Die Erfindung bezieht sich auf substituierte Azatricycloderivate und ihre Metabolite, ihre Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel
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worin R1 für Methyl, Ethyl oder Allyl und n für 1 oder 2 stehen sowie deren Herstellung und immunosuppressive und antimikrobielle Wirkung sind in der Literatur beschrieben. Diese Substanzen werden aus Kulturmedien isoliert, die durch Fermentation von Streptomyces-Stämmen nach an sich bekannten Methoden erhalten wurden. Vorzugsweise wird als Produktionsstamm Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (FERM BP-927), wie in der EP 184 162 beschrieben verwendet. Dieser Stamm ist vom Fermentation Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan unter den Bedingungen des Budapester Abkommens erhältlich. Dieser Stamm wurde am 27. April 1989 beim Agricultural Research Culture Collection International Depository Authority, Peoria, lllinois 61 604, USA, unter den Bedingungen des Budapester Abkommens neuerlich hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL 18.488.
Es wurde nun gefunden, dass in dieser Fermentationsbrühe eine Anzahl von Metaboliten enthalten ist, die wertvolle pharmakologische Aktivitäten besitzen. Sie können nach einem Verfahren erhalten werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man aus der Fermentationsbrühe nach Abtrennung der Verbindungen der Formel II nach an sich bekannten Methoden aus den verbleibenden Lösungen und Waschflüssigkeiten die Metabolite isoliert, beispielsweise mit Hilfe von chromatographischen Verfahren.
Dieses Verfahren kann analog zu bekannten Methoden durchgeführt werden, z.B. mit Hilfe von chromatographischen Verfahren.
Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe kann beispielsweise folgendermassen ausgeführt werden:
6200 l Fermentationsbrühe werden mit 6000 l Essigester während 6 Stunden bei Raumtemperatur ausgerührt und anschliessend in einem Separator aufgetrennt. Der Essigesterteil wird darauf unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der resultierende Extrakt wird anschliessend durch Verteilung zwischen 3 x 70 l Methanol/Wasser (9/1) und 3 x 70 l Hexan entfettet. Der Methanol/Wasser-Teil ergibt nach dem Eindampfen zur Trockne am Vakuum weiteren Extrakt. Dieser wird an einer Säule von 25 kg Sephadex LH20 chromatographiert. Die Fraktionen, die laut DC und HPLC die Verbindung der Formel II enthalten, werden vereinigt und zur weiteren Reinigung an einer Säule (Durchmesser 15 cm) von 20 kg Kieselgel Merck (0.04 bis 0.063 mm) mit tert.Butylmethylether chromatographiert. Nach 50 l Eluat werden Fraktionen von 6.2 l gesammelt. Die Fraktionen, die laut DC und HPLC die Verbindung der Formel
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enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Daraus wird durch Kristallisation aus Acetonitril die Verbindung der Formel lla als kristallines Produkt gewonnen. Schliesslich wird die Säule mit 90 l Methanol ausgewaschen. Dabei resultieren 91 g Metabolitengemisch, welches durch weitere Chromatographie an 800 g Kieselgel H mit tert.-Butylmethylether/Methanol/Wasser (88/11/1, 80/17,5/2 und 70/25/4) aufgetrennt wird. Sephadexfiltration und anschliessende Chromatographie an Lichroprep RP18 führen zur weiteren Auftrennung des Metabolitengemisches. Mittels DC- und HPLC-Analytik werden die Fraktionen, die gleiche Metabolite enthalten, vereinigt.
Auf diese Weise erhält man drei verschiedene Fraktionen mit verschiedenen Retentionszeiten:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 01 AL=L: Fraktion:
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: Retentionszeit (Minuten):
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Gradient 1:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Gradient 2:
<tb> <SEP>A <SEP>10,21 <SEP>17,69
<tb> <SEP>B <SEP>4,99 <SEP>13,94
<tb> <SEP>C <SEP>9,65
<tb> <SEP>HPLC-System: <SEP>Säule, Lichrosorb RP18 Merck, 250 x 4 mm selbst gefüllt. Fluss 2 ml/min, Detektion UV 220 nm/0,1
<tb> <SEP>Lösungen: <SEP>Triethylamin-Phosphatpuffer pH 3,5, 0,05 M 10% Acetonitril/Acetonitril
<tb> <SEP>Gradient 1: <SEP>in 20 min von 50:50 auf 10:90
<tb> <SEP>Gradient 2: <SEP>in 20 min von 90:10 auf 10:90
<tb></TABLE>
Nach nochmaliger chromatographischer Reinigung der Fraktion A an Lichroprep RP18 mit H2O/Methanol (1/4) wird der Metabolit A als HPLC-einheitliche und farblose Festsubstanz gewonnen. Er besitzt die in den Diagrammen 1 und 5 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren.
Fp: 70-75 DEG C
[ alpha ]20_D = -75,6 DEG (c = 1,17 in Methanol)
UV: lambda max (Methanol) 320 log epsilon min = 1,3074
Nochmalige Filtration von Fraktion B über eine Säule von Sephadex LH20 in Methanol ergibt den Metabolit B als HPLC-einheitliche, farblose amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 2 und 6 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren.
Fp: 72-78 DEG C
[ alpha ]20_D = - 71,1 DEG (c = 1,22 in Methanol)
UV: lambda max (Methanol) 225 log epsilon min = 1,1561; 323 log epsilon min = -0.0907
<1>H-NMR (CDCl3): Konformerengemisch ca. 2:1
Charakteristische Signale [ppm]: 6,70 (m, H-24); 6,11 (d, breit. J = 15Hz, H-23).
<1><3>C-NMR (CDCl3): Charakteristische Signale [ppm] des in höherer Konzentration vorliegenden Konformeren:199,9 (C-22); 148,8 (C-24); 137,6 (C-19); 131,8 (C-23); 98,1 (C-10?); 128,1 (C-29); 124,0 (C-20).
Der Metabolit B besitzt eine DELTA <23>-Doppelbindung.
Weitere Chromatographie von Fraktion C an Lichroprep RP18 mit Methanol/Wasser (4/1) führt zu Metabolit C als HPLC-einheitliche, amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 3 und 7 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren.
Fp: 55-60 DEG C
[ alpha ]20_D = +7,5 DEG (c = 1,0 in Methanol)
UV: lambda max (Methanol) 321 log epsilon min = 1.2972
Die Nebenfraktionen, die bei der Chromatographie an Kieselgel mit tert.Butylmethylether keine Verbindung der Formel lla enthalten, werden vereinigt, weiter an Kieselgel H und Lichroprep RP18 aufgetrennt und HPLC-analytisch evaluiert. Die Fraktionen mit der Retentionszeit 8,01 Min. (Gradient 1) werden vereinigt. Es resultiert der Metabolit D als farblose amorphe Festsubstanz. Er besitzt die in den Diagrammen 4 und 8 wiedergegebenen IR- bzw. Massen-Spektren.
Fp: 74-78 DEG C
[ alpha ]20_D = -131 DEG (c = 1,02 in Chloroform)
UV: lambda max (Methanol) 256 log epsilon min = 0,3716
<1>H-NMR (CDCl3): Charakteristische Signale [ppm] bei 5,33 (d, J = 4Hz, H-26); 5,22 (d, J = 9Hz, H-29); 4,53 (d, breit, J = 15Hz, H-6e); 4,37 (d, breit, J = 4Hz, H-2); 4,19 (ddd, J1 = 2Hz, J2 = 5Hz, J3 = 7Hz, H-24).
<1><3>C-NMR (CDCI3): Charakteristische Signale [ppm] bei 208,4 (C-22); 202,6 (C-9); 169,6 (C-1); 167,5 (C-8); 131,6 (C-29); 124,2 (C-20); 135,1 (C-37); 116,6 (C-38); 81,4 (C-26); 68.3 (C-24).
Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Metaboliten A, B und C, dadurch gekennzeichnet, dass man nach Abtrennung der Verbindung der Formel IIa aus der Fermentationsbrühe die Säule mit Methanol auswäscht und die erhaltene Lösung des Metabolitengemisches durch mehrfach aufeinander folgende Chromatographieschritte auftrennt.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung vom Metaboliten D, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Chromatographie der Fermentationsbrühe mit tert-Butylmethylether zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa erhaltenen Nebenfraktionen durch mehrfach aufeinander folgende Chromatographieschritte auftrennt.
Bei der Aufarbeitung der Fermentationsansätze entstehen Randfraktionen, die aufgrund der HPLC-Analytik einen neuen Metaboliten mit der Retentionszeit 11,7 Min. (Gradient 1) enthalten. Chromatographische Trennung und Reinigung an Kieselgel H, Sephadex LH20 und Lichroprep RP18 ergibt
a) die Verbindung der Formel
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als HPCL-einheitliche amorphe farblose Festsubstanz.
Fp: 103-105 DEG C
[ alpha ]20_D = -41,8 DEG (c = 0,95 in Chloroform)
<1>H-NMR (CDCI3 + CH3OH 5:1): Zwei Konformere im Verhältnis von ca. 3:1. Charakteristische Signale bei [ppm] 4.37 (d, breit, J = 14Hz, H-6e); 3,91 (d, J = 2Hz, H-26): 4,08 (H-26 min ).
<1><3>C-NMR (CDCI3): Charakteristische Signale [ppm] bei 168,8 (C-1); 162,2 (C-8); 189,9 (C-9); 99,8 (C-10); 50,5 (C-18); 210,9 (C-22); 41,2 (C-23); 71,5 (C-24); 37,7 (C-25); 136,3 (C-28); 127,8 (C-29).
Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel Ia, dadurch gekennzeichnet, dass man die bei der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe zur Abtrennung der Verbindung der Formel IIa entstehenden Randfraktionen mehrfach aufeinander folgenden Chromatographieschritten unterwirft [Verfahrensvariante a)].
In der Verbindung der Formel la ist der Laktonring nicht über die Oxyfunktion in Position 26, sondern über die Oxyfunktion in Position 24 geknüpft. Verbindungen mit dieser isomeren Grundstruktur sind hiernach als "iso" bezeichnet.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur synthetischen Herstellung der Verbindungen mit dieser isomeren Grundstruktur, nämlich der Verbindungen der Formel I
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worin X für die Oxo- oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe, R1 min für Methyl. Ethyl, n-Propyl oder Allyl und R2 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe stehen, dadurch gekennzeichnet, dass man
b) zur Herstellung der Verbindungen der Formel
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worin R1 min und R2 obige Bedeutung besitzen und X min für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, eine Verbindung der Formel
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worin X min , R1 min und R2 obige Bedeutung besitzen, mit einer Base, wie Imidazol behandelt oder
c) zur Herstellung von Verbindungen der Formel
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worin R1 min obige Bedeutung besitzt und X min min für die Oxo- oder Hydroxygruppe steht, aus einr Verbindung der Formel
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worin X, R1 min und R2 obige Bedeutung besitzen und R3 für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X, R2 und R3 für eine geschützte Hydroxygruppe steht, die Schutzgruppe (n) nach bekannten Methoden abspaltet.
Die Verbindungen mit dieser "Iso-Struktur" sind wichtige Zwischenverbindungen für die Herstellung neuer, biologisch aktiver Derivate.
Falls X für gegebenenfalls geschütztes Hydroxy steht, können sie in Stellung 22 die S- oder die R-Konfiguration aufweisen.
Die Diastereomeren A besitzen am C-22 die Konfiguration S, die Diastereomeren B die Konfiguration R in dieser Stellung. AIs Schutzgruppen für die Hydroxygruppe können allgemein gebräuchliche Schutzgruppen eingesetzt werden, beispielsweise die tert.Butyldimethylsilylgruppe.
Die obigen Verfahrensvarianten können analog zu bekannten Methoden durchgeführt werden.
Verfahrensvariante a) wird vorzugsweise wie oben beschrieben durchgeführt.
Verfahrensvariante b) ist eine Umlagerung. Sie kann z.B. durch Behandeln einer Verbindung der Formel lla min in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, beispielsweise in Dimethylformamid, mit einer Base, z.B. mit Imidazol, Carbonyldiimidazol oder 4-Dimethylaminopyridin, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, z.B. bei etwa 50 bis 60 DEG C, durchgeführt werden. Die Abtrennung der gewünschten Endprodukte von gegebenenfalls entstehenden Nebenprodukten kann nach bekannten Methoden, beispielsweise chromatographisch, erfolgen.
Verfahrensvariante c) ist eine Schutzgruppenabspaltung. Sie kann ebenfalls nach bekannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von HF/Acetonitril, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur. Je nach den Reaktionsbedingungen (Reaktionsdauer, Reaktionstemperatur) kann die Abspaltung derart gelenkt werden, dass entweder alle Schutzgruppen oder nur ein Teil der Schutzgruppen entfernt werden. Diese teilweise Abspaltung von Schutzgruppen ist vor allem dann erwünscht, wenn anschliessend in einer weiteren Reaktion eine bestimmte Hydroxygruppe umgesetzt werden soll.
Bei den erfindungsgemässen Verfahren bleibt die Konfiguration, insbesondere an der Position 22, falls X für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe steht, unverändert. Werden die Ausgangsprodukte als diastereomere Gemische eingesetzt, so kann die Auftrennung in die einzelnen Diastereomeren an einer beliebigen Stelle des Reaktionsablaufs nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise chromatographisch, erfolgen.
Die Ausgangsprodukte können analog zu bekannten Methoden erhalten werden.
Die Ausgangsverbindungen der Formel
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worin R1 min , R2 und R3 obige Bedeutung besitzen, können durch Oxidation von Verbindungen der Formel
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worin R1 min , R2 und R3 obige Bedeutung besitzen, erhalten werden.
Die als Ausgangsprodukt benötigte Fermentationsbrühe kann beispielsweise folgendermassen erhalten werden:
A) Startkultur auf Agar:
Eine Agarkultur des Stammes Streptomyces tsukubaensis Nr. 9993 (Hinterlegung entsprechend dem Budapester Vertrag Nr. FERM BP-927, Fermentation Research Institute, Japan) wird 14 Tage bei 27 DEG C in folgendem Medium kultiviert:
4 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Malzextrakt, 4 g/l Dextrose, 20 g/l Agar, pH = 6,6 (NaOH/H2SO4).
B) Vorkultur:
Die Sporen und das Mycel von 6 Startkulturen werden in 90 ml einer 0,9% NaCI-Lösung suspendiert. 10 Erlenmayerkolben mit je 1 Liter Vorkulturmedium werden mit je 7 ml dieser Suspension inokuliert. Das Vorkulturmedium hat folgende Zusammensetzung: 10 g/l Glyzerin, 10 g/l Stärke, 5 g/l Glucose, 10 g/l Wollsamenextrakt, 5 g/l Hefeextrakt, 2 g/l CaCO3, pH = 6,8. Die Züchtung dieser Vorkultur wird 96 Stunden bei 27 DEG C und 200 Upm unter Rühren durchgeführt.
C) Zwischenkultur:
Je zwei 500-Liter-Aliquots des Vorkulturmediums werden in einem 750-Liter-Stahlfermenter mit 5 Liter der Vorkultur 48 Stunden bei 27 DEG C, 100 Upm und 0,5 Liter/Minute Durchlüftung inkubiert.
D) Hauptkultur:
6000 Liter des Hauptkulturmediums werden in zwei 4500-Liter-Stahlfermentern mit 600 Liter Zwischenkultur inokuliert. Das Hauptkulturmedium hat folgende Zusammensetzung: 45 g/l lösliche Stärke, 10 g/l Cornsteep, 10 g/l Hefeextrakt, 1 g/l CaCO3, pH = 6,8 (NaOH). Die Inkubation wird 96 Stunden bei 27 DEG C, 50 UpM, 0,5 bar und einer Durchlüftung von 0,5 Liter/Minute durchgeführt.
Die übrigen Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Verfahren, bzw. analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.
Eine Untergruppe der erfindungsgemässen Verbindungen betrifft Verbindungen der Formel
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worin X obige Bedeutung besitzt.
Erklärung der Figuren:
Die Diagramme 1 bis 4 stellen die IR-Spektren für die Metaboliten A bis D dar.
Diese Diagramme 5 bis 8 stellen die Massenspektren für die Metaboliten A bis D dar.
BEISPIELE
In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern, ohne jedoch ihren Umfang einzuschränken, sind alle Temperaturen in DEG C.
In den Beispielen werden die folgenden Verbindungen durch Kurzbezeichnungen dargestellt:
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EMI16.1
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Beispiel 1:33-O-tert.Butydimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 (Verfahren b)
[R1 min = Allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S)-OH]. (Formel I)
92 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (Diastereomeres A) und 12 mg Imidazol werden in 1 ml Dimethylformamid 120 Stunden bei 60 DEG gerührt. Man dampft ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (2/1). Anstelle von Imidazol können auch andere Basen, z.B. 4-Dimethylaminopyridin oder Carbonyldiimidazol, verwendet werden.
Bei Verwendung von Carbonyldiimidazol verfährt man beispielsweise folgendermassen: Zu einer Lösung von 459 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 (Diastereomeres A) in 5 ml wasserfreiem Benzol werden 85 mg Carbonyldiimidazol gegeben und das Gemisch 12 Stunden bei 50 DEG gerührt. Man dampft im Vakuum ein und isoliert durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (3/1) neben dem 22,24-cyclischen Carbonat der Ausgangsverbindung die Titelsubstanz als farblose amorphe Festsubstanz.
<1>H-NMR-Spektrum (CDCl3, charakt. Signale, ppm): (5,04 (m, H-24); 3,84 (d, J = 7Hz, H-26): 4,79 (d, breit, J = 10Hz, H-20); 3,28, 3,38 und 3,41 (OCH3); 3,655 (dd, J1 = 2Hz, J2 = 9Hz, H-14).
Analog wie in Beispiel 1 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I erhalten werden:
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 01 AL=L: Beispiel
<tb>Head Col 02 AL=L: R1 min
<tb>Head Col 03 AL=L: X
<tb>Head Col 04 to 05 AL=L: R2
<tb> <SEP>2 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>(R)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>3<1)> <SEP>-C2H5 <SEP>(S)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>4 <SEP>-C2H5 <SEP>(R)-OH <SEP>O.BDMS <SEP>farbloser amorpher Feststoff
BDMS = tert.Butyldimethylsilyl
<1)> <1>H-NMR-Spektrum (CDCl3, charakt.
Signale, ppm) für Beispiel 3: 3.29 + 3.39 + 3.42 (s + s + s, OCH3); 3.59 (dd, J1 =,12Hz, J2 = 2.5Hz, H-15); 3.67 (d, J = 10Hz, H-14); 3.85 (d, J = 7Hz, H-26); 4.49 (d, breit, J = 13 Hz, H-6); 4.76 (d, J = 10Hz, H-20).
<tb></TABLE>
Beispiel 5: 22(S)-Dihydro-iso-FK 506 (Verfahren c)
[R1 min = Allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S)-OH]. (Formel I)
Zu 1 ml Acetonitril und 20 mu l 40 proz. HF werden 106 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 (Diastereomeres A) in 1,4 ml Acetonitril getropft und das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Man engt anschliessend im Vakuum ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel mit Essigsäureethylester. Amorphe farblose Festsubstanz.
<1>H-NMR-Spektrum (CDCI3, charakt. Signale, ppm): 3,895 (d, J = 6Hz, H-26); 4,80 (d, breit, J = 10Hz, H-20); 3,67 (d, J = 9Hz, H-14); 3,295, 3,39 und 3,42 (OCH3).
Analog wie in Beispiel 5 beschrieben können auch folgende Verbindungen der Formel erhalten werden:
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Head Col 01 AL=L: Beispiel
<tb>Head Col 02 AL=L: R1 min
<tb>Head Col 03 AL=L: X
<tb>Head Col 04 to 05 AL=L: R2
<tb> <SEP>6 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>(R)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>7 <SEP>-C2H5 <SEP>(S)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>8 <SEP>-C2H5 <SEP>(R)-OH <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>9 <SEP>-C2H5 <SEP>Oxo <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb> <SEP>10 <SEP>-CH2.CH=CH2 <SEP>Oxo <SEP>OH <SEP>farbloser amorpher Feststoff
<tb></TABLE>
Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen können folgendermassen erhalten werden:
A) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-FR 520
Zu einer Lösung von 80 mg FR 520 in 3 ml Dichlormethan werden 15 mg Imidazol und 17 mg tert.Butyldimethylsilylchlorid unter Rühren zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann mit gesättigter wässriger Ammoniumchloridlösung verdünnt und dreimal mit Diethylether extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser und einer wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck konzentriert und chromatographisch gereinigt.
B) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-FK 506 und
33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(R)-dihydro-FK 506
3,9 g Tetramethylammonium-triacetoxyborhydrid und 2,75 g 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-FK 506 werden bei -20 DEG in 24 ml Acetonitril/Eisessig (1/1) gelöst und das Gemisch 2 Stunden bei 0-5 DEG gerührt. Man versetzt anschliessend mit Wasser, rührt 15 Minuten bei 10-15 DEG und extrahiert dann mit Methylenchlorid. Die organische Phase wird mit Wasser und gesättigter wässriger NaCI-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingedampft. Aus dem Rohprodukt werden durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (5/1) die beiden diastereomeren Titelverbindungen im Mengenverhältnis von ca. 10:1 als amorphe farblose Festsubstanzen isoliert.
Diastereomeres A (Hauptprodukt)
1H-NMR (CDCl3): Zwei Konformere im Verhältnis von ca. 2:1.
Charakteristische Signale [ppm] des überwiegend vorliegenden Konformers bei 5,30 (H-26); 4,66 (m, H-2); 4,44 (d, breit, J = 13Hz, H-6e) Signale für die OCH3-Gruppen der beiden Konformeren findet man bei 3,31, 3,32, 3,335, 3,38, 3,39 und 3,42 ppm.
<1><3>C-NMR (CDCI3) Charakteristische Signale des überwiegend vorliegenden Konformers [ppm] bei 195,9 (C-9); 169,1 (C-1) 165,0 (C-8); 137,4 (C-37); 136,4 (C-19); 132,2 (C-28); 128,9 (C-29); 126,1 (C-20); 115,7 (C-38); 98,4 odor 97,0 (C-10).
Diastereomeres B (Nebenprodukt):
<1><3>C-NMR (CDCI3) Charakteristische Signale des überwiegend vorliegenden Konformers [ppm] bei 169,1 (C-1); 165,8 (C-8); 136,2 (C-19); 125,5 (C-20); 98,7 (C-10); 43,3 (C-21) und 36,8 (C-23).
C) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(5)-dihydro-FR 520 und
33-O-tert. Butyldimethylsilyl-22 (R)-dihydro-FR 520
Man verfährt, ausgehend von FR 520, analog wie unter B) beschrieben und erhält die Titelverbindungen.
D) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506
a) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506
460 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 und 120 mg Bis-trimethylsilylacetamid werden in 5 ml trockenem Toluol 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft ein und erhält bei der chromatographischen Auftrennung des Rückstandes an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (4/1) die Titelverbindung neben 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-22-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 als farblose, amorphe Substanz.
<1>H-NMR (CDCl3): 3,30 + 3,40 + 3,44 (s+s+s, OCH3); 3,67 (d, J = 9Hz, H-26); 4,52 (d, breit, J = 13Hz, H-6e); 4,81 (d, J = 10Hz, H-20).
b) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506
Zu einer Lösung von 60 mg 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22(S)-dihydro-iso-FK 506 in 2 ml trockenem Methylenchlorid werden 100 mg gepulvertes Molekularsieb 4A sowie 12 mg N-Methylmorpholin-N-oxid gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur versetzt man mit ca. 10 mg Tetrapropylammonium-perruthenat und rührt weitere 3 Stunden. Man dampft ein, nimmt mit Essigsäureethylester auf, wäscht mit wässriger NaHCO3-Lösung und Wasser, trocknet und dampft ein. Die so erhaltene Verbindung kann durch Chromatographie an Kieselgel mit Toluol/Essigsäureethylester (6/1) gereinigt werden. Man erhält eine farblose amorphe Substanz.
E) 33-O-tert.Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FR 520
Man verfährt analog wie unter D beschriebon und erhält die Titelverbindung als farblosen amorphen Feststoff.
Die erfindungsgemässen Metaboliten und Verbindungen besitzen interessante pharmakologische Eigenschaften und können daher als Heilmittel verwendet werden. Insbesondere zeigen sie immunosuppressive und antiinflammatorische Wirkung. Die immunosuppressive Wirkung zeigt sich z.B. in vitro durch die Hemmung der Allogen-stimulierten Hyperproliferation von Lymphozyten (MLR = mixed Iymphocyte reaction) sowie in der Unterdrückung der primären humoralen Immunantwort gegen Schaferythrocyten. Die antiinflammatorische Wirkung kann in vitro durch dio Inhibierung der TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat) stimulierten PGE2-Freisetzung aus Maus-Makrophagen, bzw. des FMLP- oder Ca-lonophor A23187-stimulierten "oxidative burst" von humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten nachgewiesen werden.
In vivo zeigt sich die antiinflammatorische Wirkung der neuen Verbindungen am Modell der Oxazolon bedingten allergischen Kontakt-Dermatitis an der Maus.
Diese Wirksamkeiten können mit den folgenden Testmethoden nachgewiesen werden:
1. Prüfung der Wirksamkeit nach topischer Applikation am Modell der Oxazolon-AIIergie an der Maus:
Dieser Test wird analog wie bei F.M. Dietrich und R. Hess in Int. Arch. Allergy 38/246-259 (1970) beschrieben durchgeführt.
2. Inhibierung des "oxidative burst" in humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten (Inhibierung der FMLP- bzw. A23187-stimulierten Chemilumineszenz):
Die Präparation polymorphkerniger Leukozyten (PMNL) und die Bestimmung der Chemilumineszenz wird wie in der Literatur beschrieben (M. Schaude, W. Mlineritsch, B. Mandak, Mycoses 31(5), 259-267 [1988]) durchgeführt, wobei die CL-Reaktion entweder durch Zugabe des Peptids N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin (FMLP, 4 x 10<-><6> M oder durch den Calziumionophor A 23 187 (4 x 10<-><6> M) gestartet wird. Als minimale Hemmkonzentration wird jene niedrigste Wirkstoffkonzentration bezeichnet, bei der eine deutliche Hemmung aller 3 Parameter beobachtet werden kann.
3. Inhibierung der Makrophagen-Aktivierung (Inhibierung der TPA-induzierten Freisetzung von PGE2):
Die Inhibierung der PGE2-Synthese durch peritoneale Mausmakrophagen wurde analog wie bei A. Haselberger et. al., Circ. Shock Res. 26/185-192 (1988) beschrieben unter Verwendung von TPA als Stimulans durchgeführt.
4. Proliferative Antwort von Lymphozyten auf allogene Stimulation:
Der Test wird wie in der Literatur beschrieben durchgeführt: T. Meo (1979): The MLR in the mouse. In "Immunological Methods", L. Lefkovits and B. Pernis, Eds., Acad. Press, N.Y., S. 227-239.
5. Primäre humorale Immunantwort auf rote Schafsblutzellen in vitro:
Der Test wird wie in der Literatur beschrieben durchgeführt: R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of normal mouse spleen cell suspensions in vitro, Science 153/1004-1006 (1966); R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice, J. Exp. Med. 126/423-442 (1967).
Die Ergebnisse dieser Tests sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: Tabelle 1:
Inhibierung der Oxazolon bedingten allergischen Kontakt-Dermatitis an der Maus bei topischer Applikation einer 0,01%igen Lösung der Prüfsubstanz in Ethanol:
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung:
<tb>Head Col 02 AL=L: % Inhibierung
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>44
<tb> <SEP>Metabolit B <SEP>47
<tb> <SEP>Metabolit C <SEP>48
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>44
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tabelle 2:
Hemmung der TPA-induzierten PGE2-Freisetzung aus Mausmakrophagen (M phi /PGE2) und des FMLP- bzw.
Ca-Ionophor A23 187 induzierten "oxidative burst" von humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten (PMN/FMLP und PMN/A23 187):
<tb>
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung:
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L: M phi /PGE2
<tb>Head Col 04 AL=L: PMN/FMLP
MHK [ mu M]
<tb>Head Col 05 AL=L: PMN/A23 187
MHK [ mu M]
<tb>
<tb>SubHead Col 02 AL=L>[ mu M]:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>% Inhib.:
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>0,5 <SEP>40 <SEP>0,001
<tb> <SEP>Metabolit B <SEP>1 <SEP>30 <SEP>0,5
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>0,5 <SEP>0,5
<tb> <SEP>iso-FK 506 <SEP>1 <SEP>35
<tb>
MKH = Minimale Hemmkonzentration
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Title: Tabelle 3:
Hemmung der Allogen-stimulierten Hyperproliferation von Mauslymphozyten (MLR) und der primären humoralen Immunantwort gegen Schaferythrocyten (MDA = Mishell-Dutton Assay):
<tb>Head Col 01 AL=L: Verbindung:
<tb>Head Col 02 to 03 AL=L:
IC-50 [ mu g/ml]
<tb>SubHead Col 02 AL=L>MLR:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>MDA:
<tb> <SEP>Metabolit A <SEP>0,1 <SEP>0,1
<tb> <SEP>Metabolit D <SEP>< 0,008 <SEP>0,036
<tb></TABLE>
Die erfindungsgemässen Metalboliten und Verbindungen sind daher als Immunosuppressiva und Entzündungshemmer für die Behandlung und Vorbeugung der Resistenz bei Transplantationen von Organen und Geweben wie Herz, Niere, Leber, Knochenmark, Haut usw. von Graft-versus-Host-Erkrankungen bei Knochenmarktransplantationen, Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoider Arthritis, Systemischer Lupus erythematodes, Hashomoto's Thyroiditis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Typ I Diabetes, Uveitis usw., sowie für die Therapie von entzündlichen Hauterkrankungen, wie Psoriasis, atopischer Dermatitis und anderen ekzematösen Dermatitiden, Urticaria, An gioödemen, Vaskulitiden, Erythemen und kutanen "Eosinophilen", Alopecia areata geeignet.
Die Verbindungen können topisch oder systemisch, z.B. enteral, z.B. oral verabreicht werden. Die Tagesdosis beträgt von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg. Bei topischer Anwendung genügt im allgemeinen eine 1 bis 3%ige Konzentration, lokal verabreicht. Beispiele von galenischen Formen sind Lotionen, Gels und Cremes.
Pharmazeutische Zusammenbereitungen können z.B. durch Mischen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger- oder Verdünnungsmittel hergestellt werden.
Die topische Verabreichung kann auch z.B. am Auge erfolgen.
The invention relates to substituted azatricyclo derivatives and their metabolites, their preparation and pharmaceutical compositions containing them.
The compounds of the general formula
EMI1.1
in which R1 is methyl, ethyl or allyl and n is 1 or 2 and their preparation and immunosuppressive and antimicrobial activity are described in the literature. These substances are isolated from culture media obtained by fermentation of Streptomyces strains according to methods known per se. Streptomyces tsukubaensis No. 9993 (FERM BP-927), as described in EP 184 162, is preferably used as the production strain. This strain is available from the Fermentation Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305, Japan under the terms of the Budapest Agreement. This strain was again deposited on April 27, 1989 with the Agricultural Research Culture Collection International Depository Authority, Peoria, lllinois 61 604, USA, under the terms of the Budapest Agreement. The deposit number is NRRL 18.488.
It has now been found that this fermentation broth contains a number of metabolites that have valuable pharmacological activities. They can be obtained by a process which is characterized in that the metabolites are isolated from the remaining solutions and washing liquids from the fermentation broth after removal of the compounds of the formula II by methods known per se, for example with the aid of chromatographic processes.
This process can be carried out analogously to known methods, e.g. using chromatographic methods.
The fermentation broth can be worked up, for example, as follows:
6200 l fermentation broth are stirred with 6000 l ethyl acetate for 6 hours at room temperature and then separated in a separator. The ethyl acetate part is then evaporated to dryness in vacuo. The resulting extract is then degreased by partitioning between 3 x 70 l methanol / water (9/1) and 3 x 70 l hexane. After evaporation to dryness in a vacuum, the methanol / water part gives further extract. This is chromatographed on a column of 25 kg Sephadex LH20. The fractions, which according to TLC and HPLC contain the compound of formula II, are combined and, for further purification, chromatographed on a column (diameter 15 cm) of 20 kg silica gel Merck (0.04 to 0.063 mm) with tert-butyl methyl ether. After 50 l of eluate, fractions of 6.2 l are collected. The fractions, according to DC and HPLC, the compound of the formula
EMI3.1
contain, are combined and evaporated to dryness in vacuo. From this, the compound of formula IIIa is obtained as crystalline product by crystallization from acetonitrile. Finally the column is washed out with 90 l of methanol. This results in 91 g of metabolite mixture, which is separated by further chromatography on 800 g of silica gel H with tert-butyl methyl ether / methanol / water (88/11/1, 80 / 17.5 / 2 and 70/25/4). Sephadexfiltration and subsequent chromatography on Lichroprep RP18 lead to the further separation of the metabolite mixture. The fractions containing the same metabolites are combined by means of DC and HPLC analysis.
In this way you get three different fractions with different retention times:
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> Head Col 01 AL = L: fraction:
<tb> Head Col 02 to 03 AL = L: retention time (minutes):
<tb> SubHead Col 02 AL = L> Gradient 1:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> Gradient 2:
<tb> <SEP> A <SEP> 10.21 <SEP> 17.69
<tb> <SEP> B <SEP> 4.99 <SEP> 13.94
<tb> <SEP> C <SEP> 9.65
<tb> <SEP> HPLC system: <SEP> column, Lichrosorb RP18 Merck, 250 x 4 mm self-filled. Flow 2 ml / min, detection UV 220 nm / 0.1
<tb> <SEP> solutions: <SEP> triethylamine phosphate buffer pH 3.5, 0.05 M 10% acetonitrile / acetonitrile
<tb> <SEP> Gradient 1: <SEP> in 20 min from 50:50 to 10:90
<tb> <SEP> Gradient 2: <SEP> in 20 min from 90:10 to 10:90
<tb> </TABLE>
After a further chromatographic purification of fraction A on Lichroprep RP18 with H2O / methanol (1/4), metabolite A is obtained as a colorless solid substance which is uniform in HPLC. It has the IR or mass spectra shown in diagrams 1 and 5.
Mp: 70-75 ° C
[alpha] 20_D = -75.6 ° (c = 1.17 in methanol)
UV: lambda max (methanol) 320 log epsilon min = 1.3074
Filtration of fraction B again through a column of Sephadex LH20 in methanol gives metabolite B as a colorless, amorphous solid substance which is uniform in HPLC. It has the IR or mass spectra shown in diagrams 2 and 6.
Mp: 72-78 ° C
[alpha] 20_D = - 71.1 ° (c = 1.22 in methanol)
UV: lambda max (methanol) 225 log epsilon min = 1.1561; 323 log epsilon min = -0.0907
<1> H-NMR (CDCl3): conformer mixture approx. 2: 1
Characteristic signals [ppm]: 6.70 (m, H-24); 6.11 (d, broad. J = 15Hz, H-23).
<1> <3> C-NMR (CDCl3): Characteristic signals [ppm] of the conformer present in higher concentration: 199.9 (C-22); 148.8 (C-24); 137.6 (C-19); 131.8 (C-23); 98.1 (C-10?); 128.1 (C-29); 124.0 (C-20).
Metabolite B has a DELTA <23> double bond.
Further chromatography of fraction C on Lichroprep RP18 with methanol / water (4/1) leads to metabolite C as an HPLC-uniform, amorphous solid. It has the IR or mass spectra shown in diagrams 3 and 7.
Mp: 55-60 ° C
[alpha] 20_D = +7.5 ° (c = 1.0 in methanol)
UV: lambda max (methanol) 321 log epsilon min = 1.2972
The secondary fractions, which do not contain any compound of the formula IIIa when chromatographed on silica gel with tert-butyl methyl ether, are combined, separated further on silica gel H and Lichroprep RP18 and evaluated by HPLC analysis. The fractions with the retention time of 8.01 minutes (gradient 1) are pooled. The metabolite D results as a colorless amorphous solid. It has the IR or mass spectra shown in diagrams 4 and 8.
Mp: 74-78 ° C
[alpha] 20_D = -131 ° (c = 1.02 in chloroform)
UV: lambda max (methanol) 256 log epsilon min = 0.3716
<1> H NMR (CDCl3): Characteristic signals [ppm] at 5.33 (d, J = 4Hz, H-26); 5.22 (d, J = 9Hz, H-29); 4.53 (d, broad, J = 15Hz, H-6e); 4.37 (d, broad, J = 4Hz, H-2); 4.19 (ddd, J1 = 2Hz, J2 = 5Hz, J3 = 7Hz, H-24).
<1> <3> C NMR (CDCI3): Characteristic signals [ppm] at 208.4 (C-22); 202.6 (C-9); 169.6 (C-1); 167.5 (C-8); 131.6 (C-29); 124.2 (C-20); 135.1 (C-37); 116.6 (C-38); 81.4 (C-26); 68.3 (C-24).
The invention therefore also relates to a process for the preparation of the metabolites A, B and C, characterized in that, after the compound of the formula IIa has been separated off from the fermentation broth, the column is washed out with methanol and the solution of the metabolite mixture obtained is separated by repeated successive chromatography steps.
It further relates to a process for the preparation of the metabolite D, characterized in that the secondary fractions obtained in the chromatography of the fermentation broth with tert-butyl methyl ether for separating off the compound of the formula IIa are separated by repeated successive chromatography steps.
When the fermentation batches are worked up, fractions are formed which, based on HPLC analysis, contain a new metabolite with a retention time of 11.7 minutes (gradient 1). Chromatographic separation and purification on silica gel H, Sephadex LH20 and Lichroprep RP18 results
a) the compound of the formula
EMI6.1
as a HPCL-uniform amorphous colorless solid.
Mp: 103-105 ° C
[alpha] 20_D = -41.8 ° (c = 0.95 in chloroform)
<1> H-NMR (CDCI3 + CH3OH 5: 1): two conformers in a ratio of approx. 3: 1. Characteristic signals at [ppm] 4.37 (d, broad, J = 14Hz, H-6e); 3.91 (d, J = 2Hz, H-26): 4.08 (H-26 min).
<1> <3> C-NMR (CDCI3): Characteristic signals [ppm] at 168.8 (C-1); 162.2 (C-8); 189.9 (C-9); 99.8 (C-10); 50.5 (C-18); 210.9 (C-22); 41.2 (C-23); 71.5 (C-24); 37.7 (C-25); 136.3 (C-28); 127.8 (C-29).
The invention therefore also relates to a process for the preparation of the compound of the formula Ia, characterized in that the marginal fractions formed in the work-up of the fermentation broth for separating off the compound of the formula IIa are subjected to successive chromatography steps [process variant a)].
In the compound of the formula Ia, the lactone ring is not linked via the oxyfunction in position 26, but rather via the oxyfunction in position 24. Compounds with this isomeric basic structure are hereinafter referred to as "iso".
The invention also relates to a process for the synthetic preparation of the compounds having this isomeric basic structure, namely the compounds of the formula I.
EMI7.1
wherein X for the oxo or an optionally protected hydroxy group, R1 min for methyl. Ethyl, n-propyl or allyl and R2 represent an optionally protected hydroxy group, characterized in that
b) for the preparation of the compounds of the formula
EMI8.1
wherein R1 min and R2 have the above meaning and X min represents an optionally protected hydroxyl group, a compound of the formula
EMI8.2
wherein X min, R1 min and R2 have the above meaning, treated with a base such as imidazole or
c) for the preparation of compounds of the formula
EMI9.1
wherein R1 min has the above meaning and X min min represents the oxo or hydroxyl group, from a compound of the formula
EMI9.2
wherein X, R1 min and R2 have the above meaning and R3 stands for an optionally protected hydroxyl group, with the proviso that at least one of the groups X, R2 and R3 stands for a protected hydroxyl group, which splits off the protective group (s) by known methods.
The compounds with this "iso structure" are important intermediates for the production of new, biologically active derivatives.
If X stands for optionally protected hydroxy, they can have the S or R configuration in position 22.
The diastereomers A have the configuration S on the C-22, the diastereomers B the configuration R in this position. As protective groups for the hydroxyl group, common protective groups can be used, for example the tert-butyldimethylsilyl group.
The above process variants can be carried out analogously to known methods.
Process variant a) is preferably carried out as described above.
Process variant b) is a rearrangement. It can e.g. by treating a compound of formula IIIa min in a solvent inert under the reaction conditions, e.g. in dimethylformamide, with a base, e.g. with imidazole, carbonyldiimidazole or 4-dimethylaminopyridine, preferably at elevated temperature, e.g. at about 50 to 60 ° C. The desired end products can be separated from any by-products which may be formed by known methods, for example by chromatography.
Process variant c) is a deprotection. It can also be carried out by known methods, for example using HF / acetonitrile, preferably at about room temperature. Depending on the reaction conditions (reaction time, reaction temperature), the cleavage can be directed in such a way that either all protective groups or only some of the protective groups are removed. This partial removal of protective groups is particularly desirable when a certain hydroxyl group is subsequently to be reacted in a further reaction.
In the method according to the invention, the configuration remains unchanged, in particular at position 22 if X stands for an optionally protected hydroxyl group. If the starting products are used as diastereomeric mixtures, the individual diastereomers can be separated at any point in the course of the reaction by methods known per se, for example by chromatography.
The starting products can be obtained analogously to known methods.
The starting compounds of the formula
EMI11.1
where R1 min, R2 and R3 have the above meaning, can be obtained by oxidation of compounds of the formula
EMI11.2
wherein R1 min, R2 and R3 have the above meaning, are obtained.
The fermentation broth required as the starting product can be obtained, for example, as follows:
A) Start culture on agar:
An agar culture of the strain Streptomyces tsukubaensis No. 9993 (deposited in accordance with the Budapest Treaty No. FERM BP-927, Fermentation Research Institute, Japan) is cultivated for 14 days at 27 ° C. in the following medium:
4 g / l yeast extract, 10 g / l malt extract, 4 g / l dextrose, 20 g / l agar, pH = 6.6 (NaOH / H2SO4).
B) preculture:
The spores and the mycelium from 6 starting cultures are suspended in 90 ml of a 0.9% NaCl solution. 10 Erlenmayer flasks, each with 1 liter of preculture medium, are inoculated with 7 ml of this suspension. The preculture medium has the following composition: 10 g / l glycerin, 10 g / l starch, 5 g / l glucose, 10 g / l wool seed extract, 5 g / l yeast extract, 2 g / l CaCO3, pH = 6.8. This preculture is grown for 96 hours at 27 ° C. and 200 rpm with stirring.
C) Intermediate culture:
Two 500-liter aliquots of the preculture medium are incubated in a 750-liter steel fermenter with 5 liters of the preculture for 48 hours at 27 ° C., 100 rpm and 0.5 liter / minute aeration.
D) Main culture:
6000 liters of the main culture medium are inoculated in two 4500 liter steel fermenters with 600 liters of intermediate culture. The main culture medium has the following composition: 45 g / l soluble starch, 10 g / l corn steep, 10 g / l yeast extract, 1 g / l CaCO3, pH = 6.8 (NaOH). The incubation is carried out for 96 hours at 27 ° C., 50 rpm, 0.5 bar and aeration of 0.5 liters / minute.
The other starting products are known or can be produced by known processes or analogously as described in the examples.
A subgroup of the compounds according to the invention relates to compounds of the formula
EMI13.1
where X has the above meaning.
Explanation of the figures:
Diagrams 1 to 4 show the IR spectra for metabolites A to D.
These diagrams 5 to 8 represent the mass spectra for the metabolites A to D.
EXAMPLES
In the following examples, which explain the invention in more detail, but without restricting its scope, all temperatures are in DEG C.
In the examples, the following connections are represented by short names:
EMI15.1
EMI16.1
EMI17.1
Example 1: 33-O-tert-butydimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506 (process b)
[R1 min = allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S) -OH]. (Formula I)
92 mg of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (S) -dihydro-FK 506 (diastereomer A) and 12 mg of imidazole are stirred in 1 ml of dimethylformamide at 60 ° for 120 hours. It is evaporated and purified by chromatography on silica gel with toluene / ethyl acetate (2/1). Instead of imidazole, other bases, e.g. 4-dimethylaminopyridine or carbonyldiimidazole can be used.
When using carbonyldiimidazole, the following procedure is carried out, for example: 85 mg of carbonyldiimidazole are added to a solution of 459 mg of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (S) -dihydro-FK 506 (diastereomer A) in 5 ml of anhydrous benzene, and the mixture is 12 Stirred at 50 ° for hours. It is evaporated in vacuo and isolated by chromatography on silica gel with toluene / ethyl acetate (3/1) in addition to the 22,24-cyclic carbonate of the starting compound, the title substance as a colorless amorphous solid substance.
<1> H NMR Spectrum (CDCl3, Characteristic Signals, ppm): (5.04 (m, H-24); 3.84 (d, J = 7Hz, H-26): 4.79 (d , broad, J = 10Hz, H-20); 3.28, 3.38 and 3.41 (OCH3); 3.655 (dd, J1 = 2Hz, J2 = 9Hz, H-14).
The following compounds of the formula I can also be obtained analogously to that described in Example 1:
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Head Col 01 AL = L: Example
<tb> Head Col 02 AL = L: R1 min
<tb> Head Col 03 AL = L: X
<tb> Head Col 04 to 05 AL = L: R2
<tb> <SEP> 2 <SEP> -CH2.CH = CH2 <SEP> (R) -OH <SEP> O.BDMS <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 3 <1)> <SEP> -C2H5 <SEP> (S) -OH <SEP> O.BDMS <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 4 <SEP> -C2H5 <SEP> (R) -OH <SEP> O.BDMS <SEP> colorless amorphous solid
BDMS = tert-butyldimethylsilyl
<1)> <1> H NMR spectrum (CDCl3, character.
Signals, ppm) for Example 3: 3.29 + 3.39 + 3.42 (s + s + s, OCH3); 3.59 (dd, J1 =, 12Hz, J2 = 2.5Hz, H-15); 3.67 (d, J = 10Hz, H-14); 3.85 (d, J = 7Hz, H-26); 4.49 (d, broad, J = 13 Hz, H-6); 4.76 (d, J = 10Hz, H-20).
<tb> </TABLE>
Example 5: 22 (S) -dihydro-iso-FK 506 (method c)
[R1 min = allyl, R2 = tert-butyldimethylsiloxy; X = (S) -OH]. (Formula I)
To 1 ml of acetonitrile and 20 ml of 40 percent. HF 106 mg of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506 (diastereomer A) are added dropwise in 1.4 ml of acetonitrile and the mixture is stirred for 1 hour at room temperature. It is then concentrated in vacuo and purified by chromatography on silica gel with ethyl acetate. Amorphous colorless solid.
<1> H NMR Spectrum (CDCI3, Characteristic Signals, ppm): 3.895 (d, J = 6Hz, H-26); 4.80 (d, broad, J = 10Hz, H-20); 3.67 (d, J = 9Hz, H-14); 3,295, 3,39 and 3,42 (OCH3).
The following compounds of the formula can also be obtained analogously to that described in Example 5:
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Head Col 01 AL = L: Example
<tb> Head Col 02 AL = L: R1 min
<tb> Head Col 03 AL = L: X
<tb> Head Col 04 to 05 AL = L: R2
<tb> <SEP> 6 <SEP> -CH2.CH = CH2 <SEP> (R) -OH <SEP> OH <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 7 <SEP> -C2H5 <SEP> (S) -OH <SEP> OH <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 8 <SEP> -C2H5 <SEP> (R) -OH <SEP> OH <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 9 <SEP> -C2H5 <SEP> Oxo <SEP> OH <SEP> colorless amorphous solid
<tb> <SEP> 10 <SEP> -CH2.CH = CH2 <SEP> Oxo <SEP> OH <SEP> colorless amorphous solid
<tb> </TABLE>
The compounds required as starting products can be obtained as follows:
A) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-FR 520
15 mg of imidazole and 17 mg of tert-butyldimethylsilyl chloride are added to a solution of 80 mg of FR 520 in 3 ml of dichloromethane with stirring. The reaction mixture is stirred for 2 hours at room temperature, then diluted with saturated aqueous ammonium chloride solution and extracted three times with diethyl ether. The extract is washed with water and an aqueous sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, concentrated under reduced pressure and purified by chromatography.
B) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (S) -dihydro-FK 506 and
33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (R) -dihydro-FK 506
3.9 g of tetramethylammonium triacetoxyborohydride and 2.75 g of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-FK 506 are dissolved in 24 ml of acetonitrile / glacial acetic acid (1/1) at -20 ° and the mixture is stirred for 2 hours at 0-5 ° . Then water is added, the mixture is stirred at 10-15 ° for 15 minutes and then extracted with methylene chloride. The organic phase is washed with water and saturated aqueous NaCl solution, dried (MgSO4) and evaporated. Chromatography on silica gel with toluene / ethyl acetate (5/1) isolates the two diastereomeric title compounds in a ratio of approximately 10: 1 as amorphous, colorless solid substances.
Diastereomer A (main product)
1H-NMR (CDCl3): Two conformers in a ratio of approx. 2: 1.
Characteristic signals [ppm] of the predominant conformer at 5.30 (H-26); 4.66 (m, H-2); 4.44 (d, broad, J = 13Hz, H-6e) signals for the OCH3 groups of the two conformers can be found at 3.31, 3.32, 3.335, 3.38, 3.39 and 3.42 ppm .
<1> <3> C-NMR (CDCI3) Characteristic signals of the predominant conformer [ppm] at 195.9 (C-9); 169.1 (C-1) 165.0 (C-8); 137.4 (C-37); 136.4 (C-19); 132.2 (C-28); 128.9 (C-29); 126.1 (C-20); 115.7 (C-38); 98.4 or 97.0 (C-10).
Diastereomer B (by-product):
<1> <3> C-NMR (CDCI3) Characteristic signals of the predominant conformer [ppm] at 169.1 (C-1); 165.8 (C-8); 136.2 (C-19); 125.5 (C-20); 98.7 (C-10); 43.3 (C-21) and 36.8 (C-23).
C) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (5) -dihydro-FR 520 and
33-O-tert. Butyldimethylsilyl-22 (R) -dihydro-FR 520
Starting from FR 520, the procedure is analogous to that described under B) and the title compounds are obtained.
D) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506
a) 33-O-tert-Butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506
460 mg of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506 and 120 mg of bis-trimethylsilylacetamide are stirred in 5 ml of dry toluene at room temperature for 24 hours. It is evaporated and the chromatographic separation of the residue on silica gel with toluene / ethyl acetate (4/1) gives the title compound in addition to 33-O-tert-butyldimethylsilyl-22-O-trimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506 as a colorless, amorphous substance.
<1> H NMR (CDCl3): 3.30 + 3.40 + 3.44 (s + s + s, OCH3); 3.67 (d, J = 9Hz, H-26); 4.52 (d, broad, J = 13Hz, H-6e); 4.81 (d, J = 10Hz, H-20).
b) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FK 506
100 mg of powdered molecular sieve 4A and 12 mg of N-methylmorpholine-N are added to a solution of 60 mg of 33-O-tert-butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-22 (S) -dihydro-iso-FK 506 in 2 ml of dry methylene chloride -oxide given. After stirring for 30 minutes at room temperature, about 10 mg of tetrapropylammonium perruthenate are added and the mixture is stirred for a further 3 hours. It is evaporated, taken up in ethyl acetate, washed with aqueous NaHCO3 solution and water, dried and evaporated. The compound thus obtained can be purified by chromatography on silica gel using toluene / ethyl acetate (6/1). A colorless amorphous substance is obtained.
E) 33-O-tert-butyldimethylsilyl-26-O-trimethylsilyl-iso-FR 520
The procedure is analogous to that described under D and the title compound is obtained as a colorless amorphous solid.
The metabolites and compounds according to the invention have interesting pharmacological properties and can therefore be used as medicines. In particular, they show immunosuppressive and anti-inflammatory effects. The immunosuppressive effect shows e.g. in vitro by inhibiting the allogen-stimulated hyperproliferation of lymphocytes (MLR = mixed Iymphocyte reaction) and by suppressing the primary humoral immune response against sheep erythrocytes. The anti-inflammatory effect can be in vitro by dio inhibition of the TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) stimulated PGE2 release from mouse macrophages, or the FMLP or Ca ionophore A23187 stimulated "oxidative burst" of human neutrophils polymorphonuclear leukocytes can be detected.
In vivo, the anti-inflammatory effect of the new compounds is demonstrated by the model of the allergic contact dermatitis caused by oxazolone in the mouse.
These efficacies can be demonstrated using the following test methods:
1. Testing the effectiveness after topical application on the model of the oxazolone allergy on the mouse:
This test is carried out analogously to F.M. Dietrich and R. Hess in Int. Arch. Allergy 38 / 246-259 (1970).
2. Inhibition of the "oxidative burst" in human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes (inhibition of FMLP or A23187-stimulated chemiluminescence):
The preparation of polymorphonuclear leukocytes (PMNL) and the determination of chemiluminescence is carried out as described in the literature (M. Schaude, W. Mlineritsch, B. Mandak, Mycoses 31 (5), 259-267 [1988]), the CL- Reaction either by adding the peptide N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine (FMLP, 4 x 10 <-> <6> M or by the calcium ionophore A 23 187 (4 x 10 <-> <6 > M) The minimum inhibitory concentration is the lowest active substance concentration at which a clear inhibition of all 3 parameters can be observed.
3. Inhibition of macrophage activation (inhibition of TPA-induced release of PGE2):
The inhibition of PGE2 synthesis by peritoneal mouse macrophages was carried out analogously to A. Haselberger et. al., Circ. Shock Res. 26 / 185-192 (1988) described using TPA as a stimulant.
4. Lymphocyte proliferative response to allogeneic stimulation:
The test is carried out as described in the literature: T. Meo (1979): The MLR in the mouse. In "Immunological Methods", L. Lefkovits and B. Pernis, Eds., Acad. Press, N.Y., pp. 227-239.
5. Primary humoral immune response to red sheep blood cells in vitro:
The test is carried out as described in the literature: R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of normal mouse spleen cell suspensions in vitro, Science 153 / 1004-1006 (1966); R.I. Mishell, R.W. Dutton: Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice, J. Exp. Med. 126 / 423-442 (1967).
The results of these tests are summarized in the following tables:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: Table 1:
Inhibition of allergic contact dermatitis caused by oxazolone in the mouse when topical application of a 0.01% solution of the test substance in ethanol:
<tb> Head Col 01 AL = L: connection:
<tb> Head Col 02 AL = L:% inhibition
<tb> <SEP> Metabolite A <SEP> 44
<tb> <SEP> Metabolite B <SEP> 47
<tb> <SEP> Metabolite C <SEP> 48
<tb> <SEP> Metabolite D <SEP> 44
<tb> </TABLE>
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Title: Table 2:
Inhibition of TPA-induced PGE2 release from mouse macrophages (M phi / PGE2) and the FMLP or
Ca ionophore A23 187 induced "oxidative burst" from human neutrophils with polymorphonuclear leukocytes (PMN / FMLP and PMN / A23 187):
<tb>
<tb> Head Col 01 AL = L: connection:
<tb> Head Col 02 to 03 AL = L: M phi / PGE2
<tb> Head Col 04 AL = L: PMN / FMLP
MIC [mu M]
<tb> Head Col 05 AL = L: PMN / A23 187
MIC [mu M]
<tb>
<tb> SubHead Col 02 AL = L> [mu M]:
<tb> SubHead Col 03 AL = L>% Inhib .:
<tb> <SEP> Metabolite A <SEP> 0.5 <SEP> 40 <SEP> 0.001
<tb> <SEP> Metabolite B <SEP> 1 <SEP> 30 <SEP> 0.5
<tb> <SEP> Metabolite D <SEP> 0.5 <SEP> 0.5
<tb> <SEP> iso-FK 506 <SEP> 1 <SEP> 35
<tb>
MKH = minimal inhibitory concentration
<tb> </TABLE>
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> Title: Table 3:
Inhibition of the allogen-stimulated hyperproliferation of mouse lymphocytes (MLR) and the primary humoral immune response against sheep erythrocytes (MDA = Mishell-Dutton Assay):
<tb> Head Col 01 AL = L: connection:
<tb> Head Col 02 to 03 AL = L:
IC-50 [mg / ml]
<tb> SubHead Col 02 AL = L> MLR:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> MDA:
<tb> <SEP> Metabolite A <SEP> 0.1 <SEP> 0.1
<tb> <SEP> Metabolite D <SEP> & lt 0.008 <SEP> 0.036
<tb> </TABLE>
The metal bolites and compounds according to the invention are therefore used as immunosuppressants and anti-inflammatories for the treatment and prevention of resistance in transplants of organs and tissues such as heart, kidney, liver, bone marrow, skin etc. of graft-versus-host diseases in bone marrow transplants, autoimmune diseases such as rheumatoid Arthritis, systemic lupus erythematosus, Hashomoto's thyroiditis, multiple sclerosis, myasthenia gravis, type I diabetes, uveitis etc., as well as for the therapy of inflammatory skin diseases such as psoriasis, atopic dermatitis and other eczematous dermatitis, urticaria, an gioitemic edema, vasculature cutaneous "eosinophils", alopecia areata.
The compounds can be topical or systemic, e.g. enteral, e.g. administered orally. The daily dose is from about 0.01 mg to about 100 mg. For topical application, a 1 to 3% concentration, administered locally, is generally sufficient. Examples of galenic forms are lotions, gels and creams.
Pharmaceutical compositions can e.g. by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
Topical administration can also be e.g. done on the eye.