLA-DR. The receptor may comprise a β chain having homologous regions, for example at least the homologous regions of the β chain of HLA-DR.

[0060] En variante, ou de plus, le récepteur peut comporter une chaîne a ayant des régions homologues, par exemple au moins les régions homologues de la chaîne a de HLA-DR. Le récepteur peut être un antigène de classe I ou de classe Il du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC). Dans certains modes de réalisation, le récepteur de surface de cellule peut comporter, mais sans s’y limiter, un récepteur HLA-DR, un récepteur DM, un récepteur DR un récepteur DQ, un récepteur HLA-A, un récepteur HLA-B, un récepteur HLA-C, un récepteur HLA-E, un récepteur HLA-F, ou un récepteur HLA-G. Dans certains modes de réalisation, le récepteur de surface de cellule peut-être un récepteur HLA-DR. [0060] As a variant, or in addition, the receptor may comprise an α chain having homologous regions, for example at least the homologous regions of the α chain of HLA-DR. The receptor can be a class I or class II major histocompatibility complex (MHC) antigen. In some embodiments, the cell surface receptor can include, but is not limited to, HLA-DR receptor, DM receptor, DR receptor, DQ receptor, HLA-A receptor, HLA-B receptor , an HLA-C receptor, an HLA-E receptor, an HLA-F receptor, or an HLA-G receptor. In some embodiments, the cell surface receptor may be an HLA-DR receptor.

[0061 ] L’agent peut être un anticorps lié au récepteur, comme un anticorps monoclonal lié au récepteur. [0061] The agent can be an antibody bound to the receptor, such as a monoclonal antibody bound to the receptor.

[0062] Un exemple d’agent peut être un qui module l’expression de gène MHC, comme l’expression de MHC de classe Γ et/ou l’expression de MHC de classe ll<+>. [0062] An example of an agent can be one which modulates MHC gene expression, such as MHC class Γ expression and / or MHC class II <+> expression.

[0063] Dans certains modes de réalisation, l’agent peut être utilisé en association avec un modificateur de réponse biologique. Des exemples de modificateurs de réponse biologique comprennent, mais sans s’y limiter, un agent alcoylant, un immunomodulateur, un facteur de croissance, une cytokine, un récepteur de surface de cellule, une hormone, un acide nucléique, une séquence nucléotidique, un antigène ou un peptide. Par exemple, un agent alcoylant peut être ou peut comporter un cyclophosphoamide. [0063] In some embodiments, the agent can be used in conjunction with a biological response modifier. Examples of biological response modifiers include, but are not limited to an alkylating agent, an immunomodulator, a growth factor, a cytokine, a cell surface receptor, a hormone, a nucleic acid, a nucleotide sequence, a antigen or peptide. For example, an alkylating agent can be or can include a cyclophosphoamide.

[0064] D’autres modificateurs de réponse biologique peuvent comprendre des composés capables de réguler à la hausse l’expression d’antigène MHC de classe I et/ou de classe II qui, dans certains modes de réalisation, peuvent permettre à un agent qui se lie à un récepteur MHC d’agir plus efficacement. [0064] Other biological response modifiers may include compounds capable of up-regulating MHC class I and / or class II antigen expression which, in some embodiments, may allow an agent which binds to an MHC receptor to act more efficiently.

[0065] Comme tout type de cellule peut être réalisé pour exprimer des antigènes MHC de classe I et/ou de classe II, ceci peut fournir un procédé pour rétro-différencier une large variété de types de cellule, qu’ils expriment ou non de manière constitutive des antigènes MHC de classe I et/ou de classe II. As any type of cell can be made to express MHC class I and / or class II antigens, this can provide a method for retro-differentiating a wide variety of cell types, whether or not they express from. constitutive of MHC class I and / or class II antigens.

[0066] Des cellules déterminées sont généralement incubées avec un agent pendant au moins 2 heures, typiquement entre 2 et 24 heures, de préférence entre 2 et 12 heures. Des incubations sont typiquement effectuées depuis une température ambiante ou par exemple d’environ 22 °C, jusqu’à environ 37 °C, y compris 33 °C. La progression de la procédure de rétro-différenciation peut être vérifiée périodiquement en enlevant une petite quantité aliquote de l’échantillon, et en examinant les cellules en utilisant une microscopie et/ou une cytométrie en flux. En variante, le dispositif peut comporter des moyens de suivi pour la surveillance en ligne de la progression du processus de rétro-différenciation. [0066] Determined cells are generally incubated with an agent for at least 2 hours, typically between 2 and 24 hours, preferably between 2 and 12 hours. Incubations are typically performed from room temperature or, for example, from about 22 ° C, up to about 37 ° C, including 33 ° C. The progress of the retro-differentiation procedure can be checked periodically by removing a small aliquot of the sample, and examining the cells using microscopy and / or flow cytometry. Alternatively, the device may include tracking means for on-line monitoring of the progress of the retro-differentiation process.

[0067] En plus de l’utilisation d’agents de rétro-différenciation, les cellules déterminées peuvent être mises en culture dans du plasma ou sérum autologue, ou tant du sérum de sang foetal ou du sérum de cheval. Facultativement, les cellules déterminées peuvent être mises en culture avec des anticoagulants, des chélateurs ou des antibiotiques. La plage de température pour incuber les cellules peut être étendue de 18 à 40 °C, et peut également comprendre 4 à 10% de C02et/ou 10 à 35% d’02. En outre, une incubation peut survenir dans des poches de sang, des poches de culture de tissus ou des récipients en matière plastique, qui sont revêtus ou non revêtus. In addition to the use of retro-differentiating agents, the determined cells can be cultured in plasma or autologous serum, or both fetal blood serum or horse serum. Optionally, the determined cells can be cultured with anticoagulants, chelators or antibiotics. The temperature range for incubating the cells can be extended from 18 to 40 ° C, and can also include 4 to 10% CO2 and / or 10 to 35% O2. In addition, incubation can occur in blood bags, tissue culture bags or plastic containers, which are coated or uncoated.

[0068] Certains types de cellules rétro-différenciées peuvent être obtenus par rétro-différenciation en utilisant des conditions de culture particulières. Par exemple, des cellules déterminées peuvent être rétro-différenciées en cellules pluripotentes en mettant en culture les cellules déterminées dans du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), des acides aminés non essentiels (NEAA), de la L-glutamine (L-glu), et du β-mercaptoéthanol (2 βΜΕ), en association avec les agents de rétro-différenciation. Les cellules déterminées peuvent également être exposées initialement à des chélateurs. Certain types of retro-differentiated cells can be obtained by retro-differentiation using particular culture conditions. For example, specific cells can be back-differentiated into pluripotent cells by culturing the determined cells in Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium (DMEM), non-essential amino acids (NEAA), L-glutamine ( L-glu), and β-mercaptoethanol (2 βΜΕ), in combination with retro-differentiation agents. The determined cells can also be exposed initially to chelators.

[0069] Comme autre exemple, pour obtenir des cellules mésenchymateuses, des cellules déterminées peuvent être mises en culture en association avec un ou des agents de rétro-différenciation - en utilisant du DMEM (faible teneur en glucose) et de la L-glu, ou du DMEM (faible teneur en glucose), de la L-glu, du 2 βΜΕ, et du NEAA. De plus, la gentamicine antibiotique peut également être utilisée dans la culture cellulaire. As another example, to obtain mesenchymal cells, specific cells can be cultured in association with one or more retro-differentiation agent - using DMEM (low glucose content) and L-glu, or DMEM (low glucose), L-glu, 2 βΜΕ, and NEAA. Additionally, the antibiotic gentamicin can also be used in cell culture.

Cellules trans-différenciées Trans-differentiated cells

[0070] Des cellules trans-différenciées sont obtenues en mettant en culture des cellules déterminées avec un milieu de culture de tissu en association avec des agents de rétro-différenciation. Les cellules déterminées subissent ainsi une Trans-differentiated cells are obtained by culturing determined cells with a tissue culture medium in combination with retro-differentiation agents. The determined cells thus undergo a

10 transdifférenciation, dans laquelle les cellules déterminées sont transformées en cellules d’un autre type de cellule; dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont transformées en cellules d’un lignage différent. Transdifferentiation, in which the determined cells are transformed into cells of another cell type; in some embodiments, the determined cells are transformed into cells of a different lineage.

[0071 ] Le type de cellule cible obtenu par trans-différenciation dépend des conditions de culture. Ces conditions varient selon le type de milieu de culture de tissu, la présence/l’absence de divers agents promoteurs de différenciation, la présence/l’absence de différents sérums, la température d’incubation, la présence/l’absence d’oxygène ou de dioxyde de carbone, et le type de conteneur ou récipient utilisé pour l’incubation. The type of target cell obtained by trans-differentiation depends on the culture conditions. These conditions vary depending on the type of tissue culture medium, the presence / absence of various differentiation promoting agents, the presence / absence of different sera, the incubation temperature, the presence / absence of oxygen or carbon dioxide, and the type of container or vessel used for the incubation.

[0072] Des exemples de milieux de culture de tissus utilisés pour une transdifférenciation comprennent, mais sans s’y limiter, du milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (IMDM), du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), du milieu minimum essentiel de Eagle (EME), de l’a-milieu minimum essentiel (a-MEM), Roswell Park Mémorial Institute (RPMI; site où le milieu a été développé) 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, Leibovitz L-15, du milieu E de Williams, ou tout milieu de culture de tissu formulé commercialement. [0072] Examples of tissue culture media used for transdifferentiation include, but are not limited to, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), Dulbecco's Modified Minimum Essential Eagle's Medium (DMEM), Eagle's essential minimum (EME), a-medium essential minimum (a-MEM), Roswell Park Memorial Institute (RPMI; site where medium was developed) 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, Leibovitz L-15, Williams' E medium, or any commercially formulated tissue culture medium.

[0073] Des agents promoteurs de différenciation comprennent des anticoagulants, des chélateurs et des antibiotiques. Des exemples de tels agents peuvent être un ou plusieurs parmi les suivants: des vitamines et minéraux, ou des dérivés de ceux-ci, comme de la vitamine A (rétinol), B3, C (ascorbate), ascorbate 2-phosphate, D2, D3, K, de l’acide rétinoïque, du nicotinamide, du zinc ou un composé de zinc, et du calcium ou des composés de calcium; des hormones naturelles ou synthétiques comme de l’hydrocortisone, et de la déxaméthasone; des acides aminés ou des dérivés de ceux-ci, comme de la L-glutamine (L-glu), de l’acide tétraacétique d’éthylèneglycol (EGTA), de la proline, et des acides aminés non essentiels (NEAA); des composés ou des dérivés de ceux-ci, comme 13-mercaptoéthal, de l’adénosine monophosphate cyclique de dibutyl (db-cAMP), du monothioglycérol (MTG), de la putrescine, du diméthylsulfoxide (DMSO), de l’hypoxanthine, de l’adénine, de la forskoline, du cilostamide, et de la 3-isobutyl-1 -méthylxanthine; des nucléosides et des analogues et ceux-ci, comme de la 5-azacytidine; des acides ou des sels de ceux-ci, comme de l’acide ascorbique, du pyruvate, de l’acide okadaïque, de l’acide linoléique, de l’acide éthylènediaminetétraacetique (EDTA), de la citrate-dextrose de formula A anticoagulante (ACDA), du disodium EDTA, du butyrate de sodium, et du glycérophosphate; des antibiotiques ou des médicaments, comme G418, gentamycine, Pentoxifylline (1 -(5-oxohéxyl)-3, 7-diméthylxanthine), et de l’indométhacine; et des protéines, comme activateur plasminogène tissulaire (TPA). [0073] Promoting differentiation agents include anticoagulants, chelators and antibiotics. Examples of such agents can be one or more of the following: vitamins and minerals, or derivatives thereof, such as vitamin A (retinol), B3, C (ascorbate), ascorbate 2-phosphate, D2, D3, K, retinoic acid, nicotinamide, zinc or a zinc compound, and calcium or calcium compounds; natural or synthetic hormones such as hydrocortisone, and dexamethasone; amino acids or derivatives thereof, such as L-glutamine (L-glu), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), proline, and non-essential amino acids (NEAA); compounds or derivatives thereof, such as 13-mercaptoethal, cyclic dibutyl adenosine monophosphate (db-cAMP), monothioglycerol (MTG), putrescine, dimethylsulfoxide (DMSO), hypoxanthine, adenine, forskolin, cilostamide, and 3-isobutyl-1-methylxanthine; nucleosides and analogs and these, such as 5-azacytidine; acids or salts thereof, such as ascorbic acid, pyruvate, okadaic acid, linoleic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citrate-dextrose formula A anticoagulant (ACDA), disodium EDTA, sodium butyrate, and glycerophosphate; antibiotics or drugs, such as G418, gentamycin, Pentoxifylline (1 - (5-oxohexyl) -3, 7-dimethylxanthine), and indomethacin; and proteins, such as tissue plasminogen activator (TPA).

[0074] Ces agents promoteurs de différenciation peuvent être utilisés pour obtenir des types particuliers de cellules cibles. Par exemple, de la vitamine B3peut être utilisée pour produire des cellules acineuses, comme des îlots de Langerhans ou de l’hydrocortisone; de la déxaméthasone peut être utilisée pour produire des cellules d’une origine mésenchymateuse ou d’origine épithéliale (par exemple cellules épithéliales du rein, de la peau et de structures associées, comme des cellules de bulbe pileux); et du β-mercaptoéthal peut être utilisé pour produire des cellules ectodermiques comme des cellules neuronales, y compris des cellules accessoires du CNS. [0074] These differentiation promoter agents can be used to obtain particular types of target cells. For example, vitamin B3 can be used to produce acinar cells, such as islets of Langerhans or hydrocortisone; dexamethasone can be used to produce cells of mesenchymal or epithelial origin (eg epithelial cells of the kidney, skin, and associated structures, such as hair bulb cells); and β-mercaptoethal can be used to produce ectodermal cells such as neuronal cells, including accessory cells of CNS.

[0075] Le milieu de culture peut contenir du plasma autologue; des plaquettes; du sérum, comme un échantillon de sang foetal; ou des sérums provenant de mammifères, comme du sérum de cheval. De plus, le processus de conversion peut avoir lieu dans des poches de sang, des ossatures, des poches de culture tissulaire, ou des récipients de culture tissulaire en matière plastique. Les récipients de culture tissulaire peuvent être des récipients de culture tissulaire adhérents ou non adhérents, ou peuvent être revêtus ou non revêtus avec des agents comme de la gélatine, du collagène, des matrigels, ou des matrices extracellulaires qui favorisent une adhérence ou une flottaison selon le type de tissus ou de cellules spécifiques nécessaires devant être préparé. The culture medium can contain autologous plasma; platelets; serum, such as a sample of fetal blood; or sera from mammals, such as horse serum. Additionally, the conversion process can take place in blood bags, frameworks, tissue culture bags, or plastic tissue culture vessels. Tissue culture vessels can be adherent or non-adherent tissue culture vessels, or can be coated or uncoated with agents such as gelatin, collagen, matrigels, or extracellular matrices which promote adhesion or flotation according to the type of specific tissues or cells needed to be prepared.

[0076] Des conditions de culture supplémentaires comprennent la température, qui peut être entre environ 10 et environ 60 °C, ou entre environ 18 et environ 40 °C; les niveaux de dioxyde de carbone (C02), qui peuvent être entre environ 0 et environ 20%, ou environ 4 et environ 10%; et d’oxygène (02), qui peuvent être entre environ 0 et environ 50%, ou environ 10 et environ 35%. Additional culture conditions include temperature, which can be between about 10 and about 60 ° C, or between about 18 and about 40 ° C; carbon dioxide (C02) levels, which can be between about 0 and about 20%, or about 4 and about 10%; and oxygen (02), which can be between about 0 and about 50%, or about 10 and about 35%.

[0077] Des exemples de procédés pour obtenir les cellules cibles, et utilisés en association avec des agents de rétro-différenciation, sont décrits dans le tableau 1. Examples of methods for obtaining the target cells, and used in combination with retro-differentiation agents, are described in Table 1.

11 Tableau 1 : Procédés pour obtenir différents types de cellules cibles en association avec des agents de rétro-différenciation. 11 Table 1: Methods for obtaining different types of target cells in association with retro-differentiation agents.

[0078] [0078]

Type de cellules Conditions de culture Conditions de culture cibles utilisées en association supplémentaires avec des agents de rétro-différenciation Cell type Culture conditions Target culture conditions used in additional combination with retro-differentiation agents

Cellules souches • DMEM, NEAA, L- • Avant exposition de cellules pluripotentes ou glu, 2PME déterminées à chélateurs ou population agents anticoagulants. hétérogène de • Pour des progéniteurs cellules progenitors, ectraction progénitrices d’agent de pluripotentes rétrodifférenciation en diluant avec un milieu de culture seulement Stem cells • DMEM, NEAA, L- • Before exposure of determined pluripotent cells or glue, 2PME to chelators or population anticoagulants. heterogeneous of • For progenitor cells progenitors, ectraction of progenitor of pluripotent retrodifferentiation agent by diluting with culture medium only

Cellules souches • DMEM (faible teneur • Gentamycine mésenchymateuses en glucose), L-glu ; ou Stem cells • DMEM (low • Gentamycin mesenchymal glucose), L-glu; or

* DMEM (faible teneur en glucose), L-glu, 2βΜΕ, NEAA * DMEM (low glucose), L-glu, 2βΜΕ, NEAA

• Cellules ® RPMI 1640, GAIC germinales facultativement avec • L’incubation peut être à pluripotentes NEAA, L- glu, 2βΜΕ environ 30-32°C pour des • Germline ® RPMI 1640, GAIC cells optionally with • Incubation can be pluripotent NEAA, L-glu, 2βΜΕ around 30-32 ° C for

• Oocytes pour oocytes ; ou spermatozoïdes, et environ • Oocytes for oocytes; or sperm, and about

• spermatozoïdes • milieu EME, retinol, 38 à 39°C pour des oocytes. L-glu, pyruvate de • Des cellules peuvent être sodium, lactate de exposées à des chélateurs sodium, NEAA pour comme EDTA et EGT avant oocytes ; ou rétro-différenciation et • spermatozoa • EME medium, retinol, 38 to 39 ° C for oocytes. L-glu, pyruvate • Cells can be sodium, lactate exposed to sodium chelators, NEAA for like EDTA and EGT before oocytes; or retro-differentiation and

• DMEM, Hams F12, redifférenciation. vitamine C, vitamine • Pour du sperm, on peut E, acide rétinoïque, inclure l'ajout d'acide rétinol, okadaïque, de DMSO et de pyruvate, facultative zinc ou d'un composé de ment avec zinc ; du Gamete 100 peut Pentoxifylline pour être utilisé à la place en tant spermatozoïdes ; ou que milieu de base. • DMEM, Hams F12, redifferentiation. vitamin C, vitamin • For sperm, we can E, retinoic acid, include the addition of retinol acid, okadaic, DMSO and pyruvate, optional zinc or a compound of ment with zinc; of Gamete 100 can Pentoxifylline to be used instead as sperm; or that base medium.

• Pour des oocytes, on peut • For oocytes, we can

• conditions de culture inclure l'ajout de dp-cAMP, pour cellules de EDTA de disodium, de souches forskolin, de cilostamide et pluripotentes listées de hypoxanthine. ci-dessus, et avec conditions de culture • Culture conditions include the addition of dp-cAMP, for disodium EDTA cells, forskolin strains, cilostamide and listed pluripotent hypoxanthine. above, and with growing conditions

12 supplémentaires • Pour des oocytes, on peut listées dans la utiliser à la place du milieu colonne suivante 199 en tant que milieu de pour du base. spermatozoïde ou des oocytes. Additional 12 • For oocytes, one can listed in the use instead of medium next column 199 as the base pour medium. sperm or oocytes.

Kidney • DMEM, Hams F12, et hydrocortisone, facultativement avec de la vitamine K ; ou Kidney • DMEM, Hams F12, and hydrocortisone, optionally with vitamin K; or

• les conditions de culture pour des cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de l’hydrocortisone • the culture conditions for pluripotent stem cells listed above, with hydrocortisone

• Épithélium • DMEM, NEAA, L- • Avec récipients de culture alvéolaire glu, facultativement tissulaire revêtus de matrigel « Endoderme avec 2βΡΜΕ, et d’antibiotique G418 nicotinamide ; ou • Epithelium • DMEM, NEAA, L- • With sticky alveolar culture vessels, optionally tissue coated with matrigel "Endoderm with 2βΡΜΕ, and antibiotic G418 nicotinamide; or

® Conditions de culture pour cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec nicotinamide, facultativement avec dexamethasone, acide rétinoique, dbcAMP ; ou ® Culture conditions for pluripotent stem cells listed above, with nicotinamide, optionally with dexamethasone, retinoic acid, dbcAMP; or

• IMDM, L-glu, acide ascorbique, MTG • IMDM, L-glu, ascorbic acid, MTG

• Neurone • DMEM avec Hams • Neuron • DMEM with Hams

• Ectoderme F12, NEAA, 2βΜΕ, facultativement avec de la putrescine, de l'acide rétinoïque, de la L-glu, de l’hydrocortisone, de l’ascorbate ; ou • Ectoderm F12, NEAA, 2βΜΕ, optionally with putrescine, retinoic acid, L-glu, hydrocortisone, ascorbate; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, facultativement avec • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, optionally with

13 de la putrescine, de l'acide rétinoïque, de la L-glu, de l’hydrocortisone, de l’ascorbate îlots de Langerhans • DMEM, Hams F12, cellules acineuses vitamine B3; ou 13 putrescine, retinoic acid, L-glu, hydrocortisone, ascorbate islets of Langerhans • DMEM, Hams F12, acinar cells vitamin B3; or

• RPMI 1640 avec vitamine B3; ou • RPMI 1640 with vitamin B3; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de la vitamine B3 (nicotinamide), facultativement avec de la déxaméthasone • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, with vitamin B3 (nicotinamide), optionally with dexamethasone

Cellules • IMDM, • L'incubation peut être à 33 hématopoïétiques facultativement avec °C de l’hydrocortisone ; • L'incubation peut être à ou température ambiante pour amplifier des Cells • IMDM, • Incubation can be at 33 hematopoietic optionally with hydrocortisone ° C; • Incubation can be at or room temperature to amplify

• IMDM, L glutamine mégacaryocytes dans la et MTG ; ou culture. • IMDM, L glutamine megakaryocytes in and MTG; or culture.

• Les conditions de • Des cellules différenciées culture pour les peuvent être exposées à des cellules souches chélateurs avant conversion pluripotentes listées pour amplifier des ci-dessus, avec progéniteurs d’érythroïdes MTG remplaçant durant la culture. 2βΜΕ, • Du RPMI 1640 peut être facultativement avec utilisé en tant que milieu de des vitamines base pour enrichissement de progéniteurs de lymphoïdes. • The conditions for • Cultured differentiated cells can be exposed to the chelating stem cells prior to pluripotent conversion listed to amplify from above, with MTG erythroid progenitors replacing during culture. 2βΜΕ, • RPMI 1640 can optionally be used as a vitamin base medium for enrichment of lymphoid progenitors.

• Du butyrate de sodium et/ou de la 5- azacytidine peuvent être ajoutés à la culture pour favoriser une différenciation d’érythroïdes primitifs • Sodium butyrate and / or 5-azacytidine can be added to the culture to promote differentiation of primary erythroids

Hépatocytes du foie • DMEM ou IMDM ou • α-milieu essentiel minimum, L-glu, facultativement avec de la Liver hepatocytes • DMEM or IMDM or • minimum essential α-medium, L-glu, optionally with

14 déxaméthasone, L'acide ascorbique2-phosphate et nicotinamide ; ou 14 dexamethasone, Ascorbic acid2-phosphate and nicotinamide; or

• milieu E de Williams, sodium pyruvate de sodium, déxaméthasone ; ou • Williams' E medium, sodium sodium pyruvate, dexamethasone; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de la déxaméthasone • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, with dexamethasone

Peau/ kératinocytes • Hams F12, DMEM • Éventuellement avec (media ratio 3:1 ), gentamycine en tant hydrocortisone, L- qu'antibiotique. giu, facultativement • Peut incuber à 36,4°C avec adénine ; ou Skin / Keratinocytes • Hams F12, DMEM • Optionally with (media ratio 3: 1), gentamycin as hydrocortisone, L- as antibiotic. giu, optionally • Can incubate at 36.4 ° C with adenine; or

• E199 or DMEM avec L-glu, facultativement avec hydrocortisone et adénine ; ou • E199 or DMEM with L-glu, optionally with hydrocortisone and adenine; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de l’hydrocortisone, facultativement avec du calcium ou des composés de calcium ou de l'ascorbate • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, with hydrocortisone, optionally with calcium or calcium compounds or ascorbate

Mélanocytes • MCDB et Leibovitz L-15, TPA, facultativement avec 3-isobutyl-1 méthylxanthine ; ou Melanocytes • MCDB and Leibovitz L-15, TPA, optionally with 3-isobutyl-1 methylxanthine; or

• milieu 199 and hydrocortisone • medium 199 and hydrocortisone

Ostéocytes/os • DMEM, βglycérophosphate, déxaméthasone, ascorbate et L-glu, Osteocytes / bone • DMEM, βglycerophosphate, dexamethasone, ascorbate and L-glu,

15 facultativement avec de la vitamine D3; ou Optionally with vitamin D3; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec glycérophosphate, déxaméthasone et ascorbate, facultativement avec de la vitamine D3. • Culture conditions for pluripotent stem cells listed above, with glycerophosphate, dexamethasone and ascorbate, optionally with vitamin D3.

Cellule de bulbe • milieu E de William, pileux/cheveux L-glu, hydrocortisone, et/ou vitamine D2, adénine et acide linoléique ou Bulb cell • William's medium E, hair / hair L-glue, hydrocortisone, and / or vitamin D2, adenine and linoleic acid or

• DMEM, Hams F12 en tant que milieu de base, L-glu, hydrocortisone et/ou vitamine D2, adénine et acide linoléique ; ou • DMEM, Hams F12 as base medium, L-glu, hydrocortisone and / or vitamin D2, adenine and linoleic acid; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec hydrocortisone, vitamine D2, adénine et acide linoléique. • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, with hydrocortisone, vitamin D2, adenine and linoleic acid.

Chondrocytes/ ® DMEM, pyruvate, cartilage ascorbate 2phosphate, déxaméthasone et proline ; ou • Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec ascorbate 2 phosphate, Chondrocytes / ® DMEM, pyruvate, cartilage ascorbate 2phosphate, dexamethasone and proline; or • The culture conditions for the pluripotent stem cells listed above, with ascorbate 2 phosphate,

16 déxaméthasone et proline. 16 dexamethasone and proline.

Adipocytes/cellules • DMEM, grasses déxaméthasone, et indométhacine ; ou Adipocytes / Cells • DMEM, fatty dexamethasone, and indomethacin; or

• déxaméthasone et indométhacine • dexamethasone and indomethacin

Muscles • DMEM, faible teneur • Éventuellement avec squelettiques en glucose, gentamycine en tant facultativement avec qu’antibiotique hydrocortisone, • Éventuellement avec une déxaméthasone, L- faible concentration en glutamine et sérum. pyruvate de sodium ; • Éventuellement avec des ou récipients de culture ayant de Muscles • DMEM, low content • Possibly with skeletal glucose, gentamycin as optionally with hydrocortisone antibiotic, • Possibly with dexamethasone, L- low concentration in glutamine and serum. sodium pyruvate; • Possibly with culture vessels or containers with

• DMEM et Ham F12 la gélatine. ou F10 en tant que • Éventuellement à une milieu de base, ou température supérieure à DMEM et milieu 39°C. 199 ; ou • Éventuellement ajout de 5- • DMEM and Ham F12 gelatin. or F10 as • Optionally at base medium, or temperature above DMEM and medium 39 ° C. 199; or • Possibly adding 5-

• Les conditions de azacytidine culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec glucose, gentamycine et sérum bas • The culture azacytidine conditions for the pluripotent stem cells listed above, with glucose, gentamycin and low serum

Vaisseaux sanguins • DMEM, NE AA et (endothélium) 2βΜΕ ; ou Blood vessels • DMEM, NE AA and (endothelium) 2βΜΕ; or

• IMDM et déxaméthasone • IMDM and dexamethasone

Muscles • DMEM 4:1 et milieu « Récipients de culture revêtus cardiaques/ M199 ou DMEM de gélatine pour une cardiomyocytes (faible teneur en différenciation complète et glucose), L-glu, sérum autologue ou plasma Muscles • 4: 1 DMEM and medium "Cardiac / M199 coated culture vessels or gelatin DMEM for cardiomyocytes (low content of complete differentiation and glucose), L-glu, autologous serum or plasma

NE AA ; ou DMEM appauvri en plaquettes. (faible teneur en • Une différenciation complète glucose) avec acide peut être observée sur une ascorbique et/ou lamelle couvre objet DMSO ; ou NE AA; or DMEM depleted in platelets. (low in • Complete differentiation of glucose) with acid can be observed on an ascorbic and / or DMSO coverslip; or

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées • Culture conditions for the listed pluripotent stem cells

17 ci-dessus, culture antigravitaire ou dans un environnement vibrant. 17 above, anti-gravity culture or in a vibrant environment.

Tropoblastes • DMEM, L-glu, 2βΜΕ, Peut être utilisé pour produire NEAA avec une des facteurs de croissance dilution continue autologues et des hormones avec le même milieu nécessaires pour différencier de culture moins des cellules en mésoderme et l'agent de rétro- ectoderme, y compris des différenciation ; ou cellules souches germinales et Tropoblasts • DMEM, L-glu, 2βΜΕ, Can be used to produce NEAA with an autologous continuous dilution growth factors and hormones with the same medium needed to differentiate less culture cells into mesoderm and the agent from retro-ectoderm , including differentiation; or germ stem cells and

* RPMM 640, 2βΜΕ, des cellules souches pyruvate de sodium progénitrices. et L-glutamine * RPMM 640, 2βΜΕ, sodium pyruvate progenitor stem cells. and L-glutamine

[0079] De manière notable, pour les conditions de culture décrites pour chaque type de cellule dans le tableau 1 , une suppression de l’agent de rétro-différenciation par une dilution consécutive de la condition de culture avec le milieu de culture correspondant a pour résultat une trans-différenciation plus renforcée. Notably, for the culture conditions described for each type of cell in Table 1, a suppression of the retro-differentiation agent by a consecutive dilution of the culture condition with the corresponding culture medium has for result in more enhanced trans-differentiation.

[0080] Pendant la culture, le milieu de culture contenant facultativement les différents agents promoteurs de différenciation peut être dilué par l’ajout d’un ou plusieurs milieux, mais sans l’agent de rétro-différenciation. Sans être lié à une théorie, une dilution semble augmenter la différenciation du fait que les cellules deviennent moins denses, et les facteurs de stimulation de prolifération sont moins concentrés. Ainsi, l’ajout d’un milieu peut en outre améliorer une transdifférenciation, et va affecter le type de cellule qui est obtenu dans le lignage cellulaire. Par exemple, si la cellule cible est un neurone, l’ajout d’un milieu de culture peut avoir pour résultat un décalage du développement vers un neurone plus mature plutôt qu’un progéniteur de neurones (les deux ayant le même lignage). A titre d’autre exemple, une différenciation vers l’avant de progéniteurs de muscle squelettique va uniquement différencier par une dilution consécutive du milieu de culture qui est obtenue en diminuant graduellement la concentration en sérum. [0080] During cultivation, the culture medium optionally containing the various differentiation promoting agents can be diluted by adding one or more media, but without the retro-differentiating agent. Without being bound by theory, dilution appears to increase differentiation as cells become less dense, and proliferation-stimulating factors are less concentrated. Thus, the addition of a medium can further improve transdifferentiation, and will affect the type of cell that is obtained in the cell lineage. For example, if the target cell is a neuron, adding culture medium may result in a developmental shift towards a more mature neuron rather than a progenitor of neurons (both having the same lineage). As another example, forward differentiation of skeletal muscle progenitors will only differentiate by a consecutive dilution of the culture medium which is achieved by gradually decreasing the serum concentration.

Cellules redifférenciées Redifferentiated cells

[0081 ] Les cellules rétro-différenciées peuvent être utilisées pour obtenir des cellules cibles en redéterminant ou redifférenciant les cellules rétro-différenciées en un type de cellule cible. Ceci peut être effectué en mettant en contact des cellules rétro-différenciées avec des facteurs de croissance. Par exemple, de l’acide rétinoïque a été utilisé pour différencier des cellules souches en cellules neuronales. De la méthylcellulose suivie par une co-culture avec une ligne stromale de moelle osseuse et IL-7 a été utilisée pour différencier des cellules souches en précurseurs de lymphocytes (Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: pages 909 à 916). Le Page (New Scientist, Dec. 16, 2000) enseigne que des cellules souches peuvent être différenciées en cellules épithéliales de poumons. Bischoff (Dev Biol 1986, 1 15: pages 129 à 139) enseigne comment différencier des cellules satellites de muscle en fibres musculaires matures. Des cellules précurseurs neuronales peuvent être agrandies avec un facteur de croissance de fibroblastes et un facteur de croissance épidermique basiques (Nakafuku et Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41 : pages 153 à 168). Des cellules souches hématopoïétiques peuvent être dilatées en utilisant plusieurs facteurs de croissance, y compris GM-CSF, de l’érythropoïétine, un facteur de cellules souches et des interleukines (IL-1 , IL-3, IL-6) - voir Metcalf (Nature 1989, 339: pages 27-30) pour un résumé de ces différents facteurs. Retro-differentiated cells can be used to obtain target cells by redetermining or redifferentiating the retro-differentiated cells into a target cell type. This can be done by contacting retro-differentiated cells with growth factors. For example, retinoic acid has been used to differentiate stem cells into neuronal cells. Methylcellulose followed by co-culture with a bone marrow stromal line and IL-7 has been used to differentiate stem cells into lymphocyte precursors (Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: pages 909-916). The Page (New Scientist, Dec. 16, 2000) teaches that stem cells can be differentiated into lung epithelial cells. Bischoff (Dev Biol 1986, 115: pages 129-139) teaches how to differentiate muscle satellite cells into mature muscle fibers. Neuronal precursor cells can be enlarged with basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor (Nakafuku and Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41: pages 153-168). Hematopoietic stem cells can be dilated using several growth factors, including GM-CSF, erythropoietin, stem cell factor, and interleukins (IL-1, IL-3, IL-6) - see Metcalf ( Nature 1989, 339: pages 27-30) for a summary of these different factors.

[0082] Potocnik et al. (EMBO J 1994, 13: pages 5274 à 83) ont même démontré la différenciation de cellules souches en cellules hématopoïétiques en utilisant des conditions de faible teneur en oxygène (5%). [0082] Potocnik et al. (EMBO J 1994, 13: pages 5274 to 83) even demonstrated the differentiation of stem cells into hematopoietic cells using conditions of low oxygen content (5%).

[0083] La cellule redifférenciée peut être du même lignage que la cellule déterminée d’où provient la cellule rétro-différenciée. En variante, la cellule redifférenciée peut être d’un lignage différent de la cellule déterminée d’où provient la cellule rétro-différenciée. Par exemple, un lymphocyte B peut être rétro-différencié en une cellule souche CD34<+>CD38<_>HLA-DR<“>. Cette cellule souche peut ensuite être redifférenciée ou redéterminée le long d’un lignage cellulaire B (le même lignage) ou d’un lignage lymphoïde (lignage différent). The redifferentiated cell can be of the same lineage as the determined cell from which the retro-differentiated cell originates. Alternatively, the redifferentiated cell may be of a different lineage from the specific cell from which the retro-differentiated cell originated. For example, a B lymphocyte can be back-differentiated into a CD34 <+> CD38 <_> HLA-DR <“> stem cell. This stem cell can then be redifferentiated or redetermined along a B cell lineage (the same lineage) or a lymphoid lineage (different lineage).

Cellules cibles Target cells

[0084] Les cellules cibles de la présente invention sont des cellules reprogrammées qui peuvent être obtenues par rétrodifférenciation, transdifférenciation ou redifférenciation, comme décrit ci-dessus. Selon la présente invention, les cellules cibles peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, des cellules souches myéloïdes, des cellules souches neuronales, des cellules satellites de muscle squelettique, des cellules souches épithéliales, des cellules souches endodermiques neuroectodermiques, des cellules germinales, des cel- The target cells of the present invention are reprogrammed cells which can be obtained by back-differentiation, transdifferentiation or redifferentiation, as described above. According to the present invention, target cells can include, but are not limited to, pluripotent stem cells, lymphoid stem cells, myeloid stem cells, neuronal stem cells, skeletal muscle satellite cells, epithelial stem cells, neuroectodermal endodermal stem cells, germ cells, cells

18 Iules souches extra-embryonnaires et embryonnaires, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules de rein, des cellules d’épithélium alvéolaires, des cellules d’endoderme, des neurones, des cellules d’ectoderme, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des oocytes, du sperme, des cellules hématopoïétiques, des hépatocytes, de la peau/des kératinocytes, des mélanocytes, de l’os/des ostéocytes, des cheveux/des cellules de bulbe pileux, du cartilage/des chondrocytes, des cellules grasses/adipocytes, des cellules squeletto-musculaires, des cellules d’endothélium, des cellules de muscle cardiaque/cardiomyocytes, et des tropoblastes. 18 Extra-embryonic and embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, kidney cells, alveolar epithelium cells, endoderm cells, neurons, ectoderm cells, islets of Langerhans, acinar cells, oocytes, sperm, hematopoietic cells, hepatocytes, skin / keratinocytes, melanocytes, bone / osteocytes, hair / hair bulb cells, cartilage / chondrocytes, fatty cells / adipocytes, skeletal muscle cells, endothelium cells, cardiac muscle cells / cardiomyocytes, and tropoblasts.

[0085] Comme décrit ci-dessus, des cellules déterminées et/ou des cellules rétro-différenciées sont mises en culture dans des conditions particulières pour induire une rétro-différenciation et/ou une trans-différenciation et/ou une redifférenciation, et obtenir les cellules cibles. La durée pendant laquelle les cellules déterminées et/ou les cellules rétro-différenciées sont mises en culture n’est pas commandée par un laps de temps particulier, mais plutôt par la détermination que les cellules cibles ont été produites. As described above, determined cells and / or retro-differentiated cells are cultured under specific conditions to induce retro-differentiation and / or trans-differentiation and / or redifferentiation, and to obtain them. target cells. The length of time that determined cells and / or retro-differentiated cells are cultured is not driven by a particular time period, but rather by the determination that the target cells have been produced.

[0086] La détermination de la production de, ou des changements du nombre de, cellules cibles rétro-différenciées, transdifférenciées ou redifférenciées peut être effectuée en surveillant les changements du nombre relatif de cellules déterminées qui régulent à la baisse l’expression de marqueurs associés au lignage ou de facteurs de transcription, et/ou les changements du nombre relatif de cellules ayant une caractéristique de marqueurs de surface de cellules des cellules cibles. En variante, ou de plus, des diminutions du nombre de cellules ayant des marqueurs de surface de cellule typiques de la cellule déterminée, et non pas des cellules cibles, peuvent être surveillées. Par exemple, la cellule cible peut-être une cellule souche embryonnaire, qui est caractérisée par des marqueurs spécifiques à de nombreux stades, comme POU5F1 (OCT-4), TERT, KLF4, UTF1 , SOX2, Nanog ou de marqueurs embryonnaires spécifiques à un stade 3 et 4 (SSEA-3 et SSEA-4), des glycoprotéines à poids moléculaire élevé TRA-1 -60 et TRA-1 -81 et du phosphatase alcalin (Andrews et al., Hybridoma 1984, 3: pages 347 à 361 ; Kannagi et al., EMBO J 1983, 2: pages 2355 à 2361 ; Fox et al., Dev Biol 1984, 103: pages 263 à 266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: pages 169 à 173). Ils n’expriment également pas SSEA-1 , dont la présence est un indicateur de différenciation. D’autres marqueurs sont connus pour d’autres types de cellules souches, comme Nestein pour des cellules souches neuro-épithéliales (J Neurosci 985, 5: 3310). Des cellules souches mésenchymateuses sont positives pour SH2, SH3, CD29, CD44, CD71 , CD90, CD106, CD120a et CD124, par exemple, et négatives pour CD34, CD45 et CD14. Des cellules souches pluripotentes sont des cellules CD34<+>DR<_>TdT<“>(d’autres marqueurs utiles étant CD38- et CD36<+>). Des cellules souches lymphoïdes sont des cellules DR<+>, CD34<+>et TdT<+>(également CD38<+>). Des cellules souches myéloïdes sont des cellules CD34<+>, DR<+>, CD13<+>, CD33<+>, CD7<+>et TdT<+>. Determination of the production of, or changes in the number of, retro-differentiated, transdifferentiated or redifferentiated target cells can be performed by monitoring changes in the relative number of cells determined which downregulate the expression of associated markers. lineage or transcription factors, and / or changes in the relative number of cells having a characteristic of cell surface markers of target cells. Alternatively, or in addition, decreases in the number of cells having cell surface markers typical of the determined cell, and not target cells, can be monitored. For example, the target cell may be an embryonic stem cell, which is characterized by specific markers at many stages, such as POU5F1 (OCT-4), TERT, KLF4, UTF1, SOX2, Nanog or embryonic markers specific to a stage 3 and 4 (SSEA-3 and SSEA-4), high molecular weight glycoproteins TRA-1 -60 and TRA-1 -81 and alkaline phosphatase (Andrews et al., Hybridoma 1984, 3: pages 347 to 361 ; Kannagi et al., EMBO J 1983, 2: pages 2355-2361; Fox et al., Dev Biol 1984, 103: pages 263-266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: pages 169-173). They also do not express SSEA-1, the presence of which is an indicator of differentiation. Other markers are known for other types of stem cells, such as Nestein for neuroepithelial stem cells (J Neurosci 985, 5: 3310). Mesenchymal stem cells are positive for SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a and CD124, for example, and negative for CD34, CD45 and CD14. Pluripotent stem cells are CD34 <+> DR <_> TdT <"> cells (other useful markers are CD38- and CD36 <+>). Lymphoid stem cells are DR <+>, CD34 <+> and TdT <+> (also CD38 <+>) cells. Myeloid stem cells are CD34 <+>, DR <+>, CD13 <+>, CD33 <+>, CD7 <+> and TdT <+> cells.

[0087] Des marqueurs de cellules supplémentaires pour des cellules cibles peuvent être découverts par analyse par puce à ADN. L’analyse peut impliquer d’isoler de TARN depuis des cellules cibles qui ont été rétro-différenciées et/ou trans-différenciées et/ou redifférenciées, d’étiqueter l’ARN isolé avec une teinture, et d’hybridiser l’ARN isolé sur une puce à ADN. La puce à ADN peut comporter des gènes ou des oligonucléotides représentant un génome entier, ou peut comporter des gènes ou des oligonucléotides concernant un système organique particulier, un système tissulaire particulier, une maladie et une pathologie particulières, etc. Des marqueurs de cellules peuvent être identifiés, par lesquels des gènes/oligonucléotides présentent une intensité de signal élevée, et sont ainsi régulés à la hausse ou à la baisse dans les cellules cibles. Cette information peut ensuite être appliquée pour déterminer des cellules cibles sur la base de la présence de marqueurs, ou même de groupes ou d’un motif de marqueurs, qui ont été identifiés par l’analyse par puce à ADN. [0087] Additional cell markers for target cells can be discovered by microarray analysis. The assay may involve isolating RNA from target cells that have been back-differentiated and / or trans-differentiated and / or redifferentiated, labeling the isolated RNA with a dye, and hybridizing the isolated RNA. on a DNA chip. The DNA chip may contain genes or oligonucleotides representing an entire genome, or may include genes or oligonucleotides relating to a particular organ system, a particular tissue system, a particular disease and pathology, etc. Cell markers can be identified, by which genes / oligonucleotides exhibit high signal intensity, and thus are upregulated or downregulated in target cells. This information can then be applied to determine target cells based on the presence of markers, or even groups or pattern of markers, that have been identified by microarray analysis.

[0088] Une confirmation de cellules cibles peut également être effectuée en utilisant plusieurs dosages in vitro comme des dosages CFC (voir également les exemples). Des cellules souches hématopoïétiques très primitives sont souvent mesurées en utilisant un dosage de cellules initiatrices de culture à long terme (LTC-IC) (Eaves et al., J Tiss Cuit Meth 1991 , 13: pages 55 à 62). Les LTC-ICs soutiennent une hématopoïèse pendant 5 à 12 semaines. Confirmation of target cells can also be performed using multiple in vitro assays such as CFC assays (see also examples). Very primitive hematopoietic stem cells are often measured using a long-term culture initiator cell assay (LTC-IC) (Eaves et al., J Tiss Cuit Meth 1991, 13: pages 55-62). LTC-ICs support hematopoiesis for 5 to 12 weeks.

[0089] Pour d’autres types de cellules comme des cellules du système nerveux central, du pancréas, du foie, du rein, de la peau, etc., une culture de cellules peut continuer jusqu’à ce que les cellules cibles émergent telles que caractérisées par immunohistochimie, cytométrie en flux, puce à ADN, ou réaction en chaîne de polymérase à transcription inverse (RTPCR), qui sont des techniques connues dans le domaine. Il peut s’agir également de dosages fonctionnels, par exemple, d’une greffe d’un hôte immunodéficient ou d’une correction ou d’une amélioration d’un état clinique sous-jacent, comme observé ici. [0089] For other types of cells such as cells of the central nervous system, pancreas, liver, kidney, skin, etc., cell culture can continue until target cells emerge such as. as characterized by immunohistochemistry, flow cytometry, microarray, or reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR), which are techniques known in the art. They can also be functional assays, for example, a transplant of an immunodeficient host or a correction or improvement of an underlying clinical condition, as seen herein.

[0090] Les cellules cibles peuvent être identifiées par puce à ADN ou RT-PCR qui montre l’acquisition de nouveaux facteurs de transcription spécifiques à un lignage, de protéines, et de signaux dans les cellules cibles. Par exemple, des cellules souches rétro-différenciées converties en cellules cibles du lignage ectodermique peuvent exprimer des gènes comme Nestin, Criptol, isl1 , LHX1 , et/ou EN1 , et si elles sont en outre différenciées en neurones, elles vont exprimer des neurofilaments (NF). D’autre part, des cellules converties en cellules cibles du lignage endodermique peuvent exprimer des gènes comme sox7, sox 17, Nodal, PDX1 , et/ou FOXA2; mais des cellules cibles différenciées en outre vers des îlots de Langerhans pancréatiques peuvent exprimer des gènes comme insuline (INS) et neurog3 (NGN3). De manière notable, la conversion vers les cellules cibles souhaitées peut être accompagnée par une régulation à la baisse de facteurs de transcription matures associés à la population de départ d’origine qui a subi une conversion. [0090] Target cells can be identified by microarray or RT-PCR which shows the acquisition of new lineage-specific transcription factors, proteins, and signals in target cells. For example, retro-differentiated stem cells converted to target cells of the ectodermal lineage can express genes like Nestin, Criptol, isl1, LHX1, and / or EN1, and if they are further differentiated into neurons, they will express neurofilaments ( NF). On the other hand, cells converted to target cells of the endodermal lineage can express genes like sox7, sox 17, Nodal, PDX1, and / or FOXA2; but target cells further differentiated to pancreatic islets of Langerhans can express genes such as insulin (INS) and neurog3 (NGN3). Notably, the conversion to the desired target cells may be accompanied by down-regulation of mature transcription factors associated with the original starting population that has undergone conversion.

19 [0091 ] De plus, la détermination de la production de cellules cibles peut survenir en reconnaissant des caractéristiques structurelles et/ou morphologiques particulières des cellules cibles, par exemple la forme et la dimension de la cellule, etc. Ces caractéristiques sont connues dans la technique pour les cellules cibles de la présente invention. [0091] In addition, the determination of the production of target cells can occur by recognizing particular structural and / or morphological characteristics of the target cells, for example the shape and size of the cell, etc. These characteristics are known in the art for the target cells of the present invention.

[0092] Une fois que les nombres relatifs du type de cellule souhaité ont augmenté jusqu’à un niveau adapté, qui peut être par exemple aussi bas que 0,1 % ou aussi élevé que 5%, les populations de cellules modifiées résultantes peuvent être utilisées de plusieurs manières. Par rapport au nombre de cellules cibles, par exemple des cellules souches pluripotentes, formées, il est important d’apprécier l’aptitude à la prolifération de cellules souches. Bien que dans certaines circonstances, les nombres de cellules souches ou d’autres cellules rétro-différenciées formées puissent apparaître comme étant bas, des études ont montré que 50 cellules souches hématopoïétiques pluripotentes peuvent reconstituer à elles seules un système hématopoïétique entier chez une souris donneuse. Ainsi, l’utilité thérapeutique ne nécessite pas la formation d’un grand nombre de cellules. Once the relative numbers of the desired cell type have increased to a suitable level, which may be, for example, as low as 0.1% or as high as 5%, the resulting modified cell populations may be used in several ways. In relation to the number of target cells, eg pluripotent stem cells, formed, it is important to assess the proliferation ability of stem cells. Although under some circumstances the numbers of stem cells or other retro-differentiated cells formed may appear to be low, studies have shown that 50 pluripotent hematopoietic stem cells on their own can reconstitute an entire hematopoietic system in a donor mouse. Thus, therapeutic utility does not require the formation of a large number of cells.

[0093] Une conversion de cellules déterminées en cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées peut également être effectuée in vivo par administration de l’agent, mélangé avec un porteur ou diluant pharmaceutique, à un patient. Cependant, on préfère dans de nombreux cas qu’une rétro-différenciation, une trans-différenciation ou une redifférenciation soit effectuée in vitro/ex vivo. [0093] A conversion of determined cells into retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated target cells can also be carried out in vivo by administering the agent, mixed with a pharmaceutical carrier or diluent, to a patient. However, in many instances it is preferred that retro-differentiation, trans-differentiation or redifferentiation be performed in vitro / ex vivo.

[0094] Des populations de cellules traitées obtenues in vitro peuvent ensuite être utilisées avec un traitement minimum. Par exemple, elles peuvent être simplement combinées à un porteur ou diluant pharmaceutiquement acceptable, et administrées à un patient ayant besoin de cellules souches. [0094] The populations of treated cells obtained in vitro can then be used with a minimum treatment. For example, they can be simply combined with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and administered to a patient in need of stem cells.

[0095] Il peut cependant être souhaitable d’enrichir la population de cellules pour les cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciée, ou de purifier les cellules de la population de cellules. Ceci peut être effectué de manière pratique en utilisant plusieurs procédés (voir Vattese-Dadey-The Scientist 1999, 13). Par exemple, des cellules peuvent être purifiées sur la base de marqueurs de surface de cellule en utilisant une chromatographie et/ou une cytométrie en flux. Néanmoins, il sera souvent ni nécessaire ni souhaitable de purifier intensivement des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées à partir de la population de cellules, puisque d’autres cellules présentes dans la population (par exemple des cellules stromales) peuvent maintenir la viabilité et la fonction de cellules souches. [0095] However, it may be desirable to enrich the cell population for retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated target cells, or to purify cells from the cell population. This can be done conveniently using several methods (see Vattese-Dadey-The Scientist 1999, 13). For example, cells can be purified on the basis of cell surface markers using chromatography and / or flow cytometry. However, it will often be neither necessary nor desirable to extensively purify retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated target cells from the population of cells, since other cells present in the population (e.g. stromal cells) may maintain viability and function of stem cells.

[0096] Une cytométrie en flux est une technique bien établie, fiable et puissante pour caractériser des cellules chez des populations mixtes, de même que pour trier des cellules. Ainsi, les moyens de purification ou d’isolement peuvent comprendre ainsi un cytomètre en flux. Une cytométrie en flux fonctionne sur la base de caractéristiques physiques de particules dans une suspension liquide, que l’on peut distinguer en interrogeant avec un faisceau de lumière. De telles particules peuvent bien sûr être des cellules. Des caractéristiques physiques comprennent la dimension et la structure cellulaire ou, comme cela est devenu très populaire ces dernières années, des marqueurs de surface de cellule liés par des anticorps monoclonaux conjugués à des molécules fluorescentes. [0096] Flow cytometry is a well established, reliable and powerful technique for characterizing cells in mixed populations, as well as for sorting cells. Thus, the purification or isolation means can thus comprise a flow cytometer. Flow cytometry works on the basis of physical characteristics of particles in a liquid suspension, which can be distinguished by interrogating with a beam of light. Such particles can of course be cells. Physical characteristics include cell size and structure or, as has become very popular in recent years, cell surface markers bound by monoclonal antibodies conjugated to fluorescent molecules.

[0097] Kreisseg et al. (J Hematother 1994, 3: pages 263 à 89) établissent que, «du fait de la disponibilité d’anticorps monoclonaux anti-CD34, une cytométrie en flux à plusieurs paramètres est devenue l’outil de choix pour déterminer des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices. » Kreisseg décrit en outre des techniques courantes pour quantifier et caractériser des cellules exprimant CD34 par cytométrie en flux. En outre, Korbling et al., (Bone Marrow Transplant 1994, 13: pages 649 à 654) enseigne la purification de cellules CD34<+>par immunoadsorption suivi par une cytométrie en flux, sur la base d’une expression de HLA-DR comme décrit ci-dessus, CD34<+>est un marqueur utile en association avec des cellules souches/cellules progénitrices. Des techniques de cytométrie en flux pour trier des cellules souches sur la base d’autres caractéristiques physiques sont également disponibles. Par exemple, Visser et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 391 à 407) enseigne que des cellules souches peuvent être isolées sur la base de leur taille et de leur degré de structuration. Grogan et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 625 à 644) enseigne également que des «cellules souches viables peuvent être triées à partir de tissus hématopoïétiques simples en pureté élevée et vérifiable». Kreisseg et al. (J Hematother 1994, 3: pages 263 to 89) establish that, "due to the availability of anti-CD34 monoclonal antibodies, multiparameter flow cytometry has become the tool of choice for determining hematopoietic stem cells and progenitor cells. Kreisseg further describes common techniques for quantifying and characterizing cells expressing CD34 by flow cytometry. In addition, Korbling et al., (Bone Marrow Transplant 1994, 13: pages 649-654) teaches the purification of CD34 <+> cells by immunoadsorption followed by flow cytometry, based on HLA-DR expression. as described above, CD34 <+> is a useful marker in association with stem cells / progenitor cells. Flow cytometry techniques for sorting stem cells on the basis of other physical characteristics are also available. For example, Visser et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 391-407) teaches that stem cells can be isolated on the basis of their size and degree of structuring. Grogan et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 625-644) also teaches that "viable stem cells can be sorted from simple hematopoietic tissue in high and verifiable purity".

[0098] De même qu’une sélection de cellules sur la base de la présence d’un marqueur de surface de cellules ou d’une autre propriété physique (sélection positive), des populations de cellules peuvent être enrichies et purifiées en utilisant des critères négatifs. Par exemple, des cellules qui possèdent des marqueurs spécifiques à un lignage, comme CD4, CD8, CD42 et CD3, peuvent être enlevés de la population de cellules par cytométrie en flux ou chromatographie d’affinité. As well as selection of cells based on the presence of a cell surface marker or other physical property (positive selection), populations of cells can be enriched and purified using criteria. negative. For example, cells that have lineage-specific markers, such as CD4, CD8, CD42, and CD3, can be removed from the cell population by flow cytometry or affinity chromatography.

[0099] Une technique très utile pour purifier des cellules implique l’utilisation d’anticorps ou d’autres ligands d’affinité liés à des billes magnétiques. Les billes sont incubées avec la population de cellules, et les cellules qui ont un marqueur de surface de cellule, comme CD34, auquel se lie le ligand d’affinité, sont capturées. Le tube échantillon contenant les cellules est placé dans un concentrateur d’échantillon magnétique où les billes sont attirées vers les côtés du tube. Après une ou plusieurs étapes de lavage, les cellules intéressantes ont été partiellement ou sensiblement complètement purifiées des autres cellules. Lors d’une utilisation dans un format de sélection négative, au lieu de laver les cellules liées aux billes en mettant la phase liquide au rebut, la phase liquide est conservée et ensuite, les cellules liées aux billes sont enlevées efficacement de la population de cellules. One very useful technique for purifying cells involves the use of antibodies or other affinity ligands bound to magnetic beads. The beads are incubated with the cell population, and cells which have a cell surface marker, such as CD34, to which the affinity ligand binds, are captured. The sample tube containing the cells is placed in a magnetic sample concentrator where the beads are attracted to the sides of the tube. After one or more washing steps, the cells of interest have been partially or substantially completely purified from other cells. When used in a negative selection format, instead of washing the cells bound to the beads by discarding the liquid phase, the liquid phase is retained and then the cells bound to the beads are efficiently removed from the cell population. .

[0100] Ces procédés de vérification à base de ligand d’affinité peuvent être utilisés avec tout type de cellule pour lequel des marqueurs adaptés ont été caractérisés, ou peuvent être caractérisés. Urbankova et al. (J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: pages 449 à 452) enseigne la micro-préparation de cellules souches hématopoïétiques depuis une suspension [0100] These affinity ligand-based verification methods can be used with any type of cell for which suitable markers have been characterized, or can be characterized. Urbankova et al. (J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: pages 449 to 452) teaches the micro-preparation of hematopoietic stem cells from a suspension

20 de moelle osseuse de souris par fractionnement de champ-écoulement gravitationnels. Urbankova et al. font en outre comme commentaire que le procédé a été utilisé pour la caractérisation de cellules souches provenant d’une moelle épinière de souris du fait que ces cellules sont plus grosses que les autres cellules dans la moelle épinière, et qu’il est par conséquent possible de les séparer du mélange. Ainsi des paramètres physiques autres que des marqueurs de surface de cellule peuvent être utilisés pour purifier/enrichir des cellules souches. 20 of mouse bone marrow by gravitational field-flow fractionation. Urbankova et al. further comment that the method was used for the characterization of stem cells from a mouse spinal cord because these cells are larger than other cells in the spinal cord, and therefore it is possible to separate them from the mixture. Thus, physical parameters other than cell surface markers can be used to purify / enrich stem cells.

[0101 ] Des populations de cellules comportant des cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées, et/ou des cellules cibles reprogrammées purifiées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées produites par les procédés de la présente invention, peuvent être conservées in vitro en utilisant des techniques connues. Typiquement, des milieux de croissance minimum comme Hanks, RPMI 1640, milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) ou milieu essentiel minimum de Dulbecco modifié selon Iscove, sont utilisés, complétés avec du sérum de mammifère comme FBS, et facultativement du plasma autologue, afin de fournir un environnement de croissance adapté pour les cellules. Les cellules souches peuvent être mises en culture sur des couches d’alimentation comme des couches de cellules stromales (voir Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: pages 1 15 à 150). Les cellules stromales sont censées sécréter des facteurs qui maintiennent des cellules progénitrices dans un état indifférencié. Un système de culture à long terme de cellules souches est décrit par Dexter et al. (J Cell Physiol 1977, 91 : 335) et Dexter et al. (Acta Haematol 1979, 62: 299). [0101] Populations of cells comprising reprogrammed target cells, such as retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated target cells, and / or purified reprogrammed target cells, such as retro-differentiated, trans-differentiated or redifferentiated target cells produced by the methods of the present invention, can be preserved in vitro using known techniques. Typically, minimum growth media such as Hanks, RPMI 1640, Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) or Dulbecco's minimum essential medium modified according to Iscove, are used, supplemented with mammalian serum such as FBS, and optionally autologous plasma, in order to to provide a suitable growth environment for cells. Stem cells can be cultured on feed layers such as stromal cell layers (see Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: pages 115-150). Stromal cells are believed to secrete factors that keep progenitor cells in an undifferentiated state. A long-term stem cell culture system is described by Dexter et al. (J Cell Physiol 1977, 91: 335) and Dexter et al. (Acta Haematol 1979, 62: 299).

[0102] Par exemple, Lebkowski et al. (Transplantation 1992, 53: 101 1-9) enseigne que des cellules hématopoïétiques CD34<+>humaines peuvent être purifiées en utilisant une technologie basée sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux qui sont immobilisés de manière covalente sur des surfaces en polystyrène, et que les cellules CD34<+>purifiées par ce procédé peuvent être conservées avec une viabilité supérieure à 85%. Lebkowski et al., (J Hematother 1993, 2: pages 339 à 342) enseigne également comment isoler et cultiver des cellules CD34<+>humaines. Voir également Haylock et al. (Immunomethods 1994, 5: pages 217-25) pour une revue des différents procédés. [0102] For example, Lebkowski et al. (Transplantation 1992, 53: 101 1-9) teaches that human CD34 <+> hematopoietic cells can be purified using technology based on the use of monoclonal antibodies which are covalently immobilized on polystyrene surfaces, and that the CD34 <+> cells purified by this method can be preserved with a viability greater than 85%. Lebkowski et al., (J Hematother 1993, 2: pages 339-342) also teach how to isolate and cultivate human CD34 <+> cells. See also Haylock et al. (Immunomethods 1994, 5: pages 217-25) for a review of the different methods.

[0103] Des populations de cellules comprenant des cellules souches et des préparations purifiées comprenant des cellules souches peuvent être congelées/cryo-préservées pour une utilisation future. Des techniques adaptées pour congeler des cellules et ensuite les faire revivre sont connues dans la technique. [0103] Populations of cells comprising stem cells and purified preparations comprising stem cells can be frozen / cryo-preserved for future use. Suitable techniques for freezing cells and then reviving them are known in the art.

[0104] Selon un premier aspect, la rétro-différenciation, trans-différenciation ou redifférenciation survient sur des cellules provenant d’échantillons de couche leucocyto-plaquettaire, ou dans ceux-ci. L’expression «couche leucocyto-plaquettaire» signifie la couche de globules blancs qui se forme entre la couche de globules rouges et le plasma lorsque du sans non coagulé est centrifugé ou laissé à reposer. [0104] According to a first aspect, retro-differentiation, trans-differentiation or redifferentiation occurs on cells originating from buffy-coat samples, or in these. The term "buffy coat" means the layer of white blood cells that forms between the layer of red blood cells and the plasma when uncoagulated free is centrifuged or allowed to stand.

Procédés de traitement Treatment processes

[0105] Des cellules cibles reprogrammées de la présente invention, comme des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles trans-différenciées et des cellules cibles redifférenciées, peuvent être combinées avec différents composants pour produire des compositions de la présente invention. Les compositions peuvent être combinées avec un ou plusieurs porteurs ou diluants pharmaceutiquement acceptables pour produire une composition pharmaceutique (qui peut être destinée à une utilisation humaine ou animale). Des porteurs et diluants adaptés comprennent, mais sans s’y limiter, des solutions salines isotoniques, par exemple une solution tamponnée par phosphate. La composition de la présente invention peut être administrée par injection directe. La composition peut être formulée pour une administration parentérale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intraoculaire, buccale, transdermique, ou pour une injection dans le liquide céphalo-rachidien. [0105] Reprogrammed target cells of the present invention, such as retro-differentiated target cells, trans-differentiated target cells, and redifferentiated target cells, can be combined with various components to produce compositions of the present invention. The compositions can be combined with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents to produce a pharmaceutical composition (which can be for human or animal use). Suitable carriers and diluents include, but are not limited to, isotonic saline solutions, eg, phosphate buffered solution. The composition of the present invention can be administered by direct injection. The composition can be formulated for parenteral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraocular, buccal, transdermal administration, or for injection into cerebrospinal fluid.

[0106] Des compositions comprenant des cellules cibles peuvent être administrées par injection ou implantation. Les cellules peuvent être délivrées dans une suspension, ou enrobées dans une matrice de support, comme des matrices naturelles et/ou synthétiques biodégradables. Des matrices naturelles comportent, mais sans s’y limiter, des matrices de collagène. Des matrices biodégradables synthétiques comportent, mais sans s’y limiter, des polyanhydrides et de l’acide polylactique. Ces matrices peuvent fournir un support pour des cellules fragiles in vivo. [0106] Compositions comprising target cells can be administered by injection or implantation. The cells can be delivered in a suspension, or embedded in a support matrix, such as natural and / or synthetic biodegradable matrices. Natural matrices include, but are not limited to, collagen matrices. Synthetic biodegradable matrices include, but are not limited to, polyanhydrides and polylactic acid. These matrices can provide support for fragile cells in vivo.

[0107] Les compositions peuvent également comporter les cellules cibles rétro-différenciées ou trans-différenciées ou redifférenciées de la présente invention, et au moins un excipient, porteur ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. The compositions may also comprise the retro-differentiated or trans-differentiated or redifferentiated target cells of the present invention, and at least one pharmaceutically acceptable excipient, carrier or vehicle.

[0108] Une administration peut également être effectuée par une administration commandée, c’est-à-dire une administration sur un laps de temps qui peut être de plusieurs minutes à plusieurs heures ou plusieurs jours. L’administration peut être systémique (par exemple par injection intraveineuse), ou dirigée vers un site d’intérêt particulier. Des cellules peuvent être introduites in vivo en utilisant un transfert de liposomes. [0108] Administration can also be effected by controlled administration, that is, administration over a period of time which can be several minutes to several hours or several days. Administration can be systemic (eg by intravenous injection), or directed to a site of particular interest. Cells can be introduced in vivo using liposome transfer.

[0109] Des cellules cibles peuvent être administrées en doses allant de 1 x 10<5>à 1 x 10<7>cellules par kilo. Par exemple, 14 x 10<6>cellules CD34<+>peuvent être administrées à un patient de 70 kg pour une reconstitution tissulaire. Les dosages peuvent être toute combinaison des cellules cibles listées dans cette demande. [0109] Target cells can be administered in doses ranging from 1 x 10 <5> to 1 x 10 <7> cells per kilogram. For example, 14 x 10 <6> CD34 <+> cells can be administered to a 70 kg patient for tissue reconstitution. Assays can be any combination of the target cells listed in this application.

[0110] Les procédés de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter divers troubles, états ou maladies. De tels états comportent, mais sans s’y limiter, une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie β, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, une maladie du foie, la sclérose en plaques, une [0110] The methods of the present invention can be used to treat various disorders, conditions or diseases. Such conditions include, but are not limited to, bone marrow failure, hematologic conditions, aplastic anemia, β-thalassemia, diabetes, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease, spinal cord injury , muscular dystrophy, kidney disease, liver disease, multiple sclerosis,

21 insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, et une dystrophie cristalline/cécité, ou tout trouble associé à une dégénération tissulaire. 21 congestive heart failure, hepatitis C virus, HIV virus, head trauma, lung disease, depression, non-obstructive azoospermia, andropause, menopause and infertility, rejuvenation, ulcers scleroderma, psoriasis, wrinkles, cirrhosis of the liver, autoimmune disease, alopecia, retinitis pigmentosa, and crystal dystrophy / blindness, or any disorder associated with tissue degeneration.

[0111 ] Une anémie aplasique est un trouble rare mais fatal de la moelle osseuse, marqué par une pancytopénie et une moelle épinière hypocellulaire (Young et al. Blood 2006, 108: 2509-2519). Le trouble peut être provoqué par une pathophysiologie auto-immune, avec des cellules cytotoxiques T de type 1 activées exprimant la cytokine Th1 , en particulier un γ-interféron ciblé vers le compartiment de cellules souches hématopoïétiques, menant à une défaillance de la moelle épinière, et ainsi à une déficience hématopoïétique (Bacigalupo et al., Hematology 2007, pages 23 à 28). La majorité de patients souffrant d’une anémie aplasique peuvent être traités avec une transplantation de cellules souches obtenues par fratrie appariée en HLA (Locasciulli et al. Haematologica., 2007; 92:1 1-18.), bien que l’extension de cette approche à des patients plus âgés ou à ceux qui manquent de donneurs familiaux reste un défi important. En dépit du taux de survie raisonnable après transplantation de cellules souches allogéniques appariées en HLA, la procédure implique certains risques potentiels du fait du régime immunosuppresseur utilisé pour empêcher une réaction de greffon contre hôte (GVDH). Par exemple, du cyclophosphoamide à haute dose avec ou sans globuline antithymocyte (ATG) conduit à une période d’immunosuppression prolongée, et prédispose le patient à une infection opportuniste. Un autre risque potentiel est un rejet de greffe qui peut survenir des semaines ou des mois après une transplantation de cellules souches (Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981 , 141 : pages 758 à 763; Sanders et al., Semin Hematol 1991 , 28: 244-249). De plus, le risque de rejet de greffe augmente avec le nombre de transfusions sanguines reçues avant une transplantation de cellules souches. [0111] Aplastic anemia is a rare but fatal disorder of the bone marrow marked by pancytopenia and a hypocellular spinal cord (Young et al. Blood 2006, 108: 2509-2519). The disorder may be caused by autoimmune pathophysiology, with activated type 1 cytotoxic T cells expressing the cytokine Th1, in particular a γ-interferon targeted to the hematopoietic stem cell compartment, leading to spinal cord failure, and thus to hematopoietic deficiency (Bacigalupo et al., Hematology 2007, pages 23 to 28). The majority of patients with aplastic anemia can be treated with transplantation of stem cells obtained from HLA-matched siblings (Locasciulli et al. Haematologica., 2007; 92: 1 1-18.), Although the extension of this approach to older patients or to those who lack family donors remains a significant challenge. Despite the reasonable survival rate after transplantation of HLA-matched allogeneic stem cells, the procedure involves some potential risks due to the immunosuppressive regimen used to prevent a graft versus host reaction (GVDH). For example, high dose cyclophosphoamide with or without antithymocyte globulin (ATG) leads to a prolonged period of immunosuppression, and predisposes the patient to opportunistic infection. Another potential risk is transplant rejection which can occur weeks or months after stem cell transplantation (Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981, 141: pages 758 to 763; Sanders et al., Semin Hematol 1991, 28: 244-249). In addition, the risk of transplant rejection increases with the number of blood transfusions received before a stem cell transplant.

[0112] La thalassémie est une maladie du sang récessive autosomique héréditaire marquée par un taux de synthèse réduit d’une des chaînes de globine constituant l’hémoglobine. Il y a ainsi une sous-production des protéines de globine normales, souvent du fait de mutations de gènes régulateurs, ayant pour résultat la formation de molécules d’hémoglobine anormales, provoquant une anémie. Différents types de thalassémie comprennent une alpha-thalassémie, bêta-thalassémie et delta-thalassémie, qui affectent la production de Palpha-globine, bêta-globine et delta-globine, respectivement. Des traitements comprennent une transfusion sanguine chronique, une chélation de fer, une splénectomie, et une transplantation hématopoïétique allogénique. Cependant, une transfusion sanguine chronique n’est pas disponible pour la plupart des patients du fait du manque de donneur de moelle osseuse appariée en HLA, tandis qu’une transplantation hématopoïétique allogénique est associée à de nombreuses complications possibles, comme des infections et une réaction de greffon contre hôte. [0112] Thalassemia is an inherited autosomal recessive blood disease marked by a reduced rate of synthesis of one of the globin chains that make up hemoglobin. There is thus an underproduction of normal globin proteins, often due to mutations in regulatory genes, resulting in the formation of abnormal hemoglobin molecules, causing anemia. Different types of thalassemia include alpha-thalassemia, beta-thalassemia and delta-thalassemia, which affect the production of alpha-globin, beta-globin and delta-globin, respectively. Treatments include chronic blood transfusion, iron chelation, splenectomy, and allogeneic hematopoietic transplantation. However, chronic blood transfusion is not available for most patients due to the lack of an HLA-matched bone marrow donor, while allogeneic hematopoietic transplantation is associated with many possible complications, such as infections and reaction. graft versus host.

[0113] Le diabète est un syndrome résultant de niveaux de sucre anormalement élevés dans le sang (hyperglycémie). Le diabète fait référence à un groupe de maladies qui mènent à des niveaux de glucose sanguin élevés du fait de défauts de sécrétion d’insuline ou d’action d’insuline dans le corps. Les diabètes sont typiquement séparés en deux types: des diabètes de type 1 , marqués par une production diminuée d’insuline, ou des diabètes de type 2, marqués par une résistance aux effets de l’insuline. Les deux types mènent à une hyperglycémie, qui provoque largement les symptômes associés généralement aux diabètes, par exemple une production excessive d’urine, ayant pour résultat une soif de compensation, et une ingestion de liquide accrue, une vision troublée, une perte de poids inexpliquée, une léthargie, et un changement du métabolisme énergétique. Le diabète est considéré être une maladie chronique, c’est-à-dire sans guérison. Des options de traitement sont limitées à des injections d’insuline, de l’exercice, un régime adapté, ou pour des patients souffrant de diabète de type 2, à certains médicaments, par exemple ceux qui favorisent une sécrétion d’insuline par le pancréas, une diminution du glucose produit par le foie, une augmentation de la sensibilité des cellules à l’insuline, etc. [0113] Diabetes is a syndrome resulting from abnormally high levels of sugar in the blood (hyperglycemia). Diabetes refers to a group of diseases that lead to high blood glucose levels due to defects in insulin secretion or insulin action in the body. Diabetes are typically separated into two types: type 1 diabetes, marked by decreased production of insulin, or type 2 diabetes, marked by resistance to the effects of insulin. Both types lead to hyperglycemia, which largely causes the symptoms commonly associated with diabetes, such as excessive urine production, resulting in thirst for compensation, and increased fluid intake, blurred vision, weight loss. unexplained lethargy, and a change in energy metabolism. Diabetes is considered a chronic disease, that is, without cure. Treatment options are limited to insulin injections, exercise, diet, or for patients with type 2 diabetes, certain medications, for example those that promote insulin secretion by the pancreas , a decrease in the glucose produced by the liver, an increase in the sensitivity of cells to insulin, etc.

[0114] Une maladie de neurones moteurs fait référence à un groupe de troubles neurologiques qui affectent les neurones moteurs. De telles maladies comprennent une sclérose latérale amyotrophique (ALS), une sclérose latérale primaire (PLS), et une atrophie musculaire progressive (PMA). Une ALS est marquée par une dégénérescence des neurones moteurs supérieurs et inférieurs, qui cessent d’envoyer des messages aux muscles, en ayant pour résultat leur affaiblissement et une éventuelle atrophie. La PLS est une maladie de neurones moteurs rare affectant uniquement les neurones moteurs supérieurs, qui provoque des difficultés d’équilibre, de faiblesse et des rigidités dans les jambes, une spasticité, et des problèmes d’élocution. La PMA est un sous-type d’ALS qui affecte uniquement les neurones moteurs inférieurs, qui peut provoquer une atrophie musculaire, une fasciculation, et une faiblesse. Il n’y a pas de guérison connue pour des maladies de neurones moteurs. Le Riluzole, qui est considéré comme réduisant des dommages occasionnés aux neurones moteurs, a été approuvé en tant que médicament pour l’ALS, bien qu’il ralentisse la progression de l’ALS plutôt que d’en atténuer les effets. Pour la PLS, les traitements s’adressent uniquement aux symptômes, comme le Baclofen qui peut réduire la spasticité, ou la quinine qui peut diminuer les crampes. [0114] Motor neuron disease refers to a group of neurological disorders that affect motor neurons. Such diseases include amyotrophic lateral sclerosis (ALS), primary lateral sclerosis (PLS), and progressive muscular atrophy (PMA). SLA is marked by degeneration of the upper and lower motor neurons, which stop sending messages to muscles, resulting in their weakening and possible atrophy. PLS is a rare motor neuron disease affecting only the upper motor neurons, which causes balance difficulties, weakness and stiffness in the legs, spasticity, and speech problems. PMA is a subtype of ALS that affects only lower motor neurons, which can cause muscle atrophy, fasciculation, and weakness. There is no known cure for motor neuron diseases. Riluzole, which is believed to reduce damage to motor neurons, has been approved as a drug for ALS, although it slows the progression of ALS rather than mitigating its effects. For PLS, treatments are only for symptoms, such as Baclofen which can reduce spasticity, or quinine which can decrease cramps.

[0115] La maladie de Parkinson (PD) est un trouble neurodégénératif marqué par la perte de la voie striato-nigrale, résultant de la dégénérescence de neurones dopaminergiques dans le locus niger. La cause de la PD est inconnue, mais est associée à la mort progressive de neurones mésencéphaliques dopaminergiques (tyrosine hydroxylase (TH) positive), induisant une déficience motrice. Ainsi, la PD est caractérisée par une rigidité musculaire, des tremblements, une bradykinésie, et potentiellement une kinésie. Ainsi, il n’y a actuellement pas de cure satisfaisante pour la maladie de Parkinson, ni de traitement pour empêcher ou traiter la maladie de Parkinson, ou ses symptômes. Un traitement symptomatique des déficiences motrices associées à la maladie implique l’administration orale de dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), qui peut mener à une amélioration substantielle de la fonction motrice, mais dont les effets sont réduits comme la dégénérescence Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder marked by the loss of the striato-nigral pathway, resulting from the degeneration of dopaminergic neurons in the niger locus. The cause of PD is unknown, but is associated with the progressive death of dopaminergic mesencephalic neurons (tyrosine hydroxylase (TH) positive), leading to motor impairment. Thus, PD is characterized by muscle stiffness, tremors, bradykinesia, and potentially kinesia. Thus, there is currently no satisfactory cure for Parkinson's disease, nor a treatment to prevent or treat Parkinson's disease, or its symptoms. Symptomatic treatment of the motor impairments associated with the disease involves oral administration of dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), which can lead to substantial improvement in motor function, but the effects of which are reduced such as degeneration

22 des neurones dopaminergiques progresse. Des stratégies en variante comprenne une greffe neuronale, qui est basée sur l’idée que la dopamine alimentée depuis les cellules implantées dans le striatum peuvent se substituer aux cellules striato-nigrale perdues, et une thérapie génique, qui peut être utilisée pour remplacer la dopamine dans le striatum affecté en agrandissant les enzymes sensibles à L-DOPA ou une synthèse de dopamine, comme en introduisant des molécules neuroprotectrices potentielles qui peuvent empêcher les neurones TH-positifs de mourir, ou stimuler la régénération et la récupération fonctionnelle dans le système striato-nigral détérioré. 22 of dopaminergic neurons progressing. Alternative strategies include neuronal transplant, which is based on the idea that dopamine supplied from cells implanted in the striatum can substitute for lost striatal cells, and gene therapy, which can be used to replace dopamine. into the affected striatum by enlarging enzymes sensitive to L-DOPA or dopamine synthesis, such as by introducing potential neuroprotective molecules that can prevent TH-positive neurons from dying, or stimulate regeneration and functional recovery in the striato- system. nigral deteriorated.

[0116] Une blessure de la moelle épinière est caractérisée par une détérioration de la moelle épinière et, en particulier, des fibres nerveuses, en ayant pour résultat une déficience d’une partie ou de tous les muscles ou nerfs sous le site de blessure. Une telle détérioration peut survenir par un traumatisme occasionné à la colonne vertébrale qui se rompt, se disloque, s’écrase, ou par une compression d’une ou plusieurs vertèbres, ou par des blessures non-traumatiques provoquées par de l’arthrite, un cancer, une inflammation ou une dégénérescence de disques. Bien que des traitements suite à une blessure de la moelle épinière puissent impliquer des médicaments comme la méthylprédnisolone, qui est un corticostéroïde qui réduit la détérioration des cellules nerveuses et diminue l’inflammation dans la zone blessée, ou des médicaments pour contrôler la douleur et la spasticité musculaire, de même que l’immobilisation de la colonne vertébrale, ou une intervention chirurgicale pour enlever des disques à hernie ou tout objet susceptible de détériorer la colonne vertébrale, il n’existe pas de moyens connus pour inverser la détérioration de la moelle épinière. [0116] A spinal cord injury is characterized by damage to the spinal cord and, in particular, nerve fibers, resulting in impairment of some or all of the muscles or nerves below the site of injury. Such deterioration may arise from trauma to the ruptured, dislocated, crushed spine, or from compression of one or more vertebrae, or from non-traumatic injuries caused by arthritis, cancer, inflammation or degeneration of discs. Although treatments for a spinal cord injury may involve drugs like methylprednisolone, which is a corticosteroid that reduces damage to nerve cells and decreases inflammation in the injured area, or drugs to control pain and pain. muscle spasticity, as well as immobilization of the spine, or surgery to remove herniated discs or anything that could damage the spine, there are no known ways to reverse the damage to the spinal cord .

[0117] Une dystrophie musculaire (MD) indique un ensemble de maladies musculaires héréditaires qui affaiblissent les muscles squelettiques. Une MD peut-être caractérisée par un affaiblissement progressif des muscles, des défauts dans les protéines de muscle, une apoptose de cellules de muscle, et une atrophie tissulaire. Il y a plus de 100 maladies qui présentent des caractéristiques de MD, bien que neuf maladies en particulier - de Duchenne, de Becker, des ceintures, congénitale, facioscapulohumérale, myotonique, oculopharyngée, distale, et de Emery-Dreifuss - soient classées en tant que MD. Il n’y a pas de guérison connue pour une MD, ni même de traitements spécifiques. Une thérapie physique peut maintenir une tonicité musculaire, et une intervention chirurgicale peut être utilisée pour améliorer la qualité de vie. En outre, des symptômes comme la myotonie peuvent être traités avec des médicaments, mais il n’y a pas de traitement à long terme. [0117] Muscular dystrophy (MD) indicates a set of inherited muscle diseases that weaken the skeletal muscles. MD may be characterized by progressive muscle weakness, defects in muscle proteins, apoptosis of muscle cells, and tissue atrophy. There are over 100 diseases that exhibit features of MD, although nine diseases in particular - Duchenne, Becker, Girdle, Congenital, Facioscapulohumeral, Myotonic, Oculopharyngeal, Distal, and Emery-Dreifuss - are classified as that MD. There is no known cure for MD, nor even specific treatments. Physical therapy can maintain muscle tone, and surgery can be used to improve quality of life. Also, symptoms like myotonia can be treated with medication, but there is no long-term treatment.

[0118] Une maladie rénale indique des états qui détériorent les reins, et diminuent leur aptitude à fonctionner, comprenant l’enlèvement de déchets et de l’eau en excès depuis le sang, la régulation des électrolytes, de la pression sanguine, de l’équilibre acide-base, et la réabsorption de glucose et d’acides aminés. Les deux causes principales d’une maladie rénale sont le diabète et une pression sanguine élevée, bien que d’autres causes comprennent une glomérulonéphrite, un lupus, et des malformations et des obstructions dans le rein. Il n’y a pas de guérison d’une maladie rénale, et la thérapie se focalise ainsi sur un ralentissement de la progression de la maladie, et un traitement des causes de la maladie, comme en commandant le glucose sanguin et une pression sanguine élevée, et en surveillant l’alimentation; et un traitement des complications de la maladie, comme par exemple en s’occupant d’une rétention hydrique, d’une anémie, d’une maladie osseuse; et en remplaçant la fonction rénale perdue, comme par dialyse ou transplantation. [0118] Kidney disease indicates conditions which deteriorate the kidneys, and decrease their ability to function, including removing waste and excess water from the blood, regulating electrolytes, blood pressure, blood pressure, 'acid-base balance, and reabsorption of glucose and amino acids. The two main causes of kidney disease are diabetes and high blood pressure, although other causes include glomerulonephritis, lupus, and deformities and blockages in the kidney. There is no cure for kidney disease, and therapy thus focuses on slowing the progression of the disease, and treating the causes of the disease, such as controlling blood glucose and high blood pressure. , and monitoring feeding; and treatment of complications of the disease, for example by dealing with fluid retention, anemia, bone disease; and replacing lost kidney function, such as through dialysis or transplantation.

[0119] La sclérose en plaques est une maladie auto-immune dans laquelle le système immunitaire attaque le système nerveux central, en menant à une démyélinisation. La MS affecte l’aptitude des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière à communiquer les unes avec les autres, comme le propre système immunitaire du corps attaque et détériore la myéline qui enveloppe les axons de neurones. Lorsque la myéline est perdue, les axons ne peuvent plus conduire efficacement des signaux. Ceci peut mener à divers symptômes neurologiques, qui progressent habituellement en incapacité physique et cognitive. Il n’y a pas de guérison connue pour la MS; des traitements tentent de restaurer la fonction après une attaque (démarrage soudain ou affaiblissement des symptômes de MS), d’empêcher de nouvelles attaques, et d’empêcher une incapacité. Par exemple, un traitement à base de corticostéroïdes peut aider à mettre fin à l’attaque, tandis qu’un traitement à base d’interféron pendant une attaque initiale s’est avéré diminuer la chance qu’une MS clinique se développe. [0119] Multiple sclerosis is an autoimmune disease in which the immune system attacks the central nervous system, leading to demyelination. MS affects the ability of nerve cells in the brain and in the spinal cord to communicate with each other, as the body's own immune system attacks and breaks down the myelin that surrounds the axons of neurons. When myelin is lost, axons can no longer effectively conduct signals. This can lead to various neurological symptoms, which usually progress to physical and cognitive disability. There is no known cure for MS; treatments attempt to restore function after an attack (sudden onset or weakening of symptoms of MS), prevent further attacks, and prevent disability. For example, treatment with corticosteroids may help stop the attack, while treatment with interferon during an initial attack has been shown to decrease the chance of clinical MS developing.

[0120] Le virus de l’immunodéficience humaine (HVIH) est un lentivirus qui peut mener au syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), un état dans lequel le système immunitaire commence à être défaillant. Le VIH infecte principalement des cellules vitales dans le système immunitaire humain, comme des cellules T auxiliaires, des macrophages, et des cellules dendritiques. Une infection par le VIH mène à des niveaux bas de cellules CD4<+>T par une suppression virale directe de cellules infectées, par des taux d’apoptose accrus dans les cellules infectées, ou en tuant des cellules CD4<+>T au moyen de lymphocytes CD8 cytotoxiques qui reconnaissent des cellules infectées. Actuellement, il n’y a pas de vaccin ni de guérison pour le VIH ou le SIDA. Un traitement pour une infection par le VIH consiste en une thérapie antirétrovirale très active, ou HAART. Des options de HAART courantes sont des combinaisons (ou «cocktails») constitués d’au moins trois médicaments d’au moins deux types d’agents antirétroviraux. Typiquement, ces classes sont deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse analogue (NARTIs or NRTIs) plus un inhibiteur de protéase, ou un inhibiteur de transcriptase inverse non-nucléosidique (NNRTI). [0120] The human immunodeficiency virus (HVIH) is a lentivirus that can lead to acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), a condition in which the immune system begins to fail. HIV primarily infects cells vital in the human immune system, such as T helper cells, macrophages, and dendritic cells. HIV infection leads to low levels of CD4 <+> T cells by direct viral suppression of infected cells, by increased levels of apoptosis in infected cells, or by killing CD4 <+> T cells by means of cytotoxic CD8 lymphocytes that recognize infected cells. Currently, there is no vaccine or cure for HIV or AIDS. Treatment for HIV infection is highly active antiretroviral therapy, or HAART. Common HAART options are combinations (or “cocktails”) of three or more drugs of two or more types of antiretroviral agents. Typically, these classes are two nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors (NARTIs or NRTIs) plus a protease inhibitor, or a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI).

[0121 ] Une insuffisance cardiaque congestive indique un état dans lequel le cœur ne peut plus pomper suffisamment de sang vers les autres organes du corps. Cet état peut résulter du maladie coronarienne, de tissu cicatriciel sur le cœur provoqué par un infarctus du myocarde, d’une pression sanguine élevée, d’une valvulopathie, de défauts du cœur, et d’une infection de la valvule cardiaque. Des programmes de traitement consistent typiquement de repos, une alimentation saine, des activités journalières modifiées, et des médicaments, comme des inhibiteurs d’enzyme convertissant l’angiotensin- [0121] Congestive heart failure indicates a condition in which the heart can no longer pump enough blood to other organs in the body. This condition can result from coronary artery disease, scar tissue on the heart caused by a myocardial infarction, high blood pressure, valve disease, heart defects, and infection of the heart valve. Treatment programs typically consist of rest, a healthy diet, modified daily activities, and medications, such as angiotensin-converting enzyme inhibitors.

23 (ACE), des bêtabloquants, des digitales, des diurétiques et des vasodilatateurs. Cependant, le programme de traitement ne va pas inverser la détérioration ou l’état du cœur. 23 (ACE), beta-blockers, digitalis, diuretics and vasodilators. However, the treatment program will not reverse the deterioration or condition of the heart.

[0122] L’hépatite C est une maladie infectieuse dans le foie, provoquée par le virus de l’hépatite C. L’hépatite C peut progresser vers une cicatrisation (fibrose) et une cicatrisation avancée (cirrhose). La cirrhose peut mener a une défaillance du foie, et à d’autres complications, comme un cancer du foie. Les traitements actuels comprennent l’utilisation d’une combinaison d’alpha-interférons pegylés et de la ribavirine médicamenteuse antivirale. Les taux de succès peuvent varier entre 50 et 80% selon le génotype de virus. [0122] Hepatitis C is an infectious disease in the liver caused by the hepatitis C virus. Hepatitis C can progress to scarring (fibrosis) and advanced scarring (cirrhosis). Cirrhosis can lead to liver failure, and other complications, such as liver cancer. Current treatments include the use of a combination of pegylated alpha interferons and the antiviral drug ribavirin. Success rates can vary between 50 and 80% depending on the virus genotype.

[0123] Un traumatisme crânien indique une blessure de la tête qui peut ou non provoquer une blessure du cerveau. Des causes courantes de traumatisme crânien comprennent des accidents de circulation, des accidents domestiques et des accidents de loisirs, des chutes, et des assauts. Divers types de problèmes peuvent résulter d’un traumatisme crânien, comme une fracture du crâne, des lacérations du cuir chevelu, un hématome sous-dural (saignements entre la dure-mère et le crâne), une contusion cérébrale (ecchymose du cerveau), une commotion (perte temporaire de fonction du fait d’un traumatisme), un coma, ou même la mort. Le traitement d’un traumatisme crânien va varier selon le type de blessure. Si le cerveau est atteint, il n’y a pas de moyen rapide pour le rétablir, et souvent la détérioration ne peut pas être guérie par les moyens de traitement disponible. [0123] Head trauma indicates injury to the head which may or may not result in injury to the brain. Common causes of head trauma include traffic accidents, home and leisure accidents, falls, and assaults. Various types of problems can result from head trauma, such as skull fracture, scalp lacerations, subdural hematoma (bleeding between the dura and the skull), brain contusion (bruising of the brain), concussion (temporary loss of function due to trauma), coma, or even death. Treatment for a head injury will vary depending on the type of injury. If the brain is damaged, there is no quick way to restore it, and often the damage cannot be cured by the means of treatment available.

[0124] Une maladie pulmonaire est une expression large pour des maladies du système respiratoire, ce dernier comprenant le poumon, la cavité pleurale, des tubes bronchiques, la trachée, la voix respiratoire supérieure, et les nerfs et muscles pour respirer. Des exemples de maladie pulmonaire comprennent une maladie pulmonaire obstructive, dans laquelle les tubes bronchiques deviennent rétrécis; une maladie pulmonaire restrictive ou fibrotique, dans laquelle le poumon perd de la souplesse, et provoque une dilatation de poumon incomplète et une rigidité de poumon accrue; des infections des voix respiratoires, qui peuvent être provoquées par le froid courant ou une pneumonie; des tumeurs respiratoires, comme celles provoquées par le cancer, des maladies de la cavité pleurale; et des maladies pulmonaires vasculaires, qui affectent la circulation pulmonaire. Un traitement pour une maladie pulmonaire varie selon le type de maladie, mais peut comprendre des médicaments comme des corticostéroïdes des antibiotiques, de l’oxygène, une ventilation mécanique, une radiothérapie, et une intervention chirurgicale. [0124] Lung disease is a broad term for diseases of the respiratory system, the latter including the lung, pleural cavity, bronchial tubes, trachea, upper respiratory tract, and nerves and muscles for breathing. Examples of lung disease include obstructive pulmonary disease, in which the bronchial tubes become narrowed; restrictive or fibrotic lung disease, in which the lung loses flexibility, and causes incomplete lung dilation and increased lung stiffness; respiratory tract infections, which can be caused by running cold or pneumonia; respiratory tumors, such as those caused by cancer, diseases of the pleural cavity; and vascular pulmonary disease, which affects pulmonary circulation. Treatment for lung disease varies depending on the type of disease, but may include drugs like corticosteroids, antibiotics, oxygen, mechanical ventilation, radiation therapy, and surgery.

[0125] Une dépression est un trouble mental caractérisé par une humeur morose accompagnée par une faible estime de soi et une perte d’intérêt ou de plaisir à des activités normalement agréables. Biologiquement, une dépression est accompagnée par une activité altérée dans de multiples parties du cerveau, y compris les noyaux du raphé, qui sont un groupe de petits noyaux dans le tronc cérébral supérieur qui est une source de sérotonine; le noyau suprachiasmatique, qui commande des rythmes biologiques comme le cycle de sommeil/éveil; l’axe hypothalamo-pituitaire-surrénalien, qui est une chaîne de structures qui sont activées pendant une réponse du corps à diverses contraintes; la zone ventrale de la calotte, qui est considérée comme étant responsable des circuits de «récompense» du cerveau; les noyaux accumbens, dont on nous enseigne qu’ils jouent un rôle dans la récompense, le rire, le plaisir, l’addiction, et la peur; et le cortex antérieur cingulaire, qui est activé par des expériences négatives. Des traitements contre la dépression comprennent des antidépresseurs qui augmentent la quantité de sérotonine extracellulaire dans le cerveau, l’exercice, et une psychothérapie. Cependant, on continue de s’interroger sur l’efficacité de ces traitements. [0125] Depression is a mental disorder characterized by a moody mood accompanied by low self-esteem and loss of interest or pleasure in normally enjoyable activities. Biologically, depression is accompanied by altered activity in multiple parts of the brain, including the raphe nuclei, which are a group of small nuclei in the upper brainstem that is a source of serotonin; the suprachiasmatic nucleus, which controls biological rhythms such as the sleep / wake cycle; the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, which is a chain of structures that are activated during a body's response to various stresses; the ventral area of the skullcap, which is believed to be responsible for the brain's “reward” circuits; nuclei accumbens, which we are taught to play a role in reward, laughter, pleasure, addiction, and fear; and the anterior cingulate cortex, which is activated by negative experiences. Treatments for depression include antidepressants that increase the amount of extracellular serotonin in the brain, exercise, and psychotherapy. However, questions remain about the effectiveness of these treatments.

[0126] Une azoospermie non obstructive est un état médical d’un homme n’ayant pas un niveau quelconque de spermatozoïdes mesurable dans sa semence du fait d’un problème de spermatogenèse. Celui-ci est souvent provoqué par un déséquilibre hormonal, et peut être traité en utilisant des médicaments qui rétablissent le déséquilibre. [0126] Non-obstructive azoospermia is a medical condition of a man not having any measurable level of sperm in his semen due to a problem with spermatogenesis. This is often caused by a hormonal imbalance, and can be treated using drugs that restore the imbalance.

[0127] L’andropause est un état analogue à la ménopause que l’on rencontre chez des hommes d’âge moyen, impliquant une réduction de la production des hormones testostérone et déhydroépiandrostérone. Les traitements comprennent une thérapie de remplacement d’hormones et de l’exercice. [0127] Andropause is a menopausal-like condition found in middle-aged men, involving reduced production of the hormones testosterone and dehydroepiandrosterone. Treatments include hormone replacement therapy and exercise.

[0128] Une sclérodermie est une maladie auto-immune chronique qui affecte du tissu conjonctif. Un durcissement de la peau est la manifestation la plus visible de cette maladie, bien qu’elle puisse affecter du tissu conjonctif d’un bout à l’autre du corps. Il n’y a pas de guérison directe connue pour la sclérodermie. [0128] Scleroderma is a chronic autoimmune disease which affects connective tissue. The most visible manifestation of this condition is hardening of the skin, although it can affect connective tissue throughout the body. There is no known direct cure for scleroderma.

[0129] Le psoriasis est une maladie auto-immune chronique qui provoque l’apparition de pastilles rouges à écailles sur la peau. La cause du psoriasis est liée à une croissance excessive de cellules de peau. Une hypothèse suggère qu’il est lié à des cellules-T qui migrent vers le derme, et déclenchent la libération de cytokines induisant la production rapide de cellules de peau. Des traitements pour le psoriasis comprennent des médicaments qui ciblent les cellules-T. [0129] Psoriasis is a chronic autoimmune disease that causes red scaly patches to appear on the skin. The cause of psoriasis is linked to the excessive growth of skin cells. One hypothesis suggests that it is linked to T-cells that migrate to the dermis, and trigger the release of cytokines that induce rapid production of skin cells. Treatments for psoriasis include drugs that target T-cells.

[0130] Une rétinite pigmentaire est un type de dystrophie rétinienne progressive dans laquelle les photorécepteurs ou l’épithélium de pigment rétinien sont anormaux, et mènent à une perte de vision. Les thérapies pour traiter une rétinite pigmentaire sont limitées. [0130] Retinitis pigmentosa is a type of progressive retinal dystrophy in which the photoreceptors or the retinal pigment epithelium are abnormal, and lead to vision loss. Therapies to treat retinitis pigmentosa are limited.

[0131 ] Les états décrits ici peuvent être traités avec un type particulier, ou une combinaison de types, de cellules cibles. Dans des modes préférés de réalisation, les états décrits ici peuvent être traités par perfusion des types de cellules indiqués dans le tableau 2. [0131] The conditions described here can be treated with a particular type, or a combination of types, of target cells. In preferred embodiments, the conditions described herein can be treated by infusion of the cell types shown in Table 2.

24 Tableau 2: Régimes de traitement pour divers états en utilisant des cellules cibles reprogrammées, c’est-à-dire rétro-différenciées ou trans-différenciées ou redifférenciées. 24 Table 2: Treatment regimens for various conditions using reprogrammed target cells, i.e., retro-differentiated or trans-differentiated or redifferentiated.

[0132] [0132]

Etat Type de cellules de traitement (un type, ou plusieurs en combinaison) Status Type of processing cells (one type, or several in combination)

Anémie aplasique Cellules hématopoïétiques Aplastic anemia Hematopoietic cells

Beta-thalassémie Cellules hématopoïétiques Beta-thalassemia Hematopoietic cells

Diabètes Cellules souches mésenchymateuses, cellules souches pluripotentes et/ou îlots de Langerhans Diabetes Mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells and / or islets of Langerhans

Maladie de Cellules souches pluripotentes, cellules d'épithélium neurones moteurs alvéolaires, cellules d'ectoderme et/ou neurones Disease of pluripotent stem cells, epithelium cells alveolar motor neurons, ectoderm cells and / or neurons

Maladie de Cellules souches pluripotentes et/ou neurones Parkinson Pluripotent Stem Cells and / or Parkinson's Disease

Blessure de la Cellules souches pluripotentes et/ou neurones moelle épinière Injury of the Pluripotent Stem Cells and / or Spinal Cord Neurons

Dystrophie Cellules souches pluripotentes, cellules souches musculaire mésenchymateuses et/ou cellules de muscle squelettique Dystrophy Pluripotent stem cells, mesenchymal muscle stem cells and / or skeletal muscle cells

Maladie rénale Cellules rénales, cellules souches mésenchymateuses et/ou cellules souches pluripotentes Kidney disease Kidney cells, mesenchymal stem cells and / or pluripotent stem cells

Sclérose en Cellules souches pluripotentes, cellules souches plaques mésenchymateuses et/ou neurones Pluripotent stem cell sclerosis, mesenchymal plaque stem cells and / or neurons

Défaillance cardiomyocytes, cellules souches mésenchymateuses, cardiaque cellules souches pluripotentes et/ou cellules congestive d'endothélium Failure of cardiomyocytes, mesenchymal stem cells, cardiac pluripotent stem cells and / or congestive endothelium cells

Virus de cellules hématopoïétiques, cellules souches l'hépatite C pluripotentes, cellules souches mésenchymateuses et/ou hépatocytes du foie Hematopoietic cell viruses, pluripotent hepatitis C stem cells, mesenchymal stem cells and / or liver hepatocytes

Virus de Cellules hématopoïétiques l'immunodéficience humaine Hematopoietic Cell Virus Human Immunodeficiency

Traumatisme Cellules souches pluripotentes et/ou neurones crânien Trauma Pluripotent stem cells and / or cranial neurons

Maladie pulmonaire Cellules souches pluripotentes, cellules souches mésenchymateuses, cellules d'épithélium alvéolaires et/ou cellules d'endothélium Lung disease Pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, alveolar epithelium cells and / or endothelium cells

Dépression Cellules souches pluripotentes et/ou neurones Depression Pluripotent stem cells and / or neurons

Azoospermie non Cellules souches pluripotentes, cellules germinales obstructive ou pluripotentes et/ou spermatozoïdes Andropause Azoospermia no Pluripotent stem cells, obstructive or pluripotent germ cells and / or sperm Andropause

Ménopause et Cellules souches pluripotentes, oocytes, cellules stérilité germinales pluripotentes Réjuvénilisation Cellules germinales pluripotentes, cellules souches Menopause and Pluripotent Stem Cells, Oocytes, Pluripotent Germ Sterility Cells Rejuvenilization Pluripotent Germ Cells, Stem Cells

25 pluripotentes, kératinocytes, cellules du bulbe pileux, neurones, spermatozoïdes, ostéocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, cellules de muscle squelettique, neurones, cellules d'endothélium, et/ou mélanocytes 25 pluripotent, keratinocytes, hair bulb cells, neurons, spermatozoa, osteocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, neurons, endothelium cells, and / or melanocytes

Ulcères de Cellules souches pluripotentes, cellules d'endothélium, sclérodermie kératinocytes et/ou cellules souches mésenchymateuses Ulcers of pluripotent stem cells, endothelium cells, scleroderma keratinocytes and / or mesenchymal stem cells

Psoriasis Cellules souches mésenchymateuses et/ou cellules souches pluripotentes Psoriasis Mesenchymal stem cells and / or pluripotent stem cells

Rides Cellules souches mésenchymateuses, kératinocytes, et/ou cellules souches pluripotentes Wrinkles Mesenchymal stem cells, keratinocytes, and / or pluripotent stem cells

Cirrhose du foie hépatocytes du foie, cellules souches mésenchymateuses, cellules endodermiques, cellules souches pluripotentes Cirrhosis of the liver hepatocytes of the liver, mesenchymal stem cells, endodermal cells, pluripotent stem cells

Maladie autoCellules souches mésenchymateuses et/ou cellules immune souches pluripotentes Auto Disease Mesenchymal stem cells and / or pluripotent immune stem cells

Alopécie Cellules du bulbe épineux et/ou mélanocytes Alopecia Cells of the spinous bulb and / or melanocytes

Rétinite neurones et/ou cellules souches pluripotentes pigmentaire ou dystrophie cristalline/cécité Retinitis neurons and / or pluripotent pigment stem cells or crystal dystrophy / blindness

[0133] A titre d’exemple, un patient peut être traité pour un état tel que décrit ci-dessus à travers les étapes suivantes: [0133] As an example, a patient can be treated for a condition as described above through the following steps:

1 ) une fistule-canule est insérée dans un bras du patient; 1) a cannula-fistula is inserted into the patient's arm;

2) Des globules blancs sont recueillis par aphérèse en utilisant un système automatisé, comme le dispositif COBE® Spectra Device (Gambro PCT); 2) White blood cells are collected by apheresis using an automated system, such as the COBE® Spectra Device (Gambro PCT);

3) Des cellules souches rétro-différenciées autologues sont produites à partir des globules blancs du patient; 3) Autologous retro-differentiated stem cells are produced from the patient's white blood cells;

4) Les cellules souches rétro-différenciées autologues sont lavées puis perfusées de manière intraveineuse dans le patient; 4) Autologous retro-differentiated stem cells are washed and then infused intravenously into the patient;

5) Les progrès du patient sont surveillés, y compris par prélèvement d’échantillons de sang et évaluation des zones blessées. 5) Patient progress is monitored, including blood sampling and assessment of injured areas.

[0134] La présente invention va maintenant être décrite au moyen d’exemples non limitatifs qui suivent, qui illustrent davantage la présente invention, et qui ne sont pas prévus, et ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention. [0134] The present invention will now be described by way of non-limiting examples which follow, which further illustrate the present invention, and which are not intended, and should not be interpreted as limiting the scope of the present invention.

EXEMPLES EXAMPLES

Exemple 1 Example 1

Matériaux et procédés Materials and processes

[0135] Cette étude clinique a évalué la sécurité d’une perfusion d’une dose unique de cellules reprogrammées pendant 3 heures autologues à la suite d’une exposition à une condition de culture inductive hématopoïétique, chez quatre patients souffrant d’une anémie aplasique. [0135] This clinical study evaluated the safety of a single dose infusion of reprogrammed cells for 3 autologous hours following exposure to an inductive hematopoietic culture condition, in four patients suffering from aplastic anemia. .

[0136] Cette étude clinique a été approuvée par le comité d’éthique du King Edward Mémorial (KEM) Hospital, et a été effectuée en collaboration étroite avec l’institut d’immuno-hématologie (IIH). Les patients devaient satisfaire les critères indiqués dans le tableau 3. En résultat, quatre patients souffrant d’une anémie sévère (trois hommes) et hypoplasique (une femme) ont été choisis pour l’étude. Ces quatre patients ont été sélectionnés et surveillés par l’équipe IIH/KEM. Les historiques cliniques et de traitement des patients sont indiqués dans le tableau 4, tandis que leurs dosages de perfusion de cellules CD34<+>sont indiqués dans le tableau 5. [0136] This clinical study was approved by the King Edward Memorial (KEM) Hospital Ethics Committee, and was performed in close collaboration with the Institute of Immunohematology (IIH). Patients had to meet the criteria shown in Table 3. As a result, four patients with severe (three males) and hypoplastic (one female) anemia were selected for the study. These four patients were selected and monitored by the IIH / KEM team. The clinical and treatment histories of the patients are shown in Table 4, while their CD34 <+> cell infusion assays are shown in Table 5.

26 Tableau 3: Critères d’inclusion [0137] 26 Table 3: Inclusion criteria [0137]

Chaque 1 - Décomptes de Neutrophiles absolus < 0.5X10<y>/L critère est 2- Décompte de plaquettes <20X10<9>/L nécessaire 3- Anémie avec réticulocytes corrigés<1 % Each 1 - Absolute Neutrophil counts <0.5X10 <y> / L criterion is 2- Platelet count <20X10 <9> / L required 3- Anemia with corrected reticulocytes <1%

Un seul 4- Cellularité de moelle osseuse <25 % des 5- Cellularité de moelle osseuse <50 % avec moins de 30 % critères est de cellules hématopoïétiques nécessaire 6- Sujet évalué durant les trois premiers mois de diagnostic Only one 4- Bone marrow cellity <25% of 5- Bone marrow cellity <50% with less than 30% criteria is hematopoietic cells necessary 6- Subject evaluated during the first three months of diagnosis

7- Sujet n'ayant pas reçu préalablement de thérapie immunosuppressive 7- Subject who has not previously received immunosuppressive therapy

[0138] Les patients ont été transfusés avec 2 unités de globules rouges conditionnés irradiés et 4 unités de plaquettes, afin de maintenir leur niveau d’hémoglobine au-dessus de 8 g/dl, et les numérations de plaquettes au-dessus de 50,000. Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 ou 3 fois leur volume de sang complet en utilisant la machine d’aphérèse Cobe Spectra, et le kit de séparation de globules blancs (les deux de chez Gambro BCT). L’aphérèse impliquait une cathétérisation veineuse jugulaire et anticubitale à l’aide d’un cathéter à une seule lumière pour un accès veineux. [0138] Patients were transfused with 2 units of conditioned irradiated red blood cells and 4 units of platelets, in order to maintain their hemoglobin level above 8 g / dl, and platelet counts above 50,000. Patients underwent apheresis by processing 2-3 times their whole blood volume using the Cobe Spectra Apheresis Machine, and the White Blood Cell Separation Kit (both from Gambro BCT). Apheresis involved jugular and anticubital venous catheterization using a single lumen catheter for venous access.

[0139] Une quantité aliquote de cellules a été recueillie de manière aseptique pour une analyse de CD34, à la suite d’un recueil de 150 à 200 ml de couche leucocyto-plaquettaire. Par la suite, la couche leucocyto-plaquettaire a été soumise à une reprogrammation sous des conditions de culture inductive hématopoïétique. Brièvement, la procédure de reprogrammation a impliqué l’ajout de 1000 pg de CR3/43 purifié (spécialement préparé par DakoCytomation pour TriStem Corp.) dilué dans 30 ml de milieu modifié selon Iscove, de manière aseptique dans la poche de globules blancs. La poche ensuite été incubée dans un incubateur de culture de tissu stérile maintenu à 37 °C et 5% de C02pendant trois heures. A la suite de l’achèvement du processus de reprogrammation, les cellules converties ont été analysées quant à leur teneur en cellules CD34<+>. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline en utilisant le dispositif de traitement de cellules 2991 de chez COBE. Après agitation et remise en suspension dans une solution saline, la suspension cellulaire a été perfusée dans le patient via la veine jugulaire sous l’action de la gravité en utilisant un ensemble de perfusion. Des signes vitaux, y compris les numérations CBC de patients, ont été surveillés en continu avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues. [0139] An aliquot of cells was collected aseptically for CD34 analysis, following collection of 150-200 ml of buffy coat. Subsequently, the buffy coat was subjected to reprogramming under inductive hematopoietic culture conditions. Briefly, the reprogramming procedure involved adding 1000 µg of purified CR3 / 43 (specially prepared by DakoCytomation for TriStem Corp.) diluted in 30 ml of Iscove modified medium, aseptically into the white blood cell bag. The bag was then incubated in a sterile tissue culture incubator maintained at 37 ° C and 5% CO 2 for three hours. Following the completion of the reprogramming process, the converted cells were analyzed for the content of CD34 <+> cells. Then the cells were washed twice with saline using the 2991 cell processing device from COBE. After shaking and resuspending in saline, the cell suspension was infused into the patient via the jugular vein under the action of gravity using an infusion set. Vital signs, including CBC counts of patients, were continuously monitored before and after infusion of autologous reprogrammed cells.

Tableau 4: historiques cliniques et de traitement de patients souffrant d’une anémie aplasique jusqu’à une perfusion de cellules souches reprogrammées humaines autologues (HRSC). Table 4: Clinical and treatment histories of patients with aplastic anemia until infusion of autologous human reprogrammed stem cells (HRSC).

[0140] [0140]

Patient Historique clinique jusqu'à Traitement jusqu'à perfusion de HRSC perfusion de RSC Patient Clinical history up to Treatment until HRSC infusion RSC infusion

Patient A • Diagnostic de SAA en A reçu un essai de homme de 2002 stéroïdes anabolisants 25 ans • Présentait des (TabMenabol) pendant anémie symptômes de faiblesse 8 mois, sans une aplasique et de dyspnée quelconque amélioration sévère ® Episodes fréquents de significative saignement rectal et des gencives, et de Patient A • Diagnosis of AAS in A received a 2002 male trial of anabolic steroids 25 years • Presented with (TabMenabol) during anemia symptoms of weakness 8 months, without aplastic and dyspnea any severe improvement ® Frequent episodes of significant rectal bleeding and gums, and

27 vomissements 27 vomiting

• A reçu respectivement 4 et 2 unités de sang et de plaquettes, tous les mois • Received 4 and 2 units of blood and platelets, respectively, every month

• Apparition de jaunissement du blanc de l’oeil avec congestion oculaire sévère • Appearance of yellowing of the white of the eye with severe eye congestion

Patient B • Diagnostic d'anémie A reçu des produits femme de 26 Hypoplasique en hématiques pendant 3 ans anémie janvier 2004 mois avant perfusion de Hypoplasique • Présentait des RSC, sans réponse symptômes de polyménorrhée de 6 mois Patient B • Diagnosis of anemia Received female products from 26 Hypoplastic in haematics for 3 years anemia January 2004 months before infusion of Hypoplastic • Presented CRS, unresponsive symptoms of polymenorrhea for 6 months

• Uniquement avant perfusion de RSC, les patients ont reçu 4 et 6 unités, respectivement, de globules rouges et de plaquettes • Prior to CRS infusion only, patients received 4 and 6 units, respectively, of red blood cells and platelets.

Patient C • Diagnostic d'anémie A reçu une thérapie de homme de aplasique très sévère en cyclosporine pendant 6 19 ans 2003 mois, qui s'est terminée anémie • Présentait des en mars 2003, sans aplasique symptômes d'anémie, de effet très sévère faiblesse et de dyspnée pendant l’effort Patient C • Diagnosis of anemia Received a man's therapy of very severe aplastic cyclosporine for 6 19 years 2003 months, which ended anemia • Presented in March 2003, without aplastic symptoms of anemia, of very severe effect weakness and dyspnea during exertion

® Fièvre avec frissons durant 10 à 15 jours du fait d'une neutropénie sévère ® Fever with chills lasting 10 to 15 days due to severe neutropenia

• Multiples épisodes d'infections, de vomissements et de points purpuriques • Multiple episodes of infections, vomiting and purpuric stitches

• Abcès fessier • Buttock abscess

• Deux évanouissements du fait d'une hémorragie du cerveau • Two fainting spells due to bleeding in the brain

• · A reçu respectivement 5 et 2 unités de sang et de plaquettes toutes les deux semaines • Received 5 and 2 units of blood and platelets, respectively, every two weeks

28 Patient D homme de 35 ans anémie aplasique très sévère 28 Patient D, 35-year-old male, very severe aplastic anemia

Anémie, faiblesse, dyspnée Anemia, weakness, dyspnea

Fièvre avec frissons du fait d'une neutropénie sévère, et multiples épisodes d'infections et de saignement Diagnostic datant de 3 ans auparavant A reçu respectivement 4 et 2 unités de sang et de plaquettes, chaque mois Fever with chills due to severe neutropenia, and multiple episodes of infection and bleeding Diagnosis 3 years ago Received 4 and 2 units of blood and platelets, respectively, each month

A reçu des thérapies de cyclosporine et antituberculose. Pas de réponse à 6 mois d'immunosuppression Received cyclosporine and anti-tuberculosis therapy. No response after 6 months of immunosuppression

[0141 ] Toute la surveillance clinique a été effectuée par l’équipe IIH/KEM. L’exigence de transfusion a été déterminée avant et après perfusion à partir des enregistrements de transfusion obtenus à la suite de la réception de toute unité de produit sanguin. Les unités de transfusion ont seulement été utilisées après avoir obtenu le consentement des patients et de leurs proches immédiats en tant que témoins. Avant transfusion au patient, tous les produits sanguins ont été irradiés au Tata Mémorial Hospital. Les patients ont également été questionnés concernant leur bien-être avant et après transfusion des cellules reprogrammées. Tous les patients ont emporté une copie ou les enregistrements originaux de leurs états, et la totalité du suivi laboratoire et clinique. La durée de surveillance de ces patients était établie à l’origine à 2 ans, mais a été étendue. Pour le premier mois suivant la perfusion, les patients ont été gardés à l’hôpital dans des pièces à pression positive stérilisées. [0141] All clinical monitoring was performed by the IIH / KEM team. The transfusion requirement was determined before and after infusion from the transfusion records obtained from the receipt of any unit of blood product. The transfusion units were only used after obtaining the consent of the patients and their immediate relatives as witnesses. Before transfusion to the patient, all blood products were irradiated at the Tata Memorial Hospital. Patients were also questioned about their well-being before and after transfusion of the reprogrammed cells. All patients brought a copy or original recordings of their condition, and all laboratory and clinical follow-up. The monitoring period for these patients was originally set at 2 years, but has been extended. For the first month after the infusion, patients were kept in hospital in sterilized positive pressure rooms.

Tableau 5: Patient, date de perfusion, poids et taille, cellules mononucléaires recueillies et cellules CD34<+>perfusées. Table 5: Patient, date of infusion, weight and height, mononuclear cells collected and CD34 <+> cells infused.

[0142] [0142]

ID de Poids Taille Cellules CD34<÷>patient et mononucléaires reçues/kg date de recueillies perfusion Weight ID Size CD34 <÷> patient and mononuclear cells received / kg date collected infusion

Patient A 48 152 1x10<9>1 1 .7x10<e>7/6/2004 Patient A 48 152 1x10 <9> 1 1 .7x10 <e> 6/7/2004

Patient B 38 153 3,6X10<9>20x10<e> 7/14/2004 Patient B 38 153 3,6X10 <9> 20x10 <e> 7/14/2004

Patient C 52 166 3,9X10<9>25x10<e>7/27/2004 Patient C 52 166 3.9X10 <9> 25x10 <e> 7/27/2004

Patient D 52,5 160 4,3x10 23x10<e> 8/17/2004 Patient D 52.5 160 4.3x10 23x10 <e> 8/17/2004

[0143] Un million de cellules ont été teintées selon les instructions du fabricant avec les éventails suivants d’anticorps monoclonaux (tous de chez DakoCytomation): [0143] One million cells were stained according to the manufacturer's instructions with the following ranges of monoclonal antibodies (all from DakoCytomation):

[0144] Eventail 1 constitué de conjugués de IgG 1 -FITC, lgG1 -PE-Cy5 et IgGIRPE témoins négatifs en isotypes. Fan 1 consisting of conjugates of IgG 1 -FITC, IgG1 -PE-Cy5 and negative control IgGIRPE in isotypes.

[0145] Eventail 2 constitué de CD45-FITC anti-humain et de CD34-RPE-Cy5 [0146] Eventail 3 constitué de CD38-FITC anti-humain et de CD34-RPE-Cy5 [0147] Eventail 4 constitué de CD61 -FITC et CD34-RPE-Cy5 [0148] Eventail 5 constitué de CD33/13 RPE and CD7-FITC [0149] Eventail 6 constitué de CD45 et Glycophorine-A-RPE [0150] Eventail 7 constitué de CD3-FITC et CD19-RPE [0145] Fan 2 consisting of anti-human CD45-FITC and CD34-RPE-Cy5 [0146] Fan 3 consisting of anti-human CD38-FITC and CD34-RPE-Cy5 [0147] Fan 4 consisting of CD61 -FITC and CD34-RPE-Cy5 [0148] Fan 5 consisting of CD33 / 13 RPE and CD7-FITC [0149] Fan 6 consisting of CD45 and Glycophorin-A-RPE [0150] Fan 7 consisting of CD3-FITC and CD19-RPE

[0151 ] Une analyse de cellules a été réalisée avec le système FACSCalibur System (BD bioscience) en utilisant le logiciel BD cell Quest. [0151] Cell analysis was performed with the FACSCalibur System (BD bioscience) using the BD cell Quest software.

29 [0152] Pour un dosage clonal, des cellules mononucléaires de moelle osseuse (MNC) d’un patient avant et après perfusion des cellules reprogrammées ont été ensemencées avec du méthocult GFH4434 enrichi avec des facteurs de croissance recombinants selon les instructions du fabricant (technologies de cellules souches). Une différenciation en colonies de cellules hématopoïétiques a été évaluée et comptée au cours du temps en utilisant une microscopie inversé à contraste de phase. [0152] For a clonal assay, bone marrow mononuclear cells (MNC) from a patient before and after infusion of the reprogrammed cells were seeded with methocult GFH4434 enriched with recombinant growth factors according to the manufacturer's instructions (technologies stem cells). Colony differentiation of hematopoietic cells was assessed and counted over time using inverted phase contrast microscopy.

[0153] Des CBC de patient, des enzymes du foie et des variants d’hémoglobine ont été surveillés en continu avant et après le processus. Une fois les patients sortis de l’hôpital, les CBC, enzymes du foie, les variants d’hémoglobine, et l’établissement d’un caryotype de sang périphérique et de G cerclage ont été surveillés par un laboratoire indépendant dans des buts de reconfirmation. Ces tests ont été effectués fréquemment à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées autologues. [0153] Patient CBCs, liver enzymes, and hemoglobin variants were continuously monitored before and after the process. After hospital discharge, CBCs, liver enzymes, hemoglobin variants, and peripheral blood and G-cerclage karyotyping were monitored by an independent laboratory for reconfirmation purposes. . These tests were performed frequently following an infusion of the autologous reprogrammed cells.

[0154] Des échantillons de sang périphérique et des cellules de moelle osseuse ont été analysés avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues. Ce test a été répété à des intervalles de six mois la première année, et sur une base annuelle les deux années suivantes après déclenchement de la thérapie par cellules souches reprogrammées autologues. De plus, les cellules reprogrammées ont été analysées avant perfusion pour vérifier la stabilité des cellules, ce qui a également été effectué à la suite de l’étape de conversion de 3 heures, de même qu’après établissement d’une culture à long terme d’un mois au maximum des cellules transformées. L’établissement d’un caryotype et d’un G cerclage ont été surveillés par un troisième laboratoire indépendant. [0154] Peripheral blood samples and bone marrow cells were analyzed before and after perfusion of the autologous reprogrammed cells. This test was repeated at six-month intervals the first year, and on an annual basis for the following two years after initiation of autologous reprogrammed stem cell therapy. In addition, the reprogrammed cells were analyzed before perfusion to verify cell stability, which was also done following the 3 hour conversion step, as well as after establishing a long term culture. one month maximum of transformed cells. The establishment of a karyotype and G cerclage were monitored by a third independent laboratory.

[0155] Des frottis de moelle osseuse et une section au trépan ont été effectués avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues. Ce test a été effectué 14 à 20 jours après perfusion des cellules reprogrammées autologues, et ensuite sur une base annuelle. [0155] Bone marrow smears and a trephine section were performed before and after perfusion of the autologous reprogrammed cells. This test was performed 14 to 20 days after infusion of the autologous reprogrammed cells, and thereafter on an annual basis.

[0156] Toutes les sections de frottis et au trépan ont été balayées en utilisant un microscope accroché à un caméscope avant et après perfusion des cellules souches reprogrammées pour évaluer et enregistrer une prise de greffe. [0156] All smear and trephine sections were scanned using a microscope hung on a camcorder before and after infusion of the reprogrammed stem cells to assess and record engraftment.

Résultats Results

[0157] Tous les patients ont toléré l’aphérèse, et le processus de perfusion de cellules souches reprogrammées uniques, sans effet contraire. Le patient A et le patient D sont devenus indépendants à la transfusion après une seule perfusion de cellules souches hématopoïétiques reprogrammées (RHSC) (voir Tableaux 6 and 7). Une greffe de plaquettes, de neutrophiles et de globules rouges a été délivrée 3 et 6 jours après perfusion chez le patient A et le patient D, respectivement. Une commutation d’hémoglobine foetale a été notée chez le patient A et le patient D (voir tableaux 4 et 5) mais pas chez les patient B et C (données non représentées). Avant perfusion, des enzymes du foie ont été élevées chez les patients A et D en dépit d’être négatifs à HCV (comme mesuré par le test ELISA). Les enzymes du foie ont commencé à se normaliser après perfusion de RHSC, et ont atteint des niveaux normaux 4 ans après perfusion de RHSC. Les patients B et C sont décédés 2 ans et six mois après perfusion, respectivement. Une commutation d’hémoglobine foetale a été notée chez des patients 001 et 004 (voir tableaux 6 et 7). Ces deux patients ont présenté une prise de greffe à long-terme après une seule perfusion de HRSC autologues. [0157] All patients tolerated apheresis, and the process of infusion of single reprogrammed stem cells, without adverse effect. Patient A and patient D became transfusion independent after a single infusion of reprogrammed hematopoietic stem cells (RHSC) (see Tables 6 and 7). A platelet, neutrophil and red blood cell transplant was delivered 3 and 6 days after infusion in patient A and patient D, respectively. Switching fetal hemoglobin was noted in patient A and patient D (see Tables 4 and 5) but not in patients B and C (data not shown). Before infusion, liver enzymes were elevated in patients A and D despite being negative for HCV (as measured by the ELISA test). Liver enzymes began to normalize after infusion of RHSC, and reached normal levels 4 years after infusion of RHSC. Patients B and C died 2 years and six months after infusion, respectively. Fetal hemoglobin switching was noted in patients 001 and 004 (see Tables 6 and 7). These two patients presented long-term engraftment after a single infusion of autologous HRSCs.

30 Tableau 6: Numération de sang complet de patient A, variant d’hémoglobine et enzymes du foie d’un patient souffrant d’une anémie aplasique sévère avant et après perfusion de HRSC autologues. Table 6: Whole blood count from patient A, variant hemoglobin and liver enzymes from a patient with severe aplastic anemia before and after infusion of autologous HRSCs.

[0158] [0158]

Tests du Nadir 19/07/2004 26/05/2005 07/03/2006 05/01/2008 sang avant après après après après perfusion perfusion perfusion perfusion perfusion Nadir tests 07/19/2004 05/26/2005 03/07/2006 01/05/2008 blood before after after after after infusion infusion infusion infusion infusion

WBC [10<3>/μ I] 1,3 3,4 3,1 3,7 5,4 WBC [10 <3> / μ I] 1.3 3.4 3.1 3.7 5.4

HB [g/dL] 2,6 7,1 9 12 14 HB [g / dL] 2.6 7.1 9 12 14

RBC [10<Β>/μΙ_] 0,9 2 2,3 2,9 3,86 RBC [10 <Β> / μΙ_] 0.9 2 2.3 2.9 3.86

RETIC [%] 1 4 1,7 RETIC [%] 1 4 1.7

MCV [fL] 101,5 101,5 121,74 100 101,4 MCV [fL] 101.5 101.5 121.74 100 101.4

MCH [Pg] 33,6 35,5 39,13 30,8 36,3 MCH [Pg] 33.6 35.5 39.13 30.8 36.3

MCHC [g/dL] 33,8 35 32,14 30,8 35,8 MCHC [g / dL] 33.8 35 32.14 30.8 35.8

Plaquettes Platelets

18 26 37 58 189 18 26 37 58 189

[10<3>/μί] [10 <3> / μί]

Neutrophiles Neutrophils

0,32 1,000 1,054 1,184 1,994 0.32 1.000 1.054 1.184 1.994

[10<3>/pLl [10 <3> / pLl

ESO [10 /μ L] 0,62 0,74 0,65 ESO [10 / μ L] 0.62 0.74 0.65

BASO BASO

0 0 0,054 0 0 0.054

[10<3>/pL] [10 <3> / pL]

LYMPH LYMPH

1,500 1,922 2,220 2,214 1,500 1,922 2,220 2,214

[103⁄4JL1 [103⁄4JL1

MONO MONO

0,500 0,062 0,222 0324 0.500 0.062 0.222 0324

[10<3>/pL] [10 <3> / pL]

HB A [g/dL] 5,1 6,7 9,2 12 HB A [g / dL] 5.1 6.7 9.2 12

HBA2 [g/dL] 0,13 0,14 0,24 0,39 HBA2 [g / dL] 0.13 0.14 0.24 0.39

HBF [g/dL] ND 1,2 2,4 2,6 1,82 HBF [g / dL] ND 1.2 2.4 2.6 1.82

SGOT [U/L] 150 127 74 32 30 SGOT [U / L] 150 127 74 32 30

SGPT[U/L] 145 181 49 37 44 SGPT [U / L] 145 181 49 37 44

[0159] WBC = globules blancs; HB = hemoglobin; RBC = globule rouge; RETIC = réticulocyte; MCV = volume corpusculaire moyen; MCH = hémoglobine corpusculaire moyenne; MCHC = concentration en hémoglobine corpusculaire moyenne; ESO = éosinophiles; BASO = basophiles; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hemoglobin A; HBA2 = hémoglobine A2; HBF = hemoglobin foetale; SGOT = transaminases SGO; SGPT = transaminases SGP [0159] WBC = white blood cells; HB = hemoglobin; RBC = red blood cell; RETIC = reticulocyte; MCV = mean corpuscular volume; MCH = mean corpuscular hemoglobin; MCHC = mean corpuscular hemoglobin concentration; ESO = eosinophils; BASO = basophils; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hemoglobin A; HBA2 = hemoglobin A2; HBF = fetal hemoglobin; SGOT = SGO transaminases; SGPT = SGP transaminases

31 Tableau 7: Numération de sang complet de patient D, de variant d’hémoglobine et d’enzymes du foie d’un patient souffrant d’une anémie aplasique sévère avant et après perfusion de HRSC autologues. 31 Table 7: Whole blood count from patient D, variant hemoglobin and liver enzymes from a patient with severe aplastic anemia before and after infusion of autologous HRSCs.

[0160] [0160]

Tests du Nadir 28/09/2004 30/05/2005 07/03/2006 05/01/2008 sang avant après après après après perfusion perfusion perfusion perfusion perfusion Nadir tests 09/28/2004 05/30/2005 03/07/2006 01/05/2008 blood before after after after after infusion infusion infusion infusion infusion

WBC WBC

1,7 3 2,2 2,7 4 1.7 3 2.2 2.7 4

[10<3>/μΙ_] [10 <3> / μΙ_]

HB 3 11,1 7,7 11,5 13 HB 3 11.1 7.7 11.5 13

RBC 3,6 2,4 3,2 3,45 RBC 3.6 2.4 3.2 3.45

RET!C r%] 2,4 3,4 1,7 RET! C r%] 2.4 3.4 1.7

MCV 90,3 108,33 113 110,3 MCV 90.3 108.33 113 110.3

MCH 30,9 32 35,9 37,8 MCH 30.9 32 35.9 37.8

MCHC 34,2 29,62 31,9 34,2 MCHC 34.2 29.62 31.9 34.2

Plaquettes 5 30 20 25 68 Platelets 5 30 20 25 68

[10<3>/μΙ_] [10 <3> / μΙ_]

Neutrophiles 0,1 0,72 0,50 1,0 1,24 Neutrophils 0.1 0.72 0.50 1.0 1.24

Γ10<3>/μί] Γ10 <3> / μί]

ESO Π0<3>/μΙ_] 0,90 0,22 0,54 0,64 ESO Π0 <3> / μΙ_] 0.90 0.22 0.54 0.64

BASO 0 0 0 0 BASO 0 0 0 0

Γ10<3>/μΙ_1 Γ10 <3> / μΙ_1

LYMPH 2,01 1,67 1,59 1,88 LYMPH 2.01 1.67 1.59 1.88

[10<3>/pL] [10 <3> / pL]

MONO 0,18 0,44 0,54 0,12 ί10<3>/μί] MONO 0.18 0.44 0.54 0.12 ί10 <3> / μί]

HB A 10,6 7,13 10,33 12,1 HB A 10.6 7.13 10.33 12.1

HBA2 0,33 0,19 0,28 0,36 HBA2 0.33 0.19 0.28 0.36

HBF 0,11 0,2 0,38 0,9 0,42 HBF 0.11 0.2 0.38 0.9 0.42

SGOT 160 46 46 69 34 SCPT 150 57 32 60 46 SGOT 160 46 46 69 34 SCPT 150 57 32 60 46

[0161 ] WBC = globules blancs; HB = hemoglobin; RBC = globule rouge; RETIC = réticulocyte; MCV = volume corpusculaire moyen; MCH = hémoglobine corpusculaire moyenne; MCHC = concentration en hémoglobine corpusculaire moyenne; ESO = éosinophiles; BASO = basophiles; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hémoglobine A; HBA2 = hémoglobine A2; HBF = hémoglobine foetale; SGOT = transaminases SGO; SGPT = transaminases SGPT. [0161] WBC = white blood cells; HB = hemoglobin; RBC = red blood cell; RETIC = reticulocyte; MCV = mean corpuscular volume; MCH = mean corpuscular hemoglobin; MCHC = mean corpuscular hemoglobin concentration; ESO = eosinophils; BASO = basophils; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hemoglobin A; HBA2 = hemoglobin A2; HBF = fetal hemoglobin; SGOT = SGO transaminases; SGPT = SGPT transaminases.

[0162] La fig. 1 représente une cytométrie en flux de cellules mononucléaires ayant subi une aphérèse avant et 3 heures après induction d’une reprogrammation hématopoïétique. Le nombre de cellules positives CD34 généré après reprogrammation hématopoïétique est indiqué dans le tableau 4. Une cytométrie en flux représentative de cellules mononucléaires ayant subi une aphérèse avant et après reprogrammation hématopoïétique montre une augmentation importante du nombre de cellules positives CD34 avec et sans expression de CD45, CD38 et CD7 (fig. 1 ). Lors de la perfusion, les cellules CD34 sont mises en circulation dans du sang périphérique pendant trois à six jours, et sont ensuite différenciées à un niveau durable en myélocytes, comme indiqué par une augmentation importante de cellules exprimant CD33&13, avec et sans CD7, ayant une dispersion avant et latérale élevée (voir fig. 2). Ce motif de reprogrammation a été observé chez tous les patients. [0162] FIG. 1 shows a flow cytometry of mononuclear cells which underwent apheresis before and 3 hours after induction of hematopoietic reprogramming. The number of CD34 positive cells generated after hematopoietic reprogramming is shown in Table 4. Representative flow cytometry of mononuclear cells that underwent apheresis before and after hematopoietic reprogramming shows a significant increase in the number of CD34 positive cells with and without CD45 expression. , CD38 and CD7 (fig. 1). Upon infusion, CD34 cells are circulated in peripheral blood for three to six days, and are then differentiated to a sustained level into myelocytes, as indicated by a large increase in cells expressing CD33 & 13, with and without CD7, having high front and side dispersion (see fig. 2). This pattern of reprogramming was observed in all patients.

[0163] Difficilement, des colonies ont été formées après aspiration de moelle osseuse de patients avant perfusion de HRSC autologue, opération suivie par un ensemencement dans une culture cellulaire de méthylcellulose (voir fig. 3). Un dosage clonal uniquement chez le patient B souffrant d’anémie hypoplasique a présenté une hématopoïèse diminuée. Cependant, 14 à 20 jours après perfusion, toutes les aspirations de moelle osseuse obtenues chez les patients ont donné naissance à une plage normale d’une variété de colonies hématopoïétiques avec une élévation moyenne du nombre d’unités de formation de Burst-erythroid (BFU-erythroid). Des frottis de moelle osseuse et des sections de trépan (voir fig. 3) 14 à 20 jours après perfusion de HRSC autologue ont montré une augmentation importante du nombre de myélocytes à différents stades de différenciation, avec des mégacaryocytes matures et immatures chez tous les patients par [0163] With difficulty, colonies were formed after aspiration of bone marrow from patients before infusion of autologous HRSC, an operation followed by inoculation in a cell culture of methylcellulose (see FIG. 3). Clonal dosing only in patient B with hypoplastic anemia showed reduced hematopoiesis. However, 14-20 days after infusion, all bone marrow aspirations obtained in the patients gave rise to a normal range of a variety of hematopoietic colonies with an average elevation in the number of Burst-erythroid formation units (BFU -erythroid). Bone marrow smears and trephine sections (see Fig. 3) 14-20 days after autologous HRSC infusion showed a marked increase in the number of myelocytes at different stages of differentiation, with mature and immature megakaryocytes in all patients. by

32 comparaison à une ligne de base. Une hyperplasie érythroïde à différents stades de différenciation a également été notée dans tous les échantillons. 32 comparison to a baseline. Erythroid hyperplasia at various stages of differentiation was also noted in all samples.

[0164] Aucun changement dans les motifs d’établissement de karyotype et de G cerclage dans des échantillons de sang périphérique et de moelle osseuse obtenus avant et après perfusion (chez le patient A et le patient D pendant plus de 4 ans) de HRSC autologue chez tous les patients (voir fig. 4). [0164] No change in the patterns of karyotype establishment and G cerclage in peripheral blood and bone marrow samples obtained before and after infusion (in patient A and patient D for more than 4 years) of autologous HRSC in all patients (see Fig. 4).

[0165] Après perfusion de HRSC autologue chez des patients souffrant d’anémie aplasique, des cellules CD34 primitives (CD38-) et déterminées (CD38<+>) ont été mises en circulation dans la circulation périphérique pendant trois jours avant reprogrammation en myélocytes (fig. 2). Une prise de greffe de myéloïdes s’en est suivie trois jours après perfusion de HRSC chez les patients A, B, et D. D’autre part, une prise de greffe de myéloïdes s’en est suivie au 20<e>jour pour le patient 003, lors d’une analyse par cytométrie en flux. La perfusion unique de HRSC, sans l’utilisation d’un quelconque régime de pré-conditionnement, mène à une prise de greffe à long terme pour 2 des 4 patients souffrant d’une anémie aplasique. Les patients A et B ont présenté une prise de greffe à long terme sans une quelconque transfusion après perfusion de HRSC. Une prise de greffe de neutrophiles, de globules rouges et de plaquettes chez un tel patient a été accompagnée par un changement ou une augmentation du niveau d’hémoglobine Hb F (tableaux 6 et 7). Ceci n’a pas été noté chez les deux autres patients qui sont décédés. Un changement de Hb F chez ces deux patients confirme la capacité de HRSC perfusé vers un phénotype Hb juvénile, et ainsi une prise de greffe et une reconstitution, comme observé avec une transplantation de cellules souches de sang de cordon ombilical (Elhasid et al., Leukemia 2000, 14: pages 931 à 934; Locatelli et al., Bone Marrow Transplant 1996, 18: pages 1095 à 1 101). [0165] After infusion of autologous HRSC in patients suffering from aplastic anemia, primitive CD34 cells (CD38-) and determined (CD38 <+>) were put into circulation in the peripheral circulation for three days before reprogramming in myelocytes ( fig. 2). Myeloid engraftment followed three days after HRSC infusion in patients A, B, and D. On the other hand, myeloid engraftment followed on day 20 for patient 003, during flow cytometry analysis. The single infusion of HRSC, without the use of any pre-conditioning regimen, leads to long-term engraftment in 2 of 4 patients with aplastic anemia. Patients A and B experienced long-term engraftment without any transfusion following HRSC infusion. Neutrophils, red blood cells and platelets engraftment in such a patient was accompanied by a change or an increase in the level of hemoglobin Hb F (Tables 6 and 7). This was not noted in the other two patients who died. A change in Hb F in these two patients confirms the ability of HRSC infused to a juvenile Hb phenotype, and thus engraftment and reconstitution, as seen with umbilical cord blood stem cell transplantation (Elhasid et al., Leukemia 2000, 14: pages 931 to 934; Locatelli et al., Bone Marrow Transplant 1996, 18: pages 1095 to 1,101).

[0166] La prise de greffe à long terme avec préservation du nombre de chromosomes et cerclage reflète clairement la sécurité de perfusion de HRSC dans un état hématologique où une évolution clonale n’est pas un événement rare avec des thérapies habituelles. [0166] Long-term engraftment with preservation of chromosome number and cerclage clearly reflects the safety of HRSC infusion in a hematologic state where clonal development is not a rare event with usual therapies.

[0167] De manière importante, les HRSC autologues étaient capables d’une prise de greffe à long terme et d’un taux de survie dans un sous-ensemble de patients souffrant d’une anémie aplasique sévère sans l’utilisation d’un quelconque régime d’immunosuppression, comme celles constatées avec des cellules souches syngéniques. [0167] Importantly, autologous HRSCs were capable of long-term engraftment and survival rate in a subset of patients with severe aplastic anemia without the use of any. immunosuppression regimen, such as those seen with syngeneic stem cells.

[0168] En résumé, 14 jours après perfusion, l’analyse de la moelle osseuse des personnes perfusées a présenté une augmentation de cellularité de moelle osseuse, et des myéloïdes, des érythroïdes et des lignages mégacaryocytes à différents stades de différenciation, avec une chute de cellules grasses et de cellules stromales, qui sont l’occupant prédominant d’une moelle osseuse atteinte par une anémie aplasique sévère. Il y avait une augmentation importante de la masse de globules rouges dans la moelle osseuse, avec une augmentation correspondante du niveau d’hémoglobine, de même que de la numération de réticulocytes. Il y avait également une augmentation stable d’hémoglobine foetale - un composant important pour améliorer une anémie de cellules falciformes et de béta thalassémie - et de globules rouges exprimant l’hémoglobine foetale après perfusion. De plus, il y avait une amélioration importante des indices de globules rouges, comme déterminé par la taille des globules rouges, la teneur et la concentration en hémoglobine. Les cellules reprogrammées présentaient un caryotype normal et une stabilité génétique après perfusion. Enfin, une prise de greffe et un repeuplement à long terme ont été observés chez plus de trois patients souffrant d’une anémie aplasique. [0168] In summary, 14 days after infusion, the analysis of the bone marrow of the infused persons presented an increase in bone marrow cellularity, and of myeloid, erythroid and megakaryocyte lineages at different stages of differentiation, with a fall. fatty cells and stromal cells, which are the predominant occupant of a bone marrow with severe aplastic anemia. There was a marked increase in the mass of red blood cells in the bone marrow, with a corresponding increase in the level of hemoglobin, as well as in the count of reticulocytes. There was also a stable increase in fetal hemoglobin - an important component in improving sickle cell anemia and beta thalassemia - and red blood cells expressing fetal hemoglobin after infusion. In addition, there was a significant improvement in red blood cell indices, as determined by red blood cell size, hemoglobin content and concentration. The reprogrammed cells exhibited normal karyotype and genetic stability after infusion. Finally, long-term engraftment and repopulation have been observed in more than three patients with aplastic anemia.

Exemple 2 Example 2

Matériaux et procédés Materials and processes

[0169] Des cellules hématopoïétiques reprogrammées autologues (cellules cibles) ont été testées chez 21 patients souffrant d’une bêta-thalassemie. 19 patients avaient une bêta-thalassémie majeure, et 2 avaient une bêta-thalassémie. L’un des patients souffrant d’une bêta-thalassémie intermédiaire avait un variant thalassémie/Hb E (courant chez un patient de l’extrême orient et d’origine indienne), et l’autre avait une thalassémie/anémie de drépanocytes. [0169] Autologous reprogrammed hematopoietic cells (target cells) were tested in 21 patients with beta-thalassemia. 19 patients had beta thalassemia major, and 2 had beta thalassemia. One of the patients with beta-thalassemia intermedia had a variant thalassemia / Hb E (common in a patient from the Far East and of Indian descent), and the other had thalassemia / sickle cell anemia.

[0170] Les patients ont été soumis à une aphérèse en traitant deux ou trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation de globules blancs jusqu’à ce que les cellules cibles aient été obtenues, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives, comme décrit ci-dessus. Les patients ont reçu les cellules reprogrammées autologues via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou les veines du bras ou de la cuisse. [0170] The patients were subjected to apheresis by treating two or three times their volume of whole blood. Autologous reprogrammed cells were generated by reprogramming white blood cells until target cells were obtained, as indicated by their distinguishing characteristics, as described above. Patients received autologous reprogrammed cells via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0171 ] Aucun effet collatéral toxique ou contraire n’a été observé à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées chez des patients souffrant d’une bêta-thalassémie, comme mesuré par une surveillance des signes vitaux, un échocardiogramme, les densités osseuses, les enzymes du foie et du rein, y compris établissement de caryotype et G cerclage, par comparaison à une ligne de référence. Il y a une réduction moyenne statistiquement importante (50%) d’exigence de transfusion sanguine chez des patients souffrant d’une bêta-thalassémie majeure, maintenant presque 9 mois à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées, par comparaison à une ligne de référence. Deux patients souffrant de thalassémie qui sont des bêta-thalassémies intermédiaires (une première était une thalassémie/HB E et l’autre une thalassémie/anémie de drépanocytes) sont devenus indépendants d’une transfusion maintenant presque 9 mois après une perfusion des cellules reprogrammées. [0171] No toxic or adverse side effects were observed following an infusion of the reprogrammed cells in patients suffering from beta-thalassemia, as measured by monitoring vital signs, echocardiogram, bone densities. , liver and kidney enzymes, including karyotyping and G cerclage, compared to a baseline. There is a statistically significant mean reduction (50%) in blood transfusion requirement in patients with beta thalassemia major, now almost 9 months following infusion of reprogrammed cells, compared to a line of reference. Two thalassemia patients who are beta thalassemia intermediates (one was thalassemia / HB E and the other was thalassemia / sickle cell anemia) have become transfusion independent now almost 9 months after infusion of the reprogrammed cells.

33 [0172] Le poids moyen et la taille à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées ont été significativement supérieures par comparaison à une ligne de référence, et la taille d’organes chez des patients souffrant de thalassémie avec une rate et/ou un foie agrandi(e), a été normalisée. La concentration en hémoglobine foetale moyenne absolue a augmenté chez des patients souffrant de thalassémie majeure et d’une thalassémie intermédiaire à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées par comparaison à une ligne de référence (fig. 5). De même, les indices de globules rouges moyens tels que reflétés par une amélioration de la taille des globules rouges, la teneur en hémoglobine (fig. 6) et la concentration (fig. 7) ont également été améliorés significativement par comparaison à une ligne de référence. 33 [0172] The mean weight and height following infusion of reprogrammed cells were significantly greater compared to a baseline, and organ size in thalassemia patients with a spleen and / or a spleen. enlarged liver, was normalized. The absolute mean fetal hemoglobin concentration increased in patients with thalassemia major and thalassemia intermedia following infusion of the reprogrammed cells compared to a baseline (Fig. 5). Likewise, the average red blood cell indices as reflected by an improvement in red blood cell size, hemoglobin content (Fig. 6) and concentration (Fig. 7) were also significantly improved compared to a line of reference.

[0173] Enfin, la ferritine de sérum moyenne (un biomarqueur pour une surcharge en fer) a diminué significativement chez des patients souffrant d’une thalassémie à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées (fig. 8). [0173] Finally, mean serum ferritin (a biomarker for iron overload) was significantly decreased in patients with thalassemia following infusion of reprogrammed cells (Fig. 8).

[0174] Une surcharge en fer est la cause majeure de mortalité et de mobilité chez des patients souffrant de thalassémie, d’anémie de drépanocytes, et de tout trouble induit par une surcharge en fer de transfusion. [0174] Iron overload is the major cause of mortality and mobility in patients suffering from thalassemia, sickle cell anemia, and any disorder induced by transfusion iron overload.

Exemple 3 Example 3

Matériaux et procédés Materials and processes

[0175] Deux patients souffrant de diabète ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Des cellules souches mésenchymateuses reprogrammées autologues, des cellules souches pluripotentes et des îlots de Langerhans (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0175] Two patients with diabetes underwent apheresis by treating 2-3 times their whole blood volume. Autologous reprogrammed mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells, and islets of Langerhans (target cells) were obtained by reprogramming apheresis white blood cells until the target cells have developed, as indicated by their distinctive characteristics. as described above. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0176] A la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées autologues, les patients ont synthétisé un niveau normal d’insuline, comme mesuré par diète absolue and peptides c stimulés par ingestion d’aliments après 90 minutes. Ce niveau normal de peptides c a été maintenu jusqu’à trois mois après la perfusion des cellules reprogrammées (fig. 9). De plus, les niveaux de Hb A1 C, indiquant un témoin de glycémie, s’étaient normalisés à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées (fig. 10). Par exemple, des patients ayant un niveau de Hb A1 C au-dessus de 10% avant perfusion ont maintenant un niveau de Hb A1 C de 5,8% à la suite de la réception des cellules reprogrammées. De plus, les niveaux de glucose sanguin de ces patients semblent atteindre des niveaux normaux après perfusion, par comparaison à une ligne de référence. De plus, une réduction drastique d’ingestion/injection d’insuline par le patient diabétique a été notée à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées. [0176] Following infusion of the autologous reprogrammed cells, patients synthesized a normal level of insulin, as measured by absolute diet and c-peptides stimulated by ingestion of food after 90 minutes. This normal level of c-peptides was maintained for up to three months after infusion of the reprogrammed cells (Fig. 9). In addition, Hb A1 C levels, indicative of a blood sugar control, had normalized following infusion of the reprogrammed cells (Fig. 10). For example, patients with an Hb A1 C level above 10% before infusion now have an Hb A1 C level of 5.8% following receipt of the reprogrammed cells. In addition, the blood glucose levels of these patients appear to reach normal levels after infusion, compared to a baseline. In addition, a drastic reduction in the ingestion / injection of insulin by the diabetic patient was noted following the infusion of the reprogrammed cells.

Exemple 4 Example 4

Matériaux et procédés Materials and processes

[0177] Quatre patients souffrant d’une sclérose latérale amyotrophique (ALS) ont reçu les cellules reprogrammées autologues. Le diagnostic de cette maladie n’implique pas un biomarqueur spécifique. Cette maladie est diagnostiquée par une exclusion clinique d’autres troubles similaires. [0177] Four patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) received the autologous reprogrammed cells. The diagnosis of this disease does not involve a specific biomarker. This disease is diagnosed by clinical exclusion of other similar disorders.

[0178] Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules d’épithélium alvéolaires, et des neurones (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées au patient via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0178] The patients underwent apheresis by treating 2 to 3 times their volume of whole blood. Autologous reprogrammed pluripotent stem cells, alveolar epithelium cells, and neurons (target cells) were obtained by reprogramming apheresis white blood cells until target cells have developed, as indicated by their characteristics. distinctive as described above. Autologous reprogrammed cells were administered to the patient via an intravenous infusion into the jugular or veins in the arm or thigh.

Résultats Results

[0179] Chez des patients souffrant d’ALS et traités avec les cellules reprogrammées autologues, il y a eu une amélioration importante du test de fonction pulmonaire (PFT). Une déficience dans ce test de fonction pulmonaire est l’une des causes qui mènent à une mortalité précoce. La plupart des patients ont ressenti une moindre rigidité dans les membres et le cou, et certains ont rapporté une amélioration de leur élocution. D’autres ont présenté une amélioration de l’aptitude à la marche, de même qu’à lever la tête. [0179] In patients with ALS treated with autologous reprogrammed cells, there was a significant improvement in the pulmonary function test (PFT). A deficiency in this lung function test is one of the causes leading to early mortality. Most patients felt less stiffness in the limbs and neck, and some reported improved speech. Others have shown improvement in the ability to walk as well as lift their heads.

Exemple 5 Example 5

Matériaux et procédés Materials and processes

[0180] Quatre patients souffrant de la maladie de Parkinson ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang total. Des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et des neurones (cellules cibles) ont été [0180] Four patients with Parkinson's disease underwent apheresis by treating two to three times their whole blood volume. Autologous reprogrammed pluripotent stem cells and neurons (target cells) have been

34 obtenus par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. 34 obtained by reprogramming apheresis white blood cells until the target cells have developed, as indicated by their distinctive characteristics as described above. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0181 ] Des patients chez lesquels l’effet de tressaillement de la maladie est prononcé ont ressenti une réduction importante de l’agitation, et de l’ingestion de médicaments habituels utilisés pour gérer ce trouble. Le premier patient, qui prenait 4 comprimés de Sinemet (régulateur de dopamine) par jour, et quatre mois après transfusion, ne prend plus qu’un comprimé par jour. [0181] Patients with a pronounced disease thrill effect have experienced a marked reduction in agitation, and in ingestion of the usual drugs used to manage this disorder. The first patient, who was taking 4 Sinemet (dopamine regulator) tablets per day, and four months after transfusion, now only takes one tablet per day.

Exemple 6 Example 6

Matériaux et procédés Materials and processes

[0182] Deux patients souffrant d’une blessure de la moelle épinière ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Des cellules souches pluripotentes rétro-différenciées autologues et des neurones (cellules cibles) ont été obtenus par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0182] Two patients with a spinal cord injury underwent apheresis processing two to three times their whole blood volume. Autologous retro-differentiated pluripotent stem cells and neurons (target cells) were obtained by reprogramming apheresised white blood cells until the target cells had developed, as indicated by their distinctive characteristics as described below. above. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0183] Un patient a perdu le suivi. L’autre patient était un quadriplégique avec une blessure de la moelle épinière en C5-C6. Ce patient était incapable de s’asseoir ou de tourner son torse dans un lit. A la suite du traitement, il était capable de s’asseoir droit pendant de très longues périodes de temps, et pouvait tourner son corps dans un lit. Il était également capable de tenir debout tout seul après avoir appuyé son corps contre un mur. De plus, il était capable de remuer ses orteils, et a rapporté une sensation dans sa vessie. Une analyse par IRM avant et après perfusion des cellules reprogrammées a montré une légère réduction de la taille de la lésion suite à la perfusion de cellules reprogrammées. Il a commencé à subir activement une physiothérapie, et s’est senti de manière générale beaucoup mieux que précédemment. [0183] One patient lost follow-up. The other patient was a quadriplegic with a C5-C6 spinal cord injury. This patient was unable to sit up or turn his torso in a bed. Following the treatment, he was able to sit upright for very long periods of time, and could turn his body in a bed. He was also able to stand on his own after leaning his body against a wall. In addition, he was able to wiggle his toes, and reported a sensation in his bladder. MRI analysis before and after infusion of the reprogrammed cells showed a slight reduction in lesion size following the infusion of the reprogrammed cells. He began to actively undergo physiotherapy, and generally felt much better than before.

Exemple 7 Example 7

Matériaux et procédés Materials and processes

[0184] Deux patients souffrant d’une dystrophie musculaire (MD) ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules de muscle squelettique (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Le premier patient souffrait d’une MD des membres-de la gaine abdominale, qui fait référence à une classe de MD dans laquelle les muscles qui sont affectés le plus sévèrement sont généralement ceux des hanches et des épaules, et le second patient souffrait d’une MD de type nemelin. [0184] Two patients with muscular dystrophy (MD) were treated with autologous reprogrammed pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, and skeletal muscle cells (target cells) were obtained by reprogramming white blood cells having undergone apheresis until the target cells have grown, as indicated by their distinguishing features as described above. The first patient suffered from limb-abdominal sheath MD, which refers to a class of MD in which the muscles that are most severely affected are usually those of the hips and shoulders, and the second patient suffered from a nemelin-type MD.

[0185] Les patients ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation selon la présente invention. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0185] The patients underwent apheresis by treating two to three times their volume of whole blood. Autologous reprogrammed cells were generated by reprogramming according to the present invention. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0186] L’atrophie musculaire associée à une MD peut être mesurée en surveillant le niveau de créatine phosphokinase d’enzymes musculaires (CPK). Cette enzyme a diminué en réponse à la perfusion de cellules souches rétro-différenciées (fig. 1 1 ). La lactate déhydrogénase, une enzyme qui est sécrétée pendant une rupture de tissu, a également diminué (fig.1 1 ). Les patients ont également ressenti une diminution d’alanine aminotransférase d’enzymes du foie (ALT) et d’aspartate aminotransférase (AST), les deux étant associées à une inflammation et une blessure de cellules du foie, de même que du muscle squelettique. [0186] Muscle atrophy associated with MD can be measured by monitoring the level of muscle enzyme creatine phosphokinase (CPK). This enzyme decreased in response to infusion of retro-differentiated stem cells (Fig. 11). Lactate dehydrogenase, an enzyme that is secreted during tissue disruption, was also decreased (Fig. 11). Patients also experienced a decrease in the liver enzymes alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), both of which are associated with inflammation and injury of liver cells, as well as skeletal muscle.

[0187] De plus, les patients ont présenté une amélioration de mobilité, comme déterminé par enregistrement vidéo de patients avant et après perfusion des cellules reprogrammées, et de tests de fonction pulmonaire à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées, par comparaison à une ligne de référence. [0187] In addition, patients exhibited improved mobility, as determined by video recording of patients before and after infusion of the reprogrammed cells, and pulmonary function tests following infusion of the reprogrammed cells, compared to a reference line.

35 Exemple 8 35 Example 8

Matériaux et procédés Materials and processes

[0188] Des patients souffrant d’une maladie rénale ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules rénales (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les patients ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation selon la présente invention. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0188] Patients with kidney disease have been treated with autologous reprogrammed pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, and kidney cells (target cells) have been obtained by reprogramming white blood cells that have undergone apheresis to. that the target cells have grown, as indicated by their distinctive characteristics as described above. The patients underwent apheresis by processing two to three times their whole blood volume. Autologous reprogrammed cells were generated by reprogramming according to the present invention. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0189] Des patients recevant une perfusion de cellules reprogrammées autologues ont ressenti une amélioration de divers niveaux de marqueur de fluide qui sont indicateurs d’une fonction rénale plus saine, comme le débit d’urine, de créatinine de sérum et de BUN ou UREA. Par exemple, un patient homme diabétique de 75 ans a présenté une fonction rénale améliorée 24 mois après traitement avec les cellules reprogrammées autologues (voir tableau 8). Le patient a montré des niveaux accrus d’hémoglobine, qui est la molécule de protéines dans les globules rouges qui transporte l’oxygène, et un facteur de croissance-1 analogue à de l’insuline (IGF-1 ), un facteur de croissance. Le patient a également présenté des diminutions d’urée, qui est un composé organique, de créatinine, qui est un produit de rupture de phosphate de créatine dans du muscle, d’acid urique, qui est un composé organique excrété dans l’urine, et de phosphore, qui est un minerai que l’on trouve dans les os; des quantités élevées de ces marqueurs indiquent une pauvre fonction rénale. En outre, le patient présentait une diminution d’hémoglobine glycosylée (HbA1 C), qui est une forme d’hémoglobine, et qui est utilisée couramment comme un indicateur de concentration en glucose de plasma de gens souffrant du diabète. [0189] Patients receiving autologous reprogrammed cell infusion have experienced improvement in various fluid marker levels which are indicative of healthier kidney function, such as urine flow, serum creatinine, and BUN or UREA. . For example, a 75 year old male diabetic patient experienced improved renal function 24 months after treatment with autologous reprogrammed cells (see Table 8). The patient showed increased levels of hemoglobin, which is the protein molecule in red blood cells that carries oxygen, and an insulin-like growth factor-1 (IGF-1), a growth factor . The patient also experienced decreases in urea, which is an organic compound, creatinine, which is a breakdown product of creatine phosphate in muscle, uric acid, which is an organic compound excreted in the urine, and phosphorus, which is a mineral found in bones; high amounts of these markers indicate poor kidney function. In addition, the patient had a decrease in glycosylated hemoglobin (HbA1 C), which is a form of hemoglobin, and is commonly used as an indicator of plasma glucose levels in people with diabetes.

[0190] De manière similaire, un homme diabétique de 51 ans a présenté une amélioration similaire 12 mois après traitement (voir tableau 8). Ce patient présentait des niveaux accrus d’hémoglobine, et des niveaux diminués de créatinine, de HbA1 C, et d’azote dans le sang sous la forme d’urée (BUN), qui est une mesure de la quantité d’azote dans le sang sous forme d’urée. [0190] Similarly, a 51 year old diabetic man showed a similar improvement 12 months after treatment (see Table 8). This patient had increased levels of hemoglobin, and decreased levels of creatinine, HbA1 C, and nitrogen in the blood in the form of urea (BUN), which is a measure of the amount of nitrogen in the blood. blood in the form of urea.

Tableau 8: niveaux de marqueur de fonction rénale chez deux patients hommes diabétiques. Table 8: Renal function marker levels in two male diabetic patients.

[0191 ] [0191]

Homme diabétique de 75 ans Homme diabétique de 51 ans 75-year-old man with diabetes 51-year-old diabetic man

Ligne de 24-mois Ligne de 12 mois après référence après référence traitement traitement 24-month line 12-month line after referral after referral treatment treatment

Hémoglobine 8 12.9 12 14.5 Hemoglobin 8 12.9 12 14.5

Ffl/dll Ffl / dll

Urée [g/dl] 190 38 n/a n/a Urea [g / dl] 190 38 n / a n / a

Créatinine 12 1.9 15 4.5 Creatinine 12 1.9 15 4.5

[mg/dll [mg / dll

Acide urique 8.5 4 n/a n/a [mg/dl] Uric acid 8.5 4 n / a n / a [mg / dl]

Phosphore 6.1 3.8 n/a. n/a rmg/dll Phosphorus 6.1 3.8 n / a. n / a rmg / dll

HbA1 C [%] 14.4 6.1 12 6 HbA1 C [%] 14.4 6.1 12 6

IGF-1 [ng/dl] 45 1 12 n/a n/a BUN [mg/dl] n/a n/a 79 19 IGF-1 [ng / dl] 45 1 12 n / a n / a BUN [mg / dl] n / a n / a 79 19

[0192] HbA1 C = hémoglobine glycosylée; IGF-1 = facteur 1 analogue à de l’insuline; BUN = azote uréique du sang [0192] HbA1 C = glycosylated hemoglobin; IGF-1 = insulin-like factor 1; BUN = blood urea nitrogen

[0193] Une analyse de 12 patients ayant un diabète de type II, et traités avec des cellules reprogrammées autologues, a révélé des niveaux diminués de microalbumine (fig. 13), qui est associée à une fuite d’albumine dans l’urine, et qui est un indicateur d’une maladie rénale, de même que d’un dysfonctionnement endothélial vasculaire et d’une maladie cardio-vasculaire. Les 12 patients ont également ressenti des niveaux moindres de HbA1 C (fig. 14). [0193] An analysis of 12 patients with type II diabetes, and treated with autologous reprogrammed cells, revealed decreased levels of microalbumin (Fig. 13), which is associated with albumin leakage in the urine, and which is an indicator of kidney disease, as well as vascular endothelial dysfunction and cardiovascular disease. All 12 patients also experienced lower levels of HbA1 C (Fig. 14).

[0194] De plus, une femme de 45 ans souffrant d’une glomérulonéphrite auto-immune a présenté une amélioration de fonction rénale en moins de 18 mois après traitement avec des cellules reprogrammées autologues (voir tableau 9). [0194] In addition, a 45-year-old woman with autoimmune glomerulonephritis showed improvement in renal function within 18 months after treatment with autologous reprogrammed cells (see Table 9).

36 Tableau 9: Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 45 ans souffrant de glomérulonéphrite auto-immune. 36 Table 9: Levels of renal function markers in a 45-year-old woman with autoimmune glomerulonephritis.

[0195] [0195]

Ligne de référence 18 mois après traitement Reference line 18 months after treatment

Hémoglobine Hemoglobin

9 1 1 ,5 9 1 1, 5

[q/dll [q / dll

Créatinine Creatinine

9,3 2,1 9.3 2.1

[mg/dl] BUN [mg/dl] 89 15 [mg / dl] BUN [mg / dl] 89 15

BUN = azote uréique du sang BUN = blood urea nitrogen

[0196] De plus, une patiente femme de 59 ans souffrant d’une maladie rénale au stade terminal a présenté une amélioration du niveau de créatinine, du niveau d’urée, du niveau d’hémoglobine, et de parathormone (PTH) lors d’un traitement avec des cellules reprogrammées (voir tableau 10). Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 45 ans souffrant d’une maladie auto-immune. La patiente a également diminué le nombre de sessions d’hémodialyse qu’elle avait prévue par mois, de 12 sessions à environ 8 sessions. [0196] In addition, a 59-year-old female patient with end-stage renal disease exhibited improvement in creatinine level, urea level, hemoglobin level, and parathyroid hormone (PTH) during treatment. 'treatment with reprogrammed cells (see Table 10). Levels of renal function markers in a 45 year old woman with autoimmune disease. The patient also reduced the number of hemodialysis sessions she had scheduled per month, from 12 sessions to about 8 sessions.

Tableau 10: Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 59 ans souffrant d’une maladie rénale au stade terminal avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées. Table 10: Levels of Renal Function Markers in a 59-year-old Woman with End-Stage Kidney Disease Before and After Therapy with Reprogrammed Cells.

[0197] [0197]

Marqueur de Pré-thérapie Post-thérapie fonction rénale 02/03/2009 29/04/2009 23/05/2009 05/08/2009 11/08/2009 Renal function Pre-therapy Post-therapy marker 02/03/2009 04/29/2009 05/23/2009 08/05/2009 08/11/2009

Hémoglobine [g/dl] 9,8 9,2 11,5 Hemoglobin [g / dl] 9.8 9.2 11.5

TLC/WBC (par μΙ) 3800 6800 5100 TLC / WBC (per μΙ) 3800 6800 5100

PLT (par pi) 361000 273000 348000 PLT (per ft) 361,000 273,000 348,000

HbA1C [%] 5,6 HbA1C [%] 5.6

AST [U/L] 25 16 14 AST [U / L] 25 16 14

ALT [U/L] 49 11 12 ALT [U / L] 49 11 12

Urée [mg/dl] 90 70 22,13 Urea [mg / dl] 90 70 22.13

Créatinine [mg/dl] 14,5 11,2 11,86 8,86 9,58 Creatinine [mg / dl] 14.5 11.2 11.86 8.86 9.58

S. Albumine [g/dl] 3 3,4 3,3 3 S. Albumin [g / dl] 3 3.4 3.3 3

PT [seconds] 31,2 PT [seconds] 31.2

INR 2,71 INR 2.71

Calcium [mg/dl] 8,4 9,5 9,4 8,7 9,5 Phosphore[mg/dl] 8 9,2 5,9 Calcium [mg / dl] 8.4 9.5 9.4 8.7 9.5 Phosphorus [mg / dl] 8 9.2 5.9

Potassium [mmol/dl] 5.9 5.2 6.9 4.1 Potassium [mmol / dl] 5.9 5.2 6.9 4.1

Sodium [mmol/dl] 133 136 Sodium [mmol / dl] 133 136

Acide urique [mg/dl] 7,9 6,1 7,5 4,8 PTH [pg/ml] 195,6 108,2 Uric acid [mg / dl] 7.9 6.1 7.5 4.8 PTH [pg / ml] 195.6 108.2

[0198] TLC =numération de leukocytes totale; WBC = globules blancs; PLT = plaquettes; HbA1 C = hémoglobine glycosylée; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransferase; PT = temps de prothrombine; INR = taux normalisé international (pour une coagulation sanguine); PTH = parathormone [0198] TLC = total leukocyte count; WBC = white blood cells; PLT = platelets; HbA1 C = glycosylated hemoglobin; AST = aspartate aminotransferase; ALT = alanine aminotransferase; PT = prothrombin time; INR = international standard rate (for blood coagulation); PTH = parathyroid hormone

[0199] Un patient de 46 ans souffrant d’une défaillance rénale chronique du fait d’un diabète a également présenté une amélioration du niveau de créatinine, du niveau d’urée et du niveau d’hémoglobine lors d’un traitement avec des cellules reprogrammées (voir tableau 1 1 ). Le patient a diminué le nombre de sessions d’hémodialyse qu’il avait prévu par mois, de 12 sessions à environ 5 sessions, et a diminué le traitement avec de l’époétine alfa (EPREX ) délivrée de manière sous-cutanée, de 4000 unités deux fois par semaine à 4000 unités une fois toutes les deux semaines. [0199] A 46 year old patient with chronic kidney failure due to diabetes also showed improvement in creatinine level, urea level and hemoglobin level when treated with cells. reprogrammed (see table 1 1). The patient reduced the number of hemodialysis sessions he had scheduled per month from 12 sessions to about 5 sessions and reduced treatment with epoetin alfa (EPREX) delivered subcutaneously by 4,000 units twice a week to 4000 units once every two weeks.

37 Tableau 11 : Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez un patient de 46 ans souffrant d’une défaillance rénale chronique avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées. 37 Table 11: Levels of renal function markers in a 46 year old patient with chronic renal failure before and after therapy with reprogrammed cells.

[0200] [0200]

Marqueur de Pré-thérapie Post-thérapie fonction 21/09/2008 24/02/2009 20/04/2009 rénale Marker of Pre-therapy Post-therapy function 09/21/2008 02/24/2009 04/20/2009 renal

Hémoglobine Hemoglobin

6,5 10,3 9,4 fa/d Π 6.5 10.3 9.4 fa / d Π

TLC/WBC TLC / WBC

5500 8200 10100 (par μΙ) 5500 8200 10100 (per μΙ)

PLT (par μΙ) 159000 246000 300000 PLT (per μΙ) 159000 246000 300000

FBS [mg/dl] 133 120 121 FBS [mg / dl] 133 120 121

2 hrs PP 2 hrs PP

170 172 169 img/di] 170 172 169 img / di]

AST [U/L] 9 34 32 AST [U / L] 9 34 32

ALT [U/L] 5 22 15 ALT [U / L] 5 22 15

Urée [mg/dl] Urea [mg / dl]

109 51 65 109 51 65

Créatinine Creatinine

7,5 4,9 4 7.5 4.9 4

[mg/dll [mg / dll

S. Albumine S. Albumin

3,5 3,7 4 fa/d 11 3.5 3.7 4 fa / d 11

PT PT

12,7 12 11 12.7 12 11

[secondes] [seconds]

INR 1 1 1 INR 1 1 1

Calcium Calcium

10 9,9 1 1 10 9.9 1 1

[mg/dl] [mg / dl]

Phosphore Phosphorus

6 5,3 5 6 5.3 5

[mg/dll [mg / dll

Potassium Potassium

6,2 5,1 4,7 6.2 5.1 4.7

[mmol/l] [mmol / l]

Magnésium Magnesium

2,3 2,4 2,8 [mg/dl] 2.3 2.4 2.8 [mg / dl]

[0201 ] TLC =numération de leukocytes totale; WBC = globules blancs; PP = post prandial; PLT = plaquettes; FBS = glycémie à jeun; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransferase; PT = temps de prothrombine; INR = taux normalisé international (pour une coagulation sanguine) [0201] TLC = total leukocyte count; WBC = white blood cells; PP = post prandial; PLT = platelets; FBS = fasting blood sugar; AST = aspartate aminotransferase; ALT = alanine aminotransferase; PT = prothrombin time; INR = international normalized rate (for blood coagulation)

Exemple 9 Example 9

Matériaux et procédés Materials and processes

[0202] Des patients souffrant d’une sclérose en plaques ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses et des neurones (cellules cibles). Les cellules cibles ont été formées par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0202] Patients with multiple sclerosis have been treated with autologous reprogrammed pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells and neurons (target cells). Target cells were formed by reprogramming white blood cells subjected to apheresis until the target cells had developed, as indicated by their distinctive characteristics as described above. Patients underwent apheresis by processing 2-3 times their whole blood volume. Autologous reprogrammed cells were administered to patients via an intravenous infusion into the jugular or veins of the arm or thigh.

Résultats Results

[0203] Des patients traités avec des cellules reprogrammées autologues ont présenté une réduction des lésions dans le cerveau et la moelle épinière. Une réduction de lésions peut survenir dans les trois mois suivant la réception du traitement (fig. 15a-b). Une réduction de la détérioration de tissu cervical est survenue dans les six mois (fig. 16a-b). [0203] Patients treated with autologous reprogrammed cells have shown a reduction in lesions in the brain and spinal cord. Reduction of lesions may occur within three months of receiving treatment (Fig. 15a-b). A reduction in cervical tissue deterioration occurred within six months (Fig. 16a-b).

38 [0204] Des patients traités avec des cellules reprogrammées autologues ont également présenté une suppression de lésions de moelle épinière (fig. 17a-b). En outre, ces patients ont présenté une amélioration du score d’échelle de statut d’impuissance étendue (EDSS), une rémission, et n’ont pas participé à une thérapie habituelle pendant quatre ans après la réception d’une perfusion unique. [0204] Patients treated with autologous reprogrammed cells also exhibited suppression of spinal cord damage (Fig. 17a-b). In addition, these patients experienced an improvement in the Extended Impotence Status Scale (EDSS) score, remission, and did not participate in usual therapy for four years after receiving a single infusion.

Exemple 10 Example 10

Matériaux et procédés Materials and processes

[0205] Une patiente souffrant du VIH a été traitée avec des cellules souches hématopoïétiques reprogrammées autologues. La patiente a été soumise à une aphérèse en traitant deux à trois fois son volume de sang complet. Les cellules cibles ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées à la patiente via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse. [0205] A patient with HIV was treated with autologous reprogrammed hematopoietic stem cells. The patient was subjected to apheresis processing two to three times her whole blood volume. Target cells were obtained by reprogramming white blood cells subjected to apheresis until the target cells had developed, as indicated by their distinctive characteristics as described above. Autologous reprogrammed cells were administered to the patient via an intravenous infusion into the jugular or veins in the arm or thigh.

Résultats Results

[0206] Avant traitement, le test de criblage pour des anticorps VIH-1 et VIH-2 a présenté une valeur de test de 3,68. Une valeur de 1 ,0 ou supérieure est considérée comme positive. [0206] Before treatment, the screening test for HIV-1 and HIV-2 antibodies showed a test value of 3.68. A value of 1, 0 or greater is considered positive.

[0207] Deux mois après traitement avec des cellules reprogrammées autologues, la valeur de test pour le criblage des anticorps VIH-1 et VIH-2 était de 0,46, indiquant que la patiente ne présentait pas un résultat positif pour VIH-1 et VIH-2. Six mois après traitement, la valeur de test pour le criblage des anticorps VIH-1 et VIH-2 était de 0,48, démontrant encore que la patiente ne présentait pas un résultat positif pour le VIH. [0207] Two months after treatment with autologous reprogrammed cells, the test value for screening for HIV-1 and HIV-2 antibodies was 0.46, indicating that the patient did not have a positive result for HIV-1 and HIV-2. Six months after treatment, the test value for screening for HIV-1 and HIV-2 antibodies was 0.48, again demonstrating that the patient did not test positive for HIV.

Exemple 11 Example 11

[0208] Les effets d’un traitement avec des cellules reprogrammées autologues ont été démontrés chez des patients souffrant d’autres états et d’autres maladies. Les cellules cibles listées ici ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. [0208] The effects of treatment with autologous reprogrammed cells have been demonstrated in patients with other conditions and diseases. The target cells listed here were obtained by reprogramming white blood cells subjected to apheresis until the target cells have developed, as indicated by their distinctive characteristics as described above.

Défaillance cardiaque congestive Congestive heart failure

[0209] Un homme de 61 ans souffrant d’une défaillance cardiaque congestive a été perfusé avec des cardiomyocytes reprogrammés autologues, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules d’endothélium. Le traitement a mené à une amélioration de la fraction d’éjection (EF); des niveaux de précurseur de peptide natriurétique du cerveau (Pro BNP), qui est un indicateur prévisionnel associé à une maladie coronarienne; des niveaux de glycémie à jeun; et des niveaux de HbA1 C (voir tableau 12). De plus, le cœur, qui était précédemment dilaté, est retourné à sa taille normale comme mis en évidence dans le tableau 12 par une diminution de la dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité (LVID/D), la dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité (LVID/S), et de l’épaisseur de septum diastolique d’extrémité (IVSD), comme mesuré par échocardiogramme. [0209] A 61-year-old man with congestive heart failure was perfused with autologous reprogrammed cardiomyocytes, pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, and endothelium cells. The treatment led to an improvement in the ejection fraction (EF); levels of brain natriuretic peptide precursor (Pro BNP), which is a predictor associated with coronary artery disease; fasting blood sugar levels; and HbA1 C levels (see Table 12). In addition, the heart, which was previously dilated, returned to its normal size as evidenced in Table 12 by a decrease in the left ventricular end diastolic internal dimension (LVID / D), the left ventricular diastolic internal dimension. extremity (LVID / S), and extremity diastolic septum thickness (IVSD), as measured by echocardiogram.

39 Tableau 12. Marqueurs de maladie coronarienne chez un patient de 61 ans souffrant d’une défaillance cardiaque congestive avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées. 39 Table 12. Markers of coronary artery disease in a 61 year old patient with congestive heart failure before and after therapy with reprogrammed cells.

[0210] [0210]

Marqueurs 1-mois 1-mois 2- mois 4- mois 6- mois 10- mois de maladie avant après après après après après coronarienne traitement traitement traitement traitement traitement traitement Markers 1-month 1-month 2- months 4- months 6- months 10- months of illness before after after after after after coronary artery treatment treatment treatment treatment treatment treatment

LVID/D [cm] 6,5 6,3 5,9 6,9 6,5 5.7 LVID / D [cm] 6.5 6.3 5.9 6.9 6.5 5.7

LVID/S [cm] 6,1 5,6 5,4 5,9 5,7 4,9 LVID / S [cm] 6.1 5.6 5.4 5.9 5.7 4.9

EF 15 18 22 29 33 45 EF 15 18 22 29 33 45

IVSD [cm] 1,3 1,3 1,2 1,2 0,6 1,0 IVSD [cm] 1.3 1.3 1.2 1.2 0.6 1.0

LVPWD [cm] 0,7 0,6 0,6 0,8 0,6 1,0 LVPWD [cm] 0.7 0.6 0.6 0.8 0.6 1.0

LV indice de 283 251 209,5 167 151,5 masse 141,5 133,5 111,4 88,8 81 LV index of 283 251 209.5 167 151.5 mass 141.5 133.5 111.4 88.8 81

[gm/m] [gm / m]

Pro BNP 2969 800 600 600 600 497 [pg/ml] Pro BNP 2969 800 600 600 600 497 [pg / ml]

Glycémie à 244 118 145 87 95 80 jeun [mg/dl] HbA1C [%] 9,2 nd nd 7,2 6,5 6 Fasting blood glucose 244 118 145 87 95 80 [mg / dl] HbA1C [%] 9.2 na na 7.2 6.5 6

[0211 ] LVID/D = dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; LVID/S = dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; EF = fraction d’éjection; IVSD = épaisseur de septum intraventiculaire diastolique d’extrémité; LVPWD = épaisseur de paroi postérieure ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; Pro-BNP= précurseur de peptide natriurétique; HbA1 C = hémoglobine glycosylée [0211] LVID / D = left ventricular end diastolic internal dimension; LVID / S = left ventricular end diastolic internal dimension; EF = ejection fraction; IVSD = thickness of end diastolic intraventicular septum; LVPWD = left ventricular end diastolic posterior wall thickness; Pro-BNP = precursor of natriuretic peptide; HbA1 C = glycosylated hemoglobin

Hépatite C Hepatitis C

[0212] 13 patients infectés du virus de l’hépatite C (HCV) et ayant une bêta-thalassémie ont reçu la perfusion de cellules hématopoïétiques reprogrammées autologues, de cellules souches pluripotentes, de cellules souches mésenchymateuses, et d’hépatocytes. Les effets du traitement ont révélé une moindre charge ou une absence de celle-ci (voir tableau 13), de même que des marqueurs sanguins améliorés (voir tableau 14) comme des enzymes du foie, de la bilirubine, de l’albumine, le temps de pro-thrombine, et le taux normalisé international (pour une coagulation sanguine). En particulier, les patients ont ressenti une normalisation des enzymes du foie alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST), qui sont toutes les deux associées à une inflammation et à une blessure des cellules du foie (fig. 18a-b). [0212] 13 patients infected with hepatitis C virus (HCV) and having beta thalassemia received the infusion of autologous reprogrammed hematopoietic cells, pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, and hepatocytes. Treatment effects revealed less or no load (see Table 13), as well as improved blood markers (see Table 14) such as liver enzymes, bilirubin, albumin, pro-thrombin time, and the international normalized level (for blood clotting). In particular, patients experienced normalization of the liver enzymes alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), both of which are associated with inflammation and injury of liver cells (Fig. 18a-b).

40 Tableau 13: Charge virale chez 12 patients infectés du virus de l’hépatite C et traités avec des cellules souches reprogrammées autologues. 40 Table 13: Viral load in 12 patients infected with hepatitis C virus and treated with autologous reprogrammed stem cells.

[0213] [0213]

ID de patient Ligne de référence 3 mois après perfusion Charge virale x 1000 Charge virale x 1000 Patient ID Referral line 3 months after infusion Viral load x 1000 Viral load x 1000

1 0 0 1 0 0

2 164 82 2 164 82

3 3 0 3 3 0

4 123 16 4 123 16

5 16 0 5 16 0

6 2 0 6 2 0

6 0 0 6 0 0

8 7,7 millions 7,7 millions 8 7.7 million 7.7 million

9 152 106 9 152 106

10 63 27 10 63 27

1 1 387 97 1 1 387 97

12 0 0 13 17 0 12 0 0 13 17 0

Tableau 14: Marqueurs sanguins chez des patients infectés par le virus de l’hépatite C, et souffrant d’une cirrhose du foie, au niveau de la ligne de référence, et après thérapie avec des cellules reprogrammées, Table 14: Blood markers in patients infected with the hepatitis C virus, and suffering from cirrhosis of the liver, at the baseline level, and after therapy with reprogrammed cells,

[0214] [0214]

Marqueurs sanguins Ligne de référence Trois mois après perfusion Blood markers Reference line Three months after infusion

Hémoglobine [g/dl] 9,8 12,9 Hemoglobin [g / dl] 9.8 12.9

Plaquette (par μΙ) 65000 120000 Plate (per μΙ) 65,000 120,000

WBC (par pi) 4300 7200 WBC (per ft) 4300 7200

Glycémie (à jeun) [mg/dl] 210 110 Blood glucose (fasting) [mg / dl] 210 110

Sang 2 hrs (PP) [mg/dl] 190 134 Blood 2 hrs (PP) [mg / dl] 190 134

ALT [U/L] 50 24 ALT [U / L] 50 24

AST [U/L] 32 31 AST [U / L] 32 31

Bilirubine (Total) [mg/dl] 6,9 3,2 Bilirubin (Total) [mg / dl] 6.9 3.2

Bilirubine (Direct) [Mg/dm] 3,1 1 ,8 Bilirubin (Direct) [Mg / dm] 3.1 1, 8

Albumine de sérum [g/l] 1 ,9 3,1 Serum albumin [g / l] 1, 9 3,1

Urée [mg/dl] 60 36 Urea [mg / dl] 60 36

Créatinine [mg/dl] 1 ,6 1 ,1 Creatinine [mg / dl] 1, 6 1, 1

INR 1 ,8 1 ,0 PT [seconds] 18 12,8 INR 1, 8 1, 0 PT [seconds] 18 12.8

[0215] WBC = globules blancs; PP = post prandial; ALT = alanine aminotransferase; AST = aspartate aminotransferase; INR = taux normalisé international (pour coagulation sanguine); PT = temps de prothrombine [0215] WBC = white blood cells; PP = post prandial; ALT = alanine aminotransferase; AST = aspartate aminotransferase; INR = international standard rate (for blood coagulation); PT = prothrombin time

[0216] Par exemple, un homme de 44 ans souffrant d’une cirrhose du foie du fait d’une infection par le virus de l’hépatite C a également présenté une amélioration des enzymes du foie alanine aminotransferase et aspartate aminotransferase, du taux international normalisé (pour coagulation sanguine), de la bilirubine, et de l’albumine, de même que de la glycémie aléatoire (voir tableau 15). En fait, ce patient était sous traitement d’albumine avant la thérapie avec les cellules reprogrammées, mais n’a pas reçu d’albumine après la thérapie. [0216] For example, a 44 year old man with cirrhosis of the liver due to infection with hepatitis C virus also showed improvement in liver enzymes alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase, from the international level. normalized (for blood coagulation), bilirubin, and albumin, as well as random glucose (see Table 15). In fact, this patient was on albumin treatment before therapy with the reprogrammed cells, but did not receive albumin after therapy.

41 Tableau 15: marqueurs sanguins chez un homme de 44 ans souffrant d’une cirrhose du foie du fait d’une infection par le virus de l’hépatite C, au niveau de la ligne de référence, et après thérapie avec des cellules reprogrammées. 41 Table 15: Blood markers in a 44 year old man with cirrhosis of the liver due to infection with hepatitis C virus, at baseline, and after therapy with reprogrammed cells.

[0217] [0217]

Marqueurs Ligne de Après thérapie sanguins référence Reference Line After Therapy Blood Markers

30/03/2009 04/04/2009 23/04/2009 i 06/05/2009 22/06/2009 03/30/2009 04/04/2009 04/23/2009 i 05/06/2009 06/22/2009

Hémoglobine Hemoglobin

10,9 10,4 1 1 ,6 13,4 10,2 fa/dil 10.9 10.4 1 1, 6 13.4 10.2 fa / dil

TLC (par pi) 2500 2700 6100 4700 2800 TLC (per ft) 2500 2700 6100 4700 2800

PLT (par pl) 20000 17000 43000 50000 27000 PLT (per pl) 20,000 17,000 43,000 50,000 27,000

AST [U/L] 212 170 131 141 120 AST [U / L] 212 170 131 141 120

ALT [U/L] 62 59 48 51 53 ALT [U / L] 62 59 48 51 53

Alkaline Alkaline

Phosphatase 196 147 58 ru/Li Phosphatase 196 147 58 ru / Li

GGT [U/L] 49 70 63 35 GGT [U / L] 49 70 63 35

Bilirubine T [mg/L] 12,7 10,9 1 1 ,2 8,1 8,8 Bilirubin T [mg / L] 12.7 10.9 1 1, 2 8.1 8.8

Bilirubine D Bilirubin D

6,8 5,4 4,71 4,9 4 [mg/D1] 6.8 5.4 4.71 4.9 4 [mg / D1]

Urée [mg/dl] 13 18 20 16 25 Urea [mg / dl] 13 18 20 16 25

Créatinine Creatinine

0,7 0,7 0,8 0,7 0,7 0.7 0.7 0.8 0.7 0.7

[mg/dl] [mg / dl]

S. Albumine S. Albumin

2,8 2,5 2,9 2,4 1 ,9 [0/Ll 2.8 2.5 2.9 2.4 1, 9 [0 / Ll

RBS [mg/d1 ] 212 154 158 188 174 RBS [mg / d1] 212 154 158 188 174

INR 1 ,9 1 ,8 1 ,72 1 ,69 1 ,72 INR 1, 9 1, 8 1, 72 1, 69 1, 72

Potassium Potassium

3,2 3,8 4,4 3.2 3.8 4.4

[mmol/L] [mmol / L]

Sodium Sodium

134 141 137 134 141 137

[mmol/L] [mmol / L]

Acide urique Uric acid

3,5 2,4 3 [Mg/dl] 3.5 2.4 3 [Mg / dl]

Alpha protéine Alpha protein

Normal foetale Cryoglobulines Négatives Normal fetal Cryoglobulins Negative

[0218] TLC = numération de leucocytes totale; PLT = plaquettes; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransférase; GGT = gamma-glutamyle transférase; RBS = glycémie aléatoire; INR = taux international normalisé (pour coagulation sanguine) [0218] TLC = total leukocyte count; PLT = platelets; AST = aspartate aminotransferase; ALT = alanine aminotransferase; GGT = gamma-glutamyl transferase; RBS = random blood sugar; INR = international normalized rate (for blood coagulation)

Traumatisme crânien Head trauma

[0219] Un patient souffrant d’un traumatisme crânien suite à un accident de véhicule à moteur a été traité avec une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et de neurones. Le traitement a mené à une réparation du tissu du cerveau détérioré (fig. 19a-b), à une amélioration de la fraction d’éjection (EF); des niveaux de précurseur de peptide natriurétique du cerveau (Pro BNP), qui est un indicateur prévisionnel associé à une maladie coronarienne; de niveau de glycémie à jeun; et des niveaux de HbA1 C (voir tableau 10). [0219] A patient with head trauma following a motor vehicle accident was treated with an infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells and neurons. Treatment led to repair of damaged brain tissue (Fig. 19a-b), improvement in ejection fraction (EF); levels of brain natriuretic peptide precursor (Pro BNP), which is a predictor associated with coronary artery disease; fasting blood sugar level; and levels of HbA1 C (see Table 10).

42 Maladie pulmonaire 42 Lung disease

[0220] Un patient souffrant d’une maladie pulmonaire restrictive associée à une maladie de neurones moteurs a été traité par perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules souches mésenchymateuses, de cellules épithéliales alvéolaires, et de cellules d’endothélium. Six mois après le traitement, la capacité vitale forcée (FVC), qui est le volume d’air qui peut être soufflé de manière forcée après inspiration complète, a augmenté de 50% à 71 %, tandis que le volume d’expiration forcé en une seconde (FEV1 ), qui est le volume d’air qui peut être soufflé de manière forcée en une seconde, a augmenté de 64% à 68%. En outre, le rapport FEV1 sur FVC, qui est d’approximativement 75-80% chez des adultes sains, a diminué de 100% à 82%. Un balayage aux rayons X des poumons a présenté une moindre opacité de la cavité pulmonaire après traitement (fig. 20). [0220] A patient with restrictive lung disease associated with motor neuron disease was treated by infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, alveolar epithelial cells, and endothelial cells. Six months after treatment, the forced vital capacity (FVC), which is the volume of air that can be forced out after full inspiration, increased from 50% to 71%, while the forced expiration volume in one second (FEV1), which is the volume of air that can be forced out in one second, increased from 64% to 68%. In addition, the FEV1 to FVC ratio, which is approximately 75-80% in healthy adults, decreased from 100% to 82%. An X-ray scan of the lungs showed less opacity of the lung cavity after treatment (Fig. 20).

Ménopause Menopause

[0221 ] Une patiente de 51 ans ayant la ménopause s’est vue administrer une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules germinales pluripotentes, et d’oocytes. A la suite du traitement, la patiente a ressenti une augmentation de divers niveaux d’hormones et de protéines, y compris le facteur de croissance analogue de l’insuline (IGF-1 ), l’estradiole, et la lipoprotéine basse densité (LDL) (voir tableau 16). [0221] A 51-year-old female patient going through menopause was given an infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells, pluripotent germ cells, and oocytes. Following treatment, the patient experienced an increase in various levels of hormones and proteins, including insulin-like growth factor (IGF-1), estradiole, and low density lipoprotein (LDL ) (see table 16).

43 Tableau 16: Effet de l’administration de cellules souches reprogrammées autologues à une patiente ayant la ménopause. 43 Table 16: Effect of Administration of Autologous Reprogrammed Stem Cells to a Patient Going through Menopause.

[0222] [0222]

Marqueurs Avant thérapie Après thérapie sanguins 23/11/2006 09/12/2006 01/01/2007 17/02/2009 Markers Before therapy After blood therapy 11/23/2006 12/09/2006 01/01/2007 02/17/2009

IGF-1 [ng/ml] 91 53 100 143 IGF-1 [ng / ml] 91 53 100 143

IGF-1-bind IGF-1-bind

5,3 4 4,5 5,9 5.3 4 4.5 5.9

[mg/Ll [mg / Ll

GH fug/Ll 2,4 3,5 3,5 1 ,5 GH fug / Ll 2.4 3.5 3.5 1, 5

Progestérone Progesterone

1 ,2 1 ,5 17,5 2,25 1, 2 1, 5 17.5 2.25

[ng/ml] [ng / ml]

Estradiole Estradiole

26 82 162 168.82 26 82 162 168.82

[pg/ml] [pg / ml]

Cortisol Cortisol

17,8 24 4,3 24,5 17.8 24 4.3 24.5

[ug/di] [ug / di]

DHEA-S DHEA-S

2,2 3,6 0,4 5,3 2.2 3.6 0.4 5.3

[Nmo1/1] [Nmo1 / 1]

Adrenocort Adrenocort

21 ,1 10 10 21, 1 10 10

[pmol/l] [pmol / l]

Tyroglobuline Tyroglobulin

47 18 31 1 .4 47 18 31 1 .4

[ng/ml] [ng / ml]

Calcitonine Calcitonin

28 40 50 28 40 50

[ng/ml] [ng / ml]

FSH [IU/1] 41 ,2 5,4 3,88 FSH [IU / 1] 41.2 5.4 3.88

LH [IU/1] 15,1 1 ,8 6,76 LH [IU / 1] 15.1 1.8 6.76

Prolactine Prolactin

16,2 1 1 ,1 10,5 0,6 16.2 1 1, 1 10.5 0.6

[ug/11 [ug / 11

Test libre Free test

8 6,4 7,5 [pmo1/1] 8 6.4 7.5 [pmo1 / 1]

Cholest Cholest

242 258 280 268 242 258 280 268

[mg/dl] [mg / dl]

HDL [mg/dl] 70 76 83 63,22 HDL [mg / dl] 70 76 83 63.22

LDL [mg/dl] 22 162 173 179,9 LDL [mg / dl] 22 162 173 179.9

Triglycer Triglycer

1 1 1 102 122 125 1 1 1 102 122 125

[mg/dl] [mg / dl]

Hbal c [%l 6,5 5,3 5,5 5,4 Hbal c [% w 6.5 5.3 5.5 5.4

Fbs [Mg/dl] 94 90 102 103 Fbs [Mg / dl] 94 90 102 103

Inhibine [U] 40 30 Inhibin [U] 40 30

Ostéocalcine Osteocalcin

6.9 6.9

[ng/mL] [ng / mL]

TSH [uU/m1] 0,84 0,7 0,5 TSH [uU / m1] 0.84 0.7 0.5

FT3 [pg/ml] 3,1 2,7 2,7 1 ,54 FT3 [pg / ml] 3.1 2.7 2.7 1.54

Calcitonin Calcitonin

28 40 50 28 40 50

[ng/ll FT4 [pg/ml] 1 ,4 0,94 0,71 0,82 [ng / ll FT4 [pg / ml] 1.4 0.94 0.71 0.82

[0223] IGF-1 = facteur de croissance analogue de l’insuline 1 ; IGF-1 -bind = liaison de facteur de croissance analogue de l’insuline; GFI = hormone de croissance; DFIEA-S = déhydroépiandrostérone sulfate ester; adrenocort = hormone adrénocorticale; FSFI = hormone stimulant les follicules; LFI = hormone de lutéinisation; FIDL = lipoprotéine haute densité; [0223] IGF-1 = insulin-like growth factor 1; IGF-1 -bind = insulin-like growth factor binding; GFI = growth hormone; DFIEA-S = dehydroepiandrosterone sulfate ester; adrenocort = adrenocortical hormone; FSFI = follicle stimulating hormone; LFI = luteinizing hormone; FIDL = high density lipoprotein;

44 44

Claims

LDL = lipoprotéine basse densité; triglycer = triglycérides; HBA1 C = hémoglobine glycosylée; FBS = échantillon de sang foetal; TSH = hormone stimulant la thyroïde; FT3 = triiodothryronine libre; FT4 = thyroxine libre Dépression [0224] Un patient souffrant de dépression a été traité avec perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, et de neurones. À la suite du traitement, le patient a ressenti une augmentation de divers niveaux d’hormones et de protéines, y compris le facteur de croissance analogue de l’insuline -1 (IGF-1 ), le cortisol, et la testostérone (voir tableau 17). Tableau 17: Effets de l’administration à une patiente ayant la ménopause de cellules reprogrammées autologues. [0225] Marqueurs sanguins Avant thérapie Après thérapie 1 1/06/2007 23/07/2007 GH fgga] <0,05 0.06 IGF-1 fng/mll 93,4 140 IGF-bp [mg/l] 4,4 5,6 Cortisol [1 .1 g/d1] 4 20,9 Adrénocort [pg/ml] <10 17,1 Shbg [nmo1/1] 37,9 39,8 FSH riu/Li 4,94 4,98 LH [IU/L] 10,1 3,72 e2 [pg/ml] 29 <28 Testostérone [pmol/l] 28,4 57,8 Prolactine [pg/l] 15,7 1 ,6 DHEA-S [pmol/l] 2,3 2,9 TSH [pll/ml] 1 ,707 3,318 FT3 [pg/ml] 1 ,69 1 ,87 FT4 [ng/d 1 ] 0,81 0,89 [0226] GH = hormone de croissance; IGF-1 = facteur de croissance analogue à de l’insuline 1 ; IGF-bp = protéine de liaison de facteur de croissance analogue à de l’insuline; Adrenocort = hormone adrénocorticale; Sh-bg = globuline de liaison d’hormones sexuelles; FSH = hormone de stimulation de follicules; LH = hormone de lutéinisation; e2 = estradiole; DHEA-S = déhydroépiandrostérone sulfate ester; TSH = hormone stimulant la thyroïde; FT3 = triiodothryronine libre; FT4 = thyroxine libre Azoospermie non-obstructive [0227] Un patient souffrant d’une azoospermie non obstructive été traité avec une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules germinales pluripotentes, et de spermatozoïdes. A la suite du traitement, le patient a ressenti une augmentation de testostérone sur une période de huit mois (fig. 21 ). Déficience de vision [0228] Un patient souffrant d’une perte de vision du fait d’une tumeur bénigne qui a été enlevée a été traité par perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et de neurones. A la suite du traitement, le client a ressenti une sensibilité rétinienne accrue, et une amélioration de la vision (fig. 22). [0229] En ayant ainsi décrit en détail des modes préférés de réalisation de la présente invention, on doit comprendre que la présente invention définie par le paragraphe ci-dessus n’est pas limitée aux détails particuliers établis ci-dessus dans la description qui précède, et que de nombreuses variantes apparentes de ceux-ci sont possibles sans sortir de l’esprit ni de la portée de la présente invention. Revendications 1. Procédé pour obtenir des cellules cibles reprogrammées destinées à être administrées à un patient en ayant besoin, consistant à: partant de cellules déterminées d’un premier lignage cellulaire, reprogrammer les cellules déterminées pour obtenir des cellules reprogrammées, dans lequel la reprogrammation comporte une trans-différenciation des 45 cellules déterminées pour obtenir des cellules trans-différenciées en mettant en culture les cellules déterminées dans un milieu de culture tissulaire comprenant un ou plusieurs agents de rétro-différenciation et un ou plusieurs agents promoteurs de différenciation.LDL = low density lipoprotein; triglycer = triglycerides; HBA1 C = glycosylated hemoglobin; FBS = fetal blood sample; TSH = thyroid stimulating hormone; FT3 = free triiodothryronin; FT4 = free thyroxine Depression [0224] A patient suffering from depression was treated with an infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells and neurons. Following treatment, the patient experienced an increase in various hormone and protein levels, including insulin-like growth factor -1 (IGF-1), cortisol, and testosterone (see table 17). Table 17: Effects of Administering Autologous Reprogrammed Cells to a Postmenopausal Patient. [0225] Blood markers Before therapy After therapy 1 06/01/2007 07/23/2007 GH fgga] <0.05 0.06 IGF-1 fng / mll 93.4 140 IGF-bp [mg / l] 4.4 5.6 Cortisol [1.1 g / d1] 4 20.9 Adrenocort [pg / ml] <10 17.1 Shbg [nmo1 / 1] 37.9 39.8 FSH riu / Li 4.94 4.98 LH [IU / L] 10.1 3.72 e2 [pg / ml] 29 <28 Testosterone [pmol / l] 28.4 57.8 Prolactin [pg / l] 15.7 1, 6 DHEA-S [pmol / l] 2.3 2.9 TSH [pll / ml] 1.707 3.318 FT3 [pg / ml] 1.69 1.87 FT4 [ng / d 1] 0.81 0.89 [0226] GH = growth hormone; IGF-1 = insulin-like growth factor 1; IGF-bp = insulin-like growth factor binding protein; Adrenocort = adrenocortical hormone; Sh-bg = sex hormone binding globulin; FSH = follicle stimulating hormone; LH = luteinizing hormone; e2 = estradiole; DHEA-S = dehydroepiandrosterone sulfate ester; TSH = thyroid stimulating hormone; FT3 = free triiodothryronin; FT4 = free thyroxine Non-obstructive azoospermia [0227] A patient with non-obstructive azoospermia was treated with an infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells, pluripotent germ cells, and sperm. Following treatment, the patient experienced an increase in testosterone over a period of eight months (Fig. 21). Vision impairment [0228] A patient with vision loss due to a benign tumor which was removed was treated with infusion of autologous reprogrammed pluripotent stem cells and neurons. Following treatment, the client experienced increased retinal sensitivity, and improved vision (Fig. 22). [0229] Having thus described in detail preferred embodiments of the present invention, it should be understood that the present invention defined by the paragraph above is not limited to the particular details established above in the preceding description. , and that many apparent variations thereof are possible without departing from the spirit or the scope of the present invention. Claims A method of obtaining reprogrammed target cells for administration to a patient in need thereof, comprising: starting from determined cells of a first cell line, reprogramming the determined cells to obtain reprogrammed cells, wherein the reprogramming comprises a trans-differentiation of 45 cells determined to obtain trans-differentiated cells by culturing the determined cells in a tissue culture medium comprising one or more retro-differentiation agents and one or more differentiation promoter agents.

2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le patient souffre d’une maladie ou d’un trouble comprenant une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie (3, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, la sclérose en plaques, une insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, des blessures de la colonne vertébrale, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, une dystrophie cristalline/cécité, le diabète, et la stérilité.2. The method of claim 1, wherein the patient suffers from a disease or disorder including bone marrow failure, hematologic conditions, aplastic anemia, thalassemia (3, diabetes, amyotrophic lateral sclerosis , Parkinson's disease, spinal cord injury, muscular dystrophy, kidney disease, multiple sclerosis, congestive heart failure, hepatitis C virus, HIV virus, head trauma, spinal injury, lung disease, depression, non-obstructive azoospermia, andropause, menopause and infertility, rejuvenilization, scleroderma ulcers, psoriasis, wrinkles, liver cirrhosis, disease autoimmune, alopecia, retinitis pigmentosa, crystal dystrophy / blindness, diabetes, and infertility.

3. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules reprogrammées sont sélectionnées dans le groupe comprenant des cellules souches pluripotentes, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches neuronales, des cellules souches épithéliales, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules souches endodermiques et neuroectodermiques, des cellules germinales, des cellules souches extraembryonnaires et embryonnaires, des cellules du rein, des cellules épithéliales alvéolaires, des cellules endodermiques alvéolaires, des neurones, des cellules ectodermiques, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des oocytes, des spermatozoïdes, des kéranocytes, des mélanocytes, des ostéocytes, des cellules de bulbe épineux, des chondrocytes, des adipocytes, des cellules endothéliales, des cardiomyocytes, et des tropoblastes.3. The method according to claim 1, wherein the reprogrammed cells are selected from the group comprising pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, neuronal stem cells, epithelial stem cells, mesenchymal stem cells, endodermal and neuroectodermal stem cells. , germ cells, extraembryonic and embryonic stem cells, kidney cells, alveolar epithelial cells, alveolar endoderm cells, neurons, ectoderm cells, islets of Langerhans, acinar cells, oocytes, sperm, keranocytes, melanocytes, osteocytes, spinous bulb cells, chondrocytes, adipocytes, endothelial cells, cardiomyocytes, and tropoblasts.

4. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules déterminées ont été obtenues à partir de sang complet, de moelle épinière, de tissu neuronal, de tissu musculaire, d’épiderme ou de derme.4. The method of claim 1, wherein the determined cells have been obtained from whole blood, spinal cord, neuronal tissue, muscle tissue, epidermis or dermis.

5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les cellules déterminées sont obtenues à partir de sang complet.5. The method of claim 4, wherein the determined cells are obtained from whole blood.

6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les cellules déterminées sont obtenues à partir de sang mobile ou immobile.6. The method of claim 5, wherein the determined cells are obtained from mobile or immobile blood.

7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les cellules déterminées sont sélectionnées dans le groupe comprenant des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des mégacaryocytes, des monocytes, des érythrocytes, des granulocytes, des mastocytes, des lymphocytes, des leucocytes, des plaquettes et des globules rouges.7. The method of claim 5, wherein the determined cells are selected from the group comprising T cells, B cells, eosinophils, basophils, neutrophils, megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, granulocytes, mast cells. , lymphocytes, leukocytes, platelets and red blood cells.

8. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent de rétro-différentiation vient en contact avec un récepteur qui sert de milieu à une capture, une reconnaissance ou une présentation d’un antigène au niveau de la surface des cellules déterminées.8. The method of claim 1, wherein the retro-differentiating agent comes into contact with a receptor which serves as a medium for capture, recognition or presentation of an antigen at the surface of the determined cells.

9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l’agent de rétro-différentiation est un anticorps monoclonal lié au récepteur.9. The method of claim 8, wherein the retro-differentiating agent is a monoclonal antibody bound to the receptor.

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’anticorps est sélectionné dans le groupe comprenant l’anticorps monoclonal CR3/43 et l’anticorps monoclonal TAL 1 B5.10. The method of claim 9, wherein the antibody is selected from the group consisting of the monoclonal antibody CR3 / 43 and the monoclonal antibody TAL 1 B5.

1 1. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le milieu de culture tissulaire est sélectionné dans le groupe comprenant du milieu Dulbecco modifié selon Iscove, du milieu minimum de Eagle modifié selon Dulbecco, du milieu minimum essentiel de Eagle, de Γα-milieu minimum essentiel, du RPMI 1640, du Ham-F-12, milieu E199, MCDB, Leibovitz L-15, et du milieu de Williams E.1 1. The method of claim 1, wherein the tissue culture medium is selected from the group comprising Dulbecco medium modified according to Iscove, minimum Eagle medium modified according to Dulbecco, minimum essential Eagle medium, minimum Γα-medium essential, RPMI 1640, Ham-F-12, E199 medium, MCDB, Leibovitz L-15, and Williams E.

12. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un anticoagulant, un chélateur ou un antibiotique.12. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is an anticoagulant, a chelator or an antibiotic.

13. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une vitamine ou un élément minéral.13. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is a vitamin or an inorganic element.

14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la vitamine ou l’élément minéral est sélectionné dans le groupe comprenant de la vitamine A, de la vitamine B3, de la vitamine C, de la vitamine D3, de la vitamine K, de l’acide rétinoïque, du nicotinamide, du zinc ou un composé du zinc, et du calcium ou un composé du calcium.14. The method of claim 13, wherein the vitamin or mineral element is selected from the group consisting of vitamin A, vitamin B3, vitamin C, vitamin D3, vitamin K, retinoic acid, nicotinamide, zinc or a zinc compound, and calcium or a calcium compound.

15. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une hormone naturelle ou synthétique.15. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is a natural or synthetic hormone.

16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l’hormone naturelle ou synthétique est de l’hydrocortisone ou de la déxaméthasone.16. The method of claim 15, wherein the natural or synthetic hormone is hydrocortisone or dexamethasone.

17. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un acide aminé.17. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is an amino acid.

18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel l’acide aminé est sélectionné dans le groupe comprenant L-glutamine, ergothionéine, proline, et des acides aminés non essentiels. 4618. The method of claim 17, wherein the amino acid is selected from the group consisting of L-glutamine, ergothionein, proline, and non-essential amino acids. 46

19. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un composé chimique sélectionné dans le groupe comprenant β-mercaptoéthal, monophosphate d’adénosine cyclique de dibutyle, monothioglycérol, putrescine, sulfoxide de diméthyle, hypoxanthine, adénine, forskoline, cilostamide, et 3-isobutyl-1 -méthylxanthine.19. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is a chemical compound selected from the group consisting of β-mercaptoethal, cyclic dibutyl adenosine monophosphate, monothioglycerol, putrescine, dimethyl sulfoxide, hypoxanthine, adenine, forskolin. , cilostamide, and 3-isobutyl-1 -methylxanthine.

20. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un nucléoside.20. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is a nucleoside.

21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le nucléoside est de la 5-azacytidine.21. The method of claim 20, wherein the nucleoside is 5-azacytidine.

22. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un acide ou un sel de celui-ci.22. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is an acid or a salt thereof.

23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel l’acide, ou un sel de celui-ci, est sélectionné dans le groupe comprenant de l’acide ascorbique, du pyruvate, de l’acide okadaïque, de l’acide linoléique, de l’acide éthylènediaminetétraacétique, de l’EDTA de disodium, de l’acide tétraacétique d’éthylène glycol, de la dextrose de citrate anticoagulante de formule A, du butyrate du sodium, et du glycérophosphate.23. The method of claim 22, wherein the acid, or a salt thereof, is selected from the group consisting of ascorbic acid, pyruvate, okadaic acid, linoleic acid,. ethylenediaminetetraacetic acid, disodium EDTA, ethylene glycol tetraacetic acid, anticoagulant citrate dextrose of formula A, sodium butyrate, and glycerophosphate.

24. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un antibiotique.24. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is an antibiotic.

25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel l’antibiotique est sélectionné dans le groupe comprenant G418, gentamycine, Pentoxifylline (1 -(5-oxohéxyle)-3, 7-diméthylxanthine), et indométhacine.25. The method of claim 24, wherein the antibiotic is selected from the group consisting of G418, gentamycin, Pentoxifylline (1 - (5-oxohexyl) -3, 7-dimethylxanthine), and indomethacin.

26. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une protéine.26. The method of claim 1, wherein the differentiation promoting agent is a protein.

27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la protéine est un activateur plasminogène tissulaire.27. The method of claim 26, wherein the protein is a tissue plasminogen activator.

28. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le milieu de culture tissulaire contient du plasma autologue, des plaquettes, du sérum, ou des sérums provenant de mammifères.28. The method of claim 1, wherein the tissue culture medium contains autologous plasma, platelets, serum, or sera from mammals.

29. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture dans des poches de sang, des ossatures, des poches de culture tissulaire, ou des récipients de culture tissulaire en matière plastique.29. The method of claim 1, wherein the cells are cultured in blood bags, frameworks, tissue culture bags, or plastic tissue culture vessels.

30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel les récipients de culture tissulaire sont des récipients de culture tissulaire adhérents ou non adhérents.30. The method of claim 29, wherein the tissue culture vessels are adherent or non-adherent tissue culture vessels.

31. Procédé selon la revendication 30, dans lequel les récipients de culture tissulaire sont revêtus ou non revêtus.31. The method of claim 30, wherein the tissue culture vessels are coated or uncoated.

32. Procédé selon la revendication 31 , dans lequel les récipients de culture tissulaire sont revêtus d’un agent sélectionné dans le groupe comprenant de la gélatine, du collagène, un mélange gélatineux de protéines sécrétées par les cellules d’un sarcome de Engelbreth-Holm-Swarm d’une souris, ou une matrice extracellulaire.32. The method of claim 31, wherein the tissue culture vessels are coated with an agent selected from the group consisting of gelatin, collagen, a gelatinous mixture of proteins secreted by Engelbreth-Holm sarcoma cells. -Swarm of a mouse, or an extracellular matrix.

33. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à une température entre 18 et 40 °C.33. The method of claim 1, wherein the cells are cultured at a temperature between 18 and 40 ° C.

34. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à des niveaux de dioxyde de carbone entre 4 et 10%.34. The method of claim 1, wherein the cells are cultured at carbon dioxide levels between 4 and 10%.

35. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à un niveau d’oxygène entre 10 et 35%.35. The method of claim 1, wherein the cells are cultured at an oxygen level between 10 and 35%.

36. Composition pharmaceutique comprenant des cellules reprogrammées obtenues par le procédé selon l’une des revendications 1 à 35.36. A pharmaceutical composition comprising reprogrammed cells obtained by the method according to one of claims 1 to 35.

37. Composition pharmaceutique selon la revendication 36 comportant en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.37. A pharmaceutical composition according to claim 36 further comprising at least one pharmaceutically acceptable excipient.

38. Utilisation d’une ou de plusieurs cellules cibles reprogrammées obtenues par le procédé selon l’une des revendications 1 à 35 dans une préparation d’un médicament ou d’une composition pharmaceutique pour réparer ou régénérer du tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, ou pour traiter une maladie ou une blessure de tissu.38. Use of one or more reprogrammed target cells obtained by the method according to one of claims 1 to 35 in a preparation of a medicament or of a pharmaceutical composition for repairing or regenerating tissue or cells of a. cell lineage in a patient, or to treat disease or tissue injury.

39. Procédé de préparation d’un médicament ou d’une composition pharmaceutique destinée à être administrée à un patient en ayant besoin, le procédé comportant les étapes consistant à: (i) mettre en oeuvre le procédé selon l’une des revendications 1 à 35 pour obtenir des cellules cibles reprogrammées; et, (ii) combiner les cellules cibles reprogrammées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques.39. A method of preparing a medicament or a pharmaceutical composition intended to be administered to a patient in need thereof, the method comprising the steps of: (i) carrying out the method according to one of claims 1 to To obtain reprogrammed target cells; and, (ii) combining the reprogrammed target cells with one or more pharmaceutical excipients.

40. Composition pharmaceutique préparée par l’intermédiaire du procédé selon la revendication 39. 4740. A pharmaceutical composition prepared by the method of claim 39. 47