CH643531A5

CH643531A5 - Verfahren zur reinigung von alpha-l-aspartyl-l-phenylalanin-niedrigalkylestern.

Info

Publication number: CH643531A5
Application number: CH276080A
Authority: CH
Inventors: Masashige Kubo; Yuji Nonaka; Keiichi Kihara
Original assignee: Sagami Chem Res; Ajinomoto Kk; Toyo Soda Mfg Co Ltd
Priority date: 1979-04-10
Filing date: 1980-04-10
Publication date: 1984-06-15
Also published as: DE3013701C2; US4309341A; CA1148943A; DE3013701A1; FR2453845A1; FR2453845B1; JPS6049199B2; GB2047711B; JPS55136257A; GB2047711A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von «-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern (auch als a-APE bezeichnet).

Die a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester und insbesondere der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (auch als a-APM bezeichnet) besitzen eine starke, saccharoseartige Süsskraft und sind daher als neuartige Süssstoffe von Interesse.

Bislang wurde eine Vielzahl von Verfahren zur Synthese von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern vorgeschlagen, wie beispielsweise die Methode der Herstellung dieser Verbindungen durch direktes Verknüpfen von L-Phe-nylalanin-methylester mit einem Additionssalz von Aspara-ginsäureanhydrid mit einer starken Säure. Dieses Verfahren liefert jedoch unvermeidbar Nebenprodukte, wie einen Tri-peptidester, der durch das Kuppeln des als Produkt anfallenden a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters mit einem weiteren Molekül der Asparaginsäure gebildet wird, ein Tripeptid, das durch Hydrolyse einer Estergruppe aus dem Tripeptidester gebildet wird, a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin (auch als a-AP bezeichnet), das durch Hydrolyse des a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters gebildet wird, und ein Diketopiperazinderivat (auch als DKP bezeichnet), insbesondere 3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin, das durch Ringbildung aus dem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester erzeugt wird.

Es ist weiterhin bekannt, die a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-niedrigalkylester dadurch herzustellen, dass man eine N-geschützte L-Asparaginsäure und einen L-Phenylalanin-niedrigalkylester mit Hilfe eines Enzyms kondensiert und dann die Schutzgruppe abspaltet. Diese Methode führt in einem geringeren Ausmass zur Bildung von Nebenprodukten. Jedoch ist es selbst bei Anwendung dieser Verfahrensweise kaum möglich, die Bildung von a-L-Aspartyi-L-phenylalanin und der oben angesprochenen Diketopiperazin-derivate weitgehend auszuschliessen.

Mögliche Methoden zur Abtrennung und Reinigung der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester könnten darin bestehen, diese Verbindungen durch ein Kristallisationsverfahren zu reinigen. In diesem Fall neigen jedoch die angesprochenen Nebenprodukte wegen ihrer ähnlichen chemischen Struktur mit den a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-

niedrigalkylestern dazu, Mischkristalle zu bilden. Somit ist es auch mit dieser Verfahrensweise kaum möglich, diese Nebenprodukte zu entfernen.

Bei einer weiteren bekannten Verfahrensweise zur Abtrennung dieser Nebenprodukte wird ein Anionenaustauscher-harz eines spezifischen Typs verwendet. Diese Verfahrensweise ist in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 35660/1977 beschrieben. Nach dieser Verfahrensweise werden die angesprochenen Nebenprodukte in einem wässrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscherharz des Acetat- oder Formiat-Typs in Kontakt gebracht, um diese Verunreinigungen durch Adsorption selektiv zu entfernen.

Es ist angegeben, dass es nicht möglich ist, die gewünschte Reinigungswirkung zu erreichen, wenn man ein anderes Anionenaustauscherharz als das der angegebenen Typen organischer Säuren verwendet, da die Verunreinigung des Dipeptidestermaterials, das heisst eines a-L-Aspartyl-L-phe-nylalanin-niedrigalkylesters, zunehmen würde, wenn man ein Anionenaustauscherharz eines solchen Typs verwenden würde.

Es besteht aber nach wie vor ein Bedürfnis zur Schaffung eines Verfahrens zur Reinigung von a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-niedrigalkylestern unter Verwendung eines Anionen-austauscherharzes.

Es wurde nunmehr gefunden, dass man die a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester in wirksamer Weise mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs reinigen kann, was angesichts der Tatsache als überraschend anzusehen ist, dass dies als unmöglich angesehen wird, es sei denn, man würde ein Anionenaustauscherharz in Form des Additionsprodukts mit einer schwachen organischen Säure einsetzen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern, das dadurch gekenn-, zeichnet ist, dass man den a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-nie-drigalkylesterin einem wässrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs in Kontakt bringt, um die Verunreinigungen durch Adsorption an dem Anionenaustauscherharz zu entfernen.

Erfindungsgemäss kann die Reinigung in wirksamster Weise unter Einsatz eines rohen a- L-Aspartyl- L-pheny 1-alanin-niedrigalkylesters erreicht werden, der mit Hilfe der oben angesprochenen Methode, bei der ein Enzym verwendet wird, hergestellt worden ist.

Im Gegensatz zu den a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrig-alkylestern, die mit Hilfe der oben angesprochenen chemischen Herstellungsweisen gebildet worden sind, enthalten die a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester, die mit Hilfe der enzymatischen Verfahrensweise synthetisiert worden sind, als Hauptverunreinigungen a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin und Diketopiperazinderivate und nur geringe Mengen anderer Verunreinigungen, die auf die Ausgangsmaterialien zurückgehen. Daher ist es für die in dieser Weise hergestellten a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester besonders wesentlich, a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und die Diketopiperazinderivate zu entfernen.

Wenn man einen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigal-kylester, der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und ein Diketopiperazinderivat enthält, mit einem Anionenaustauscherharz des Cl-Typs in einem wässrigen Lösungsmittel mit Hilfe der erfmdungsgemässen Verfahrensweise in Kontakt bringt,

wird der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester von dem Harz überhaupt nicht adsorbiert, während die Verunreinigungen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und das Diketopiperazinderivat von dem Harz adsorbiert werden.

Bei dem erfmdungsgemässen Verfahren kann man als Harz irgendein Anionenaustauscherharz des Cl-Typs ver2

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wenden. Es ist jedoch bevorzugt, ein stark basisches Anionenaustauscherharz einzusetzen.

Als wässriges Lösungsmittel verwendet man bei dem erfmdungsgemässen Verfahren Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem inerten organischen Lösungsmittel, das in Wasser löslich ist, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglykol, Dimethylformamid oder dergleichen.

Der Kontakt des Anionenaustauscherharzes mit der die Verunreinigungen enthaltenden Lösung des a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters kann in irgendeiner Weise erfolgen. Beispielsweise führt man die Lösung durch eine mit dem Harz gefüllte Säule oder bringt die Lösung und das Harz in einem Gefäss unter Rühren oder unter Bewegen miteinander in Kontakt.

Die Temperatur zum Zeitpunkt des Kontakts beeinflusst die Adsorption der Verunreinigungen nicht wesentlich. Jedoch stellt die Anwendung erhöhter Temperaturen ein Problem im Hinblick auf die Stabilität der a-L-Aspartyl-L-phe-nylalanin-niedrigalkylester dar. Demzufolge liegt die Temperatur vorzugsweise in einem Bereich von 0 bis 70°C.

Die Rückgewinnung des gereinigten a-L-Aspartyl-L-phe-nylalanin-niedrigalkylesters aus der mit dem Anionenaustauscherharz des C1 -Typs behandelten wässrigen Lösung kann in üblicher Weise erfolgen, beispielsweise durch eine normale Kristallisation. Wenn man eine Lösung des a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters mit relativ niedriger Konzentration behandelt, gewinnt man den a-L-Aspartyl-L-phe-nylalanin-niedrigalkylester beispielsweise durch Einengen und Abkühlen der Lösung. Wenn man eine relativ konzentrierte Lösung bei erhöhter Temperatur behandelt, kann man den «-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester durch einfaches Abkühlen der Lösung gewinnen.

Bei der Anwendung der oben angesprochenen Verfahrensweise, bei der ein Anionenaustauscherharz in Form eines Salzes mit einer schwachen organischen Säure eingesetzt wird, macht es der niedrige Dissoziationsgrad der schwachen organischen Säure erforderlich, eine grosse Menge der schwachen organischen Säure oder ihres Salzes in hoher Konzentration einzusetzen, wenn die adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz desorbiert werden sollen, um dieses wiederverwenden zu können. Zur Vermeidung dieser Nachteile ist es erforderlich, das Anionenaustauscherharz zunächst in die OH-Form zu überführen und dann wieder in das Salz der schwachen organischen Säure umzuwandeln.

Wenn man jedoch erfindungsgemäss das Anionenaustauscherharz des C1 -Typs verwendet, kann man dieses ohne weiteres mit Hilfe einer Chloridionen enthaltenden Lösung, wie einer Chlorwasserstoffsäurelösung oder einer Salzlösung, regenerieren.

Weiterhin werden bei Anwendung der erstgenannten Methode organische Säureionen, die eine grössere Affinität für den a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester besitzen, durch Ionenaustausch in die Lösung des behandelten ß-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylesters eingeführt. Im Gegensatz dazu werden bei der erfmdungsgemässen Verfahrensweise lediglich Chloridionen in die behandelte Lösung eingebracht, die ohne weiteres durch Kristallisation oder dergleichen abgetrennt werden können, so dass die Gewinnung des a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigal-kylesters ohne weiteres möglich ist.

Ein weiterer Vorteil des erfmdungsgemässen Verfahrens ist darin zu sehen, dass die Abwässer leichter beseitigt werden können, da diese keine organischen Säuren oder Salze davon enthalten.

Wie aus den obigen Ausführungen ohne weiteres hervorgeht, ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren in einfacher Weise die selektive Entfernung von Verunreinigungen, insbesondere der oben angesprochenen Diketopiper-azinderivate und von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin aus diese Verunreinigungen enthaltenden ß-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-niedrigalkylestern.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Die in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Analysenwerte wurden durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie ermittelt, die unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurde:

Vorrichtung:

Für a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester: Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 20 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-Gel LS-170) mit einer Korngrösse von 5 um gefüllt ist;

für a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und die Diketopiper-azinderivate:

Säule mit einem Innendurchmesser von 4,0 mm und einer Länge von 10 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-Gel IEX-210) mit einer Korngrösse von 5 [im gepackt ist, bzw. Säule mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 40 cm, die mit einem Chromatographiegel (TSK-Gel LS-170) mit einer Korngrösse von 5 um gepackt ist.

Elutionsmittel: Wässrige Natriumacetatlösung Strömungsgeschwindigkeit: 0,9 ml/min Messtemperatur: 25°C

Detektor: UV-Detektor («UVIDEC-III» der Firma Nippon Bunko K.K.)

Die Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von: 256 nm Beispiel 1

Man bereitet eine zu behandelnde Lösung durch Auflösen von 200 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxy-methyl-2,5-diketopiperazin) in 50 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man durch Auflösen von 220 mg eines rohen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylesters, der 9,1% des Diketopiperazinderivats enthält, erhält. Zu dieser Lösung gibt man 2,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-410) und rührt mit Hilfe eines Magnetrührers während 20 Minuten bei 30°C. Dann filtriert man die Reaktionslösung und wäscht das Harz mit 20 ml Wasser. Anschliessend unterwirft man die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen hochgeschwindigkeitschro-matographischen Analyse zur Bestimmung der enthaltenen Mengen an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und 3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin. Es zeigt sich, dass die Mischung 187 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-me-thylester und 0,70 mg des Diketopiperazinderivats enthält. Das Verhältnis der Menge des Diketopiperazinderivats zu der Gesamtmenge von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl-ester und dem Diketopiperazinderivat beträgt 0,37%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 93,5%.

Beispiel 2

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 400 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 20 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 20 mg a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin in 100 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält, wenn man rohen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, der 4,5% des Diketopiperazinderivats und 4,5% a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält, löst. Zu

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dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amber-lite IRA-900). Man rührt in einem Inkubator während 20 Minuten bei 30°C. Dann filtriert man die Reaktionslösung und wäscht das Harz mit 50 ml Wasser. Anschliessend unterwirft man die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser der oben angesprochenen Analysenmethode, wobei sich zeigt, dass die Mischung 398 mg a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-niedrigalkylester, 1,1 mg des Diketopiperazinderivats und 1,4 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Verhältnisse der enthaltenen Mengen des Diketopiperazins bzw. von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin zu der Gesamtmenge von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazin-derivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 0,27% bzw". 0,35%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 99,5%.

Beispiel 3

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen. Diese Lösung versetzt man mit 4,0 g (Trockengewicht) eines Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-410). Dann führt man die anschliessenden Bëhandlungsmass-nahmen nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 durch. Die Analysenergebnisse zeigen, dass die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 383 mg a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-methylester und 1,0 mg des Diketopiperazinderivats enthält, während keine merklichen Mengen an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin festzustellen sind. Der Gehalt an dem Diketo-piperazinderivat, bezogen auf die Gesamtmenge von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester und Diketopiper-azinderivat beträgt 0,26%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 95,8%.

Beispiel 4

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 400 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 40 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyI-2,5-diketopiperazin) und 40 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 100 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung von rohem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl-ester, der jeweils 9,33% des Diketopiperazinderivats bzw. a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-410) und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch. Die Analysenergebnisse zeigen, dass die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 400 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 1,8 mg des Diketopiperazinderivats und 2,3 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Gehalte an dem Diketopiperazinderivat und an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 0,45% bzw. 0,57%. Der a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl-ester wird quantitativ zurückgewonnen.

Beispiel 5

Man beschickt eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von 12 mm mit 10 g (Trockengewicht) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes des Cl-Typs (Amberlite IRA-410), das ein Volumen von 18,3 ml in der Säule ausfüllt. Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 5,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methyl-ester, 100 mg eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-car-boxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 100 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin in 400 ml Wasser. Die Lösung entspricht einer Lösung von rohem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-me-

thylester, der jeweils 1,9% des Diketopiperazinderivats und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält.

Man lässt die zu behandelnde Lösung bei einem SV von 12 und bei einer Temperatur von 29°C durch die Harzsäule dringen. Dann wäscht man das Harz mit 100 ml Wasser. Man teilt einen Teil der in dieser Weise erhaltenen Lösung in aliquote Anteile auf und unterwirft diese der Analyse in der oben angegebenen Weise. Es zeigt sich, dass die durch die Säule geführte Lösung 5,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (100% Ausbeute) enthält, während weder das Diketopiperazinderivat noch a-L-Aspartyl-L-phenylalanin nachgewiesen werden können. Die in dieser Weise erhaltene, durch die Säule geführte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 255 g des Lösungsmittels durch Destillation entfernt. Anschliessend lässt man den Rückstand durch Kühlen über Nacht im Kühlschrank kristallisieren. In dieser Weise erhält man 2,49 g (49,8%) kristallinen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester. In den Kristallen lassen sich weder das Diketopiperazinderivat noch a-L-Aspartyl-L-phenylalanin nachweisen.

Beispiel 6

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 5,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 100 mg eines Diketopiperazinderivats (3-BenzyI-6-carboxymethyl-2,5-diketopiperazin) und 100 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin in einer Mischung aus 350 ml und 50 ml Methanol. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man durch Auflösen von rohem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester erhält, der jeweils 1,9% des Diketopiperazinderivats und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Man behandelt diese Lösung nach der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung von 10 g des in Beispiel 5 eingesetzten Harzes.

Die Analyse der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigt, dass sie 4,87 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester (97,5%) enthält, während sich in der Lösung weder a-L-Aspartyl-L-phenylalanin noch das Diketopiperazinderivat feststellen lassen.

Man engt die durch die Säule geführte Lösung durch Destillation unter vermindertem Druck ein und kühlt sie nach der Abtrennung von 237 g des Lösungsmittels in einem Kühlschrank über Nacht zur Kristallisation ab. In dieser Weise erhält man 2,90 g (57,9%) a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-methylester in Form von Kristallen, in denen sich weder a-L-Aspartyl-L-phenylalanin noch das Diketopiperazinderivat nachweisen lassen.

Beispiel 7

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der in Beispiel 2 beschriebenen. Zu dieser Lösung gibt man 4,0 g (Trockengewicht) eines mässig basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-68), das in die Hydrochlorid-Form überführt worden ist, und führt die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.

Die Analysenwerte zeigen, dass die erhaltene Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 393 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 14,4 mg des Diketopiperazinderivats und 6,5 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Verhältnisse des Gehalts an dem Diketopiperazinderivat und an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 3,5% bzw. 1,6%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 97,5%.

Beispiel 8

Man bereitet eine Behandlungslösung der gleichen Zusammensetzung wie der von Beispiel 2. Zu dieser Lösung gibt

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man 4,0 g (Trockengewicht) eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IR-45), das in die Hydro-chlorid-Form überführt worden ist. Dann führt man die Behandlung in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise durch.

Die Analysenergebnisse zeigen, dass die Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser 390 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 6,3 mg des Diketopiperazinderivats und 4,9 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin enthält. Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die Gesamtmenge an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 1,6% bzw. 1,2%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 97,5%.

Beispiel 9

Man bereitet eine Behandlungslösung durch Auflösen von 4,0 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 100 mg L-Asparaginsäure und 100 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure in 400 ml Wasser. Diese Lösung entspricht einer Lösung, die man erhält, wenn man rohen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, der jeweils 2,4% L-Asparagin-säure bzw. N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure enthält, auflöst. Die Behandlungslösung wird mit 14 g des in Beispiel 5 verwendeten Harzes unter Anwendung der Verfahrensweise von Beispiel 5 behandelt.

Die Analysenwerte der in dieser Weise erhaltenen, durch die Säule geführten Lösung zeigen, dass die Lösung 3,96 g (99%) a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester enthält, während sich weder L-Asparaginsäure noch N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginsäure nachweisen lassen.

Beispiel 10

Man bildet N-Benzyloxycarbonyl-a-L-aspartyl-L-phenyl-alanin-methylester durch Kondensieren von N-Benzyloxy-carbonyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalanin-methylester unter Verwendung von Thermoase, einem proteolytischen Enzym. Anschliessend bildet man durch Abspalten der Ben-zyloxycarbonylgruppe durch eine Hydrogenolysereaktion

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316 g einer wässrigen Lösung von a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-methylester. Diese Lösung enthält 25,10 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, 0,533 g eines Diketopiperazinderivats (3-Benzyl-6-carboxymethyl-2,5-5 diketopiperazin), 0,249 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,055 g L-Asparaginsäure, was einer wässrigen Lösung eines rohen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylesters entspricht, der 2,0% des Diketopiperazinderivats, 0,94% a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 0,21 % L-Asparaginsäure enthält, io entspricht.

Man beschickt ein zylindrisches Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 2 cm mit 15,5 g (Trockengewicht)

eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-410) des Cl-Typs. Man bringt die oben beschriebene 15 Behandlungslösung mit Wasser auf ein Gesamtgewicht von 674 g. Man führt dann die Lösung bei einer Temperatur von 55°C mit einer SV von 5,2 durch die Harzsäule. Nach dem Hindurchführen der Lösung wäscht man die Harzsäule mit 65 ml Wasser. In dieser Weise erhält man 719 g eines 20 Abstroms aus der durch die Säule geführten Lösung und dem Waschwasser, den man über Nacht zur Kristallisation in einem Kühlschrank stehen lässt. Man filtriert die gebildeten Kristalle ab und wäscht sie mit 36 ml Wasser, wobei man 19,6 g (78,0%) kristallinen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-me-25 thylester erhält. Die Kristalle enthalten 25 mg des Diketopiperazinderivats und 8 mg a-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Die zurückbleibende Mischung aus dem Filtrat und dem Waschwasser enthält 5,24 g a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-me-thylester, 28 mg des Diketopiperazinderivats und 7 mg 30 a-L-Aspartyl-L-phenylalanin. Weder in den Kristallen noch in der Filtratmischung lässt sich L-Asparaginsäure nachweisen.

Die Verhältnisse der Gehalte an dem Diketopiperazinderivat bzw. an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin, bezogen auf die 35 Gesamtmenge an in dem Abstrom enthaltenem a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Diketopiperazinderivat und a-L-Aspartyl-L-phenylalanin betragen 0,2% bzw. 0,1%. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 98,8%.

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Claims

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1. Verfahren zur Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylestern, dadurch gekennzeichnet, dass man den a-L-Aspartyl-L-phe-nylalanin-niedrigalkylester in einem wässrigen Lösungsmittel mit einem Anionenaustauscher des Cl-Typs in Kontakt bringt, hierdurch die Verunreinigungen an das Anionen-austauscherharz adsorbiert und dem a-L-Aspartyl-L-phenyl-alanin-niedrigalkylester in gereinigtem Zustand gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die niedrigmolekulare Alkylgruppe des a-L-Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester eine Methylgruppe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässriges Lösungsmittel eine wässrige Lösung verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als wässriges Lösungsmittel eine wässrige Methanollosung verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zu beseitigenden Verunreinigungen a-L-Aspartyl-L-phenylalanin und 3-Benzyl-6-carboxy-methyl 1-2,5-diketopiperazin umfassen.