CH629799A5

CH629799A5 - Verfahren zur herstellung von amiden der pseudomonsaeure.

Info

Publication number: CH629799A5
Application number: CH209177A
Authority: CH
Inventors: Norman Harold Rogers
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1976-02-20
Filing date: 1977-02-18
Publication date: 1982-05-14
Also published as: JPS52102279A; GB1565083A; NL7701727A; IE44445B1; FR2349584A1; IE44445L; DK73777A; SE431649B; ZA77772B; BE851410A; SE7701722L; DK145823C; US4139629A; DK145823B; FR2349584B1; DE2706548A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Amiden der Pseudomonsäure die eine antibakterielle Wirksamkeit gegenüber bestimmten grampo- 30 sitiven und gramnegativen Organismen, insbesondere Hae-mophilis influenzae und Neisseria gonorrhoeae, aufweisen. Des weiteren besitzen die Verbindungen eine gute antimyco-plasmale Aktivität. Aus diesem Grunde sind sie wertvoll bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen auf dem Veteri- 35 närgebiet und ganz besonders in der Humanmedizin bei der Behandlung von Bronchitis und venerischen Erkrankungen.

Als gewohnheitsmässige Behandlung bei Gonorrhoeae galt lange Jahre die Verwendung von Antibiotika auf Basis von Penicillinen.

Jedoch sind einige Gonokokkenstämme gegenüber den Penicillinen weniger empfindlich, und der Grad einer solchen Resistenz nimmt allmählich zu, so dass höhere Dosen von Penicillinen erforderlich sind. Des weiteren ist von 45 Stämmen berichtet worden, die Penicillinase erzeugen und dadurch in hohem Masse gegenüber einer Penicillintherapie

40

resistent sind.

Im British Medicai Journal (1976) ist auf Seite 963 sinngemäss folgender Kommentar erschienen: «Jetzt haben sich die Aussichten zur Bekämpfung der Gonorrhoeae grundlegend verschlechtert, da überraschenderweise die Existenz von ausgesprochen resistenten Stämmen bekannt geworden ist,

deren Resistenz auf der Erzeugung von Penicillinase, einem Penicillin zerstörenden Enzym, beruht, welch letzteres auch in zahlreichen anderen Bakterienarten aufgefunden worden ist. Dies stellt eine völlig neue Entwicklung dar, deren Folgen sehr verhängnisvoll sein können.»

Es ist jetzt eine neue Klasse von Verbindungen gefunden worden, die eine hohe Wirksamkeit gegeüber zahlreichen Organismen, einschliesslich Neisseria gonorrhoeae, besitzen und als Verbindungen keinerlei verwandte Beziehungen zu den Antibiotika vom ß-Lactam-Typ, einschliesslich Penicillinen und Cephalosporinen, besitzen und die durch Penicillinase in keiner Weise beeinflusst werden.

Es handelt sich um Verbindungen der Pseudomonsäure, dem E-Isomeren der nachstehenden Formel I:

C02(CH2)gCO^H

(I)

deren antibakterielle Wirksamkeit in der GB-PS 1 395 907 beschrieben ist. Es ist jetzt gefunden worden, dass bestimmte Amide der Pseudomonsäure eine niedrigere Serumbindung als die Säure selbst besitzen und darüber hinaus wirksamer gegenüber bestimmten Organismen, insbesondere Neisseria gonorrhoeae, sind.

6S Gegenstand vorliegender Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung von Amiden der Pseudomonsäure der Formel

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in der R1 und R2 gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome oder Alkylreste bedeuten.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Patentanspruch 1 definiert.

Beispiele für die Alkylreste sind solche mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie die Methyl-, Äthyl-, n- und Isopropyl- und die n-, iso- und tert-Butylgruppe.

Besondere Amidreste -CO.NR'R2 sind das unsubstituierte Amid (-CONH2), das N-Methylamid, das N,N-Dimethyl-amid und das N,N-Diäthylamid.

Die Verbindungen der Formel II können alternativ aus Pseudomonsäure der Formel I durch an sich bekannte Verfahren zur Herstellung von Amiden von Carbonsäuren oder aus einem reaktionsfähigen Derivat der Pseudomonsäure durch Umsetzung mit einem Amin der Formel R'R2.NH hergestellt werden. Bevorzugte reaktionsfähige Derivate sind gemischte Anhydride, die beispielsweise mit Isobutylchlor-formiat, Äthylchlorformiat, Pivaloylchlorid oder anderen Substanzen zur Erzeugung gemischter Anhydride gebildet werden. Andere N-acylierende Derivate der Pseudomonsäure sind z.B. deren aktivierte Ester, beispielsweise mit Cya-nomethanol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, Thiophenol, Halogenphenol, wie Pentachlorphenol, ferner Monometh-oxyphenol oder 8-Hydroxychinolin, des weiteren Amide, wie N-Acylsacharine oder N-Acylphthalimide, sowie schliesslich Alkyliden-iminoester, die durch Umsetzung der Pseudomonsäure mit einem Oxim hergestellt worden sind.

Einige aktivierte Ester, beispielsweise die mit 1 -Hydroxy-benztriazol oder mit N-Hydroxy-succinimid gebildeten, können in situ durch Umsetzen der Säure mit der entsprechenden Hydroxyverbindung in Gegenwart eines Carbodii-mids, vorzugsweise des Dicyclohexycarbodiimids, hergestellt werden.

Beispiele anderer reaktionsfähiger Derivate der Pseudomonsäure sind die reaktionsfähigen Zwischenprodukte, die durch Umsetzen in situ mit einem Kondensationsmittel, wie einem Carbodiimid, hergestellt worden sind, beispielsweise mit N,N-Diäthyl-, N,N-Dipropyl- oder N,N-Diisopropyl-carbodiimid, N,N'-Di-cyclohexylcarbodiimid oder mit N-Äthyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid. Eine besonders zweckmässige Carbonylverbindung ist beispielsweise das N,N'-Carbonyldiimidazol oder das N,N'-Carbonyldi-triazol.

Beispiele geeigneter Lösungsmittel für das Verfahren vorliegender Erfindung sind inerte aprotonische Lösungen, wie Tetrahydrofuran, Methylendichlorid oder N,N-Dimethyla-cetamid. Die Umsetzung wird gewöhnlich bei niedriger Temperatur, beispielsweise bei —25°C bis 0°C, vorzugsweise bei etwa - 10°C, durchgeführt.

Die antibiotisch wirkenden Verbindungen der Formel II können zur Verabreichung in beliebiger üblicher Weise zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin analog anderer Antibiotika formuliert werden. Es können somit pharmazeutische und/oder veterinärmedizinische Präparate

15 hergestellt werden, die mindestens ein Amid der Pseudomonsäure der Formel II sowie gegebenenfalls pharmakologisch verträgliche, übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und/ oder Excipientien enthalten.

Derartige Präparate können zur Verabreichung auf jedem 20 beliebigen Wege formuliert werden, obgleich die orale Verabreichung bevorzugt wird. Demzufolge können die Präparate in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Pastillen oder flüssigen Zubereitungen, beispielsweise als orale oder sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen, 25 vorliegen.

Tabletten oder Kapseln für eine orale Verabreichung können in Form von Einzeldosierungen vorliegen und übliche Excipientien enthalten, wie Bindemittel, beispielsweise Sirup, Akaziengummi, Gelatine, Sorbit, Traganth oder 30 Polyvinylpyrrolidon; ferner Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; des weiteren Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthy-lenglykol oder Siliciumdioxid; weiterhin Zerfallhilfsmittel, wie Kartoffelstärke; oder schliesslich pharmakologisch unbe-35 denkliche Netzmittel, wie Natrium-laurylsulfat. Die

Tabletten können nach Methoden, die in der üblichen pharmazeutischen Praxis an sich bekannt sind, überzogen sein. Orale flüssige Zubereitungen können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen 40 oder Elixieren, vorliegen oder können als Trockenprodukte zur Rekonstituierung mit Wasser oder anderen geeigneten Vehikeln vor Gebrauch angeboten werden. Derartige flüssige Zubereitungen können übliche Zusatzstoffe, wie Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbit, Sirup, Methylcellulose, 45 Glucosesirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxy-methylcellulose, Aluminiumstearatgel oder gehärtete Speiseöle; ferner Emulgiermitel, beispielsweise Lecithin, Sor-bintan-monooleat oder Akaziengummi; des weiteren nicht wässrige Vehikel, die Speiseöle umfassen können, beispiels-50 weise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, wie von Glycerin, Propylenglykol oder Äthanol, ferner Konservierungsmittel, beispielsweise p-Hydroxy-benzoesäure-me-thylester oder -propylester oder Sorbinsäure sowie gegebenenfalls übliche Geschmackskorregentien oder Farbstoffe, 55 enthalten.

Suppositorien enthalten z.B. übliche Suppositorien-Grundbasen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride.

Für eine parenterale Verabreichung können flüssige Einzeldosen unter Verwendung der Verbindungen der Formel II 60 und eines sterilen Vehikels hergestellt werden, wobei Wasser bevorzugt wird. Je nach dem verwendeten Vehikel oder der angewendeten Konzentration kann die Verbindung der Formel II entweder suspendiert oder dispergiert in dem Vehikel vorliegen. Bei der Herstellung von Lösungen kann 65 die Verbindung der Formel II in Wasser für Injektionszwecke gelöst und durch Filtrieren sterilisiert werden, bevor ein Abfüllen in Fläschchen oder Ampullen und ein Ver-schliessen erfolgt. Vorteilhafterweise können in dem Vehikel

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Adjuvantien, wie Lokalanästhetika, Konservierungsstoffe und/oder Puffersubstanzen, gelöst sein. Um die Stabilität zu erhöhen, können die Arzneimittel nach dem Abfüllen in Fläschchen oder Ampullen gefroren und das Wasser unter vermindertem Druck entfernt werden. Das trockene, lyophi- s lisierte Pulver kann dann in einem Fläschchen oder einer Ampulle eingesiegelt werden, dem ein Fläschchen oder eine Ampulle für Injektionszwecke zur Rekonstituierung der Flüssigkeit von deren Verwendung beigefügt werden kann. Parenterale Suspensionen können praktisch in der gleichen 10 Weise hergestellt werden, mit der Massgabe, dass die Verbindung der Formel II in einem Vehikel suspendiert anstatt gelöst wird und dass die Sterilisierung nicht mit einer Filtration verbunden wird. Die Sterilisierung der Verbindung der Formel II kann durch Einwirkung von Äthylenoxid vor dem is Suspendieren in dem sterilen Vehikel erfolgen. Vorzugsweise wird bei den Präparaten zur Erleichterung einer gleichmäs-sigen Verteilung der Verbindung der Formel II eine grenzflächenaktive Verbindung oder ein Netzmittel mitverwendet.

Die pharmazeutischen und/oder veterinärmedizinischen 20 Präparate können 0,1 bis 99 Gewichtsprozent, vorzugsweise 10 bis 60 Gewichtsprozent Aktivsubstanz, je nach der Verabreichungsmethode enthalten. Wenn die Präparate aus Einzeldosierungen bestehen, enthält jede Dosis vorzugsweise 50 bis 500 mg Aktivsubstanz. Bei einer Behandlung von erwach- 25 senen Menschen liegt die angewendete Tagesdosis bei 100 bis 3000 mg, beispielsweise bei 1500 mg, je nach dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

30

Beispiel 1

Pseudomonsäure-N-methylamid

522 mg (1 mMol) des Natriumsalzes der Pseudomonsäure werden in 10 ml wasserfreiem, frisch destilliertem N,N-Dimethylacetamid gelöst. Die Lösung wird auf — 10°C 35 gekühlt. Zu der Lösung werden dann 0,13 ml (1 mMol, p = 1,04) Isobutylchlorformiat gegeben. Die Lösung wird 10 Minuten lang bei einer Temperatur von — 10°C gehalten. Anschliessend werden 3,1 ml (1 mMol) einer 1-gewichtspro-zentigen Lösung Methylamin in Wasser, bezogen auf das 40 Volumen, rasch zugegeben, und die Lösung wird eine weitere Stunde lang gerührt, während man die Temperatur allmählich auf Zimmertemperatur ansteigen lässt. Dann giesst man das Gemisch in etwa 50 ml Wasser, sättigt das Gemisch mit Natriumchlorid und extrahiert es viermal mit je 20 ml 45 Äthylacetat. Die Äthylacetatextrakte werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Ausbeute: 304 mg. Die Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch von 9 so Teilen Chloroform und 1 Teil Methanol zeigt einen Hauptfleck Rf = 0,3 mit einer Spur Pseudomonsäure Rf = 0,21 und sehr geringen Spuren bei Rf = 0,40 und 0,47. Die Substanz wird auf einer 2 mm dicken Platte aus Siliciumdioxid (HF 254 Merck) mit den Ausmassen 20 x 20 cm chromatogra- ss phiert und mit Chloroform mit einem Gehalt von 15 Prozent Methanol eluiert. Die Bande bei einem Laufwert Rf = 0,35 (unter U.V.-Licht) wird entfernt und aus dem Siliciumdioxid mit Chloroform mit einem Gehalt von 20 Prozent Methanol eluiert. Dieerhaltene ölige Substanz wird in Äthylacetat gelöst«» und gründlich mit einer wässrigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 127 mg der Substanz als Öl. 65

Die Dünnschichtchromatographie zeigt eine einheitliche Substanz bei einem Rf-Wert von 0,33 in einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis 9:1.

NMR-Spektrum in CDCh (H-Atome): 8 = 0,92 (3H,d,12-CH3); l,20(3H,d,13-CH3); 9,30 (Methylengruppe im «Ring»); 2,18 (3H,s, vinylisches CH3); 2,70 (m, Epoxid-Protonen); 2,76 (3H,d,N-CH3); 5,75 (1H, breites Sin-gulett, vinylisches H); 6,23 (-NH-).

NMR-Spektrum in CDCh (C-Atome):

174,20 (l'-C,s,); 166,95 (1-C,s); 156,95 (1-C,s); 156-97 (3-C,s,); 117,71 (2-C,d); 75,07 (5-C,d); 71,47 (13-C,d); 70,60 (7-C,d); 69,11 (6-C,d); 65,43 (16-C,t); 63,83 (9'-C,t); 61,38 (11-C,d); 55,710 (10-C,d); 42,94 (4-C und 12-C, zwei Dubletts); 39,68 (8-C,d); 36,74 (2'-C,t); 31,72 (9-C,d,); 29,139 (4',5' und 6'-C); 28,63 (8'-CO; 26,35 (N-CH3,q); 26,00 (7'-C,d); 25,73 (3'-C); 20,84 (14-C,q); 19,23 (15-C,q) und 12,75 (17-C,q).

IR-Spektrum in CDCh:

v max; 3400 (OH stark), 3300 (NH stark) 1690 (C=0 stark, (Ester), 1650 und 1540 (C=0 Amid I und C=C), 1510 (Amid II)cnr'

UV-Spektrum:

X max 222 nm (e = 10,700).

Massenspektrum:

m/e: 513 (M+), 495 (-H2O), 269 (>-CH2C02(CH2)sC0NH-CHs), 227.

Für C27H47NO8:

Ber.: M+513,3301422,

gef.: 513,3297200.

Beispiel 2

Pseudomonsäureamid

522 mg (1 mMol) des Natriumsalzes der Pseudomonsäure werden in 10 ml wasserfreiem, frisch destilliertem N,N-Dimethylacetamid gelöst. Die Lösung wird auf -15°C gekühlt. Dann werden 0,13 ml (1 mMol; p = 1,04) Isobutylchlorformiat zugegeben, und die Temperatur wird 10 Minuten lang auf -15°C gehalten. Anschliessend gibt man 2,0 ml (> 1 mMol) einer einprozentigen wässrigen Ammoniaklösung hinzu und rührt das Gemisch 90 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Anschliessend verdünnt man das Gemisch mit etwa 75 ml Wasser, sättigt es mit Natriumchlorid und extrahiert es viermal mit je 15 ml Äthylacetat. Die Äthylacetatextrakte werden mit Kochsalzlösung und wässriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird eingedampft, und man erhält 269 mg eines schwachgefärbten Öls. Die Dünnschichtchromatographie in einem Gemisch von 9 Teilen Chloroform und 1 Teil Methanol zeigt eine Hauptkomponente bei Rf = 0,25 und Spuren von Verunreinigungen bei Rf = 0,18 und 0,3. Die Substanz wird auf eine 2 mm dicke Platte aus Siliciumdioxid mit den Abmessungen 20 x 20 cm aufgebracht und mit Chloroform mit einem Gehalt von 15 Prozent Methanol eluiert.

Die der Hauptkomponente entsprechende Bande wird entfernt und aus dem Siliciumdioxid mittels Chloroform mit 50 Prozent Methanol eluiert. Nach dem Eindampfen erhält man 164 mg eines farblosen Öls. Die Dünnschichtchromatographie mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Verhältnis 9:1 zeigt eine Komponente mit einem Rf-Wert von 0,4.

NMR-Spektrum in CDCb (H-Atome): 5 = 0,90 (3H,d,12-CH3); l,19(3H,d,13-CH3); 1,31 (Methylengruppe im «Ring»); 2,19 (3H,s,vinylische CH3); 2,70 (Multiple«, Epoxid-Protonen und 4-CH2); 4,08 (2H,t,9'-CH); 5,76 (lH,s,vinylisches H) und 5,83 (2H, breit, CONH2);

5

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IR-Spektrum in CDCh: v max:

3450 (OH stark), 3350 (NH stark), 1700 (C=0-Ester), 1650 -1670 (Amid I, und C=C), 1600 (Amid II) cm-1;

UV-Spektrum X max.:

222 nm (e = 9 230)

Brechungsindex:

[a] $ = 5,02° (c = 0,6 in CHCb).

Massenspektrum:

m/e 499 (M+), 481 (-H2O) 255 (> -CH2CO2- (CH2>CONH), 227

Für C26H45NO8

Ber.:499,3144930,

gef.: 499,3137700.

Beispiel 3

Pseudomonsäure-N,N-dimethylamid 2,09 g (4 mMol) des Natriumsalzes der Pseudomonsäure werden in 10 ml waserfreiem, frisch destilliertem N,N-Dime-thylacetamid gelöst. Die Lösung wird unter Rühren auf -10°C gekühlt. Zu der Lösung werden 0,53 ml (4 mMol) Isobutylchlorformiat gegeben, und die Temperatur wird 10 Minuten lang auf-10°C gehalten. Dann werden 4,2 ml (1 Mol) Dimethylamin in Wasser zugegeben. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 0°C und 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird der erhaltene Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit Natriumbicarbonat-lösung und Kochsalzlösung gewaschen, über waserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 1,197 g eines Öls. Die Dünnschichtchromatographie und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestätigen, dass die Verbindung homogen ist. Das Öl beginnt zu kristallisieren, und beim Verreiben mit wasserfreiem Äther erhält man 776 mg eines weissen Feststoffes vom Fp. 82 bis 85°C.

NMR-Spektrum in CDCh (H-Atome)

5 = 5,70 (lH,s, vinylisches H); 4,03 (2H,t, 9'-CH2); 2,98 und 2,90 (zwei Singuletts je 3H, CON(CH3)2); 2,70 (Multipletts, Epoxid-Protonen H10 und H11,4-CHz); 2,17 (3H,s, vinylisches CH3); 1,31 (Methylengruppe im «Ring»); 1,19 (3H,d, 13-CH3) und 0,91 (3H,s, 12-CHs).

IR-Spektrum v max (CHCh):

3450 (OH stark), 2950,1710 (Ester-C=0), 1615 (breit, C=C und C=0-Amid)cnr'.

UV-Spektrum in Äthanol X max:

219 nm (e 14700).

Brechungsindex:

[a] 2d° = -6,88° (c = 1,0 in CHCh).

Massenspektrum:

M/e 527 (M+), 509 (-H2O), 509 - N(CHs)2).

M+ für C28H49NO8:

Ber.:527,347132 gef.: 527,347132.

Biologische Daten a) Antibakterielle Aktivität gegenüber grampositiven Organismen

Die Tabelle 1 zeigt die Mindesthemmkonzentrationswerte in ug/ml der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 gegenüber 6 grampositiven Organismen:

Tabelle I

Mindesthemmkonzentration (jig/ml)

Organismus Verbindung des

Beispiels 1 Beispiels 2

B. Subtilis

0,25

Staph. aureus Oxford

0,5

Staph. aureus Russell

1,25

1,0

Staph. aureus 1517

1,25

2,5

Strep. faecalis

125

100

ß-Haemolytic Strep. CN10

0,1

b) Aktivität gegenüber Neisseria gonorrhoeae Die Tabelle II zeigt die Mindesthemmkonzentrationswerte in (ig/ml* der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 gegenüber 12 Stämmen von Neisseria gonorrhoeae im Vergleich zu Benzylpenicillin:

Tabelle II

Stamm

Benzylpenicillin

Verbindung des Beispiels 1

Beispiels 2

VDRL 67

0,05

0,002

69

0,1

0,002

70

0,1

0,005

72

0,2

0,01

77

0,1

0,005

0,02

82

0,5

0,05

87

0,01

0,005

AR 229

1,0

0,05

2176

0,2

0,02

H2057

0,005

WHOVII

0,005

0,002

VD 79

0,2

0,02

Oxford Staph. 0,02

0,05

* Verdünnungsreihe in lOprozentigem Pferdeblutagar.

24stündige Inkubation bei 37°C in einer partiellen Atmosphäre von CO2. Beimpft mit einem Tropfen (0,001 ml) einer Zellsuspension über Nacht.

c) Aktivität gegenüber Mycoplasma Die Tabelle III zeigt die antimycoplasmalen Aktivitäten, ausgedrückt als Mindeshemmkonzentrat der Verbindungen der Beispiele 2 und 3, wobei sich zeigt, dass beide Verbindungen eine gute antimycoplasmale Aktivität in vitro gegenüber Mycoplasma aus menschlichen und tierischen Quellen besitzen.

Das angewendete Verfahren zur Prüfung auf eine antimycoplasmale Aktivität ist wie folgt:

Die Mindesthemmkonzentration der Pseudomonsäure-amide wird in Mikrotiterplatten durch eine Modifikation des Stoffwechsel-Hemmtests nach Taylor-Robinson, 1967, bestimmt. Die Verbindungen werden in einer Reihe mit sterilem, voll entsalztem Wasser verdünnt, wodurch man Konzentrationsbereiche von 250 bis 0,5 (ig/ml erhält. Die Myco-plasma-Kulturflüssigkeit, die 1 Gewichtsprozent Glucose und 0,005 Gewichtsprozent Phenolrot enthält, wird in einer Stärke zugesetzt, um die Verdünnung durch die wässrige s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

629 799

Lösung der Verbindungen auszugleichen. Zu jeder Konzentration der betreffenden Verbindung werden annähernd 104 Mycoplasmaeinheiten bildende Kolonien zugesetzt. Auf jeder Platte werden verbindungsfreie, jedoch infizierte, ferner nicht infizierte Stellen und schliesslich Stellen zur pH-Kontrolle vorgesehen. Die Platten werden mit Zellglasstreifen geschlossen und 7 Tage lang bei 37°C inkubiert. Die Mindesthemmkonzentration ist die niedrigste Konzentration einer Verbindung, die eine Farbänderung bei der

Mycoplasma-Kulturflüssigkeit verhindert, die durch den Glucosestoffwechsel durch das Mycoplasma verursacht wird.

Literatur:

Taylor-Robinson, D., 1967 «Mycoplasmas of various hosts and their antibiotic sensitivities», Post. Grad. Med. J., 43 Suppl. (März), Seite 100.

Tabelle III

Mindesthemmkonzentration (ug/ml)

Verbindung des Beispiels

Quelle -

Hühnchen

Maus

Rinder

Schwein

Menschen

M. Gallisepticum M.synoviae S6 ATCC 25204

M. pulmonis M. agalactiae M. dispar M. M. pneumoniae M.fermentans

«JB» ATCC 25025 H 225 suipneumoniae 429 a MWKL 4

(Laber)

2

3

<0,5 <0,5

<0,5 3,9

250 250

<0,5 <0,5

d) Serumbindung

Der Bindungsgrad der Verbindungen der Beispiele 1 und 2 an menschliches Serum im Vergleich zum Bindungsgrad mit Pseudomonsäure wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt:

Die zu untersuchenden Proben werden mit menschlichem Serum vermischt und in ein Kunststoffröhrchen («VisKing») gefüllt. Die Serumbindung wird mittels Ultrafiltration bestimmt. Das erhaltene Filtrat wird mittels der Lochplattenmethode unter Verwendung von Bacillus sub-tilis ATCC 633 in einer 0,05 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gegenüber einem Standard untersucht.

25 Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Verbindung

Prozent ungebunden in menschlichem Serum

Beispiel 1

20

Beispiel 2

14

Pseudomonsäure

Probe 1

6,6

Probe 2

6,8

B

Claims

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2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R1 und R2 Wasserstoff oder Alkyl mit 1 —6 C-Atomen bedeuten.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Amiden der Pseudomon säure der Formel

OH

(CH2) gCO.NR1*2

(II)

OH

worin R1 und R2 gleich oder verschieden Wasserstoff oder 15 Wasserstoff bedeuten.

Alky] bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man Pseudo-monsäure oder ein reaktionsfähiges Derivat davon mit einem Amin der Formel R'R2NH umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei R1 und R2 beide

20
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei R1 Wasserstoff und R2 Methyl bedeuten.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei R1 und R2 beide Methyl bedeuten.
6. Nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte Amide der Pseudomonsäure.