CH526632A - Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium - Google Patents

Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium

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CH526632A
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Description


  
 



  Verfahren zur   Züchtung    von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, zu dem während der Züchtung als Kohlenstoff lieferndes Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff zugegeben wird. Das erfindungsgemässe Verfahren wird unter aeroben Nährungsbedingungen unter Verwendung von Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe oxydieren, durchgeführt.



   Mikrobiologische Verfahren, bei denen als Kohlenstoff lieferndes Material Kohlenwasserstoffe verwendet werden und als Mikroorganismen solche eingesetzt werden, die imstande sind, die Kohlenwasserstoffe zu oxydieren, wobei dann die bei diesem Verfahren gebildeten Oxydationsprodukte gewonnen werden, sind schon von zahlreichen Autoren untersucht worden. Kürzlich wurde ein umfassender Überblick über dieses Thema in dem Lehrbuch  Advances in Enzymology  Vol. 27, Seiten 469-546 (Interscience Publishers, 1965) veröffentlicht.



  Viele Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle benutzen und einige dieser Mikroorganismen wandeln den Kohlenwasserstoff zu Stoffwechsel-Zwischenprodukten um, die sich in der Gärmischung anreichern, anstatt dass sie den Kohlenwasserstoff entweder zu Zellbestandteilen oder in Kohlendioxyd und Wasser umwandeln. Zahlreiche Arten oxydierter Kohlenwasserstoffprodukte wurden in solchen Fermentationsreaktionen produziert, beispielsweise Mono- und Dicarbonsäuren, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Ester, Phenole und Catechine, und solche Produkte können häufig als ein Ergebnis der Tätigkeit der Mikroorganismen angereichert werden. Mikroorganismen, die dazu in der Lage sind, sind u. a. Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Actinomyceten.

  Arten, in denen kohlenwasserstoffverbrauchende Mikroorganismen, die in der Lage sind, sauerstoffenthaltende Umwandlungsprodukte zu produzieren, vorkommen, sind Micrococcus, Corynebacterium, Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium, Streptomyces, Aspergillus und Acetobacter.



   Die Oxydation von Kohlenwasserstoffen durch mikrobiologische Vergärung, wie sie bisher durchgeführt wurde, enthielt in der Regel keine spezielle Kontrolle der Zugabe des Kohlenwasserstoffs zu der Fermentationsmischung. Im allgemeinen wird ein wässriges Nährmedium, das geeignete Nährsalze und Spurenelemente enthält, in ein Gärgefäss gegeben, das mit einer Rührvorrichtung und mit einer Vorrichtung für die Belüftung versehen ist, die Mischung wird mit einem ausgewählten kohlenwasserstoffoxydierenden Mikroorganismus beimpft, und dann wird der zu oxydierende Kohlenwasserstoff ohne besondere Berücksichtigung seiner Konzentration in der Mischung zugegeben. Bei den meisten bisher beschriebenen Fermentationen wurde die gesamte Kohlenwasserstoffmenge am Anfang zugegeben, vgl. z. B. USA Patentschrift 2 697 062.



  Selbst in den Fällen, wo während der Vergärung zusätzliche Beigabe des Kohlenwasserstoffs erfolgt, wurde keine besondere Mühe darauf verwendet, den Kohlenwasserstoffgehalt in der Gärmischung während der gesamten Zeit unterhalb eines vorher bestimmten Maximums von geringer Höhe zu halten, wie im folgenden beschrieben wird.



   Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, zu dem während der Züchtung als Kohlenstoff lieferndes Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff zugegeben wird, zu entwickeln.



  Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die angestrebte Verbesserung dadurch erreicht werden kann, dass so gearbeitet wird, dass die kontinuierliche Zugabe des flüssigen Kohlenwasserstoffes zu dem Nährmedium während der Züchtung mit einer solchen Geschwindigkeit erfolgt, dass keine wesentliche Menge einer getrennten Kohlenwasserstoffphase während der Durchführung der Züchtung in dem Nährmedium vorhanden ist.



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, zu dem während der Züchtung  als Kohlenstoff lieferndes Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff zugegeben wird, das sich dadurch auszeichnet, dass eine Dispersion von   Kohleilwasserstoff      oxydieo    renden Mikroorganismen unter aeroben   Fermentations-    bedingungen in dem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird, dass der flüssige Kohlenwasserstoff unter kräftigem Rühren der Mischung kontinuierlich zugegeben wird und die Zugabegeschwindigkeit des Kohlenwasserstoffes so geregelt wird, dass dessen Menge in der Dispersion ausser dem Anteil, der durch die Zellen der Mikroorganismen absorbiert ist, nicht die Löslichkeitsgrenze des Kohlenwasserstoffes in dem wässrigen Nährmedium übersteigt.



   Beim erfindungsgemässen Verfahren wird aIso die Zugabe des Kohlenwasserstoffs so gelenkt, dass die Menge an unverbrauchtem Kohlenwasserstoff in der Gärmischung, abgesehen von durch die Zellen absorbiertem Kohlenwasserstoff, unterhalb der Menge liegt, die in dem wässrigen Nährmedium löslich ist Wie festgestellt wurde, bewirkt die Begrenzung der Kohlenwasserstoffzugabe auf einen solchen Wert, dass die Konzentration unterhalb der Löslichkeitsgrenze bleibt, wesentlich verbesserte Ausbeuten an den Stoffwechselprodukten der Mikroorganismen, die Oxydationsprodukte der Kohlenwasserstoffe enthalten.



   Eine bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens zur mikrobiologischen Oxydation flüssiger Kohlenwasserstoffe umfasst die folgenden Ver   fahrensschritte:    a) Züchtung einer Dispersion von kohlenwasser   stoffoxydierenden    Mikroorganismen unter aeroben Fer   mentationsbedingungen    in einem wässrigen Nährmedium; b) Kontinuierliche Zugabe eines flüssigen Kohlenwasserstoffs zu der Dispersion, während die Mischung heftig gerührt wird und c) Regulierung der Zugabegeschwindigkeit des Kohlenwasserstoffs in der Weise, dass dessen Menge in der Dispersion ausser dem Anteil, der durch die Zellen des Mikroorganismus absorbiert ist, nicht die Löslichkeitsgrenze des Kohlenwasserstoffs in dem wässrigen Nährmedium übersteigt.



   Durch Regulierung der Zugabe des flüssigen Kohlenwasserstoffs zur Aufrechterhaltung der Konzentration, wie oben beschrieben wurde, können höhere Geschwindigkeiten bei der Produktion des gewünschten oxydierten Kohlenwasserstoffproduktes erhalten werden und während der Fermentation können grössere Mengen davon angesammelt werden.



   Das erfindungsgemässe, verbesserte Gärverfahren kann für die mikrobiologische Oxydation jedes beliebigen Kohlenwasserstoffs, der bei der Gärtemperatur flüssig ist, angewendet werden, wobei jeder beliebige   koh-    lenwasserstoff-oxydierende Mikroorganismus, dessen Stoffwechselprozess eine partielle Oxydation des Kohlenwasserstoffs bewirkt, verwendet werden kann. In der Regel wird der Mikroorganismus einer der oben angeführten Gattungen angehören, obwohl viele Mikroorganismen anderer Gattungen, für diesen Zweck ebenfalls verwendet werden können, je nach dem speziellen Kohlenwasserstoff und je nach der Art des gewünschten Oxydationsproduktes.

  Es ist eine allgemeine Regel, dass irgendein beliebiger   konlenw asserstoffoxydierender    Mikroorganismus, wenn er   Substratkonzentrationen    ausgesetzt wird, die höher sind, als die erfindungsgemäss angewandten, das gewünschte oxydierte Produkt nicht so wirksam produzieren wird, als wenn die Kohlenwasserstoffzugabe erfindungsgemäss reguliert wird.



  In der Tat kann bei einigen flüssigen Kohlenwasserstoffen, z. B. den Xylolen oder anderen Aromaten, in einigen Fällen die Anwendung von Konzentrationen, die wesentlich unter der Löslichkeitsgrenze in der wässrigen Phase liegen, erforderlich sein, um Hemmung der mikrobiologischen Oxydation zu vermeiden.



   Der besondere Nutzen des   erfindungsgemässen    Verfahrens liegt in dessen Anwendung zur   mikrobiologi-    schen Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe. Insbesondere kann es zur Oxydation der   CG-Ct0-Kohlen-    wasserstoffe der Benzolreihe, d. h. Benzol und Alkylbenzole mit bis zu 4 Alkylkohlenstoffatomen, angewendet werden. In dem oben zitierten Lehrbuch werden viele Literaturhinweise, die aromatische Oxydationen mittels Mikroorganismen beschreiben, angegeben. Unter den Arten von Oxydationen, die vorkommen, befinden sich die Alkylgruppenoxydationen von Alkylbenzolen, die durch gewisse Kulturen von Nocardia verursacht werden, wie von Davis und Raymond in  Applied Microbiology , Vol. 9, No. 5, September 1961, Seiten 383-388 und ausserdem in USA Patentschrift 3 057 784 beschrieben wurde.

  Andere Beispiele sind die Vergärung von   WCt0    - Methylbenzolen mittels anderer Nocardiaarten, welche anstatt oder zusätzlich zur Oxydation der Methylgruppen die Oxydation an Ringkohlenstoffatomen verursachen, wie durch Raymond und Jamison in der USA Patentschrift 3 383 289 beschrieben wurde. Beispielsweise kann p-Xylol durch gewisse Stämme von Nocardia auf diese Weise entweder in   a,a'-Dimethylmuconsäure oder aber in - Toluylsäure    und 2,3-Dihydroxy-p-toluylsäure umgewandelt werden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist in gIeicher Weise bei der mikrobiologischen Oxydation der Alkylnaphthaline, die bei herkömmlichen oder geeigneten Gärtemperaturen flüssig sind, nützlich. Beispielsweise sind 1-Methylnaphthalin,   1-Äthylnaphthalin,      2-Äthyl-    naphthalin und die meisten isomeren   Dimethylnaphtha-    line normalerweise flüssig und können mittels verschiedener Mikroorganismen in oxydierte Produkte, wie beispielsweise Naphthoesäuren oder Salicylsäuren, übergeführt werden. (Vgl.  Advances in Enzymology , loc.



  cit. Seiten 523-525). Durch Anwendung der erfindungsgemäsen Verfahrensweise können bei solchen Fermentationen verbesserte Ergebnisse erzielt werden.



   Verbesserte Ergebnisse können auch bei der Oxydation von normalerweise flüssigen Alkanen des   Cs-Cjo-    Bereichs, insbesondere von n-Paraffinen, und auch von Cycloparaffinen, wie z. B. Cyclohexan und n-Butylcyclohexan, erzielt werden. Oxydationen solcher gesättigter Kohlenwasserstoffe werden ebenfalls in dem oben erwähnten Lehrbuch und in  Applied   Microbiology ,    loc.   cit,    ebenso wie in Vol. 8, No. 6, November 1960, Seiten 329-334 diskutiert.

 

   Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens unter Anwendung irgendeines löslichen Kohlenwasserstoffs in Verbindung mit einem geeigneten Mikroorganismus, der dessen Oxydation bewirken kann, kann die Vergärung in mehr oder weniger herkömmlicher Art durchgeführt werden, ausser dass die Zugabe des Kohlenwasserstoffs sorgfältig kontrolliert wird, um seine Konzentration unterhalb der Löslichkeitsgrenze in dem Nährmedium zu halten, abgesehen  von dem Anteil des Kohlenwasserstoffs, der durch die Zellen des Mikroorganismus absorbiert ist.

  Diese Löslichkeitsgrenze hängt hauptsächlich von dem   verwendet    ten Kohlenwasserstoff und von der angewandten Vergärungstemperatur   ak    aber auf jeden Fall begrenzt sie den Bereich der Substratkonzentration und bestimmt einen Bereich, der im Vergleich zu den bisher im allgemeinen angewandten Konzentrationen erheblich tiefer liegt. Bei einigen Mikroorganismen ist es erwünscht, die Konzentration an Kohlenwasserstoff beträchtlich unterhalb der Grenze seiner Löslichkeit in dem wässrigen   Salzmedium    zu halten, um beste Ergebnisse zu erzielen.



   Die Grenzen der Löslichkeit des Kohlenwasserstoffs in dem Nährmedium sind üblicherweise weniger als 200 ppm und können häufig weniger als 75 ppm sein.



  Die Grenze der Löslichkeit von p-Xylol in einem her   kömmlichea    Nährsalzmedium bei ca.   30     C ist z. B. von der Grössenordnung 150 ppm. Während der Fermentation wird der Kohlenwasserstoff kontinuierlich der Mischung, die kräftig gerührt und belüftet wird,   zugege    ben, wobei die Geschwindigkeit so reguliert wird, dass die durschnittliche Konzentration an unverbrauchtem Kohlenwasserstoff in der wässrigen Phase (abgesehen von den Zellen) ständig unterhalb der Löslichkeitsgrenze gehalten wird. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, eine weit geringere   Kohlenwasserstoffkon-    zentration, z.

  B. 5 bis   20ppm,    einzuhalten, da einige Mikroorganismen empfindlich gegenüber einer höheren Konzentration sein können und davon ungünstig   beein-    flusst werden können, auch wenn sie wesentlich unterhalb der Löslichkeitsgrenze ist. Eine wesentliche Konzentration an Kohlenwasserstoff sollte jedoch in dem Nährmedium eingehalten werden, da sonst die Gärgeschwindigkeit zu langsam ist.



   Bei der Oxydation von Alkylbenzolen des   CrC,0-    Bereichs, z. B. p-Xylol, werden im allgemeinen die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Konzentration an unverbrauchtem Kohlenwasserstoff in einem Bereich zwisehen 5 und   150 lppm    in der wässrigen Nährphase eingehalten wird, wobei die beste Konzentration von dem besonderen Mikroorganismus, der verwendet wird,   ab    hängt.



   Der unverbrauchte Kohlenwasserstoff, der zu irgendeiner Zeit in der Fermentationsmischung vorhanden ist, ist teilweise in der wässrigen Phase gelöst und teilweise durch die Zellen des Mikroorganismus absorbiert. Die in jeder Phase vorhandenen Mengen können leicht durch Abtrennen der Zellen von der klaren Brühe mittels Zentrifugieren oder Filtrieren, anschliessende Extraktion der beiden Teile mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Hexan oder Isooctan) und Bestimmung der jeweiligen Menge des extrahierten Kohlenwasserstoffs, bestimmt werden. Bestimmungen dieser Art, die bei Verwendung verschiedener Nocardiaarten zur Oxydation von p-Xylol gemacht wurden, haben gezeigt, dass bei Anwendung üblicher Fermentationsbedingungen bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens das p-Xylol in etwa gleichen Mengen auf die wässrige Phase und auf die Zellen verteilt ist.



  Die oben angegebenen Konzentrationen beziehen sich ausschliesslich auf die Kohlenwasserstoffmengen in der wässrigen Phase und schliessen den Kohlenwasserstoffanteil, der durch die Zellen absorbiert ist, nicht ein.



  Demzufolge wäre die Gesamtmenge an unverbrauchtem Kohlenwasserstoff in der Fermentationsmischung zweimal so hoch, wie die aus den hierin angegebenen Konzentrationen berechnet.



   Die Einhaltung der oben beschriebenen   verhältrlis-.   



  mässig niedrigen   Kohlenwasserstoffkonzentratioa    ist nicht nur dadurch vorteilhaft, dass sie die ungünstigen Wirkungen, die der flüssige Kohlenwasserstoff sonst auf den Mikroorganismus haben könnte, vermindert,   son-    dern auch dadurch, dass es die Verdampfungsverluste an Kohlenwasserstoff durch das Belüftungsgas vermindert. In den Fällen, in denen aufgrund von mangelhafter Regulierung versehentlich ein   Çerschuss    an Koh   lenwasserstoff    während der Fermentation zugesetzt wird, kann der Kohlenwasserstoff die Wirkung des Mikroorganismus hemmen oder vollständig verhindern.



  Häufig jedoch wird durch kontinuierliches Einleiten von Luft genügend Kohlenwasserstoff verdunstet, um die mikrobiologische Oxydation wieder mit einer zufriedenstellenden Geschwindigkeit ablaufen zu lassen.



   Das erfindungsgemäss verwendete Nährmedium sollte Quellen an assimilierbarem Stickstoff, Phosphor, Schwefel und: Magnesium enthalten und kann zahlreiche Spurenelemente und Vitamine, die üblicherweise verwendet werden, oder die verwendet werden, da sie für den besonderen Mikroorganismus erforderlich   sind >     enthalten. Mineralsalze, die üblicherweise für die Bereitstellung solcher Elemente in biologischen Fermentationen gebraucht werden, können verwendet werden. Bei.



  spiele für geeignete Stickstoffquellen sind   Ammonium-    salze, wie z. B.   (NH412SO4    oder   NH4Cl,    Nitrate, wie z. B.   NH4NOa    oder NaNO3, Harnstoff, Sojabohnenmehl und andere organische Stickstoffquellen. In folgenden ist eine für den vorliegenden Zweck geeignete Mineralsalzzusammensetzung angegeben:
Konzentration    [g/1 H20l       MgSO4 . 7H20    0,2
Na2CO3 0,1    CaCl2. 2H2O    0,01
MnSO4 . H2O 0,02
FeSO4   . 7EI;O    0,005    Na2HP04    3,0    KH2PO4   
CO(NH2)2 2,0
Diese Mineralsalzzusammensetzung würde normalerweise einen pH-Wert von ca. 7,1 haben. 

  Falls gewünscht wird, die Fermentation bei einem pH-Wert unter 7 auszuführen, kann die Menge an KH2PO4 im Verhältnis zu Na2HPO4 vermehrt werden, um den pH-Wert auf einen niedrigeren Wert zu vermindern.



   Die Fermentation kann   ehargenweise    oder kann kontinuierlich durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass die oben beschriebene Kohlenwasserstoffkonzentration eingehalten wird. Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird eine Mischung des Nährmediums in einem Gärgefäss, das mit Vorrichtungen zum Rühren und zur Belüftung versehen ist, hergestellt, die Mischung wird mit dem gewählten kohlenwas  serstoffverbrauchenden Mikroorganismus beimpft, und die Fermentation wird dann durch kontinuierliche Zugabe des Kohlenwasserstoffs mit korrekter Geschwindigkeit durchgeführt, während die Fermentationsbedingungen eingehalten werden. Im allgemeinen wird eine Temperatur im Bereich von 20 bis 400 C angewandt, und der pH-Wert wird in dem Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, gehalten.

  Der Kohlenwasserstoff kann kontinuierlich zugegeben werden, oder in kleinen Anteilen, während die Mischung kräftig gerührt und belüftet wird, vorausgesetzt, dass die   Zugabegeschwindig    keit die gewünschte niedrige durchschnittliche Kohlenwasserstoffkonzentration (z. B. bei der Alkylbenzoloxydation 5 bis 150 ppm) aufrecht erhält. Der gewählte Kohlenwasserstoff kann von Beginn der Fermentation an zugesetzt werden, oder die Zellen können erst auf einem anderen Substrat gezüchtet werden, und die Zugabe des gewählten Kohlenwasserstoffs beginnt später, nachdem ein beträchtliches Wachstum erzielt wurde.



  Die Zugabe des Kohlenwasserstoffs mit geregelter Geschwindigkeit wird fortgesetzt, vorzugsweise bis die maximale Ansammlung des gewünschten Oxydationsproduktes eingetreten ist. Die Brühe kann dann in irgendeiner für die Isolierung des gewünschten Oxydationsproduktes geeigneten Weise verarbeitet werden.



  Beispielsweise kann das Produkt direkt aus der gesamten Brühe mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B.



  einem Kohlenwasserstoff oder Äther, extrahiert werden, oder die Zellen können erst durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden, und die Zellen und die klare Brühe können getrennt voneinander aufgearbeitel werden.



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, in denen als Kohlenwasserstoffsubstrat p-Xylol verwendet wird, näher erläutert. Beispiel 1, zu dem die Figuren 1A und iB der dazugehörigen Zeichnung gehören, zeigt die Oxydation von p-Xylol zu a,a'-Dimethylmuconsäure (im folgenden  DMMS  genannt), mittels eines be   stimmten    wildwachsenden Stammes von Nocardia corallina. Dieser Mikroorganismus wurde in der oben erwähnten USA Patentschrift Nr. 3 383 289 von Raymond und Jamison beschrieben, und eine Kultur dieses Stammes ist bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C., unter der Registriernummer ATCC 19070 hinterlegt.

  Dieser Nocardia-Stamm ist gegenüber Kohlenwasserstoffkonzentrationen besonders empfindlich, da er schon von p-Xylol-Konzentrationen, die wesentlich geringer als die Löslichkeitsgrenze in dem wässrigen Salzmedium sind, ungünstig beeinflusst wird. Beispiele 2 bis 4 betreffen die Obligation von p-Xylol zu p-Toluylsäure (im folgenden  PTS  genannt und zu Dihydroxy-p-toluylsäure (im folgenden  DHPT  genannt) mittels eines Stammes von Nocardia salmonicolor, der ebenfalls hinterlegt wurde und die Registriernummer ATCC 19149 hat.



   Beispiel 1
Nocardia corallina ATCC 19070 wurde zur Herstellung von a,a'-DMMS aus p-Xylol in einem   60u1-Gär-    gefäss, das mit Vorrichtungen zur Belüftung und zum Rühren der Fermentationsmischung versehen war, verwendet. Als wässriges Nährmedium wurde eine Mineralsalzlösung verwendet, die ungefähr die Zusammensetzung, die oben angegeben wurde, hat.   34 1    der Lösung wurden eingebracht und sterilisiert, und die Mischung wurde dann mit dem Mikroorganismus beimpft. Die Mischung wurde bei   ca. 300 C    kräftig gerührt; währenddessen wurde sie mit einer konstanten Geschwindigkeit von   12,741. min¯t    belüftet. Specköl wurde als Wachstumssubstrat verwendet und wurde während des Ansatzes mit einer Geschwindigkeit von   5 mi. h-'    zugegeben.

  Unter Verwendung eines pH-Kontrollapparates wurde der pH-Wert während des Ansatzes durch Zugabe von wässrigem Ätznatron automatisch bei 6,8 gehalten.



  Das pXylol wurde kontinuierlich in die Mischung gegeben, und Proben davon wurden von Zeit zu Zeit abgenommen und zur Bestimmung der p-Xylolkonzentration in der wässrigen Phase untersucht. Dazu wurde die Mischung zentrifugiert, um die klare Brühe zu erhalten, die letztgenannte wurde mit Isooctan extrahiert, und der Extrakt wurde durch U. V.-Spektroskopie analysiert.



  Anhand dieser Analysen wurde ein Versuch gemacht, die Konzentration an unverbrauchtem p-Xylol in der wässrigen Phase auf weniger als 30 ppm einzustellen.



  Dies wurde während eines Teiles des Ansatzes erreicht, wie aus Fig. 1B ersehen werden kann, welche die Ver änderung der Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit vom Beginn der p-Xylolzugabe zeigt. Während eines Teiles des Ansatzes jedoch und insbesondere nach einer Zeit von ca. 10 und 42 Stunden erreichte die Xylolkonzentration erheblich höhere Werte als beabsichtigt. Der DMMS-Gehalt der gesamten Brühe zu verschiedenen Zeiten, wie in Fig. 1A gezeigt, wurde aus den Mengen   Ätznatron,    die von dem automatischen pH-Kontrollapparat zugegeben wurden, berechnet. Aus diesen Ergebnissen wurde die durchschnittliche Geschwindigkeit der DMMS-Produktion für die Zeit zwischen den Probenahmen berechnet, und diese Ergebnisse sind in Fig. 1A gegen die Fermentationszeit aufgetragen.

  Am Ende der Fermentation nach ca. 50 Stunden zeigte die Analyse der gesamten Brühe, dass sie ca.



   12,4 g   DMMS . l-t    enthielt. Durch den Mikroorganismus wurden kaum PTS oder DHPT oder andere saure Produkte produziert.



   Ein Vergleich der Figuren 1A und 1B erläutert die Wirkung der Xylol-Konzentration auf die Fähigkeit   des    Mikroorganismus ATCC No. 19070 p-Xylol in DMMS umzuwandeln. Während der ersten 8 Stunden des Ansatzes wurde kein merklicher p-Xylolgehalt der Nährsalzlösung festgestellt, obgleich dieser Stoff zugefügt wurde, und nach 8 Stunden war die Produktion von DMMS offensichtlich. Etwa zu dieser Zeit (10. Stunde) verursachte unzureichende Regulierung einen Anstieg des p-Xylolgehaltes auf eine Konzentration (112 ppm), die für diesen besonderen Mikroorganismus zu hoch ist, als Folge davon fiel die DMSS-Produktion auf null. Die Zugabe von p-Xylol wurde zeitweise unterbrochen.

 

  während die Belüftung der Mischung fortgesetzt wurde, woraufhin die Gärung wieder einsetzte. Während des Zeitraums von 14 bis 28 Stunden wurde eine gute Regulierung der p-Xylolkonzentration in einem Bereich von ca. 10 bis ca. 30 ppm erzielt, und eine grosse Geschwindigkeit der DMMS-Produktion wurde beobachtet, wobei die Geschwindigkeit ein Maximum von 0,6 g DMMS pro Liter der Gesamtbrühe pro Stunde erreichte. Um die 42. Stunde war die Regulierung wiederum so schlecht, dass die p-Xylolkonzentration die Löslichkeitsgrenze dieser Verbindung in der wässrigen Phase überschritt. Dies brachte die Gärung praktisch zum Erliegen und danach wurde wenig DMMS produziert.



   Das voranstehende Beispiel erläutert die Wichtigkeit der Regulierung der Kohlenwasserstoffkonzentration auf eine so geringe Höhe, dass sie durch den verwende  ten besonderen Mikroorganismus ertragen werden kann. In diesem Punkt war der Mikroorganismus besonders empfindlich gegenüber der Kohlenwasserstoffkonzentration, so dass Konzentrationen sogar wesentlich unterhalb der Löslichkeitsgrenze die gewünschte Oxydation hemmten. Der in den folgenden Beispielen verwendete Mikroorganismus hatte eine grössere Widerstandsfähigkeit gegenüber p-Xylol und seine Oxydationsfähigkeit wurde nicht so leicht gehemmt.



   Beispiel 2
Bei diesem Versuch wurde Nocardia salmonicolor ATCC 19149 zur Oxydation von p-Xylol zu DHPT und PTS verwendet. Das Verfahren war im allgemeinen das gleiche wie in Beispiel 1 ausser, dass der Mikroorganismus zuerst 37 Stunden lang bei 300 C auf n-Hexadecan gezüchtet wurde und dann erst die Zugabe von p-Xylol begann. Das letztgenannte wurde in Form einer 75:25 (Gewichtsbasis) Mischung von p-Xylol n-Hexadecan zugegeben. Diese Mischung wurde mit einer konstanten Geschwindigkeit von   20 mi. h-1    während des ganzen Versuchs zugegeben, und es wurde kein Versuch gemacht, den Gehalt an unverbrauchtem p-Xylol in dem wässrigen Nährmedium durch Veränderung der Zugabegeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit des Verbrauchs zu regulieren.

  Als Folge davon schwankten die gemessenen Werte für die p-Xylolkonzentration von 0 während der ersten Teils des Versuchs im Anschluss an die p-Xylol-Zugabe bis zu einem Wert von 672 ppm. 6 Analysen von Proben, die während der letzten 29 Stunden der Fermentationszeit genommen wurden, ergaben einen durchschnittlichen p-Xylolgehalt von 244 ppm in der wässrigen Phase. Zugabe von p-Xylol erfolgte insgesamt über einen Zeitraum von 57 Stunden. Die Ergebnisse der Endgehaltsbestimmungen der gesamten Brühe sind in Tabelle A angegeben, wobei die Ergebnisse des Beispiels 3 zum Vergleich angegeben sind.



   Beispiel 3
Dieser Versuch wurde im wesentlichen in gleicher Weise durchgeführt wie Beispiel 2, ausser dass die Zugabe der 75:25 p-Xylol:n-Hexadecan-Mischung nach 23 Stunden Wachstum auf n-Hexadecan allein begann, und dass die Substratmischung während des Versuchs mit kontrollierter Geschwindigkeit zugegeben wurde, um den p-Xylolgehalt der wässrigen Phase in der Hauptsache im Bereich von 75-135 ppm zu halten. Die Gesamtzeit der Zugabe dieser Substratmischung betrug 41 Stunden und während des gesamten Zeitraums wurde eine gute Regulierung der p-Xylolkonzentration erreicht. Die Ergebnisse der Endanalysen sind in Tabelle A gezeigt.



   Tabelle A
Beispiel II Beispiel III  [gute
Regulierungl
DHPT-Gehalt, [g/l] 1,6 5,0
PTS-Gehalt,   [g/l]    4,5 4,1
Summe 6,1 9,1
Die tabellierten Vergleichergebnisse zeigen, dass bei Durchführung einer guten Kontrolle der p-Xylolkonzentration, so dass diese Konzentration durchwegs unter der Löslichkeitsgrenze (150 ppm) in der wässrigen Phase ist, beträchtlich bessere Ausbeuten an DHPT und an Gesamtsäurebildung erhalten werden kann.



   Beispiel 4
Drei Vergleichsversuche wurden unter Verwendung von ATCC No. 19149 nach dem gleichen allgemeinen Verfahren wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei der p-Xylolgehalt der wässrigen Phase bei Konzentrationen von annähernd 25, 75 bzw. 125 ppm gehalten wurde.



  Diese Werte entsprechen Mengen von ca. 50, 150, bzw 250 ppm in der gesamten Brühe, da die Zellen annähernd gleiche Menge an unverbrauchtem p-Xylol absorbieren, wie in der wässrigen Phase vorhanden ist. Bei jedem Versuch wurden die Zellen zuerst ca. 36 Stunden lang auf n-Hexadecan bei einem pH-Wert von ca. 7,0 gezüchtet und danach wurde der pH-Wert in dem Bereich von 7,8 bis 8,0 gehalten und ein 90:10-Gemisch von   p-Xylol : n-Hexadecan    wurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit, die die p-Xylolkonzentration annähernd auf dem gewünschten Niveau hielt, zugegeben.



  Die gesamte Fermentation wurde bei 300 C durchgeführt, und die gesamte Zeit nach der anfänglichen Zugabe von p-Xylol betrug 60 Stunden. Analysen wurden durchgeführt, um die Anfangsgeschwindigkeit der Produktion von DHPT und PTS und auch die Endausbeuten an diesen Stoffen zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle B gezeigt.



   Tabelle B p-Xylol-Konz. Anfangsin wässrig. geschwindigkeit End Phase der Produktion ausbeute [mg/l]   [gil    . h] [g/l]
DHPT PTS DHPT PTS
25 0,09 0,27 1,7 6,8
75 0,11 0,17 2,9 5,5 125 0,20 0,09 5,0 4,5
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Steigerung der Xylolkonzentration innerhalb der erprobten Grenzen zur Reduktion der Bildung von PTS führt, während die Ausbeute an DHPT steigt.



   Die voranstehenden Beispiele sind bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens und der allgemeine Erfindungsgedanke kann mit Vorteil bei der Vergärung zahlreicher anderer flüssiger Kohlenwasserstoffe, wie bereits vorher gesagt, unter Verwendung vieler verschiedener Arten von Mikroorganismen, die zur Oxydation solcher Kohlenwasserstoffe   im-    stande sind, zur Anwendung gebracht werden. 

  Während in vielen Fällen der verwendete besondere Mikroorganismus durch einen grossen   Überschuss    des Kohlenwasserstoffs (insbesondere im Falle von Alkanen) nicht vollständig vergiftet wird, so ist dennoch die Anwendung verhältnismässig niedriger Konzentrationen, wie in dieser Beschreibung ausgeführt, von Vorteil, um oxydationshemmende Effekte zu vermeiden und um ausserdem den Verlust an unverbrauchtem Kohlenwasserstoff durch das Belüftungsgas auf ein Minimum zu reduzieren. 

Claims (1)

  1. PATENTANSPRUCH I
    Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, zu dem während der Züchtung als Kohlenstoff lieferndes Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff zugegeben wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Dispersion von Kohlenwasserstoff oxydierenden Mikroorganismen unter aeroben Fermen tationsbedingungen in dem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird, dass der flüssige Rohlenwasserstoff kontinuierlich zugegeben wird, während die Mischung kräftig gerührt wird, und dass die Zugabegeschwindigkeit des Kohieuwass'erstoffs so geregelt wird, dass dessen Menge in der Dispersion ausser dem Anteil, der durch die Zellen des Mikroorganismus absorbiert ist, nicht die Lös lichkeitsgrenze des Kohlenwasserstoffs in dem wässrigen Nährmedium übersteigt.
    ÜNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass ein aromatischer Kohlenwasserstoff verwendet wird.
    2. Verfahren gemäss Unteranspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff ein C,-C,,- Kohlenwasserstoff der Benzoireihe ist.
    3. Verfahren gemäss Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff p-Xylol ist.
    4. Verfahren gemäss Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff ein Alkylnaphthalin ist.
    5. Verfahren gemäss Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff 1-Methyl- naphthalin, 1 -Äthylnaphthal5n, 2-Äthylnaphthalin oder ein unter Normalbedingungen flüssiges Dimethylnaphthalin ist.
    6. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff ein C -Cl0-Alkan ist.
    7. Verfahren gemäss Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff ein geradkettiges AIkan ist.
    8. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 bis 7, dadurch-gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine kohlenwasserstoffverlArauchende Art der Gattung Micrococcus, Corygebacterium, Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium, Streptomyces, Aspergillus oder Acetobacter ist.
    9. Verfahren gemäss Unteranspruch 8, dadurch gekennzeichnet, - dass der Mikroorganismus Nocardia corallina oder Nocardia salrnonicolor ist.
    10. Verfahren gemäss -Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Nocardia corallina ATCC No. 19070 ist.
    11. Verfahren gem;ass Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Nocardia salmonicolor No. ATCC 19149 ist.
    12 57erfaBren gemäss Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis ?, dadurch gekennzeichnet, dass die Geschwindigkeit der Zugabe des Kohlenwasserstoffes so reguliert wird, dass seine Konzentration im wässrigen Nährmedium während der Durchführung der Fermentation im Bereich von 5 bis 150 ppm bleibt.
    13. Verfahren gemäss Unteranspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff p-Xylol und der Mikroorganismus eine Art der Gattung Nocardia ist.
    14. Verfahren gemäss Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des p-Xylols in dem wässrigen Nährmedium im Bereich von 5 bis 30 ppm gehalten wird.
    PATENTANSPRUCH II Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I auf die mikrobiologische Oxydation von flüssigen Koh lenwasserstoffen unter Gewinnung von Stoffwechselprodukten der MikrciorgaDismen, die eine Mischung an Oxydationsprodukten der Kohleuwasserstoffe enthalten.
    UNTERANSPRÜCHE 15. Anwendung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu oxydierenden Kohlenwasserstoff einen aromatischen Kohlenwasserstoff ver wendet.
    16. Anwendung nach Unteranspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu oxydierenden Kohlenwasserstoff einen Kolilenwasserstoff der Benzoireihe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Alkylnaphtha- J5ii,verwendet 17. Anwendung nach Unteranspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu oxydierenden Kohlenwasserstoff p-Xylol verwendet, als Mikroorganismen Stämme der Gattung Nocardia einsetzt und als Stoffwechselprodukt der Mikroorganismen eine Mischung isoliert, die a,a'-Dimethylmuconsäure, p-Toluylsäure und 2,3 -Dihydroxy-p-toluylsäure enthält.
    18. A*El.wendung gemäss Unteranspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen Stamm von Nocardia corallina verwendet und eine Mischung gewinnt, deren Hauptbestandteil -a,a'-Dime- thylmuconsäure ist.
    19. Anwendung nach Unteranspruch 17, dadurch gekennzeichnet, das man als Mikroorganismen einen Stamm von Nocardia salmonicolor verwendet, und eine Mischung isoliert, deren Hauptbestandteile p-Tolylsäure und 2,3-hydroxytolylsäure sind.
    20. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch II zur Oxydation von flüssigen Alkanen und Cycloalkanen, insbesondere solchen mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen.
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