CH650796A5 - Plasmides derives d'actinomycetes. - Google Patents
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Description
La présente invention se rapporte à de nouveaux plasmides et plus particulièrement à des plasmides dérivés d'actinomycètes. is
Les plasmides, qui sont des éléments extrachromosomiques, sont utiles comme vecteurs pour des gènes utiles de clonage dans la technologie de recombinaison de l'ADN.
Jusqu'à présent, dans les études de la recombinaison de l'ADN, Escherichia coli et Bacillus subtilis, etc., sont utilisés comme hôtes, et 20 des plasmides dérivés de ColEl et Staphylococcus sont utilisés comme vecteurs. Par exemple, on sait que l'information génétique Gram positive est difficile à exprimer en bactérie Gram négative, et l'on pense que l'utilisation d'hôtes et de vecteurs, tous deux dérivés d'actinomycètes, est préférée dans les opérations de recombinaison 25 génétique de gènes dérivés d'actinomycètes. D'autre part, les actino-mycètes sont des bactéries importantes pour la production d'antibiotiques utiles et de substances physiologiquement actives, et ils sont très recherchés à cause de la possibilité de production de nouvelles substances utiles par perfectionnement de souches au moyen de la 30 technologie de recombinaison de l'ADN.
Bien que les plasmides dérivés des actinomycètes divulgués dans les demandes de brevet japonais publiées Nos (OPI) 133397/80, 133398/80 et 124799/80, soient connus, ils ne sont pas toujours susceptibles d'être facilement utilisés comme plasmides à cause du fait qu'ils ont un poids moléculaire élevé ou qu'ils comprennent des enzymes de restriction ayant une pluralité de sites de clivage. Ainsi, les présents inventeurs ont réalisé la présente invention en isolant des plasmides qui deviennent des vecteurs utiles et indispensables pour la technologie de la recombinaison de l'ADN des actinomycètes et en clarifiant les propriétés de ceux-ci.
Les plasmides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils ont au moins un site de clivage de restriction par enzyme de restriction spécifique et qu'ils ont un poids moléculaire inférieur à 1,0 x 107. Les plasmides dénommés pSF588, pSF765, pSF701-l, pSF619 et pSF689 sont plus particulièrement préférés.
Les dessins annexés illustrent l'invention à titre d'exemple.
La fig. 1 représente un diagramme d'enzyme de restriction du plasmide pSF588.
La fig. 2 représente un diagramme de l'enzyme de restriction du plasmide pSF619.
La fig. 3 représente un diagramme de l'enzyme de restriction du plasmide pSF689.
La fig. 4 représente un diagramme de l'enzyme de restriction du plasmide pSF70I-l.
La fig. 5 représente un diagramme de l'enzyme de restriction du plasmide pSF765.
Dans la fig. 2, bien que le site de clivage du BamHI et celui du PstI soient représentés comme le même point, ils ne sont pas superposés l'un sur l'autre, mais ils sont à proximité l'un de l'autre.
Des exemples de plasmides selon l'invention ont les propriétés physico-chimiques et enzymatiques mentionnées dans le tableau I.
u I
Poids moléculaire ( x 106)
Nombre de sites de clivage de l'enzyme de restriction
Méthode enzymatique"
Méthode par microscope électronique"
BglII
Eco RI
HindIII
BamHI
SstI
Sali
PstI
Xbal
StuI
pSF588
pSF619
pSF689
pSF701-l pSF765
3.0 6,2
9.1
4.7
4.8
3,0 5,9 9,2 4,6 4,4
1
0
1
0 0
0 0
0
1 0
0 0 0 0 0
0 3
1 3 0
0
1
1
2 0
0 2
5 2
6
0 3
1
2 1
0
1
0
1 0
0 0
0 2
1
" Méthode qui comprend le traitement du plasmide ADN avec un enzyme de restriction, l'analyse des fragments résultants et le calcul du poids moléculaire («Journal of molecular Biology», 91, 315-328,1974).
b Méthode qui comprend la prise d'une micrographie électronique d'un clivage de plasmide, la mesure de la longueur de celui-ci, et la transformation en poids moléculaire par calcul («Method in Enzymology», 21d, 413-428,1971, Academic Press).
Ainsi, ces plasmides ont un poids moléculaire inférieur à 1,0 x 107 et ont au moins un site de clivage par enzyme de restriction spécifique. Par exemple, pSF689 a au moins un site de clivage pour chacun des quatres types d'enzymes de restriction, à savoir 55 BglII, BamHI, SstI et PstI.
De plus, les diagrammes de clivage fondés sur les enzymes de restriction de ces plasmides sont montrés sur les fig. 1 à 5. Sur ces dessins, les chiffres représentent le poids moléculaire obtenu par méthode enzymatique (unité: Md). 60
Les plasmides décrits ci-dessus selon l'invention ont été isolés à partir des actinomycètes suivants, respectivement:
pSF588:
Streptomyces albofaciens SF588
[FERM-P N° 5267 (1er novembre 1979), mainte
nant transformé en FERM-BP N° 122 (27 avril
1982)]
65
pSF619:
Streptomyces hygroscopicus SF619 [FERM-P N° 5269 (1er novembre 1979), maintenant transformé en FERM-BP N° 123 (27 avril 1982)]
pSF689:
Streptomyces platensis SF689
[FERM-P N° 5002 (25 mai 1979), maintenant transformé en FERM-BP N° 121 (27 avril 1982)]
pSF765:
Streptomyces fradiae SF765 [FERM-P N° 5270 (1er novembre 1979), maintenant transformé en FERM-BP N° 124 (27 avril 1982)]
pSF701-l :
Streptomyces griseochromogens SF701 [FERM-P N° 5000 (25 mai 1979), maintenant transformé en FERM-BP N° 120 (27 avril 1982)]
3
650 796
Les indications FERM-BP suivies d'un numéro et d'une date représentent les indications relatives au dépôt des micro-organismes respectifs auprès du Fermentation Research Institute (Japon).
Les propriétés microbiennes du Streptomyces platensis SF689 et du Streptomyces griseochromogens SF701 ont été décrites en détail dans les brevets japonais N°s 6878/70 et 6076/70. Les propriétés des trois autres souches sont les suivantes :
Streptomyces albofaciens SF588:
Cette souche a été isolée à partir d'une terre des Indes.
I. Caractéristiques morphologiques
La formation d'un mycélium aérien est généralement faible, mais une bonne sporulation est observée sur un milieu sucrose/nitrate/ agar et un milieu agar d'amidon, etc. La ramification est monopo-diale et aucun verticille n'est observé. La chaîne spore est en spirale (principalement spirale compacte). Ni sclérote ni sporange ne sont observés.
Lorsqu'elle est observée au microscope électronique, la structure de surface du spore est lisse. Les spores ont une forme généralement ovale-cylindrique ayant une dimension de 0,4-0,6 x 0,6-1,0 |i. Généralement, 10 ou plus des spores sont liés pour former une chaîne.
II. Caractéristiques de culture sur différents milieux de culture
Les caractéristiques de culture sur différents milieux de culture à 28: C pendant 14 à 21 d sont présentés dans le tableau 2.
Les standards de couleurs mentionnés entre parenthèses dans le tableau sont ceux selon la classification du Color Harmony Manual (produit par Container Coporation of America).
Tableau II
Milieu
Croissance et
Mycélium
Pigment couleur inverse aérien soluble
Agar de sucro mince et faible,
blanc aucun se/nitrate incolore
Agar de gluco-
moyen, brun aucun aucun se/asparagine
Agar de glycé-
faible, moyen,
très faible blanc aucun rol/asparagine incolore, légèrement jaune
-
Agar d'amidon moyen, jaune-gris blanc aucun
Agar de farine moyen-bon aucun aucun ou lé
d'avoine jaune-gris
gèrement jauile
Agar de levure bon, légère très faible,
aucun de malt ment jaune-brun blanc
Agar de tyro-
moyen, légère aucun aucun sine ment jaune
Agar nutritif moyen, bon plissé, jaune-gris faible, blanc aucun
III. Propriétés physiologiques
1. Domaine de température pour la croissance: la croissance est observée à une température de 15 à 45°C, et une bonne croissance est observée à 25-40 C.
2. Liquéfaction de la gélatine: positif (culture à 20° C pendant 21 d).
3. Hydrolyse de l'amidon: positif (culture à 28°C pendant 14 d).
4. Réduction de nitrate: positif (culture à 28"C pendant 14 d).
5. Peptonisation du lait écrémé: positif (28: C, 37°C).
6. Coagulation du lait écrémé: négatif (28 C, 37"C).
7. Formation de pigment mélanoïde: négatif.
8. Antibiotique produit: oxytétracycline.
IV. Utilisation de source de carbone (en utilisant un milieu agar de Pridham et Gottlieb)
5 1. Utilisation ... D-glucose, D-fructose, D-mannitol, i-inositol et raffïnose.
2. Utilisation douteuse ... L-arabinose et L-rhamnose.
3. Pas d'utilisation ... D-xylose et sucrose.
io V. Composition de la paroi cellulaire
Comme résultat d'analyse par la méthode de Becker («Appi. Mi-crobiol.», 13: 236, 1965), l'acide diaminopimélique dans les composants de la paroi cellulaire étant l'isomère LL.
Ainsi, les caractéristiques microbiennes de la souche SF588 sont 15 résumées comme suit: la chaîne spore est en spirale et la structure de surface des spores est lisse. Le mycélium aérien est blanc et le revers est gris-blanc-brun. Des couleurs spéciales ne sont pas observées. .Par rapport aux pigments solubles, une couleur jaune pâle est observée sur le milieu agar de farine d'avoine, mais des pigments solubles 20 ne sont pas formés dans d'autres milieux de culture utilisés. La paroi cellulaire contient de l'acide LL-diaminopimélique.
Selon les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF588 appartient au genre Streptomyces et, plus particulièrement, est similaire au Streptomyces albofaciens. Lorsque l'on compare le 25 Streptomyces albofaciens selon la description de l'International Streptomyces Project («International Journal of Systematic Bacte-riology», 18, 287-288, 1968) et la souche SF588, bien qu'ils soient différents en ce qui concerne l'utilisation du L-arabinose, ils correspondent bien l'un à l'autre en ce qui concerne les caractéristiques 30 morphologiques et les propriétés de culture. De plus la souche SF588 produit de l'oxytétracycline, alors qu'il est connu que le Streptomyces albofaciens produit également de l'oxytétracycline (M.J. Thirumalachar et al., «Hindustan Antibiot. Bull.», 3, 61-63, 1960). En conséquence, tous deux correspondent bien l'un à l'autre 35 en ce qui concerne les antibiotiques produits.
Ainsi, il est raisonnable de considérer que la souche SF588 appartient à l'espèce Streptomyces albofaciens à cause du fait qu'elles correspondent bien l'une à l'autre dans leurs propriétés essentielles, bien que quelques différences de détail existent. Par conséquent, la 40 souche SF588 a été dénommée Streptomyces albofaciens SF588 par les présents inventeurs.
Streptomyces hygroscopicus SF619:
La souche a été isolée à partir d'une terre d'un bosquet de 45 bambou dans Kasaoka City, préfecture de Okayama, au Japon.
I. Caractéristiques morphologiques
La formation de mycélium aérien est abondante sur le milieu agar d'amidon et sur le milieu agar de levure de malt, etc., et la formation de spores est bonne. La ramification est monopodiale et 50 aucun verticille n'est observé. La chaîne spore est en spirale (principalement spirale compacte). Dans la dernière période de culture (culture pendant 14 à 20 d), des parties mouillées noires (ainsi dénommées zone hygroscopique) sont apparues sur le mycélium aérien. Il n'a été observé ni sclérote ni sporange.
55 Lorsqu'elle est observée au microscope électronique, la structure de surface des spores est lisse. Les spores ont généralement une forme ovale ayant une dimension de 0,5-0,8 x 0,7-1,0 |i. Généralement, 10 ou plus des spores sont reliés pour former une chaîne.
«o II- Caractéristiques de culture sur différents milieux de culture Les caractéristiques de culture sur différents milieux à 28° C pendant 14 à 21 d sont présentées dans le tableau 3.
Les standards de couleurs mentionnés entre parenthèse dans le tableau sont ceux selon la classification du Color Harmony Manual 65 (produit par Container Corporation of America).
L'apparence des zones hygroscopiques est observée remarquablement sur les milieux agar d'amidon, agar de farine d'avoine et agar de levure de malt.
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Tableau III
Milieu
Croissance et
Mycélium
Pigment couleur inverse aérien soluble
Agar de sucro faible, incolore faible, gris-
aucun se/nitrate
brun
Agar de gluco-
faible, incolore,
très faible,
aucun se/asparagine légèrement jaune blanc
Agar de glycé-
faible, incolore,
faible, blanc aucun rol/asparagine légèrement jaune
Agar d'amidon bon, jaune-gris abondant, gris-brun (2fe)
aucun
Agar de farine moyen, bon,
abondant, gris-
aucun d'avoine jaune-gris, teinté avec une couleur olive brun (2fe-3ig)
Agar de levure bon, légère abondant, gris-
aucun de malt ment brun brun (2fe-2ge)
Agar de tyro faible, légère faible, blanc aucun sine ment jaune
Agar nutritif faible, légèrement jaune faible, blanc aucun
III. Propriétés physiologiques
1. Domaine de température pour la croissance: la croissance a été observée dans un domaine de température de 15 à 40° C, et une bonne croissance a été observée à 27-37° C.
2. Liquéfaction de la gélatine: positif (culture à 20°C pendant 14 d).
3. Hydrolyse de l'amidon: positif (culture à 28°C pendant 8 d).
4. Réduction de nitrate: négatif (culture à 28°C pendant 14 d).
5. Peptonisation du lait écrémé: positif (28°C, 37°C).
6. Coagulation du lait écrémé: négatif (28°C, 37°C).
7. Formation de pigments mélanoïdes: négatif.
8. Antibiotique produit: paromomycine.
IV. Utilisation de source de carbone (en utilisant un milieu agar de
Pridham et Gottlieb)
1. Utilisation ... D-glucose, D-fructose, D-mannitol, i-inositol, raffînose et D-xylose.
2. Pas d'utilisation ... L-arabinose, L-rhamnose et sucrose.
V. Composition de la paroi cellulaire
Comme résultat de l'analyse par la méthode Becker («Appi. Mi-crobiol.», 13, 236, 1965), l'acide diaminopimélique dans les composants de la paroi cellulaire était l'isomère LL.
Ainsi, les caractéristiques microbiennes de la souche SF619 sont résumées comme suit. La chaîne spore est en spirale, et la structure de surface des spores est lisse. Le mycélium aérien a une couleur gris-brun et les zones hygroscopiques apparaissent dans la dernière période de la culture. La couleur inverse est jaune clair/jaune-gris et des couleurs spéciales ne sont pas observées. Des pigments solubles ne sont pas formés dans tous les milieux de culture utilisés. La paroi cellulaire contient l'acide LL-diaminopimélique.
Selon les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF619 appartient au genre Streptomyces, parmi lequel le Streptomyces hygroscopicus semble le plus clairement en rapport. En effet, les caractéristiques essentielles du Streptomyces hygroscopicus telles que:
1. apparence d'une zone hygroscopique,
2. formation de mycélium aérien gris-brun,
3. chaîne spore en spirale, et
4. pas de formation de pigments mélanines,
sont observées dans la souche SF619.
En conséquence, il est raisonnable de considérer que la souche SF619 appartient à l'espèce Streptomyces hygroscopicus. Ainsi, la souche SF619 a été dénommée Streptomyces hydroscopicus SF619 par les présents inventeurs.
Streptomyces fradiae SF765:
Cettç souche a été isolée à partir d'une terre de Minamiitabashi, Tokyo, au Japon.
I. Caractéristiques morphologiques
La formation de mycélium aérien est abondante sur les milieux agar d'amidon, agar de farine d'avoine et agar de tyrosine, etc., et la formation de spores est bonne. La ramification est monopodiale et aucun verticille n'est observé. Les chaînes spores sont de différentes formes comprenant des formes linéaires, en ondes, en boucles, en crochets, en spirales primitives et en vraies spirales. On n'a observé ni sclérote ni sporange.
Lorsqu'elle est observée au microscope électronique, la structure de surface des spores est lisse. Les spores ont une forme générale ovale-cylindrique, ayant une dimension de 0,6-0,9 x 0,8-1,4 |x. Les chaînes spores sont généralement courtes, quelquefois avec moins de dix spores par chaîne.
II. Caractéristiques de culture sur différents milieux de culture Des caractéristiques de culture sur différents milieux à 28° C
pendant 14 à 21 d sont présentées dans le tableau 4.
Les couleurs de standard mentionnées entre parenthèses dans le tableau sont celles selon la classification du Color Harmony Manual (produit par Container Corporation of America).
Tableau IV
Milieu
Croissance et couleur inverse
Mycélium aérien
Pigment soluble
Agar de sucro faible, incolore faible, légère aucun se/nitrate
ment rose (5ca)
Agar de gluco-
très faible,
aucun aucun se/asparagine incolore
Agar de glycé-
faible, incolore légèrement rose aucun rol/asparagine
(5ca)
Agar d'amidon bon, jaune-gris abondant, rose-
aucun
orange-gris gris (5ec-3gc)
Agar de farine bon, jaune-gris abondant, légè
aucun d'avoine
rement rose-
beige (4ec-5gc)
Agar de levure moyen, bon,
gris-rose (5gc)
aucun de malt jaune-brun
Agar de tyro moyen, légère abondant,
aucun .
sine ment jaune-gris brun-rose (5gc)
Agar nutritif moyen, légère faible, légère aucun
ment jaune ment rose (5ca)
III. Propriétés physiologiques
1. Domaine de température pour la croissance: la croissance a été observée dans un domaine de température de 15 à 40° C, et une bonne croissance a été observée à 26-32° C.
2. Liquéfaction de la gélatine: positif (culture à 20°C pendant 21 d).
3. Hydrolyse de l'amidon: positif (culture à 28°C pendant 14 d).
4. Réduction de nitrate: positif (culture à 28°C pendant 14 d).
5. Peptonisation du lait écrémé: positif (culture à 28°C pendant 14 d).
6. Coagulation du lait écrémé: négatif (28:C, 37°C).
7. Formation de lait écrémé: négatif.
8. Antibiotique produit: néomycine.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
650 796
IV. Utilisation de source de carbone (utilisant un milieu agar de Pridham et Gottlieb )
1. Utilisation ... D-glucose, D-fructose, D-xylose et L-arabinose.
2. Pas d'utilisation ... D-mannitol, i-inositol, L-rhamnose, raffi-nose et sucrose.
V. Composition de la paroi cellulaire
Comme résultat de l'analyse par la méthode de Becker («Appi. Microbiol.», 13, 236, 1965) l'acide diaminopimélique dans les composants de la paroi cellulaire était l'isomère LL.
Ainsi, les caractéristiques microbiennes de la souche SF765 sont résumées comme suit. Les chaînes spores sont de différentes formes, de la forme linéaire à la forme spirale, et la structure de surface des spores est lisse. Le mycélium aérien a une couleur rose-gris/rose-brun et le revers a la couleur jaune-gris/jaune-brun. Des pigments solubles ne sont pas formés dans tous les milieux de culture utilisés. La paroi cellulaire contient de l'acide LL-diaminopimélique.
Selon les propriétés microbiennes décrites ci-dessus, la souche SF765 appartient au genre Streptomyces, parmi lesquels le Streptomyces fradiae semble être le plus proche. Lorsque le Streptomyces fradiae selon la description de l'International Streptomyces Project («International Journal of Systematic Bacteriology», 18, 118-120, 1968) et la souche SF765 sont comparés, les deux correspondent très bien en ce qui concerne toutes les caractéristiques morphologiques, les propriétés de culture et l'utilisation de source de carbone. De plus, étant donné que le Streptomyces fradiae et la souche SF765 produisent de la néomycine,ils correspondent l'un avec l'autre en ce qui concerne l'antibiotique produit.
En conséquence, il est raisonnable de penser que la souche SF765 appartient à l'espèce Streptomyces fradiae. Ainsi, la souche SF765 a été dénommée Streptomyces fradiae SF765 par les présents inventeurs.
L'isolement des plasmides selon la présente invention à partir d'actinomycètes et la purification de ceux-ci sont effectués selon le procédé décrit dans le «Journal of Antibiotics», vol. 33, pp. 118-121 (1980). Toutefois, les concentrations de glycine dans le cas de l'incubation des actinomycètes sont de 2,0, 0,5, 0,5, 0,5 et 0,5 respectivement pour le Streptomyces albofaciens SF588, le Streptomyces hygroscopicus SF619, le Streptomyces platensis SF689, le Streptomyces fradiae SF765 et le Streptomyces griseochromogens SF701.
Le poids moléculaire des plasmides purifiés est déterminé en préparant un échantillon selon la méthode de Davis et al. («Methods in Enzymology», vol. 21, pp. 413-428,1971, Academic Press, New York et Londres), en prenant une microphotographie électronique des molécules ADN circulaires ouvertes, en mesurant la longueur de celles-ci au moyen d'un curvimètre et en calculant avec un taux de conversion de 1 |im = 2 x 106 daltons.
Les enzymes de restriction utilisés pour le traitement et l'analyse des fragments résultants sont EcoRI, HindIII, BamHI, PstI, BglII et Sali (produits par Miles Lab. Co.), SstI et Xbal (produits par Be-thesda Res. Lab. Inc.) et StuI (produit par Wako Pure Chemical Ltd.), qui sont disponibles sur le marché.
Pour la digestion enzymatique de restriction, l'ADN a été traité avec au moins trois fois une quantité en excès des enzymes de restriction dans les conditions selon les directives des fournisseurs.
De plus, dans le cas du traitement des plasmides avec deux ou plusieurs enzymes de restriction, si la composition des solutions réagissant est commune les unes par rapport aux autres, les réactions sont effectuées en même temps. Si la composition des solutions réagissant est différente les unes des autres, la réaction dans une condition de sel faible est préalablement effectuée, puis la concentration en sel est augmentée pour réaliser une condition de réaction optimale, puis d'autres enzymes sont ajoutés pour effectuer la réaction. En effet, après le premier traitement par enzyme, l'enzyme est inactivé par chauffage à 60 C pendant 10 min. Après refroidissement, les protéines ont été séparées par une procédure phénol SDF, puis par dialyse. Ensuite, la composition réagissante est contrôlée, et le second traitement par enzyme puis le troisième traitement par enzyme sont effectués. L'analyse par électrophorèse sur gel d'agarose est effectuée selon la méthode décrite dans «Method'in Molecular Bio-logy», vol. 7, 87 (1974).
Comme décrit précédemment, les plasmides selon l'invention ont un faible poids moléculaire et ont au moins un site de clivage par enzyme de restriction spécifique, et l'isolement et la purification de ceux-ci sont facilement réalisés. En conséquence, ils sont considérés comme des vecteurs utiles dans la technologie de la recombinaison de l'ADN.
L'ADN de recombinaison par plasmide peut être produit de manière connue. Par exemple, le pSF701-l est ouvert avec EcoRI ou Xbal pour former un ADN linéaire. D'autre part, d'autres molécules d'ADN non vecteurs peuvent être ouvertes avec le même enzyme. Lorsque la molécule d'ADN linéaire obtenue et l'ADN non vecteur sont mélangés, les extrémités d'une chaîne simple de ceux-ci forment mutuellement une paire. Ensuite, de la polynucléotide ligase est ajoutée, par laquelle deux d'entre eux sont combinés par liaison covalente pour former une molécule d'ADN circulaire.
En utilisant le plasmide de recombinaison obtenu, le clonage de l'ADN non vecteur peut être réalisé par transformation d'une cellule hôte appropriée. Par exemple, la méthode de transformation en actinomycètes et le clonage d'un gène résistant à la néomycine à partir de Streptomyces fradiae ont été décrits dans «Nature», 274, 398-400 (1978) et «Nature», 286, 525-529 (1980), etc.
En outre, les plasmides selon l'invention, excepté le pSF588, sont capables de former des plasmides de plus petite dimension qui peuvent être facilement utilisés, à cause du fait qu'ils ont une pluralité de sites de clivage d'enzymes de restriction. De plus, il est possible de préparer des vecteurs navettes (shuttle vectors) (plasmides susceptibles de multiplication par différents hôtes) par exemple des vecteurs navettes à partir des plasmides selon l'invention et des vecteurs Escherichia coli, pRB322, ou Bacillus subtilis, pUBl 10, etc.
La présente invention sera illustrée par la" suite en détail en référence à des exemples et exemples de référence. Sauf indications contraires, tous les pourcentages sont des pourcentages en poids par volume (p/v).
Exemple 1:
Isolement du plasmide pSF588 à partir du Streptomyces albofaciens et purification de celui-ci
Des cellules cultivées en position inclinée ou séchées à froid de Streptomyces albofaciens SF588 ont été inoculées dans 20 ml d'un milieu MYG [1 % d'extrait de malt (produit par Difco Labs), 0,4% d'extrait de levure (produit par Difco Labs), et 2% de glucose, pH: 7,0] et incubées à 28 C pendant 2 d avec agitation à 120 tr/min. Ensuite, 2 ml de la culture du germe ont été inoculés à 80 ml de milieu MYG frais contenant 2% de glycine, et incubés à 28 C pendant 2 d avec agitation à 120 tr/min. Après incubation, les mycéliums ont été recueillis, et lavés deux fois avec un tampon de 20 mM Tris HCl contenant 0,4 M de chlorure de sodium (pH = 8,0). Les mycéliums obtenus ont été suspendus dans 5 ml de tampon sucrose TE (0,1 M Tris HCl, 0,02M EDTA et 25% sucrose, pH = 8,0) pour 1 g de mycélium humide. 0,1 ml de RNase (produit par Sigma Co., qui a été préparé par dissolution de 5 mg/ml dans une solution à 0,85% de chlorure de sodium et traité à 80' C pendant 15 min) et 0,1 ml de lysozyme 30 mg/ml (produit par Sigma Co.) ont été ajoutés, et la réaction a été effectuée à 37' C pendant environ 1 h. Le mélange réactionnel a été refroidi jusqu'à 0 C, puis 6 ml d'eau stérilisée et 0,25 ml de dodécylsulfate de sodium 5% ont été ajoutés, et le mélange a été mélangé gentiment dans un bain de glace pendant 5 min pour effectuer une Iyse complète. Ensuite, 3,1 ml d'une solution aqueuse de chlorure de sodium (5M) ont été ajoutés, et le mélange a été laissé au repos à 0-4 C pendant une nuit. Un lysat clair a été obtenu par centrifugation à 10000 g pendant 60 min. A ce lysat, du polyéthylèneglycol 1000 a été ajouté de manière à obtenir une concentration finale de 10%. Après que le lysat a été conservé à 0°C pendant 4 h, il a été centrifugé à 10000 g pendant 10 min pour obte5
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nir un précipité. Le précipité obtenu a été dissous dans un tampon sarcosyl-TE (10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA et 0,4% de sarcosi-nate de laurylsodium, pH = 8,0) et la quantité totale a été ajustée à 4,76 ml avec la même solution tampon. A la solution obtenue, 5 g de chlorure de césium ont été ajoutés et dissous dans celle-ci, et 0,5 ml 5 d'une solution de bromure d'éthidium 4,7 mg/ml a été ajouté. Le mélange a été introduit dans un tube à centrifugation réalisé en nitrocellulose, et la séparation centrifuge par gradient de densité «boyant» du CsCl/bromure d'éthidium a été effectuée à 20 C pendant 40 h ou plus à 36000 tr/min sur une ultracentrifugeuse de Beck- 10 man, modèle L2-75B, dans un rotor à angle fixe 75 Ti. Le tube de centrifugation a été irradié avec un rayon ultraviolet à 365 nm et une bande de plasmide ADN a été prise comme fraction plasmide.
Puis après élimination du bromure d'éthidium par extraction au n-butanol, l'ADN plasmide a été dialysé par rapport à un tampon 15 TE (tampon 10 mM HCl et 1 mM EDTA, pH = 8,0). La purification de l'échantillon après dialyse a été effectuée par centrifugation par gradient de densité du sucrose neutre 5-20%. En effet, en utilisant un tampon TEN contenant du bromure d'éthidium (solution tampon 10 mM Tris HCl, 20 mM EDTA, 50 mM de chlorure de so- 20 dium et 1 jig/ml de bromure d'éthidium, pH = 8,0) un mélange de 0,5 ml de l'échantillon et 0,05 ml de bromure d'éthidium (5 mg/ml) ont été superposés sur un gradient à densité linéaire de sucrose 5-20%, et la séparation par centrifugation a été effectuée à 4°C pendant 3 h à 40000 tr/min sur une ultracentrifugeuse Beckman modè- 25 le L2-75B dans un rotor SW 40. Ce tube de centrifugation a été irradié avec un rayonnement ultraviolet à 365 nm et une bande de plasmide émettant de la fluorescence a été prise. Après élimination du bromure d'éthidium par extraction au n-butanol, le plasmide ADN pSF588 a été dialysé par rapport à un tampon TE pour obtenir un 30 plasmide purifié.
Afin de déterminer le poids moléculaire, d'abord, une méthode par microscope électronique a été utilisée, qui comprend la prise d'une microphotographie électronique des ADN circulaires ouverts par une méthode de Davis et al. (décrite précédemment), la mesure 35 de la longueur du contour de ceux-ci au moyen d'un curvimètre, et le calcul par un taux de conversion de 1 (im + 2 x 10° daltons.
La détermination du poids moléculaire par une méthode enzy-matique a été effectuée par une méthode d'électrophorèse sur agarose après avoir soumis le plasmide à un traitement d'un enzyme de 40 restriction. En effet, le poids moléculaire d'un fragment d'ADN linéaire obtenu par digestion par enzyme de restriction du plasmide a été calculé par mesure de la mobilité relative par rapport au digests HindlII du X phage d'ADN ou d'un digests HindIII d'ADN SV40 par la méthode d'électrophorèse sur agarose. Dans le cas où une plu-45 ralité de fragments sont présents, il a été calculé sous la forme d'une somme totale. Les poids moléculaires sont mentionnés dans le tableau 1.
Les diagrammes d'enzymes de restriction ont été réalisés comme suit: 0,5-1 |xg d'ADN plasmide a été mis en réaction avec 9 types 50 d'enzymes de restriction (BglII, EcoRI, HindIII, BamHI, SstI, Sali, PstI, Xbal et Stul) en une quantité de 5 unités, respectivement, dans une condition réactionnelle optimale de chaque enzyme de restriction à 37° C pendant 2 h. Une solution d'arrêt de la réaction (5% de dodécylsulfate de sodium, 25% de glycérol et 0,025% de bleu de 55 bromophénol) en une quantité de 1/10 du mélange réactionnel a été ajoutée à celui-ci. Après avoir effectué le traitement à 65° C pendant 10 min, le mélange a été rapidement refroidi. Ensuite, l'analyse a été effectuée par électrophorèse sur gel d'agarose. Ainsi, en utilisant un gel d'agarose 0,08%, l'électrophorèse a été effectuée dans une solu- 60 tion tampon d'acide Tris borique (solution tampon 89 mM Tris, 2,5 mM EDTA et 89 mM acide borique). Le gel a alors été séché par immersion dans 1 Hg/ml d'une solution de bromure d'éthidium.
Le gel obtenu a été irradié avec un rayon ultraviolet à 365 nm pour prendre une photographie des bandes émettant de la fluorés- 65 cence. Le nombre de bandes a été mesuré pour déterminer le nombre de sites de clivage de chaque enzyme de restriction dans chaque plasmide. De plus, le poids moléculaire de chaque fragment a été calculé
par la méthode connue, et le nombre de sites de clivage a été examiné. Dans le cas où le plasmide présentait une pluralité de sites de clivage par enzyme de restriction, le diagramme d'enzyme de restriction a été réalisé par mesure d'une distance relative entre les sites de clivage de l'enzyme de restriction par la méthode connue (voir fig. 1).
Exemple 2:
L'isolement d'un plasmide à partir du Streptomyces hygroscopicus SF619 et la purification de celui-ci ont été effectués par la même procédure que dans l'exemple 1, excepté en ce que la concentration de glycine dans le milieu a été modifiée de façon à être de 0,5%, afin d'obtenir le plasmide purifié pSF619.
La mesure du poids moléculaire et la réalisation du diagramme d'enzyme de restriction ont été réalisées par la même procédure que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 et à la fig. 2.
Exemple 3:
L'isolement d'un plasmide à partir du Streptomyces platensis SF689 et la purification de celui-ci ont été effectués par la même procédure que dans l'exemple 1, excepté en ce que la concentration de la glycine dans le milieu a été modifiée de façon à être de 0,5% afin d'obtenir le plasmide purifié pSF689.
La mesure du poids moléculaire et la réalisation du diagramme d'enzyme de restriction ont été effectuées par la même procédure que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 et à la fig. 3.
Exemple 4:
L'isolement d'un plasmide à partir du Streptomyces fradiae SF765 et la purification de celui-ci ont été réalisés par la même procédure que dans l'exemple 1, excepté en ce que la concentration de la glycine dans le milieu a été modifiée de façon à être de 0,5%, afin d'obtenir le plasmide purifié pSF765.
La mesure du poids moléculaire et la réalisation du diagramme d'enzyme de restriction ont été réalisées par la même procédure que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 et à la fig. 4.
Exemple 5:
Etant donné qu'une cellule de Streptomyces griseochromogens SF701 comprenait deux plasmides ayant chacun un poids moléculaire différent, la préparation a été réalisée par la même procédure que dans l'exemple 1 (excepté en ce que la concentration de glycine dans le milieu était de 0,5%) par centrifugation par gradient de densité «boyant» CsCl/bromure d'éthidum, et la séparation a été réalisée par centrifugation avec gradient de densité de sucrose neutre 5-20%. Le tube de centrifugation a été irradié avec un rayon ultraviolet à 365 nm, et un plasmide pSF701-l ayant un poids moléculaire inférieur qui est apparu à la partie supérieure du tube de centrifugation a été prélevée. Après élimination du bromure d'éthidium par extraction au n-butanol, le plasmide ADN a été dialysé par rapport à un tampon TE pour obtenir le plasmide purifié pSF701-l.
La mesure du poids moléculaire et la réalisation du diagramme d'enzyme de restriction ont été effectués par la même procédure que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 et à la fig. 5.
Exemple de référence 1 :
Isolement d'une souche
Le Streptomyces albofaciens SF588, le Streptomyces hygroscopicus SF619 et le Streptomyces fradiae SF765 ont été isolés à partir d'une terre des Indes, d'une terre dans un bosquet de bambou de Kasaoka City, préfecture d'Okayama, et une terre de Minamiita-bashi à Tokyo, respectivement par la méthode suivante.
4 g de sol ont été suspendus dans 40 ml d'eau stérilisée (en utilisant un récipient conique de 100 ml). Après agitation pendant
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10 min sur un agitateur rotatif, la suspension a été laissée au repos pendant 15 min pour précipiter les particules lourdes grossières de sol. 4 ml de surnageant (boueux) ont été prélevés et dilués 10000 fois avec de l'eau stérilisée. 0,5 ml de la solution diluée a été introduit dans un vase de Pétri, et 20 ml d'un milieu agar pour séparation qui avait été stérilisé et chauffé à 45-50° C ont été ajoutés. Après que la solution diluée de sol et le milieu ont été mélangés de façon à devenir aussi homogènes que possible, le mélange a été laissé au repos pour solidifier le milieu agar. Le vase de Pétri a été incubé à 28° C pendant 10 d. Une colonie de la souche croissant sur le milieu agar a été inoculée sur une pente d'agar d'amidon/levure (0,2% dans l'extrait d'enzyme, 1,0% d'amidon soluble et 2,0% d'agar, pH = 7,0).
Le milieu agar pour séparation ayant la composition suivante a été utilisé:
Extrait d'enzyme: 0,05%
Amidon soluble: 0,25%
Agar: 2,0%
Eau: reste pH = 7,0 (avant stérilisation)
Exemple de référence 2:
Culture du Streptomyces albofaciens SF588 et isolement de l'oxytétracycline
1. Culture
Une boucle de la souche Streptomyces albofaciens SF588 (FERM-P N° 5267) ayant suffisamment crû sur un milieu agar de sucrose/nitrate a été inoculée dans un tube à test contenant 10 ml du milieu de culture suivant et incubée à 28° C pendant 20 h avec agitation au moyen d'un tube agitateur.
Milieu de culture des germes
Amidon soluble: 2,0%
Polypeptone: 1,0%
Extrait de viande: 0,3%
K2HP04: 0,05%
Eau: reste pH = 7
1 ml de la culture a été inoculé dans 5 flacons Sakaguchi contenant chacun 100 ml du milieu de culture décrit ci-dessus, et incubé à 28e C pendant 20 h avec agitation au moyen d'un agitateur inverse. La culture a été utilisée comme seconde culture de germe. La seconde culture de germe a été transférée dans un récipient de fermentation de 501 contenant 35 1 du milieu de production suivant, et incubée à 35° C pendant 50 h avec agitation et sous aération.
Milieu de production
Amidon soluble: 2,0%
Poudre de soya: 2,5%
Germe de blé: 1,0%
NaCl: 0,25%
Eau: reste pH = 7,0 avant stérilisation, ajusté avec NaOH Après avoir réalisé la culture, celle-ci a été filtrée pour obtenir 20 1 d'un filtrat.
2. Isolement de l'oxytétracycline
20 1 du filtrat de culture ont été contrôlés de manière à ajuster un pH 4 au moyen de HCl 6N, et 100 g de charbon actif y ont été ajoutés, puis le mélange a été agité. Par cette opération, l'oxytétracycline dans le filtrat de culture a été absorbé sur le charbon actif. Après agitation pendant 30 min, le charbon actif a été recueilli par filtra-tion et lavé avec 3 1 d'eau. Le charbon actif a été mélangé avec 10 1 d'une solution aqueuse d'acétone à 50%, et le pH a été ajusté à 9 au moyen de NaOH 5N avec agitation. Après une nouvelle agitation pendant 40 min, le mélange a été filtré pour obtenir 9 1 d'un filtrat. Celui-ci a été condensé sous vide pour éliminer l'acétone.
4,7 1 de la solution aqueuse obtenue ont été passés à travers une colonne remplie de 500 ml d'une résine d'échange cationique Am-berlite CG-50 (type H+) (produit par Rohm et Haas Co., USA)
pour adsorber Toxytétracycline sur la résine. Après avoir lavé la résine avec 11 d'eau, l'élution a été effectuée avec une solution aqueuse à 50% d'acétone pour obtenir chaque 500 ml de fraction. L'activité de chaque fraction a été examinée par la méthode du disque de papier en utilisant le Staphylococcus aureus 209 p comme microbe de test. Les fractions ayant une activité élevée (Nos 1-4) ont été recueillies (2 1) et condensées sous vide jusqu'à environ 100 ml. Après que le pH de la solution condensée obtenue a été ajusté à 8 avec du NaOH 5N, la solution a été laissée au repos à 5° C pour précipiter les cristaux d'oxytétracycline. Ces cristaux ont été filtrés et recristallisés (par dissolution dans HCl IN, élimination des impuretés et ajustage au pH 8) afin d'obtenir 85 mg de cristaux en aiguilles d'oxytétracycline.
Exemple de référence 3:
Culture du Streptomyces hygroscopicus SF619 et isolement de la pa-romomycine I
1. Culture
Une quantité correspondant à une boucle de platine de la souche Streptomyces hygroscopicus SF619 (FERM-P N° 5269) ayant suffisamment crû sur un milieu agar d'amidon/levure (0,2% d'extrait d'enzyme, 1,0% d'amidon soluble et 2,0% d'agar, pH 7) a été inoculée dans des tubes à test (5 tubes), chacun contenant 10 ml du milieu de germe suivant, et incubée à 28° C pendant 24 h avec agitation au moyen d'un agitateur de tube.
Milieu de germe
Glucose: 2,0%
Polypeptone: 1,0%
Extrait de viande: 0,3%
NaCl: 0,05%
Eau: reste pH = 7
0,8 ml de la culture de germe a été inoculé dans des flacons Sakaguchi (50 flacons), chacun contenant 80 ml du milieu de production suivant, et incubé à 28° C pendant 15 d avec agitation au moyen d'un agitateur alternatif.
Milieu de production
Amidon soluble: 2,0%
Sucrose: 2,0%
Poudre de soya: 3,0%
Germe de blé: 2,0%
NaCl: 0,25%
Eau: reste pH = 7,0 (ajusté avec NaOH avant stérilisation)
Après incubation, le milieu a été filtré pour obtenir 3 1 d'un filtrat.
2. Isolement de la paromomycine I
3 1 du filtrat de culture (pH 7,6) ont été passés à travers une colonne remplie avec 300 ml de la résine échangeuse de cations Amber-lite IRC-50 (type NH4+) (produit par U.S. Rohm & Haas Co.) pour adsorber la paromomycine dans le filtrat de culture sur la résine. Après lavage de la résine avec 1,5 1 d'eau, l'élution a été effectuée avec du NH4OH 0,5N pour obtenir chaque 150 ml de fraction. L'activité de chaque fraction a été examinée par la méthode du disque de papier en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme microbe de test. Les fractions actives (fractions Nos 2 et 3) ont été recueillies (300 ml) et condensées sous vide jusqu'à 30 ml. La solution condensée obtenue a été passée à travers une colonne contenant 30 ml de la résine échangeuse de cations Amberlite CG-50 (type NH4+) (produit par U.S. Rohm & Haas Co.), lavés avec 150 ml d'eau. Ensuite, la résine a été lavée avec 300 ml de NH40H 0,15N, et l'élution a été effectuée avec du NH40H 0,3N.
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Des fractions actives ont été recueillies (60 ml) et condensées à sec sous vide pour obtenir 180 mg d'une poudre brute de paromomycine (pureté 75%). La poudre brute obtenue a été dissoute dans une petite quantité d'eau, et chromatographiée avec de l'eau sur une colonne de la résine échangeuse d'anions Dowex 1X2 (type OH-) (produit par U.S. Dow Chemical Co.) (25 ml). Les fractions actives ont été recueillies et condensées à sec sous vide, et 63 mg de la base libre de paromomycine I ont été isolés sous la forme d'une poudre blanche.
Exemple de référence 4:
Culture de la souche Streptomyces fradiae SF765 et isolement de la néomycine
1. Culture
Deux ou trois boucles de la souche Streptomyces fradiae SF765 (FERM-P N° 5270) ayant suffisamment crû sur un milieu agar d'amidon/levure (0,2% d'extrait d'enzyme, 1,0% d'amidon soluble et 2,0% d'agar, pH 7) ont été inoculées dans des flacons de Sakagu-chi (8 flacons), chacun contenant 100 ml du milieu de germe suivant, et incubées à 28°C pendant 20 h avec agitation au moyen d'un agitateur alternatif. La culture obtenue a été utilisée comme culture de germe.
Milieu de germe
Amidon soluble: 2,0%
Polypeptone: 1,0%
Extrait de viande: 0,3%
K2HP04: 0,05%
Eau: reste pH = 7
400 ml de la culture de germe ont été introduits dans deux récipients de fermentation de 301 stérilisés, contenant 201 du milieu de production suivant, et incubés à 28° C pendant 69 h avec agitation sous aération.
Milieu de production
5 Amidon soluble: 2,0%
Poudre de soya: 2,5%
Germe de blé: 1,5%
CaC03: 0,3%
Eau: reste io pH = 7,0 (ajusté avec NaOH avant stérilisation)
Après incubation, le milieu a été filtré pour obtenir 271 d'un filtrat.
2. Isolement de la néomycine (mélange de B et C)
15 27 1 du filtrat de culture (pH 8,0) ont été passés à travers une colonne contenant 2,51 de la résine échangeuse de cations Amberlite IRC-50 (type NH4+) (produit par U.S. Rohm & Haas Co.) pour adsorber la néomycine du filtrat de culture sur la résine.
Après avoir lavé la résine avec 12,5 1 d'eau, l'élution a été effec-20 tuée pour obtenir chaque 11 de fraction. L'activité de chaque fraction a été examinée par la méthode du disque de papier en utilisant Bacillus subtilis ATCC 6633 comme microbe de test.
Les fractions actives (fractions Nos 2-4) ont été condensées sous vide jusqu'à 150 ml. Ensuite, la solution condensée obtenue a été 25 passée à travers une colonne contenant 200 ml d'Amberlite CG-50 (type NH4+) (produit par U.S. Rohm & Haas Co.). Après lavage avec 11 d'eau, puis 11 de NH40H 0,1N, l'élution est effectuée avec NH4OH 0,3N. Les fractions actives ont été condensées à sec sous vide pour obtenir 880 mg d'une poudre brute de néomycine. La 30 poudre brute obtenue a été dissoute dans une petite quantité d'eau, et chromatographiée avec de l'eau sur une colonne de 80 ml de Dowex 1X2 (type OH-) (produit par U.S. Dow Chemical Co.). Les fractions actives ont été condensées à sec sous vide, et 340 mg de base libre de néomycine (mélange de B et C) ont été isolés sous la 35 forme d'une poudre blanche.
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1 feuille dessins
Claims (6)
- 650 7962REVENDICATIONS1. Plasmides pratiquement purs dérivés d'actinomycètes ayant au moins un site de clivage de restriction par enzyme de restriction spécifique et ayant un poids moléculaire inférieur à 1,0 x 107. 5
- 2. Plasmide selon la revendication 1, constitué par pSF588.
- 3. Plasmide selon la revendication 1, constitué par pSF765.
- 4. Plasmide selon la revendication I, constitué par pSF701-l.
- 5. Plasmide selon la revendication 1, constitué par pSF619.
- 6. Plasmide selon la revendication 1, constitué par pSF689. io
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| JP56072185A JPS57188600A (en) | 1981-05-15 | 1981-05-15 | Novel actinomycetic plasmid |
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1982
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