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Verfahren zur Herstellung einer Tollwutvakzine
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung einer Tollwutvakzine und Vakzinen, die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind.
Vakzinen für die Immunisierung von Hunden gegen Tollwut werden üblicherweise aus Virus erzeugt, das an Embryonal-Hühnereier adaptiert und in diesen gezüchtet wird. Dieses Verfahren wird durch Schwierigkeiten bei der Trennung des gewünschten Virus von den Eikomponenten beeinträchtigt und Vakzinen, die nach diesem bekannten Verfahren'gebildet worden sind, behalten einen hohen Anteil von Hühnerprotein bei, der oft unerwünschte Nebenwirkungen herbeiführt. Ferner ist es schwierig,'Verunreinigungen, wie andere Viren oder Organismen der Pleuro-Pnemonia-Type, von dem durch Eipassage vermehrten Virus zu entfernen. Obwohl das Eivermehrungsverfahren gegenüber älteren Methoden, bei welchen lebende Tiernervengewebe angewendet werden, Vorteile aufweist, ist es nicht wirtschaftlich, und das dabei erhaltene Erzeugnis ist in vieler Hinsicht zu beanstanden.
Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, auf wirtschaftlichere Weise eine Tollwutvakzine des lebenden Tollwutvirus zu erzeugen, welche im wesentlichen von durch übermässige Mengen von Protein oder Nervengewebe bewirkten Nebenerscheinungen frei ist, indem ein Verfahren angewendet wird, bei welchem die Vermehrung oder Züchtung von Hühner- oder Hühnerei-adaptiertem Tollwutvirus in Gegenwart von Hühnerembryozellen erfolgt, worauf das Virus geerntet wird. Die mit der Erfindung verbundenen Vorteile und Verbesserungen können erhalten werden, wenn wenigstens der letzte Vermehrungsschritt ausgeführt wird, während die Hühnerembryozellen in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium vorliegen.
Es ist ein signifikanter Vorteil der Erfindung, dass dieses Verfahren die Ernte des Virus nach einfachen Standardverfahren, wie Gefrieren, Auftauen und anschliessende Trennung einer Suspension des Virus von den Zellbruchstücken, ermöglicht, wodurch die umständlichen Verfahren vermieden werden, die sonst zur Erzeugung von Vakzinen aus Eikulturen notwendig sind.
Es wurde ferner gefunden, dass es möglich ist, die Menge an verunreinigenden Viren und andern Organismen in den Vakzinen wesentlich zu vermindern, indem bei dem oben angeführten Verfahren gemäss der Erfindung ein Tollwutvirus verwendet wird, das einer oder mehreren Verdünnungspassagen in einer Hühnerembryokultur in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium unterworfen worden ist.
Bei der Durchführung der Erfindung wird das adaptierte lebende Tollwutvirus in einer Gewebekultur von embryonalen Hühnerzellen vermehrt. Ein Verfahren zur Herstellung solcher Gewebekulturen besteht im Zerhacken und Dispergieren von 7 - 10 Tage alten Hühnerembryos zur Gewinnung einer Hühnerembryozellendispersion. Die Dispersion wird dann in Kulturbehälter gebracht, die mit einem natürlichen (uncultured) Nährboden versehen sind, der das Wachstum und die Vermehrung der Zellen zu unterhalten in der Lage ist ; die Dispersion wird unter Wachstumsbedingungen gehalten. Wenn ein guter Einschichtwuchs der Hühnerembryozellen erhalten ist, kann ein Impfmaterial des Tollwutvirus in die Gewebekultur eingeführt werden.
Wird in dieser Weise gearbeitet, so wird der Nährboden wenigstens für die letzte Vermehrungsstufe durch ein synthetisches Ünterhaltsmedium ersetzt. Ist anderseits ein guter Einschichtwuchs der Hühnerembryozellen erreicht, so kann der Nährboden abgegossen und das synthetische Unterhaltsmedium entweder vor oder nach einer Beimpfung mit dem lebenden Tollwutvirus zugefügt werden.
Es ist wesentlich, dass das Tollwutvirus, welches beim Verfahren gemäss der Erfindung verwendet
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wird, nicht ein gewöhnlicher (Strassen-) Stamm ist, sondern ein adaptiertes oder modifiziertes Virus.
Eine solche Adaptation oder Modifikation kann beispielsweise durch eine Vermehrung aufeinanderfolgender Passagen in Kücken durch Intracerebralbeimpfung erreicht werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Tollwutvirus verwendet, das so modifiziert und weiter adaptiert oder modifiziert worden ist, indem eine Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Passagen in Embryonaleiern vorgenommen wurde.
Eine von verunreinigenden Viren und andern Organismen im wesentlichen freie Vakzine kann gemäss der Erfindung gebildet werden, wenn das angewendete Tollwutvirus einer oder mehreren Verdünnung- passagen unterworfen worden ist. Bei einer solchen Verfahrensweise wird das geerntete Virus verdünnt und dann in einer Hühnerembryokultur in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium vermehrt.
Zur Gewährleistung eines hohen Reinigungsgrades ist es zweckmässig, solche Verdünnungspassagen wenigstens dreimal, vorzugsweise wenigstens zehnmal, zu wiederholen. Diese Methode derVerdünnungspassagen kann am wirksamsten unter Erreichung eines hohen Reinheitsgrades ausgeführt werden, indem zuerst eine Verdünnung des geernteten Virus in aufeinanderfolgenden Zehnfachstufen erfolgt, worauf man mit einem Teil jeder solchen Verdünnung ein Hühnerembryozellgewebe beimpft und das Virus von dem am meisten verdünnten Impfmaterial, das Wachstum zeigt, für weitere Reihenpassagen oder für die Herstellung der Vakzine verwendet. Zweckmässigkeitshalber wird diese letztere Passagentechnik im Rahmen der Erfindung als "Grenzverdünnungspassage" bezeichnet.
Ausgezeichnetes Wachstum von Tollwutvirus wird im allgemeinen beobachtet, wenn die Vermehrung in dem letzten Vermehrungsschritt oder in den Verdünnungspassagen bei einer Temperatur von 34 bis 370C ausgeführt wird, obwohl vorzugsweise eine Temperatur von etwa 35 C Anwendung findet. Die Zeitdauer, die erforderlich ist, um eine zufriedenstellende Vermehrung des Virus sicherzustellen, variiert in Abhängigkeit von den Bedingungen, unter welchen die Embryozellen gehalten werden. Im allgemeinen kann eine erwünschte Proliferation innerhalb von 4 bis 14 Tagen erreicht werden, obwohl es bevorzugt wird, das Virus nach 7 - 9 Tagen zu ernten.
Die Vermehrung des Tollwutvirus in Hühnerembryozellgewebekulturen wird üblicherweise nicht durch irgendwelche beobachtbare cytopathologische Wirkungen an den Zellen feststellbar sein. Das Wachstum des Virus kann aber durch Intracerebralbeimpfung von Mäusen mit Reihenverdünnungen der Flüssigkeiten aus den Kulturröhrchen nach Bebrütung des Virus festgestellt werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Hühnerembryogewebekultur durch Zerkleinerung von Hühnerembryos (nach Entfernung der Augen) und anschliessender Dispergierung der Zellen derselben durch Trypsinisation hergestellt. Teile der entstehenden Zellsuspension werden in einen Kulturbehälter gebracht, der mit einem geeigneten Nährboden beschickt ist, wie z. B. einer Lösung von Lactalbuminhydrolysat in Earle's Grundsalzlösung, die mit einem tierischen Serum, wie z. B. inaktiviertem Kalbserum, verstärkt ist, und die geeignete Antibiotics enthält, um eine bakterielle Verunreinigung zu unterdrücken.
Sobald sich ein gutes Einschichtwachstum der Hühnerembryogewebezellen eingestellt hat, wird der Nährboden dekantiert und die Zellschicht der Gewebekultur wird mit einem Impfmaterial des Ei-adaptierten Flury-Stammes des Tollwutvirus benetzt. Der Flury-Stamm, auf welchen hier Bezug genommen ist, ist ein ursprünglich gewöhnlicher (Strassen) Stamm, der durch 138 aufeinanderfolgende Passagen unter Intracerebralbeimpfung von Kücken modifiziert worden ist. Bei solchen Arbeitsweisen ist es zur Erzielung guter Ausbeuten an vermehrtem Virus zweckmässig, die Konzentration des Virus und bzw. oder des Eimaterials in dem Impfmaterial zu kontrollieren.
Gute Ergebnisse wurden erzielt, wenn ein Impfmaterial Anwendung fand, das aus einer Suspension von etwa 10/0 Embryomaterial aus einer Aktivkultur des Flury-Stammes des Tollwutvirus in Embryonaleiern bestand.
Gemäss dieser bevorzugten Ausführungsform wird anschliessend an das Benetzen der Hühnerembryozellschicht mit der Suspension des aktiven Virus der Kulturbehälter geschlossen und eine Zeit lang stationär gehalten, um die Absorption des Virus durch die Zellen zu begünstigen. Anschliessend wird ein synthetisches Unterhaltsmedium, wie z. B. das Medium 199 von Morgan, Morton und ParKer, oder Eagle's Grundmedium, dem beimpften Kulturbehälter zugesetzt und der Behälter wird etwa 4 - 14 Tage, vorzugsweise etwa 7-9 Tage, bei einer Temperatur von etwa 350C gehalten, um eine Vermehrung des Virus zu bewirken.
Anschliessende Passagen des entstehenden vermehrten Virus können nach der nachfolgend beschriebenen Adsorptionstechnik oder durch Einführung einer kleinen Menge des geernteten Virus aus einer vorhergehenden Gewebekulturpassage in das Kulturröhrchen erhalten werden. Die Bezeichnung "synthetisches, proteinfreies Unterhaltsmedium", wie sie im Rahmen der Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen Nährboden, der im wesentlichen aus Aminosäuren, Purinen, Zuckern, Vitaminen und anorganischen Salzen zusammengesetzt ist, der in der Lage ist, künstlich erhaltene (cultured) Zellen
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Serum oder andere aus lebenden Tieren erhaltene proteinartige Materialien, deren Anwesenheit nach Impfung der Vakzinen feststellbar ist.
Zur Herstellung der Vakzinen kann das Virus, das durch eine Reihe von Passagen in Hühnerembryogewebekultur gebildet worden ist, in irgendeiner geeigneten Weise geerntet werden. Nach einer bevorzugten Arbeitsweise wird das Unterhaltsmedium, das einen Teil des gebildeten Virus enthält, von der Gewebekultur etwa 7 Tage nach der Beimpfung der Gewebekultur mit dem Virus dekantiert. Nach der Dekantation wird ein entsprechendes Volumen eines geeigneten Vakzinstabilisators, wie z. B. ein Kaseinhydrolysat, eine AminQsäure/Zuckermischung, eine gepufferte Zuckerlösung od. dgl., in den Kulturbehälter eingeführt und der Inhalt desselben wird einer Gefrier- und Auftaubehandlung unterworfen, um die Gewebezellen zu sprengen und das Virus aus denselben in Freiheit zu setzen.
Die Stabilisierungsflüssigkeit wird dann dekantiert, mit der früheren Ernte des Unterhaltsmediums zusammengebracht und zentrifugiert, um Zellbruchstücke. zu entfernen und ein Vakzinprodukt zu erhalten. Das letztere kann dann hinsichtlich seiner Aktivität titriert und in üblicher Weise auf Reinheit geprüft werden. Gewünschtenfalls kann eine solche Vakzine unmittelbar bei niederer Temperatur gelagert oder in einem verschlossenen Be- halter nach dem Gefriertrocknen konserviert werden.
Gemäss einer beispielsweisen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird Ei-adaptiertes Virus des Flury-Stammes, welches dadurch charakterisiert ist, dass es aus dem ursprünglich isolierten Strassen-Virus durch 138 aufeinanderfolgende Passagen durch Intracerebralbeimpfung in Hühnern und anschliessend durch 64 Passagen in Embryonaleiern modifiziert worden ist, in Gewebekulturen von Hühnerembryozellen überimpft. Die Gewebekulturen waren Einschichtkulturen, die in einem Glaskulturbehälter gezüchtet worden-waren.
Das Kulturmaterial wurde wie folgt hergestellt :
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<tb>
<tb> - <SEP> 10Bestandteile <SEP> : <SEP> 0/0 <SEP> : <SEP>
<tb> Earle's <SEP> Grundsalzlösung <SEP> (EBSS) <SEP> 85
<tb> 51oigne <SEP> Lösung <SEP> von <SEP> Lactalbuminhydrolysat
<tb> in <SEP> EBSS <SEP> ohne <SEP> Natriumbicarbonat <SEP> 10
<tb> inaktiviertes <SEP> Kalbserum <SEP> 5
<tb>
Das Nährmedium enthielt ferner 200 Einheiten Penicillin und 200 Mikrogramm Streptomycin je ml.
1 ml-Anteile der obigen Hühnerembryozellsuspension wurden in sterile Röhrchen gebracht und bei einer Temperatur von etwa 350C 24 - 48 h bebrütet, bis ein gutes Wachstum des Gewebes zu beobachten war. Eine ähnliche Verfahrensweise wurde auch zur. Bildung grösserer Ansätze angewendet, indem 60 bis 70 ml der Zellsuspension in Kulturkolben bebrütet wurden. Nach der Anfangsbebrütungsperiode für das Hühnerembryozellgewebe wurde das Nährmedium von den Zellschichten abgezogen und letztere wurden mit einem synthetischen Medium, nämlich Medium 199 vonMorgan und Mitarb. (Proc. Soc. Experimental Biology and Medicine, 73 [1950], S. 1 - 8), ergänzt mit 200 Einheiten Penicillin und 200 Mikrogramm Streptomycin je ml, gewaschen.
Die Waschflüssigkeit wurde von der Zellschicht des Kulturgewebes abgezogen und 0, 2 ml einer wässerigen Suspension eines loigen Embryomaterials vom Embryonaleiern, in welchen der Flury-Stamm des Tollwutvirus vermehrt worden war, wurden zugesetzt und so verteilt, dass eine Berührung mit der Zellschicht gewährleistet war. Dieses Eivirusmaterial hatte einen Titer von 106. 3 Maus-Letaldosen per 0, 2 ml, bestimmt durch Intracerebralbeimpfung in Mäusen. Die Kulturröhrchen und der so behandelte Inhalt derselben wurden 1 h bei 35 C bebrütet, wobei die Röhrchen in einer solchen stationären Lage gehalten wurden, dass das Impfmaterial die Zellschicht bedeckte.
Nach Beendigung dieser Adsorptionsperiode wurden 2 ml des Mediums 199 zu der Kultur gegeben und Röhrchen sowie Inhalt
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wurden in eine Walzentrommel gebracht und 7 Tage lang bei einer Temperatur von 35 C durch Umwälzen langsam bewegt.
Am 7. Tag nach der oben beschriebenen Beimpfung der Gewebekultur mit demEivirus wurde das Kulturmedium gefroren und aufgetaut, um das Intracellularvirus freizusetzen, und die entstehende Mischung wurde zentrifugiert. um Zellbruchstücke abzutrennen. 0, 2 ml der überstehenden Flüssigkeit der zentrifugierten Mischung wurden als Impfmaterial in den frischen Röhrchen mit Kulturgewebe wie vorstehend angegeben verwendet. Nach in der oben beschriebenen Weise durchgeführter Adsorption des Virus wurde wie vorstehend eine Bebrütung während 7 Tagen bei 350C ausgeführt. Nach 6 solchen Passagen wurden nachfolgend Passagen durchgeführt, indem eine frische, gewaschene Gewebekultur, die 2 ml des Unterhaltsmediums enthielt, mit 0,2 ml der überstehenden, Virus enthaltenden Flüssigkeit von der unmittelbar vorhergehenden Passage beimpft wurden.
Nach 4 solchen zusätzlichen Passagen wurde die überstehende Flüssigkeit der Kultur, nachdem sie gefroren und aufgetaut worden war, titriert, indem eine Intra- cerebralimpfung von Mäusen durchgeführt wurde, wobei-gefunden wurde, dass die Flüssigkeit einen Titer von 10-4, je 0, 03 ml aufwies. Dieser Passagewert stellt einen Verdünnungsfaktor von 10 7 des ur- sprünglichen Ausgangsvirus dar.
Beginnend mit dem 14. Passagewert wurde eine Reihe vonCrenzverdünnungs-Reinigungs-Blindpassagen in der folgenden Weise ausgeführt : Das Virus mit dem 14. Passagewert wurde in 10fach-Schritten verdünnt und in Mengen von 0, 2 ml in Hühnerembryokulturen überimpft. Nach 7 Tagen wurden die Kulturen, die mit 10-1- und 10-2-Verdünnungen beimpft worden waren, durch Gefrieren und Auftauen der Zellschicht geerntet ; das Gefrieren und Auftauen der Zellen wurde durchgeführt, um die Zellen aufzubrechen. 10 Tage nach der Beimpfung wurden jene Kulturen, die mit 10-3- und 10-4-Verdünnungen beimpft worden waren, in ähnlicher Weise geerntet. Das gesamte geerntete Material wurde an Mäusen auf Tollwutvirus geprüft.
Die Kulturen, die ein Wachstum des mäuseinfizierenden Virus von dem am meisten verdünnten Impfmaterial zeigten, wurden als Saatmaterial verwendet, das einer Reihenverdünnung unterworfen und in Hühnerembryogewebekulturen, wie vorstehend angegeben, überführt wurde. Nach 8 solchen Grenzver- dünnungsreinigungspassagen, die einen Verdünnungsfaktor aus dem ursprünglichen Embryonaleivirusimpf-
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material. Es wurden 10 solche Grenzverdünnungspassagen durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Endprodukt von verunreinigenden Viren und andern Mikroorganismen frei ist.
Flaschen, die mit trypsinisiertem Hühnerembryogewebe beschickt worden waren, wurden zur Herstellung grösserer Mengen des Virus verwendet. Die Flaschen wurden durch Adsorption einer Mischung von 1, 0 ml der Virussuspension aus einer vorhergehenden Passage und 9 ml des Mediums 199 zu der Zellschicht während 1 h bei 350C beimpft. Dann wurden 90 ml des Mediums 199 zugegeben und die Flaschen stationär bebrütet. 10 Tage nach der Beimpfung wurde die infektiöse überstehende Flüssigkeit entfernt und eine entsprechende Menge eines geeigneten Stabilisators wurde zu der Zellschicht gegeben, die dann durch Gefrieren und Auftauen gesprengt wurde. Die Zellbruchstücke und der Stabilisator wurden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt und zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu entfernen und eine Endvakzine herzustellen.
Andere synthetische Unterhaltsmedien, wie Parker und Healy's synthetisches Medium Nr. 858 oder Eagle's Nährboden, können in dem vorstehend angegebenen Verfahren an Stelle des Mediums 199 verwendet werden, falls dies gewünscht sein sollte.
Die Viren, die aus der 4., 5.. 6. und 7. der oben beschriebenen Gewebekulturpassagen geerntet wurden, wurden vereinigt und als Vakzine für intramuskuläre Injektionen von Hunden verwendet. Diese vereinigte Vakzine zeigte einen Titer von 104, 3-Maus-Letaldosen 500/0 (MLD5 je ml. Eine Dosis von 1 ml dieser Vakzine wurde jedem von 5 Hunden injiziert und 6 ähnliche Hunde wurden als unbeimpfte Kontrolltiere belassen. Etwa 8 Wochen nach der Impfung wurden alle Hunde mit einer Suspension eines virulenten Tollwutvirus beimpft. Alle geimpften Hunde überlebten in gutem Zustand, während alle ungeimpften Kontrollhunde starben.
Zur Veranschaulichung der verbesserten Stärke der nach der Erfindung hergestellten Vakzinen, insbesondere nach Reinigung der oben beschriebenen Grenzverdünnungsmethode, wurden Meerschweinchen intramuskulär mit Vakzinen wie folgt geimpft :
1. Virussuspension aus Hühnerembryogewebekultur (TC) vor Grenzverdünnungsreinigung.
2. Virussuspension aus Hühnerembryogewebekultur nach 10 Grenzverdünnungspassagen.
Ein Anteil von jeder Vakzine wurde einer Reihenverdünnung unterworfen, wobei Verdünnungen von ze 10-2, 10-3 bzw. 10-4 eingestellt wurden, bezogen auf die unverdünnten Vakzinen. Gruppen von Meer-
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schweinchen wurden mit jedem der oben beschriebenen Vakzinen geimpft. Jedes Meerschweinchen erhielt eine Injektion von 0, 25 ml von einer der Vakzinen oder Verdünnungen derselben intramuskulär verabreicht. Andere Gruppen ähnlicher Meerschweinchen wurden ungeimpft als Vergleichstiere belassen.
21 Tage nach der Impfung wurden alle Meerschweinchen mit einem virulenten, gewöhnlichen (Strassen-) Tollwutvirus infiziert, indem intramuskulär eine so standardisierte Menge des Virus verabreicht wurde, dass wenigstens 8CP/o Sterblichkeit bei nicht mit Vakzinen behandelten Meerschweinchen'auftrat. Die Meerschweinchen wurden dann während der weiteren Haltung auf Anzeichen von Paralyse untersucht.
Von der Zahl der Meerschweinchen, die mit jeder Verdünnung der angewendeten Vakzinen geschützt waren,
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<tb>
<tb> :Vakzinezahl <SEP> : <SEP> Quelle <SEP> : <SEP> Maus-Dosis <SEP> (MLD.),
<tb> notwendig <SEP> für <SEP> einen <SEP> Schutz
<tb> von <SEP> 50% <SEP> der <SEP> Meerschweinchen <SEP> : <SEP>
<tb> 1 <SEP> Hühnerembryo <SEP> TC, <SEP> 184
<tb> ungereingt
<tb> 2 <SEP> Hühnerembryo <SEP> TC, <SEP> 35
<tb> gereinigt
<tb>
870/0 der nicht mit Vakzine behandelten Vergleichstiere zeigten Paralyse infolge des Tollwutvirus.
Die vorstehenden Ergebnisse veranschaulichen die Verbesserung der antigenen Eigenschaften des Tollwutvirus, der auf Hühnerembryogeweben gezüchtet wurde. Diese verbesserten antigenen Eigenschaften wurden ohne Erhöhung der Virulenz des Virus für Hunde oder Meerschweinchen erzielt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung einer Tollwutvakzine des lebenden Tollwutvirus, wobei eine Vermehrung oder ein Wachstum von Hühner- oder Hühnerei-adaptiertem Tollwutvirus in Gegenwart von Hühnerembryozellen erfolgt und anschliessend das Virus geerntet wird, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens der letzte Vermehrungsschritt ausgeführt wird, während die Hühnerembryozellen in einem synthetischen, proteinfreien Unterhaltsmedium erhalten werden.