Procédé pour transformer un 11-désoxy-stéroïde en 11-oxy-stéroïde correspondant Récemment, plusieurs stéroïdes contenant un groupe hydroxyle en position 11 sont devenus des agents thérapeutiques importants dans le traitement des maladies. Parmi ces stéroïdes figure le composé F de Kendall.
On a mis au point des procédés pour préparer cette substance à partir des 11-désoxy- stéroïdes, mais malheureusement les intermédiaires appropriés sont rares, et les procédés destinés à intro duire un groupe hydroxyle en position 11 sont peu satisfaisants pour diverses raisons.
Il apparaît que le procédé de la présente inven tion représente un progrès par rapport aux procédés antérieurs d'oxydation des stéroïdes en position 11, parce qu'il évite des réactions secondaires et donne des rendements élevés.
Le procédé suivant l'invention pour transformer un 11-désoxy-stéroïde en 11-oxy-stéroïde correspon dant consiste à soumettre le 11-désoxy-stéroïde à l'action de fermentation oxydante d'un ou plusieurs champignons du genre<I>Botrytis.</I>
On cultive, par exemple, dans des conditions aérobies un champignon du genre Botrytis tel que le <I>Botrytis</I> cinerea, le Botrytis peoniae et/ou d'autres espèces de<I>Botrytis,</I> dans un milieu nutritif approprié, et on le laisse agir sur la substance S ou un ester de celle-ci tel que l'acétate, ou un 11-désoxy-stéroïde apparenté. Pendant la croissance de l'organisme dans des conditions favorables, un groupe hydroxyle est introduit en position 11. Le mécanisme exact de cette oxydation est obscur, mais elle résulte d'enzymes produits par l'organisme lorsqu'il se développe.
Un milieu nutritif approprié contient une source soluble de carbone, de l'azote et des matières minérales pou- vant servir comme sources de carbone: l'amidon de maïs, la mélasse, le maltose, le dextrose, le sucrose, le xylose, le galactose, le glycérol, le mannitol et di vers acides organiques tels que l'acide citrique, l'acide malique, l'acide acétique et divers produits naturels contenant des hydrates de carbone, par exemple la liqueur de macération de maïs, la farine de soja,
la farine de graines de coton et beaucoup d'autres matières accessibles que l'on a utilisées an térieurement comme source de carbone dans des pro cessus de fermentation.
Peuvent servir comme sources d'azote par exem ple la liqueur de macération de- maïs, la farine de soja, la farine de graines de coton, etc., et diverses autres substances telles que l'extrait de boeuf, la ca séine, la levure, les protéines digérées par enzymes, et les produits de dégradation tels que les peptones, les aminoacides .et beaucoup d'autres matières pro- téiniques accessibles que l'on a trouvées appropriées à des processus de fermentation, pour entretenir la croissance des champignons.
Diverses sources inor ganiques d'azote, notamment l'urée, les sels d'am monium, les nitrates, etc., peuvent aussi être incluses dans 1e milieu, comme source d'azote assimilable, pour donner un substrat favorable au développement de l'organisme.
Une grande partie des matières minérales néces saires à la fermentation sont présentes déjà dans les matières que -l'on utilise comme sources de carbone et d'azote. Il y en a également dans l'eau utilisée dans le processus. Mais en général, il est à conseiller d'ajouter en plus des substances fournissant des ions phosphate, sulfate, chlorure, sodium, potassium, magnésium, fer, calcium, cobalt, manganèse et divers autres.
On peut ajouter le 11-désoxy-stéroïde au milieu avant l'inoculation ou bien un ou deux jours après. Pour préparer des inocula, on peut procéder de manière suivante<B>:</B> on prend 5 à 10 cm3 d'eau stérili sée dans laquelle on met, en suspension,
la croissance superficielle d'une culture inclinée en tube d'agar- agar. La suspension résultante de spores et de mycé lium sert à inoculer deux ou trois lots de 100 cm3 de milieu stérilisé dans des fioles Erlenmeyer de 500 cm,', comme indiqué dans les exemples ci-après. Après inoculation, on fait incuber les flacons sur un dispositif secoueur à mouvement alternatif à 21o C pendant environ 2 à 4 jours.
Le contenu de 2 ou 3 de ces flacons sert à inoculer 12 litres de milieu sté rile dans une bouteille de 20 litres.
Les champignons du genre Botrytis croissent à toutes températures de 5 à 30o C et c'est dans cet intervalle de température qu'à lieu de préférence l'oxydation.
Durant le processus de fermentation, on peut as surer l'aération en envoyant de l'air stérilisé à tra vers le milieu à raison d'environ 1/3à 2 volumes d'air par volume de milieu et par minute. On agite en général mécaniquement pour maintenir en suspen sion le mycélium et les autres matières insolubles. On peut ajouter de temps en temps des agents anti- mousse tels que la silicone, les huiles de glycéri des, etc.
Le stéroïde à oxyder peut être ajouté au milieu de la fermentation soit sous forme de poudre. Ainsi on peut dissoudre le stéroïde dans du méthanol ou dans d'autres solvants miscibles à l'eau et l'ajouter au milieu de fermentation. Le stéroïde se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et devient facilement accessible à l'organisme en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fermentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de '/1o à 1 g par litre de milieu.
Lorsque l'oxydation est terminée, on peut isoler le 11-oxy-stéroïde obtenu du milieu de fermentation en ajoutant à celui-ci de l'acétone.
Dans les fermentations sur grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts dans la li queur de fermentation par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non mis cible à l'eau, tel qu'un hydrocarbure inférieur chloré, un alcool, un ester, une cétone, etc. On peut opérer une nouvelle purification et on peut séparer les pro duits stéroïdes d'avec les extraits par des méthodes connues. La séparation des mélanges de stéroïdes peut se faire en faisant usage de la chromatogra phie.
On peut identifier les stéroïdes présents dans la liqueur de fermentation extraite décrite ci-dessus par chromatographie sur bande de papier de la manière suivante: le système solvant utilisé est un mélange eau-méthanol-benzène que l'on prépare en agitant environ 50 % d'eau et 50 % de méthanol avec du benzène dans un entonnoir séparateur,
puis en lais sant les deux couches se séparer. On place une por tion de la couche inférieure dans un plateau ouvert sur le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la phase mobile, et elle sert à remplir la cavité en forme de caniveau à l'intérieur du cylin dre. On prépare une solution étalon de stéroïde en dissolvant 10 mg de chacun des stéroïdes. suivants dans 10 cm3 de chlorure de méthylène Substance S de Reichstein Cortisone Hydrocortisone 11-épi-hydrocortisone On peut également" inclure d'autres stéroïdes dans la solution étalon lorsque c'est nécessaire.
On chromatographie simultanément au moins une solution de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique exactement 0,025<I>ce</I> de la solution étalon de stéroïde sur la bande de pa pier, à la ligne de départ, à 10 cm de l'extrémité su périeure de la bande, que l'on replie par-dessus le bord du caniveau et que l'on plonge dans la phase mobile contenue dans celui-ci. On développe alors la bande pendant 2 à 4 heures à 370 C. De même, on applique 0,1 cm3 de la solution inconnue sur une au tre bande que l'on plie alors dans le même cani veau et que l'on développe avec la bande étalon au stéroïde. Le caniveau permet de développer de nom breuses bandes simultanément.
Après avoir dévelop pé convenablement les bandes de papier, on les en lève de l'appareil et on les sèche à l'air. Après sé chage, on pulvérise les bandes avec une solution al caline de bleu tétrazolium, qui produit de la couleur avec les stéroïdes qui contiennent une chaîne latérale cétole. On aligne des bandes ayant subi le dévelop pement coloré, avec au moins une bande étalon , et on les apprécie. On peut identifier les différents stéroïdes par leurs positions sur les bandes.
<I>Exemple 1</I>
EMI0002.0073
/o <SEP> en <SEP> poids
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>.... <SEP> 1,25</B>
<tb> Mannitol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> (NHi)2HP04 <SEP> <B>....... <SEP> . <SEP> ------- <SEP> 1</B> <SEP> 0,2
<tb> KH,P04 <SEP> ...'................... <SEP> 0,15
<tb> K,HP04 <SEP> <B>...... <SEP> - <SEP> ---------- <SEP> . <SEP> . <SEP> -</B> <SEP> 0,05
<tb> MgS01.7H.;
,,O <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,025
<tb> NaCl <SEP> ........................ <SEP> 0,2
<tb> Solution <SEP> <B>de</B> <SEP> sels <SEP> Wisconsin <SEP> A-Z <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Eau: <SEP> q. <SEP> s.
<tb> PH <SEP> :
<SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> 7,0 On prend 12 litres du milieu ci-dessus contenant 3 g de substance S de Reichstein, stérilisée dans une bouteille de 20 litres, et on les inocule avec 200 cm3 d'une culture mycélienne de 3 jours de Botrytis cine- rea (culture Lederle No N-51).
On conduit la fermen tation à 28 C pendant 240 heures, et au bout de ce temps les analyses sur bandes de papier indiquent une conversion en hydrocortisone de 201% environ.
On filtre le mélange de fermentation résultant, et on. lave le mycélium avec 2 litres, d'acétone. On réu nit cet extrait à la liqueur de fermentation et on 6va- pore l'acétone sous pression réduite. On extrait alors la liqueur par 4 volumes, successifs de 2 litres de chlorure de méthylène ; on réunit les extraits et on les lave à deux reprises avec une solution saline sa turée. Après séchage sur du sulfate de sodium anhy dre, on évapore l'extrait sous pression réduite, et on obtient 4 g d'un résidu huileux.
On dissout alors le désidu dans une portion; de la phase solvant du système: acétate d'éthyle, 4% en poids ; éther de pétrole (point d'ébullition. 90 - 1000, 2 % en poids; méthanol, 3 % en poids; eau, 2 0/0 en poids ;
et on place sur une colonne formée de 220g de terre d'infusoires et 110g de la phase aqueuse du système ci-dessus. On réunit les fractions éluées contenant le stéroïde et on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite.
La cristallisation du résidu par le mélange acétone-éther de pétrole (60 - 70 ) donne des, cristaux fondant à 213-216o C, [a = 1Û = -I- 1621) (éthanol) spectre ultraviolet ?, éthanol max. = 240 - 241 [, (e 16 300). Le spectre d'absorption d'infrarouge est identique à celui d'un échantillon authentique de A-1-prégnène-11P, 17a, 21- triol-3,20-dion.e (hydrocortisone).
<I>Exemple 2</I> On prend 100 cm-1 de milieu tel que décrit ci- dessus à l'exemple 1, dans un flacon Erlenmeyer de 500 c<I>e</I>, et on inocule avec 1 cm3 d'une suspension de spores de<I>Botrytis</I> cinerea (culture Lederle N,>N-51,
sur agar-agar TSA (l'agar-agar TSA est for mé de 3% de bouillon de soja trypticase (Laboratoire Biologique de Baltimore), 5 % de glycérine, 0,
3 0/0 d'extrait de boeuf et 1,5 % d'agar-agar). Au bout de 58 heures d'agitation à 280 C, on utilise 1 cm3 de cet inoculum pour inoculer des tubes:
de secoueuse de 100 cm3 contenant 10 cm3 de milieu stérile comme dans l'exemple 1, et 2 mg de substance S de Reich stein. On fait incuber un tube pendant 96 heures, et au bout de ce temps les chromatographies sur papier indiquent la présence d'environ 1 mg d'hydro- cortisone (rendement 50 %).
<I>Exemple 3</I>
EMI0003.0096
1% <SEP> en <SEP> poids
<tb> Cérélose <SEP> <B>............ <SEP> - <SEP> .........</B> <SEP> 1,0
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> NaCl <SEP> <B>................. <SEP> - <SEP> ... <SEP> ....</B> <SEP> 0,25
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 0,4
<tb> Peptone <SEP> .................... <SEP> 0,4
<tb> Eau:
<SEP> q. <SEP> s.
<tb> pfl <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 7 <SEP> par <SEP> NaOH On met 12 litres du milieu ci-dessus dans une bouteille de 20 litres équipée d'un agitateur et d'un aérateur et on inocule avec 300cm3 d'une culturemy- célienne de 3 jours de<I>Botrytis</I> cinerea (cultureEderle No N-51-61). On conduit la fermentation à 210 C. On ajoute dans la bouteille 3 g de substance S de Reichstein avant de passer à l'autoclave.
La fermentation est suivie périodiquement par un titrage sur bande de papier, et on récolte la bouteille au bout de 72 heures, lorsque le titrage montre une conversion pratiquement complète de la substance S de Reichstein.
Après un traitement comme celui-ci décrit à l'exemple 1, on obtient 7,92 g d'un résidu gommeux. On fractionne ce résidu sur de la terre d'infusoires en utilisant le système :
acétate d'éthyle 3 % en poids; éther de pétrole 2 % en poids; méthanol 3 % en poids ;
eau 2 % en poids pour donner 2,2 g d'un solide cristallin. Quand on chromatographie à nouveau ce solide sur le même système de fraction nement, on sépare le stéroïde désiré, soit 1,043 g, fondant entre 200 et 216,50 C (rendement 33,3 0/0). La cristallisation par le mélange acétone-éther de pétrole donne le composé F pur, point de fusion 217 - 2180 C. Le spectre infrarouge est identique à celui d'un échantillon authentique.
<I>Exemple 4</I> Dans une autre expérience dans des conditions comparables à celles de l'exemple 2, en utilisant le milieu de l'exemple 3, on remplace la substance S de Reichstein par l'acétate de la substance de Reich stein, et on obtient un rendement similaire en hydro cortisone, comme l'indique l'analyse chromatogra- phique. On utilise le<I>Botrytis</I> cinerea (culture Le- derle N N-51-61) comme microorganisme et on conduit la fermentation à 210 C.
<I>Exemple 5</I> Dans une autre expérience dans des conditions similaires à celles utilisées dans l'exemple 4, la <I>Botrytis</I> cinerea, la<I>Botrytis</I> peoniae et trois autres espèces de Botrytis convertissent la substance S de Reichstein en hydrocortisone, comme le montre l'analyse chromatographique.