Die Erfindung betrifft neue Azolderivate, ihre Herstellung, pharmazeutische Präparate, welche sie enthalten, sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere zur Herstellung aromatasehemmender Arzneimittel.
Die Erfindung betrifft die Verbindungen der Formel I,
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worin R1 und R2 gleich oder verschieden sind und jeweils für einen unsubstituierten oder ein- oder mehrfach substituierten Aryl- oder Heteroarylrest,
R3 für einen unsubstituierten oder ein- oder mehrfach substituierten Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder mit einem Benzolring kondensierten Cycloalkyl-, Aryl- oder Heteroarylrest oder für eine Alkoxygruppe, und
X für CH oder N,
stehen, wobei falls R3 für Methyl und R1 und R2 beide für einen Phenylrest stehen, mindestens einer dieser Phenylreste substituiert sein muss, sowie ihre Säureadditionssalze.
In der obigen Formel stehen R1, R2 und R3 als Arylreste besonders für Phenyl, als Heteroarylreste besitzen sie vorzugsweise 5 oder 6 Ringatome und als Heteroatome ein- oder mehrfach Schwefel oder Stickstoff. Die nicht-kondensierten Heteroarylreste stehen z.B. für den Thienyl- oder Pyridinrest, der kondensierte Heteroarylrest steht z.B. für den Indolyl-2 oder Indolyl-3-Rest.
Als Substituenten für R1 und R2 kommen besonders Halogenatome, z.B. F oder Cl in Frage. Bevorzugt ist eine Monosubstitution, besonders in p-Stellung.
Substituenten für den Rest R3 als Aryl- oder Heteroarylrest sind z.B. Halogen, die Nitrogruppe, die Cyangruppe, eine gegebenenfalls durch Halogen oder Phenyl ein- oder mehrfach substituierte niedere Alkyl-, niedere Alkenyl-, niedere Alkinyl-, niedere Alkylthio, niedere Alkylsulfinyl-, niedere Alkylsulfonyl- oder niedere Alkoxygruppe oder eine gegebenenfalls substituierte Phenyl- oder Phenoxygruppe. Bevorzugt als Substituenten sind Halogenatome, z.B. F oder Cl und CN.
R3 als Cycloalkylrest, auch wenn er mit einem Benzolring kondensiert ist, hat vorzugsweise 5 bis 7 C-Atome und ist bevorzugt unsubstituiert.
R3 als Alkylrest hat vorzugsweise 1 bis 4 C-Atome und kann z.B. durch CN, Alkoxy, Benzyloxy oder eine Alkoxy-(mono, di oder tri)äthylenoxygruppe substituiert sein.
R3 als Alkoxygruppe hat vorzugsweise 1 bis 4 C-Atome.
Falls die R3-Reste substituiert sind, ist eine Monosubstitution bevorzugt.
Die als Substituenten aufscheinenden oder in Substituenten enthaltenen niederen Alkylgruppen besitzen vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome, die niederen Alkenyl- und Alkynylgruppen bis 4 Kohlenstoffatome.
In der obigen Formel I sind die nachfolgenden Bedeutungen der Symbole allein oder in Kombination bevorzugt:
R1 und R2 sind p-F- oder besonders P-Cl-Phenyl
X ist CH
R3 hat die oben erwähnten bevorzugten Bedeutungen und ist besonders p-F-, p-Cl- oder p-CN-Phenyl.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man Verbindungen der Formel
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worin X, R1 und R2 obige Bedeutung besitzen, mit einer Carbonsäure R3COOH oder einem reaktiven Derivat davon nach an sich bekannten Methoden acyliert.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise durch Umsetzung einer Verbindung der Formel II mit einem entsprechenden Säurehalogenid in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z.B. in einer organischen oder anorganischen Base, die gleichzeitig als Säurefänger fungiert, wie Pyridin, gegebenenfalls unter Zusatz eines Acylierungsbeschleunigers, wie 4-Dimethylaminopyridin durchgeführt werden. Zur Acylierung kann eine Verbindung der Formel II auch mit einem Aktivester der Säure R3COOH umgesetzt werden. Beispielsweise kann die Reaktion mit einem Pyridyl-2-thiolester in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z.B. in einem Diniederalkylcarbonsäureamid wie Dimethylformamid bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Weiter kann man die Verbindungen der Formel II mit R3COOH in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid umsetzen.
Das Endprodukt kann aus dem Reaktionsgemisch nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden.
Die Ausgangsprodukte der Formel II sind teilweise neu und können beispielsweise nach folgendem Reaktionsschema erhalten werden:
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Die übrigen Ausgangsprodukte, sowie die Acylierungsmittel sind bekannt oder analog zu bekannten Methoden, bzw. analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.
In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind unkorrigiert.
Beispiel 1:
2,2-Bis-(4-chlorphenyl)-2-(1H-imidazol-1-yl)-1-(4-chlorbenzoyl-amino)ethan
Zu 670 mg 2,2-Bis-(4-chlorphenyl)-2-(1H-imidazol-1-yl)-1-aminoethan in 4 ml trockenem Pyridin werden unter Eiskühlung 0,34 ml 4-Chlorbenzoylchlorid getropft. Das Gemisch wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man giesst auf kalte, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung und extrahiert mit Essigsäurethylester. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsultat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand kristallisiert beim Digerieren mit Essigsäurethylester und Diethylether. Farblose Kristalle, Fp: 241-244 DEG .
Das als Ausgangsprodukt verwendete 2,2-Bis-(4-chlorphenyl)-2-(1H-imidazol-1-yl)-1-aminoethan kann wie folgt hergestellt werden:
a) 2,2-Bis-(4-chlorphenyl)aziridin
Eine Grignardlösung aus 8,45 g Magnesium und 36 ml Brombenzol in 200 ml absolutem Ether wird mit 300 ml getrocknetem Toluol versetzt und der Ether abdestilliert, bis eine Innentemperatur von 107 DEG erreicht ist. Zur siedenden Lösung werden nun 28,8 g p-Chloracetophenonoxim in 100 ml getrocknetem Toluol zugetropft, das Gemisch 1 1/2 Stunden zum Rückfluss erhitzt und dann unter Eiskühlung mit 300 ml 20%iger Ammoniumchloridlösung versetzt. Nach Phasentrennung wird die wässrige Phase mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird über Kieselgel (0,040 bis 0,063 mm) mit Petrolether 60-80 DEG und Diethylether/Petrolether (3/2) chromatographiert.
Das so erhaltene \l wird durch das NMR-Spektrum charakterisiert:
<1>H-NMR(CDCl3): 2.36(2H, s, breit, -CH2); 7.20-7.55 (8H, m, Aromat).
b) 2,2-Bis-(4-chlorphenyl)-2-(1H-imidazol-1-yl)-1-aminoethan
3,96 g 2,2-Bis-(4-chlorphenyl)aziridin werden mit 5,1 g Imidazol 20 Stunden auf 95 DEG erhitzt (Schmelze). Man nimmt mit Essigsäureethylester/Wasser auf und extrahiert die H2O-Phase einige Male mit Essigsäureethylester nach. Die organischen Phasen werden mit 0,25% Weinsäurelösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand, der neben dem gewünschten Produkt auch das Stellungsisomere 1,1-Bis-(4-chlorphenyl)-2-(1H-imidazol-1-yl)-1-aminoethan, enthält, wird über Kieselgel (0,040-0,063 mm) mit Dichlormethan/Methanol/Petrolether (20/1/5) aufgetrennt. Man erhält ein zähes gelbbraunes \l.
<1>H-NMR(CDCl3): 1,40 (2H, breit, -NH2); 3.90 (2H, s, -CH2); 6.9-7.5 6H, m, Aromat, Imidazol); 7,68 (1H, Imidazol)
Analog wie in Beispiel 1 beschrieben, können auch folgende Verbindungen der Formel I aus den entsprechenden Ausgangsprodukten erhalten werden:
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Die Verbindungen der Formel I sowie die pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze dieser Verbindungen weisen im Tierversuch interessante pharmakodynamische Eigenschaften auf. Sie können daher als Arzneimittel verwendet werden. Insbesondere besitzen die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I und ihre Salze eine aromatase-inhibierende Wirkung. Diese Aromataseinhibition kann z.B. in den nachfolgenden Tests nachgewiesen werden:
1.) Aromataseinhibition in vitro:
Als Enzymquelle dienen Mikrosomen aus humaner Placenta. Zur Präparation dieser Mikrosomen werden ganze humane Placenten unmittelbar nach der Entbindung gekühlt ins Labor gebracht, durch intensives Spülen mit 0,25 M Sucrose von uberschussigem Blut befreit, sodann in Stücke geschnitten und sofort unter Kühlung homogenisiert (1 g Organ + 1,5 g KCl/Tris-Puffer, pH 7,4; Ultraturrax 3 x 10 s/0 DEG C). Nach der Sedimentation von teilweise zerstörten Zellen, Zellkernen und Mitochondrien bei 200, 7000 und 11 000g jeweils 10 Minuten erfolgt die Gewinnung der mikrosomalen Fraktion durch Zentrifugation des postmitochondrialen Überstandes bei 105.000 g/60 min. Das einmal gewaschene Pellet wird dann in isotonem KCl/Tri-Puffer zu einer Cyt P-450 Konzentration von 0,5 mu M supendiert.
Die Bestimmung der Aromataseaktivität erfolgt nach einer modifizierten bekannten Methode (Thompson E.A., Siiteri P.K. 1974, J. Biol. Chem. 249, 5364-5372) unter Verwendung von 1 beta , 2 beta <3>H-Androstendion als Substrat in Gegenwart eines NADPH regenerierenden Systems. Die Prüfverbindungen werden in Konzentrationen von 0,01 und 1 mu M zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 DEG C wird die Reaktion durch Mischen mit einem grossen Überschuss an Chloroform beendet und wässrige und organische Phasen getrennt. Die Radioaktivität der wässrigen Phase ist auf <3>H2O zurückzuführen, das bei der Aromatisierung von 1 beta , 2 beta <3>H-Androstendion zu \stron entsteht, und wird als Mass für die enzymatische Aktivität verwendet.
Verbindungen, die die Aromatase unter diesen Testbedingungen signifikant inhibieren, werden zur Bestimmung von IC50-Werten sodann in einem erweiterten Konzentrationsbereich geprüft.
Für die Verbindung des Beispiels 1 wurde in diesem Test eine IC50 von 4,2 nM ermittelt (für die Vergleichssubstanz Aminoglutethimid ist die IC50 700 nM).
2. Ovulationshemmung
Rattenweibchen mit regelmässigem Zyklus erhalten die zu prüfende Substanz um 16.00 Uhr am Tage vor der Ovulation und um 11.00 Uhr am Tage der Ovulation. Die Ovulation wird bestimmt durch das Auszählen der Eier im Vaginalabstrich.
Die orale ID50 für die Verbindung des Beispiels 1 ist 0,15 mg/kg. Für die Vergleichssubstanzen Aminoglutethimid und 4-Hydroxyandrostendion liegen in diesem Test die oralen ID50 bei Werten über 10 mg/kg.
3. Einfluss auf Ovarialaromatase und E2-Produktion in vivo:
Erwachsene weibliche Ratten werden 12 Tage hindurch mit 25 IU/Tag s.c. PMSG (pregnant mare Serum gonadotrophin) vorbehandelt, am 13. Tag wird die Testsubstanz in einer Konzentration von 0,032 bis 10 mg/kg oral verabreicht. Die Ratten werden 8, 24 und 48 Stunden später getötet und Blut und Eierstöcke entnommen. Aus jeweils einem Eierstock jedes Tieres werden Mikrosomen präpariert und deren Aromataseaktivität, wie oben beschrieben, ermittelt. \stradiol wird aus dem zweiten Eierstock extrahiert und durch RIA quantifiziert; ebenso \stradiol aus dem Blut.
In diesem Test lag die ID50 der Verbindung des Beispiels 1 für die Aromataseinhibition im Eierstock unterhalb 0,032 mg/kg nach 24 Stunden (für Aminogluethimid > 5,6 mg).
4. Subchronische Effekte in vivo:
Jugendlichen, 23 Tage alten, weiblichen Ratten wird die Testsubstanz 7 Tage hindurch je einmal täglich verabreicht. Am 4. bis zum 7. Tag wird zusätzlich Testosteronproprionat s.c. injiziert. Am 8. Tag werden die Tiere getötet, das Blut gesammelt und die Uteri entnommen, gereinigt und gewogen. Gaben von Testosteron verursachen eine deutliche Zunahme der Uterusgewichte, bedingt durch die Umwandlung von Testosteron durch Aromatase in \stradiol. Daher ist die Hemmung der Uterushypertrophie durch eine Testsubstanz ein genaues Mass für die Inhibition der \strogenerzeugung durch Aromatase während der siebentägigen Behandlung.
In diesem Test betrug die ID50 für die Verbindung des Beispiels 1 0,4 mg/kg/Tag p.o.
5. Chronische Effekte
\strogenabhängige Brusttumoren werden bei Ratten durch eine einzelne orale Verabreichung von 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen (DMBA) hervorgerufen. Wenn die Tumoren durchschnittlich eine Grösse von ca. 1500 mm<3> erreicht haben, wird die Behandlung mit der zu prüfenden Substanz eingesetzt und weitergeführt bis zu 6 Wochen.
Die Verbindung des Beispiels 1 hemmt das Wachstum des Tumors deutlich bei 1 mg und 10 mg/kg p.o. pro Tag. Die Vergleichssubstanz Aminoglutethimid ist auch bei 100 mg/kg pro Tag unwirksam.
Die Aromatase spielt eine herausragende Rolle in der Biosynthese von \strogenen bei Säugetieren. Die Blockierung dieses Enzyms durch spezifische Inhibitoren kann eine drastische Senkung der üblichen Steroidspiegel bewirken. Eine derartige nichtinvasive chemische Erniedrigung des Steroidspiegels erscheint gegenüber der chirurgischen Entfernung hormonproduzierender Organe (Prostata, Ovar, Nebennieren) eine wünschenswerte Alternative und Ergänzung in der Behandlung steroidabhängiger Tumoren z.B. der Prostata, des polycystischen ovariellen Syndroms, der Carcinoma der Mamma, Ovarien, des Endometriums sowie des Morbus Cushing.
Die Verbindungen der Formel I können demnach als geeignete, spezifische Inhibitoren der Steroidsynthese in der Behandlung mehrerer der angeführten Tumoren verwendet werden.
Für die oben genannten Anwendungen variiert die zu verwendende Dosis selbstverständlich je nach verwendeter Substanz, Art der Administration und der gewünschten Behandlung. Im allgemeinen werden aber befriedigende Resultate erreicht bei Verabreichung der Verbindungen der Formel I in einer Dosis von etwa 0,15 bis 1,5 mg/kg Körpergewicht.
Für grössere Säugetiere liegt eine geeignete Tagesdosis entsprechend im Bereich von ca. 10 bis ca. 100 mg.
Diese Tagesdosis kann in kleineren Einheitsdosen 2-4 mal täglich oder in Retardform erfolgen. Eine geeignete Einheitsdosis enthält daher für die entsprechenden Anwendungen von ca. 2,5 bis ca. 50 mg der Verbindungen der Formel I neben pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen. Die Verbindungen der Formel I können, als freie Base oder als pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze, enteral (z.B. oral, beispielsweise als Tabletten oder Kapseln) oder parenteral (z.B. als Injektionslösungen oder Suspensionen) verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Präparate, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionsalz davon enthalten. Diese Präparate, beispielsweise eine Lösung oder eine Tablette, können nach bekannten Methoden, unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe, hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft weiter die Verbindungen der Formel I oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionsalze als Arzneimittel, besonders als Aromatase-Hemmer.
The invention relates to new azole derivatives, their production, pharmaceutical preparations which contain them, and their use for the production of medicaments, in particular for the production of aromatase-inhibiting medicaments.
The invention relates to the compounds of the formula I
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wherein R1 and R2 are the same or different and each represents an unsubstituted or mono- or polysubstituted aryl or heteroaryl radical,
R3 for an unsubstituted or mono- or polysubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl or benzo ring-fused cycloalkyl, aryl or heteroaryl radical or for an alkoxy group, and
X for CH or N,
stand, where if R3 is methyl and R1 and R2 both represent a phenyl radical, at least one of these phenyl radicals must be substituted, and their acid addition salts.
In the above formula, R1, R2 and R3 as aryl radicals are especially phenyl, as heteroaryl radicals they preferably have 5 or 6 ring atoms and as heteroatoms one or more times sulfur or nitrogen. The uncondensed heteroaryl residues are e.g. represents the thienyl or pyridine radical, the condensed heteroaryl radical is e.g. for the indolyl-2 or indolyl-3 radical.
Particularly suitable substituents for R1 and R2 are halogen atoms, e.g. F or Cl in question. Mono substitution is preferred, especially in the p-position.
Substituents for the radical R3 as aryl or heteroaryl radical are e.g. Halogen, the nitro group, the cyano group, a lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, lower alkylthio, lower alkylsulfinyl, lower alkylsulfonyl or lower alkoxy group which is mono- or polysubstituted or substituted by halogen or phenyl, or an optionally substituted phenyl or or phenoxy group. Preferred as substituents are halogen atoms, e.g. F or Cl and CN.
R3 as a cycloalkyl radical, even if it is condensed with a benzene ring, preferably has 5 to 7 carbon atoms and is preferably unsubstituted.
R3 as an alkyl radical preferably has 1 to 4 carbon atoms and can e.g. be substituted by CN, alkoxy, benzyloxy or an alkoxy (mono, di or tri) ethyleneoxy group.
R3 as an alkoxy group preferably has 1 to 4 carbon atoms.
If the R3 residues are substituted, mono substitution is preferred.
The lower alkyl groups appearing as substituents or contained in substituents preferably have 1 to 4 carbon atoms, the lower alkenyl and alkynyl groups up to 4 carbon atoms.
In the above formula I, the following meanings of the symbols, alone or in combination, are preferred:
R1 and R2 are p-F- or especially P-Cl-phenyl
X is CH
R3 has the preferred meanings mentioned above and is especially p-F-, p-Cl- or p-CN-phenyl.
According to the invention, the compounds of the formula I are obtained by using compounds of the formula
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wherein X, R1 and R2 have the above meaning, acylated with a carboxylic acid R3COOH or a reactive derivative thereof according to methods known per se.
The process according to the invention can be carried out, for example, by reacting a compound of the formula II with a corresponding acid halide in a solvent which is inert under the reaction conditions, e.g. in an organic or inorganic base which also acts as an acid scavenger, such as pyridine, optionally with the addition of an acylation accelerator, such as 4-dimethylaminopyridine. For acylation, a compound of the formula II can also be reacted with an active ester of the acid R3COOH. For example, the reaction with a pyridyl-2-thiol ester in a solvent inert under the reaction conditions, e.g. be carried out in a di-lower alkyl carboxamide such as dimethylformamide at room temperature. The compounds of the formula II can also be reacted with R3COOH in the presence of N-hydroxybenzotriazole and dicyclohexylcarbodiimide.
The end product can be isolated from the reaction mixture by methods known per se and optionally purified.
Some of the starting products of the formula II are new and can be obtained, for example, according to the following reaction scheme:
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The other starting products and the acylating agents are known or can be prepared analogously to known methods or analogously as described in the examples.
In the following examples, all temperatures are given in degrees Celsius and are uncorrected.
Example 1:
2,2-bis- (4-chlorophenyl) -2- (1H-imidazol-1-yl) -1- (4-chlorobenzoyl-amino) ethane
0.34 ml of 4-chlorobenzoyl chloride is added dropwise to 670 mg of 2,2-bis- (4-chlorophenyl) -2- (1H-imidazol-1-yl) -1-aminoethane in 4 ml of dry pyridine while cooling with ice. The mixture is stirred for 4 hours at room temperature. It is poured onto cold, saturated sodium bicarbonate solution and extracted with ethyl acetate. The combined organic phases are washed with saturated sodium bicarbonate solution and sodium chloride solution, dried over magnesium result and evaporated. The residue crystallized when digested with ethyl acetate and diethyl ether. Colorless crystals, mp: 241-244 DEG.
The 2,2-bis (4-chlorophenyl) -2- (1H-imidazol-1-yl) -1-aminoethane used as the starting product can be prepared as follows:
a) 2,2-bis (4-chlorophenyl) aziridine
A Grignard solution of 8.45 g of magnesium and 36 ml of bromobenzene in 200 ml of absolute ether is mixed with 300 ml of dried toluene and the ether is distilled off until an internal temperature of 107 ° C. is reached. 28.8 g of p-chloroacetophenone oxime in 100 ml of dried toluene are then added dropwise to the boiling solution, the mixture is heated to reflux for 1 1/2 hours and then 300 ml of 20% ammonium chloride solution are added while cooling with ice. After phase separation, the aqueous phase is extracted with ether. The combined organic phases are washed with saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The oily residue is chromatographed on silica gel (0.040 to 0.063 mm) with petroleum ether 60-80 ° and diethyl ether / petroleum ether (3/2).
The \ l obtained in this way is characterized by the NMR spectrum:
<1> H NMR (CDCl3): 2.36 (2H, s, broad, -CH2); 7.20-7.55 (8H, m, aromatics).
b) 2,2-bis (4-chlorophenyl) -2- (1H-imidazol-1-yl) -1-aminoethane
3.96 g of 2,2-bis (4-chlorophenyl) aziridine are heated to 95 ° C. for 20 hours with 5.1 g of imidazole (melt). The mixture is taken up in ethyl acetate / water and the H2O phase is extracted a few times with ethyl acetate. The organic phases are washed with 0.25% tartaric acid solution and saturated sodium chloride solution, dried over magnesium sulfate and evaporated. The residue, which in addition to the desired product also contains the positional isomer 1,1-bis- (4-chlorophenyl) -2- (1H-imidazol-1-yl) -1-aminoethane, is passed through silica gel (0.040-0.063 mm). separated with dichloromethane / methanol / petroleum ether (20/1/5). A tough yellow-brown \ l is obtained.
<1> H NMR (CDCl3): 1.40 (2H, broad, -NH2); 3.90 (2H, s, -CH2); 6.9-7.5 6H, m, aromatic, imidazole); 7.68 (1H, imidazole)
Analogously to that described in Example 1, the following compounds of the formula I can also be obtained from the corresponding starting products:
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The compounds of the formula I and the pharmaceutically acceptable acid addition salts of these compounds have interesting pharmacodynamic properties in animal experiments. They can therefore be used as medicines. In particular, the compounds of the formula I according to the invention and their salts have an aromatase-inhibiting effect. This aromatase inhibition can e.g. can be demonstrated in the following tests:
1.) Aromatase inhibition in vitro:
Microsomes from human placenta serve as the enzyme source. To prepare these microsomes, whole human placenta are brought to the laboratory in a cooled state immediately after delivery, excess blood is removed by intensive rinsing with 0.25 M sucrose, then cut into pieces and immediately homogenized with cooling (1 g organ + 1.5 g KCl / Tris buffer, pH 7.4; Ultraturrax 3 x 10 s / 0 ° C). After sedimentation of partially destroyed cells, cell nuclei and mitochondria at 200, 7000 and 11,000 g each for 10 minutes, the microsomal fraction is obtained by centrifuging the postmitochondrial supernatant at 105,000 g / 60 min. The pellet, once washed, is then suspended in isotonic KCl / tri buffer to a Cyt P-450 concentration of 0.5 µM.
The aromatase activity is determined by a modified known method (Thompson EA, Siiteri PK 1974, J. Biol. Chem. 249, 5364-5372) using 1 beta, 2 beta <3> H-androstenedione as substrate in the presence of a NADPH regenerating system. The test compounds are added in concentrations of 0.01 and 1 μM. After 30 minutes of incubation at 37 ° C., the reaction is ended by mixing with a large excess of chloroform and aqueous and organic phases are separated. The radioactivity of the aqueous phase is due to <3> H2O, which arises from the aromatization of 1 beta, 2 beta <3> H-androstenedione to \ stron, and is used as a measure of the enzymatic activity.
Compounds that significantly inhibit aromatase under these test conditions are then tested in an extended concentration range to determine IC50 values.
For the compound of Example 1, an IC50 of 4.2 nM was determined in this test (for the comparison substance aminoglutethimide, the IC50 is 700 nM).
2. Ovulation inhibition
Female rats with a regular cycle receive the substance to be tested at 4:00 p.m. on the day before ovulation and at 11:00 a.m. on the day of ovulation. Ovulation is determined by counting the eggs in the vaginal smear.
The oral ID50 for the compound of Example 1 is 0.15 mg / kg. For the comparison substances aminoglutethimide and 4-hydroxyandrostenedione, the oral ID50 in this test is above 10 mg / kg.
3. Influence on ovarian aromatase and E2 production in vivo:
Adult female rats are exposed to 25 IU / day SC for 12 days. PMSG (pregnant mare serum gonadotrophin) pretreated, on the 13th day the test substance is administered orally in a concentration of 0.032 to 10 mg / kg. The rats are sacrificed 8, 24 and 48 hours later and blood and ovaries are removed. Microsomes are prepared from each ovary of each animal and their aromatase activity is determined, as described above. \ stradiol is extracted from the second ovary and quantified by RIA; likewise \ stradiol from the blood.
In this test, the ID50 of the compound of Example 1 for aromatase inhibition in the ovary was below 0.032 mg / kg after 24 hours (for aminogluethimide> 5.6 mg).
4. Subchronic effects in vivo:
Adolescent, 23 day old, female rats are administered the test substance once a day for 7 days. On the 4th to 7th day, testosterone propionate s.c. injected. On the 8th day, the animals are sacrificed, the blood is collected and the uteri are removed, cleaned and weighed. Administering testosterone causes a significant increase in uterine weights due to the conversion of testosterone by aromatase to \ stradiol. Therefore, the inhibition of uterine hypertrophy by a test substance is an accurate measure of the inhibition of estrogen production by aromatase during the seven-day treatment.
In this test, the ID50 for the compound of Example 1 was 0.4 mg / kg / day p.o.
5. Chronic effects
\ estrogen-dependent breast tumors in rats are caused by a single oral administration of 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA). When the tumors have reached an average size of approx. 1500 mm <3>, the treatment with the substance to be tested is used and continued for up to 6 weeks.
The compound of Example 1 significantly inhibits the growth of the tumor at 1 mg and 10 mg / kg p.o. per day. The reference substance aminoglutethimide is also ineffective at 100 mg / kg per day.
Aromatase plays an outstanding role in the biosynthesis of estrogens in mammals. The blocking of this enzyme by specific inhibitors can lead to a drastic reduction in the usual steroid levels. Such a non-invasive chemical lowering of the steroid level appears to be a desirable alternative and supplement in the treatment of steroid-dependent tumors compared to the surgical removal of hormone-producing organs (prostate, ovary, adrenal glands) e.g. prostate, polycystic ovarian syndrome, carcinoma of the breast, ovaries, endometrium and Cushing's disease.
The compounds of the formula I can accordingly be used as suitable, specific inhibitors of steroid synthesis in the treatment of several of the tumors mentioned.
For the above-mentioned applications, the dose to be used naturally varies depending on the substance used, the type of administration and the desired treatment. In general, however, satisfactory results are achieved when the compounds of the formula I are administered in a dose of about 0.15 to 1.5 mg / kg of body weight.
For larger mammals, a suitable daily dose is accordingly in the range from approx. 10 to approx. 100 mg.
This daily dose can be given in smaller unit doses 2-4 times a day or in a sustained release form. A suitable unit dose therefore contains, for the corresponding applications, from about 2.5 to about 50 mg of the compounds of the formula I in addition to pharmaceutically acceptable diluents or carriers. The compounds of formula I, as free base or as pharmaceutically acceptable acid addition salts, can be administered enterally (e.g. orally, e.g. as tablets or capsules) or parenterally (e.g. as injection solutions or suspensions).
The invention also relates to pharmaceutical preparations which contain a compound of formula I or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof. These preparations, for example a solution or a tablet, can be prepared by known methods using the customary auxiliaries and carriers.
The invention further relates to the compounds of formula I or their pharmaceutically acceptable acid addition salts as medicaments, especially as aromatase inhibitors.