Verfahren zur Herstellung eines lebendes, abgeschwächtes Masernvirus enthaltenden Impfstoffes
Die vorliegende Erfindung betriffteinVerfahren zur Herstellung eines verbesserten, lebendes,ab- geschwächtes Masernvirus enthaltenden Impfstoffes zum Immunisieren von Menschen gegen Masern.
Das M, asernvirus. ist von früheren Forschern erfolgreich angepasst worden, so dass es in nichtmenschli- chem Gewebe oder Zellkulturen zu wachsen und sich fortzupflanzenvermag. Es ist gezeigt worden, dass durch Absohwächung in solchen nichtmenschlichen Zellkulturen Stämme des Masernvirus erhältlich sind, die für die Einimpfung in Menschen geeignet sind.
Klinische Untersuchung des in dieser Weise erhaltenen angepassten und abgeschwächten lebenden Masernvirus bzwies, dass es in den geimpften Menschen Antikörper zu formen vermag, die sie gegen Infektion mit Masern immunisieren. Unglücklicherweise zeigte ein grosser Teil der geimpften Personen unerwünschte Reaktionen, wie z. B. hohes Fieber. Ein grosser Teil der Kinder, die mit Impfstoffen. geimpft waren, die aus dem angepassten und abgeschwächten Stamm der bisher erhältlichen Masernviren erzeugt waren, zeigten als Ergebnis der Impfung ernste Ausschläge und andere Reaktionen.
DieunerwünschtenNebenwirkungen konnten in einem gewissen Ausmass durch die gieichzeitige Injektion von γ-Globuilin, das eine ausgeprägte Wirkung zum Schutz der Kinder von den ernsteren Symptomen der unerwünschten Reaktionen besitzt, unterdrückt und vermieden werden. Die Verhinderung von Reaktionen durch die kombinierte Anwendung des Masernimpf- stoffes und von y-Globulin ist schwer zu handhaben und teuer und im allgemeinen für Impfprogramme in grossem Massstab nicht geeignet.
Es wurde nun gefunden, dass beträchtliche Neben- wirkungen und unerwünschte Symptome bei den geimpften Personen vermieden oder mindestens erheblich reduziert werden können, wenn man für die Im munisier, ung einen verbesserten Impfstoff verwendet, der aus dem sogenannten Schwarzstamm des lebenden Masernvirus erzeugt ist. Dieser neue Impfstoff erfor dert keine gleichzeitige Injektion von y-Globulin. {Ein ebenso gutes oder besseresVerhaltenhinsichtlichder HäufigkeitundSchwerederReaktionenbeiden ge impften Personen kann nun erzielt werden, indem der erfindungsgemässe verbesserte Masernimpfstoff allein verwendet wird.
Der Schwarzstamm des Masernvirus ist von den bisher bekannten Stämmen des Masernvirus durch das Fehlen von wesentlichen unerwünschten Nebenwirkun- gen und Reaktionenbei den damit geimpften Personen und durch das praktische Fehlen der iiblichen patholo- gischen Symptome von Masern ohne irgendeine offenbare Herabsetzung seiner Immunisierungskapazität und Wirksamkeitunterschieden.
Die verbesserte Sicherheit und Leistung des Schwarzstammes des Masernvirus als Impfstoff kann durch die Abschwächung des angepasstentMasernvirus in einer solchen Weise, dass die Virulenz des Virus mehr geschwächt wird, als es in den bisher verwen- deten Abschwächungsverfahren der Fall war, erzielt werden.
Die erfindiungsgemässenneuen,verbesserten Impfstoffe, die abgeschwächtes lebendes Masernvirus ent halten, können erfindungsgamäss leicht hergestellt wer- den, indem der Schwarzstamm des Masernvirus in einem Kultur, medium fortgepflanzt und gezüchtet wird, das lebende tierische Zellen enthält, und indem das Zell-und tYberbleibselmaterial von dem Kulturmedium getrennt wird. Der in dieser Weise erhaltene Impfstoff kann direkt verwendet oder gelagert werden, und die üblichen Verdünnungsmittel, Stabilisatoren usw. können zu jeder Zeit zugesetzt werden. Die lagerung wird erleichtett, wenn der Impfstoff gefroren und für die spätere Verwendung in diesem zustand gehalten wird.
Wenn die Fortpflanzung des Schwarzstammesdes Masernvirus bei BedingungenundTemperaturen ausgeführt wird, die die Möglichkeit mit sich bringen, dass das Virus in eine virulentere Form rückschlägt, ist es eine gute Vorsichtsmassnahme, in das Herstellungsver- fahren und/oder in die Herstellung von Samenvorräten aus dem existierenden Schwarzstamm des Virus mindestens verschiedene Passagen bei die Virulenz redu zierenden Bedingungen einzuschliessen,
beispielsweise durch Kultivierung des Virus während mehreren Pas sagen bei Temperaturen unter 35 C und vorteilhafter unter 32 C. Wenn trotz aller Vorsichtsmassnahmen der Schwarzstamm des Virus in eine virulentere Form rückschlagen sollte, ist er kein geeignetes Ausgangs- matterial für die Zwicke der Vorliegenden Erfindung mehr und sollte durch neues materila ersetzt werden, das der vorstehend wiedergegebenen Definition des Schwarzstammes des massernvirus entspricht.
In Abhängigkeit von dem gewünschten Verwen- dungszweck kann der aus dem Kulturmedium erhaltene ImpfstoffmiteinemgeeignetenVerdünnungsmit- tel, vorzugsweise mit sterilisiertem, destilliertem Wasser, verdünnt werden. Als Alternative kann der Impfstoff zur Lagerung gefriergetrocknet werden und mit einem geeigneten Verdünnungsmittel,vorzugsweisedurchdie Zugabe von sterilisiertem, destilliertem Wasser, vor der Verwendung rekonstituiert werden.
Oft ist es von Vorteil, dem Impfstoff einen stabilisator zuzusetzen. Lactose-Glutamat-Lösung hat sich als ausgezeichneter Stabilisator für diesen Zweck erwiesen.
Das lebende Masernvirus vom Schwarzstamm, das als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfin- dungsgemässen verbesserten Impfstoffe dient, kann leicht durch Anpassung des Masernvirus, so dass es in lebendem, nichtmenschlichem Zellgewebe oder in solche lebenden, nichtmenschlichen Zellen enthaltenden Medien zu wachsen'vermag,und durch Abschwächung des xangepassten Virus durch mehrfache Passage durch ein Kulturmedium, das lebende, nichtmenschliche tierische Zellen enthält, unter dieVirulenzreduzierenden Bedingungen und bei Temperaturen unter 37 C, aber bei einer höheren Temperatur als derjenigen, bei der die Fortpflanzung des Virus aufhört, erhalten werden.
Wie oben angegeben, bildet das Verfahren zur Herstellung, des SchwtarzstammesdesMasemvirusebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfinidung. Anstatt natür0liches (natives) Masernvirus. anzupassen, ist es auch möglich, als ausgangsmiaterisal einen angepassten Stamm des Masernvirus zu verwenden, wie z. B. denjenigen, der durch Anspassung und Absschwächung durch frühere Bearbeiter aus dem Edmonston-Stamm des Masemvirus erhalten wurde, wie z. b.
Der Enders-Stamm. Abschwächung der erhältlichen, angepassten Stämme durch mehrfache Passage des Virus durch Kulturmedien, die lebende, nichtmenschliche tierische Zellen enthalben, in der vorstehend beschricebene, die Virulenz reduzierenden Art, erzeu, den Schwarzstamm des Masernvirus.
Es ist vorzuziehen, dass mindestens ein Teil der Bebrütung bei der Abschwächungsprozedur bei einer Temper, atur unter 35 Cundvorteilhafter unter 32 C ausgeführt wird. Mindestens mehrere Passagen oder ein n Teil einer grösseren Anzahl von Passagen sollte bei einer Temperatur unter 35 C und vorteilhafter unter 32 C und am zweckmässigsten bei einer Temperatur im Bereich von 28-32 Causgeführtwerden.Ge- wünschtenfalls können jedoch alle Passagen für dfie Abschwächung des Virus bei den gerade angegebenen niedrigeren Temperaturen ausgeführt werden.
Das Masernvirus kann leicht angepasst werden, so dass es in Kückenembryogewebe oder an einem Kultur- medium, das lebende Zellen eines solchen Gewebes enthält, sich fortzupflanzen vermag. Dieses gleiche Gewebe oder Nährmedien, die die lebenden Zellen eines derarti, gen Gewebes enthalten, können auch als Wachs tumsmedium für die Erzeugung des Impfstoffes aus dem Schwarzstamm des Virus dienen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Ver- fahrens zur Herstellung des Schwarzstammes des Masernvirus werden Gewabekulturen von tierischem Gewerbe in bekannter Weise m einer Nährflüssigkeit, die gegen das masernvirus nichttoxisch ist und das Wachstum eines solchen Gewebes unterstützt, eingerichtet und mit lebendem Masemvirus geimpft. Die geimpften Ge webekulturen werden dann bei 35-37 C während eines Zeitraumes bebrütet und das Virus in Reihenpassage während einer ausreichenden Anzahl von Passagen, um die Anpassung des Virus an das Wachstum auf dem spsziellen verwendeten Gewebe sicherzustellen,. auf das gleiche tierische Gewebe übertragen.
Auf d & ese Weise wurde beispielsweise gefunden, dass Masernvirus an das Wachstum auf Hundenierengewebe,Rindernierenge- wobe, SchweinenierengewebeundKückenembryogs- webe angepasstwerdenkann.Gemäss der vorstehenden anpassenden Kultur wird das Virus dann der ReSien- passage in Gewebekultur auf dem speziellen Substrat, andasesangepasstwordenist,unterworfen,wobei die Bebrütung des Virus b.
ei unternormalen Temperaturen von etwa 28 bis etwa 32 C ausgeführt wird, um eine Modifizierung des Virus, zu erzielen, wodurch das mo difizierte Virus, wenn es Kindern injiziert wird, die nicht immun gegen Masern sind, die Erzueugung der schützenden Masernantikörper zu stimulieren vermag, ohne beträchtlichen Ausschlag, hohes Fieber oder andere ubliche pathologische Symptome der Masern her vorzurufen. Das vorstehende Verfahren zur Kultivierung von Masemvirus, wenn es auf Vogelgeweben, ins besondere Kückenembryogeweben, ausgeführt wird, stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Bei ednem weiteren erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellun, des Schwarzstammes des Masemvirus wird das anfängliche lebende Masernvirus. in eine ein gerichtete tierische Gewebekultur geimpft. und bei unternormalen Temperaturen, wie oben auseinandergesetzt, ohne vorherige Anpassung an das spezielle Gewebe bei normalen Bebrütungstemperaturenbebrütet.Darnach wird die Reihenübertragung und Bebrütung bei den genannten untemormalen Temperaturen, vorzugsweise von etwa 28 bis 32 C, während einer ausreichenden Anzahl von Passagen fortgesetzt,. um die gewünschte Abschwächung des Virus zu erhalten.
Wenn frisches natünliches (natives) Masernvirus als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist es als Alternative häufig wünschenswert, die anfängliche Verveifältigung der Virus. in einer menschlichen Gewebekultur, wie z. B. menschlicher Nierengewebekultur, menschlicher Embryohüllengewebekultur oder menschlicher Herzge- webekultur, oder in. einem tierischen Gewebe, von dem man weiss, dass es leicht als Gastgewebe für die Ver vielfältigung eines derartigen natürlichen (nativen) Vi- rus, dient, wie z.
B. in Hundenierengewebekultur, zu bewirken.BeiderartigenOperationen kann es wün schenswertsein,dieKultivierung auf einem solchen menschlichen oder Hundegewebe während einer Anzahl von Reihenpassagen fortzusetzen, bis die Identität und Reinheit des gebildeten Virus festgestellt werden kann.
Darnach wird die Anpassung des Virus an andere tierische Gewebe und die Abschwächung. des Virus durch Bebrütung bei niedreigen Temperaturen mittels des oben beschriebenen Verfahrens ausgeführt. Es ist offensichtlich, dass bei irgendwelchen anpassenden Schritten vor dem Beginn der Bebrütung bei unternormalen Tem peraturen dazwischentretende Übertragungen auf an- dere Gewebe oder auf einen Embryo enthaltende Eier mittels bekannter Verfahren ausgeführt werden können, ohne vom Rahmen und Geist der vorliegenden Erfin- dung abzuweichen.
Es ist-auch möglich, die erfindungs- gemässe Abschwächung mit existerienden Stämmen des Masernvirus, die an das Wachsen in lebendem, nicht menschlichem Gewebe oder Wachstumsmedien, die Zellen eines solchenGewebesenthalten,angepasstsind, wie der Enders-Stamm des Masernvirus, auszuführen.
BeieinerVerfahrensweise wird die Kultur des nichtmenschlichen tierischen Gewebes wie oben angeg eingerichtet, und sobald ein gutes Wachstum des Gewebes ersichtlich ist, wird di. e. anfangliche Charge der Nährflüsstgkeit durch frische Nährflüssigkeitersetzt, und die Kulturen werden mit lebsndem Masernvimis g Während der Bebrütung des Virus kann eine milde Rührung der Kulturgefässe, wie beispielsweise durch eine Rolltrommeleinrichtung, verwendet werden.
Als Alternative können statische Kulturverfahren verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Gewebezellen in die Nährflüssigkeit eingetaucht sind. Die Verviel- fältigung des Virus wird gewöhnlich durch eine charak teristische cytopathoge, ne Wirkung auf, die Gewebezel- len bewiesen, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. In manchen Fällen jadoch, insbesondere in den frühen Stadien der Anpassung des Virus an einen neuen Typ von Gastzellen, zeigt sich eine be obachtbare cytopathogeneWirkung erst nach einer langen Bebrütungsdauer, wenn überhaupt.
In solchen Fäl- len kann jedoch die Vervielfältigung des Virus durch Titrieren eines Teiles der geimpften Gewebekulturflüs- sigkeit in einer Kultur von menschlichem Gewebe, wie ie z. B. menschlichem Embryohüllengewebe, menschlichem Herzgewebe oder dergleichen, das für das Virus empfindlich ist, verfolgt werden. Das letztere zeigt leicht eine typische cytopathogene Wirkung, wenn es mit Masernvirus. infiziert wird.
Bei der bevorzugten Ausführungsformwird das Virus der Reihenpassage durch aufeinanderfolgende frische tierische Gewebekulturen unterworfen, wobei während einiger, vorzugsweise etwa zehn, Reihenpassagen die Bebrütung bei 35 C vorgenomman wird, um die Anpassung an das spezielle verwendete Gewebe sicherzustellen. In jedem Fall werden weitere Reihenpassagen in einer solchen Gewebekultur darnach mit Bebrütung des Virus bei unter normalen Temperaturen, vorzugsweise von etwa 28 bis 32 C, ausgeführt, um die gewünschte Abschwächung des Virus zu erzielen. Die genaue Anzahl der Reihenpassagen bei der niedrigeren Temperatur, die erforderlich ist, schwankt in Abhängigkeit von Faktoren, wie z.
B. dem spezteilen verwendeten Stamm des Masernvirus, der früheren Kulturgeschichte desselben und dem in der Gewebekultur verwendeten speziellen Gewebe. Bei der Kückenembryogewebekultur sind gute Ergebnissehinsichtlich der Abschwächung erhalten worden, wenn etwa vierzig Reihenpassagen des Virus bei einer BebrütungstempeDatur von 28-32 C verwendet wurden.
Wenn : die Abschwächung des Virus in der vorste- hend beschriebenen Weise erhalten worden ist, kann der gewünschte abgeschwächte Schwarzstamm des Virus durch Gewebekultur auf dem gleichen Typ von Gewebe, an das das Virus angepasst worden ist, und bei fortgesetzter Bebrütung bei Temperaturen von 28 bis 32 C aufrechterhalten werden. Im allgemeinen ist es wünschenswert, jedoch nicht notwendig, das Virus auf frische Gewebekulturen zu übertragen, wenn etwa 20-75%, vorzugsweise etwa 25-50%, der Zellen in einem gegebenen Ansatz einer geimpften Gewebekultur eine cytopathogene Wirkung zeigen.
Ähnliche Techniken werden verwendet, um den abgeschwächten Virus zu vervidlfäligen, um Vorräte für die Impfstoffherstellung zu erhalten. Bei den letzteren Operationen wird die Kultur bebrütet, bis sich das Virus vervielfältigt hat unter Bildungeiner brauchbaren Konzentration desselben, und die Flüssigkeit aus den Gewebekulturgefässen wird geerntet, wie z. B. durch Dekantation unter aseptischen Bedingungen,und durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergleichen, ge klärt.
Das entstehende Produkt kann direkt als Impfstoff verwendet werden oder in Abhängigkeit von der darin enthaltenen Konzentration des Virus. mit einem geeig- neten infizierbaren Verdünnungsmittel oder einer für das Virus nichttoxischen stabilisaterenden Lösung verdünnt werden, um einen fürtigeen flüssigen Impfstoff herzustellen. Wenn ein beträchttliche Teil der Gewebezellen in der Kultur durch die cytopatogenen Wirkung des Wachstaums des Virus nicht zersetzt worden sind, wird frische Filüssigkeit, wie z.
B. eine geeignete Impfstoffstabilisatorlösung, eine im Gleichgewicht befidliche Salzlösung, frisches Nährmediium oder dergleichen, der Kulturgefässen nach dem obigen dekanntierungsschritt augesetzt, und die Gefässe und ihr Inhalt werden einem Zyklus von Gefrieren und Auftauen unterworfen, um weiteres Virus aus den Gewebezellen in Frei heitzusetzen.DieentstehendeFlüssigkeit wird geerntet und mit der vorigen Ernte vereinigt, um ein Impf stoffkonzentrat zu liefern. Das letztere wird von Gewebezellen und Überbleibseln in einergeeigneten Weise, wie oben auseinandergesetzt, befreit, und der Virusgehalt wird durch Teitratio, wie beispielsweise gegen menschliche Gewebekulturzellen, standardisiert.
Darnach kann das Impfstoffkonzentrat gewünschtenfalls direkt zur Impfung vonnichtimmunenMenschen verwendet werden, oder es kann mit einem sterilen Stabilisator, wie z. B. Lactose-Glutamat-Lösung, verdünnt und bis zum Gebrauch gefroren gelagert werden, vorzugsweise bei einer Temperatur von-20 bÅas-70 C.
Als Alternative kann der stabilisierte Impfstoff gefrier- getrocknet werden, um ein trockenes Impfstoffprodukt zu liefen, das leicht zu lagern ist und mit sterilem Wasser oder dergleichen kurz vor dem Gebrauch re konstituiert werden kann.
Obgleich die fortgesetzte Bebrütung bei den vor geschriebenen unternormalen Temperaturen bevorzugt wird, um die gewünschte Abschwächung des Virus unter Bildung des Schwarzstammes des Virus mit der geringsten Anzahl von aufeinanderfolgenden Passagen Sicherzustellen, können geringfügige Abänderungen vorgenommenwerden.BeispielsweisekönnendieRei- henpassagen, bei 28-32 C dunch eine oder mehrere Passagen bei höheren Temperaturen unterbrochen werden, vorausgesetzt, dass die Gesamtzahl der Passagen beiderunternormalenTemperatur ausreicht, um die gewünschte Abschwächung zu erzielen.
In ähnlicher Weise können, nachdem die gewünschte Abschwächung erzielt worden ist, gewünschtenssallseineoderzwei Ver vielfachungspassagen zur Fortpflanzung des Impfstoff vorrats bei geeigneten höheren Temperaturen ausgeführt werden.
Beispiel 1 Gewebekulturtechnik
8-10 Tage alte Kückenembryos wurden nach Entfernung der Augen unter aseptischen Bedingungen fein zerhackt, und das entstehende zerhackbe Gewebe-wurde mit phosphatgepufferter Salzlösungg gewaschen. Das ge waschene Gewebe wurde in bekannter Weise in einem mit einem magnetischen Rührer, gerührten Erlenmeyer Kolben der Wirkung von Trypsin unterworfen.
Das mit Trypsin bebandelte Gewebe wurde bei 1000 Umdre- hungen pro Minute 3 Minuten lang zentrifugiert, und die entstehenden konzentrierten Zellen wurden im Wachstumsmediumsuspendiert,-um500000-600000 Zellen pro Kubikzentimeterzuergeben. Das Wachs tumsmedium bestand aus der Grundsalzlösung von Earle (Natriumchlorid 6, 18 g, Kaliumchlorid 0, 4 g, Calciumchlorid 0, 2 g, Magnesiumsulfatheptahydrat 0, 2 g, saures Natr.
iumphospbat 0, 125 g, Glucose 1, 0 g, Natriumbicabonat 2, 2 g und Phenolrot 0, 02 g, gelöst in Wasser zu 1000 cm3), das 5% Kälberserum und 0, 5% Milohalbuminhydrolysat enthielt und ferner 200 Einheiten Penicillin und 200 Mikrogramm Strepto- mycin pro cm3 enthielt. Die entstehende Suspension wurde in Mengen von 1 cm3 in sterile Röhren geimpft und 24-38 Stunden lang bei 35 C bebrütet.
Ein ähnliches Verfahren wurde auch verwendet, um grössere Ansätze zu erzeugen, indem 60-70 cm3 der Suspension in Blake-oder Roux-Kulturkolben eingeführt wurden.
Nach dem.anfänglichenBebrütungszeitraumfür die Kückenembryogewebezellen wurde das Wachstumsme- dium darausentfernt, die Zellen zweimal. mit Medium 199 von Morgan und Parker (Morgan et al., Procee- dings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1950, 73, S. 1-8) gewaschen, und damach wurden 2 cm3 Medium 199 ohne Serum und auf einen pH-Wert von 7 bis 7, 2 eingestellt, in jedes Rohr zugesetzt oder 100 cm3, des Mediums in jeden Kolben.
Jedes Rohr wurde dann mit 0, 2 cm3 einer Suspension von wirksamem lebendem Masernvirus geimpft oder jeder Kolben mit einem Kubikzentimeter einer solchen Virussuspension'und.dieentstehendenKulturenbei einer Temperatur von 32-28 C während eines Zeit raumesbebrütet,umdieVervielfältigungdesVirfuszu erreichen.
Im allgemeinen wurde das Wachstum des Virus durch die Tatsiache bewiesen, dass die Zellen in der Gewebekultur eine cytopathogene Wirkung, aufwie- sen, und die Reihenpass'agedesVirusaufeinneues Gewebekulturmedium wurde gewöhnlich ausgeführt, wenn etwa 25-50 % der Zellen in der geimpften Kultur die cytopathogene Wirkung aufwiesen. Als Alternative kann das Wachcsteum des Virus in den Gewebekultur verfolgt werden, indem das Kulturmedium in einer Kul- tur von menschlichen Gewebczellen, wie z. B. mensch- lichen Embryohüllen-, menschlichen.
Herz- oder anderen geeigneten Gewoben, mittels des von Schwarz und Zirbel, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1959, Band 102, S. 711-714, dargelegten Verfahrens titriert werden.
Nach genügend Passagen der oben angegebenen Art, um die gewünschte Abschwächung, des Virus zu erzielen, wurden eine oder einigezusätzlichePassatgen in Küclcenembryogewebekultur bei 32-28 C in einem genügend grossem Massstab ausgeführt, um das Virus genügend zu vervielfältigen, dass ein Vorrat von Impf stoffkonzentrat erhalten wurde. Das Impfstoffkonzentrat wurde in bekannter Weise durch Dekantieren, Gefrieren und Auftauen und Waschen geerntet. Der gesammelte Impfstoff wurde durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit und Waschflüssigkeiten geklärt, bis er frei von Gewebezellen und Zellüberbleibseln war.
Beispiel 2 Herstellung und Prüfung des Impfstoffs
Bei Der Herstellung eines Impfstoffes gemäss der bevorzugten ausführungsform der Erfindung wurde der Edmonston-Stamm des Masernvirus, wie er durch Eniders et al. beschrieben wurde, durch Reihenpassage in Kückenemhryogwebekultur mit Bebrütung bei 35 C während 19 aufeinanderfolgenden Passagen aufrechterchalten. Daruach wurch dieses an Kückenembruyo angepasste Virus mittels der Technik von Beispiel 1 während 37 aufeinsanderfolgenden passagen in Kückenembrogewebekultur mit Bebrütung bei 32 C der Reihenpassage unterworfen. Das aus der 37.
Passage erhaltene abgeschwächte Virus wurde 3 letzten Verdün nungs-Kückenembryogewebekultur-Passatge.nunterwor- fen, denen zwei weitere Passagen in einer solchen Ge webekultur folgten, um das Virus zu vervielfachen und einen Impfastoffvorrat zu erzeugen. Bei jeder dieser letzteren passagen wurde die Kultur bei 32 C bebrütet.
Die entstehenden Impfstoffkonzentrate wurden von Gewebezellen und Überbleibseln getrennt und mit einem gleichen Volumen Lactose-Glutamat-Lösung als Stabilisator verdünnt. Die Lactose-Glutamat-Stabilisatorlösung hatte die fol-gende Zusammensetzung :
Kaliumglutamat 0, 956 g
NasHPO4 1, 25 g
KH2PO4 0, 52 g
Lactose 100, 0 g
Wasser Rest bis 1 Liter
Ein Teil. des fertigen Impfstoffs wurde gegen menschliche Herzgewebezellen titriert. Es wurde ge funden, dass die Impfstoffe 103, 5-104, 3 Gewebekultur- infektionsdosen 50% (TCID50) pro 0, 2 cm3 enthiel- ten.
Jeder Impfstoffvorrat wurde durch Impfung in Thioglycolatbakteriennährmedium, durch intra- pertioncale und subkutane Impfung in Meerschweinchen und Mäuse und durch intramuskuläure und intra zerrebrale Impfung von cynamolgösen Affen geprüft und frei von Verunreinigung befunden. Neun Kindern, die gegen Masern nicht immun waren, wurden Dosen von 0,2 cm3 des Impfstoffs infiziert, zwei intramuskulär und siedeben aukbkutan. Bei keinem der geimpften Kinderentwickelte sich ein Masernausschlag, und nur eines Zeigte während der Beobachtungszeit nach der Imfung eine ausgeprägte Temperaturerhähung,d die nur zeitweilig war.
Beispiel 3
Die Reihenpassagen. des Virus von der 37. Passage bei niedriger Temperatur von Beispiel 2 wurden ewie in Beispiel 2 bis zu einer Gexsamtzhal von 65 passagen bei der Behbrütungstemperautur von 32 C forgesetzt.
Impfstoffovrräte mit Lactose-Glutanmat-Stabilisator wurden wie vorstehend hergestellt und gefriergetrockenet.
Der rekonstituterte Impfstoff aus diesem gefriergetrockneten Material hate einen Titer von 102,5-104,5 TCID50 pro 0, 2 cm3. Ein Teil des Impfstoffes wurde auch durch direktes Gefreieren konserviert. Der Impfstoff wurde wie in Beispiel 2 auf Sciherheit geprüft.
70 Kinder, die auf komplementfixierende und neu tralisierende Masernantikörper geprüft worden waren und bei einerSerumverdünnunigvonl:2keinesolche Antikörper zeigten, wurden subkutan mit 0, 2 cm3 der oben beschriebenen Impfstoffe geimpft und darnach während eines Zeitraumes von mehreren Wochen durch ausgebildetes medizinisches Personal beobachtet. Bei keinem der Kinder wurden lokale oder sofortige Reaktionen beobachtet,ausgenommeneineeinzigemilde Nesselausschlagreaktion, die annähernd 4 Stunden nach der Impfung auftrat. Die Temperaturen wurden während des Unters. uchungszeitraumes mindestens einmal täglich und bei den meisten Kindern zweimal täglich gemessen.
In manchen Fällen konnte 7-8 Targe nach der Impfung ein mildes, fieberhaftes Ansprechen, das etwa 2 Tagedauerte,bemerkt werden. Die mittlere maximale rektale Temperatur für alle geimpften Kinder betrug 38, 2 C. Ein milder masernähnlicher Ausschlag wurde nur bei zwei Kindern am 11. bzw.
13. Tage nach dsr Impfung beobachtet. Während der PrüfungentratenkeineernstenKomplikationenirgend- eines Typs auf, und es wurde kein Anzeichen einer Beeinträchtigung des Zentralnervensystems gefunden.
3-6 Wochen nach der Impfung wurde von jedem Kind eine Blutserumprobe entnommen und auf komple. ment- fixierende und neutralisierendeMasernantikörper geprüft. 97, 1 % der Kinder hatten Antikörperniveaus ent wickelt,diemit den von einer natürlichen Maserninfektion herrührenden vergleichbar waren.
Beispiel 4 Gemässdem Verfahren von Beispiel 2 wurden mit einem Masernvirus aus der 37. Passage bei 32 C dieses Beispiels 10 zusätzliche Passagen mit Bebrütung bei 32 C und darauf 15 Passagen mit Bebrütung bei 28 C ausgeführt. Aus der 15. Passage bei 28 C hergestellte Impfstoffe wurden zur Impfung von nichtimmunen Kindern verwendet. Darnach zeigten Be- obachtung und) Untersuchungen der geimpften Kinder, dass das Virus hinsichtlich der Schwere der Reaktion ihm gegenüber abgeschwächt worden war, wobei kein bestimmbarer Verlust von Antigeneigenschaften eingetreten war.
In ähnlicher Weise kann das Masernvirus durch Kultivieren auf isoliertem Gewebe bei einer Temperatur von 28-32 C unter Verwendung von Geweben, wie z. B. Rindernierengewabe, abgeschwächt werden.
Bei der Herstellung der Gewebekulturen können an dere, geeignete proteolytische. Enzyme an Stelle des Trypsins verwendet werden, um die Gewebezellen zu dispergieren. Ebenfalls können andere Kulturflüssigkeiten, wie z. B. das Grundmedium von Eagle, Medium 199, mit 5-10%inaktiviertemPferdeserumoder ein Medium, das aus 8 Teilen der Gr. undsalzlösung von Erle, einem Teil 5% igem Milchalbuminhydrolysat und einem Teil inaktiviertem Pferde- oder Lammserum besteht, verwendet werden.