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PERFECTIONNEMENTS A LA RECUPERATION DE NOUVEAUX FACTEURS DE CROISSANCE OU VITAMINES A PARTIR DE LEURS SOLUTIONS AQUEUSES.
La présente invention concerne la récupération de nouveaux fac- teurs de croissance ou vitamines à partir de leurs solutions aqueuses. Les nouveaux facteurs de croissance ou vitamines faisant l'objet de la présente invention seront désignés ci-après par le nom générique de "coprogènes".
Les coprogènes sont obtenus par fermentation dans des milieux appropriés de certains micro-organismes., comme il est expliqué ci-après. On peut dé- celer la présence de coprogènes au moyen de certaines espèces de Pilobolus de préférence le P. Kleinii etc... par des processus qui seront décrits ci-après.
Les micro-organismes qui produisent des coprogènes sont des bac- téries telles que Sarcina lutea, Micrococcus varians, Alcaligenes bookeri Staphylococcus citreus, Micrococcus agilis; les actinomycetes tels que le Streptomyces griseolus et diverses autres espèces ; deschampignons tels que l'Aspergillus (diverses espèces): groupe du A . mentit, A. alliaceus , A . candidus, A. carbonarius, A. cinnemomeus, A. flavus, A.fumigatus, A. niger, série du Pénicilliumluteum, P. chrysogenum (séries), Epiccum granulatum, Synsporium biguttatum, Hormodendrum pyri, Stemphylium congestum, Ustilago zeae, Diulodia zeae ; et des prozoaires tels que la Polvtomella agilis.
Certaines races de Pénicillium, d'Actinomvces et de Sarcina lu- tea sont de particulièrement bonnes sources de coprogènes selon la présente invention dans des milieux appropriés contenant certaines sources de carbonè telles que les sucres, les amidons ou les acides organiques; certaines sour- ces d'azote minéral ou organique telles que les extraits de viande, les digests enzymatiques et les sels ou nitrates d'ammonium; certains suppléments de croissance tels que les extraits de levure, les sels minéraux tels que le chlorure de sodium et de potassium et de très petites quantités d'élé- m.ents métalliques tels que le magnésium., le fer, le cuivre, le zinc, le cobalt, le manganèse et le bore.
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Les coprogènes de la présente invention sont produits par les organismes précités par développement sur des milieux nutritifs convena- bles dans des conditions favorisant le développement de ces organismes.
On peut réaliser les.fermentations 'dans un intervalle de température de 25 - 37 C et une durée de 24 - 88 heures, mais on obtient généralement la production maximum à environ 32 pendant environ 60 heures.' On fait la culture dans des réservoirs, des bouteilles ou des flacons convenable- ment agités et aérés pendant la fermentation que l'on réalise en condi- tions stériles.
Les coprogènes de la présente invention contiennent du fer et sont indispensables à certains organismes pour leur croissance et utiles à d'autres, ce qui établit ainsi leur valeur dans le domaine de la nutri- tion, en particulier pour compléter des régimes alimentaires manquant de cette vitamine.
Le processus d'essai qui décèle la présence ou la quantité des coprogènes utilise une espèce de Pilobolus., de préférence le P-kleinii, bien que l'on puisse utiliser d'autres espèces telles que le P-Umbonatus le. P-Roidus ou le P-longipes. Le P-kleinii se distingue par un certain nombre de caractéristiques de croissance et de morphologie dans l'agar; les colonies se développent rapidement, le mycélium croît dans la masse plu- tôt que seulement à la surface et la fructification est aérienne. Les sporangiophores transparents, légèrement colorés, couverts de gouttelettes d'eau sont phototropiques et poussent sur des trophocystes en forme de rave dans le milieu.
Les sporangia qui sont fortement chargés sont noirs avec des parois lisses, uniformément eutinisées, contenant une matière mucilagi- neuse. Les sporangia ont un diamètre de 145- 225 . Les spores ovoïdes jaunes à parois minces mesurent 11 - 16 x 6,9 - 9,8 .
On peut isoler les P-kleinii par le processus suivant : on fait incuber du fumier de cheval frais dans une chambre à l'humidité à la tem- pérature ambiante pendant plusieurs jours jusqu'à ce qu'on obtienne des sporangiophores. La germination des spores se produit sur des sporangia des sporangiophores. On fait germer les spores d'un sporangium sur de l'agar, milieu désigné ci-après par Milieu I.
Ce milieu I est préparé de la façon suivante : on ajoute un fumier séché (375 g) vendu sous la marque Bovung (Walker-Gor- don Laboratpries) à 3 litres d'eau de robinet, on mélange, puis on laisse reposer 1 - 3 heures à la température ambiante. On filtre le mélange d'a- bord à travers de la gaze à fromage, puis à travers du papier filtre. On appelle ce filtrat une décoction de fumier. On ajoute ensuite 10 g de fa- rine d'avoine à 500 cc d'eau et on fait bouillir pendant 5 minutes, après quoi on filtre le mélange à travers deux épaisseurs de gaze à fromage.
On ajoute un demi-litre de ce dernier filtrat à un demi-litre de décoctim de fumier. On ajoute 15 g d'agar et le litre de liquide résultant pendant 15 minutes à l'autoclave sous 1,05 atmosphère de pression. La solution sté- rile autoclavée est le milieu I. On la verse dans des assiettes de Petri stériles dans lesquelles on fait germer les spores par des techniques bien connues des spécialistes de la question. On prépare d'autres cultures à partir de petits morceaux d'hyphes végétatifs. On désigne ces derniers sous le nom de "blocs d'agar".
On fait pousser l'organisme d'essai de Pilobolus kleinii dans le Milieu de Base II, défini de la façon suivante :
EMI2.1
<tb> Caséine <SEP> hydrolysée <SEP> par <SEP> HC1 <SEP> Quantité <SEP> équivalente <SEP> à <SEP> 2,5 <SEP> g <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> caséine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1-Cystine <SEP> 50,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-l-Tryptophane <SEP> 100,0"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Adénine <SEP> 5,0 <SEP> " <SEP> "
<tb>
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EMI3.1
<tb> Quanine <SEP> 5 <SEP> ,0 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Uracile <SEP> 5,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Xanthine <SEP> 5 <SEP> ,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Thymine <SEP> 5,0"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> Thiamine <SEP> 500,
0 <SEP> mcg.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Pyridoxine <SEP> 100,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 100,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Riboflavine <SEP> 200,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Acide <SEP> Nicotinique <SEP> 5000 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Choline <SEP> 500,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Inositol <SEP> 200,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Acide <SEP> p-Aminobenzoïque <SEP> 200,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb> Acide <SEP> folique <SEP> 12,0 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Biotine <SEP> 1,2 <SEP> "
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
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<tb> Vitamine <SEP> B12 <SEP> 2,4 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sels <SEP> de <SEP> Speakman <SEP> A <SEP> 2,5 <SEP> cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sels <SEP> de <SEP> Speakman <SEP> B <SEP> 2,
5 <SEP> cc
<tb>
On dissout les constituants dans l'eau distillée et on complète la solution à un volume de 250 cc avec de l'eau distillée. On ajuste le pH à 7,6, avant de soumettre à l'autoclave. La solution autoclavée est le Milieu de Base II.
Pour réaliser l'essai, on ajoute 30 g d'agar purifié (Difco) et on chauffe jusqu'à dissolution. On place 5 cc de cette solution et 5 ce de milieu de base II dans un tube à essai et on soumet à l'autoclave pen- dant 15 minutes sous 1,0 atm. de vapeur. On verse ensuite la solution stérile dans des assiettes de Petri stériles qui sont ensemencées par des blocs d'agar comme défini ci-dessus. Comme le coprogène ou facteur de croissance de Philobolus n'est pas présent dans le milieu de base II, l'or- ganisme ne croit que d'environ 2 cm dans le milieu de base II et cette petite croissance n'est possible qu'en raison de la diffusion du facteur de pilobolus de cet inoculum du bloc d'agar dans le milieu II environ- nant.
On ajoute alors la matière à essayer en solution stérile au moyen de cylindres métalliques creux disposés à la périphérie du milieu de croissance. Il se produit une croissance importante dès que la matière essayée contient un peu de coprogène ou facteur de Pilobolus et le degré de croissance dépend de la quantité de facteur présente.
Un essai quantitatif exige certaines modifications au précé- dent. On place 10 cc du milieu de base II, un volume mesuré de 10 cc ou moins de solution à essayer et suffisamment d'eau distillée pour porter le volume total à 20 cc dans une fiole d'Erlenmeyer de 125 cc munie d'un bouchon de coton. On soumet le flacon et son contenu à l'autoclave et par une technique stérile, on ensemence le mélange autoclavé à un bloc d'agar. On incube alors le flacon à 25 C pendant 5 jours, après quoi on récolte le tampon de mycelium et on le sèche à poids constant. Le poids du tampon de mycelium séché est une mesure de la croissance et par suite de la quantité de coprogène ou facteur Pilobolus présent dans la solution d'essai.
On réalise de préférence la préparation des coprogènes ou fac- teur Pilobolus par culture de Sarcina lutea ou de certaines races de Peni- cillium ou d'Actinomyces dans un milieu nutritif. L'un.quelconque de ces organismes croît de façon satisfaisante sur le suivant.
K2HPO4 1 g
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(NH4)2SO4 1 g
CaCO3 10"
Acide acétique 5 ce
On ajoute 5 g de l'un quelconque des suppléments suivants.
Casitone (Sheffield)
Amine N-Z "
Extrait de levure (Difeo)
Peptone "
Autolysat de levure "
On complète les quantités spécifiées des consti tuants à 500 cc de solution à l'aide d'eau de robinet et on les soumet à l'autoclave. On appelle le mélange autoclavé Milieu III. Naturellement, on peut utiliser de nombreux autres milieux, mais comme on connaît bien la croissance de ces organismes, il n'est pas nécessaire de décrire les conditions parti- culières pour chacun.
On ensemence le milieu III stérile dans des bouteilles sté- riles de 9 litres ou des flacons stériles de 3 litres par un processus standard par une culture de l'un des organismes de production Sarcina lutea Pénicillium P - 5 (série du Chrysogénum) ou Actinomyces A - 81. On incube ensuite le milieu ensemencé à environ 32 pendant environ 60 heures. Pen- dant l'incubation on refoule de l'air stérile à travers le milieu cE! qui assure à la fois l'agitation et fournit l'oxygène.
D'une façon générale, le milieu nutritif dans lequel les orga- nismes qui produisent les coprogènes peuvent se développer de façon satis- faisante contient de l'eau, du carbone assimilable, de l'azote et divers sels minéraux tels que précédemment cités. Comme les constituants du mi- lieu et les conditions dans lesquelles l'organisme s'y développe varient un peu d'un organisme à l'autre et que ces variations sont pour la plu- part bien connues des spécialistes il n'est pas nécessaire de décrire davan- tage les conditions du processus de fermentation.
Le procédé selon l'invention de récupération de coprogènes (tels que définis ici) à partir de leurs solutions aqueuses, consiste à soumettre une solution aqueuse à une extraction par un solvant organique hydroxyle non miscible à l'eau, à séparer la phase solvant et à réduire son volume.
L'invention ne concerne aucune fermentation particulière, car elle convient à la récupération de coprogène de toute solution aqueuse les contenant. Ces solutions aqueuses peuvent avoir été préalablement traitées pour-en extraire toute autre substance précieuse par des processus sans rapport avec la récupération des coprogènes décrits ici. Quand on emploie des liqueurs de fermentation, on élimine par filtration ou autre les cellules libres, les mycelia et autres matières-insolubles pour obtenir la solution limpide contenant les coprogènes.
De préférence, on traite la solution aqueuse par un agent de relargage tel que le sulfate d'ammonium, puis on l'extrait par un solvant hydroxyle non miscible à l'eau tel que le n-butanol, l'isobutanol, l'alcool isoamylique, l'alcool benzylique, le phénol, ou analogues. On peut utiliser d'autres agents de relargage, qui diminuent la solubilité des coprogènes dans l'eau tels que le chlorure de sodium. On les ajoute en toute quantité, de préférence voisine de la saturation. Le pH de la solution aqueuse sou- mise à l'extraction peut être d'environ 2,0 à 10,0. Pour plus de commodi- té, on extrait généralement le bouillon fermenté à sa concentration natu- relle en ions hydrogène, puis on concentre l'extrait.
Quand les solutions aqueuses extraites contiennent suffisamment de coprogène, de sorte que le. concentrât est de même riche en coprogènes, on peut utiliser ce dernier comme agent de nutrition. Ou bien on peut le purifier encore par sépara- tion chromatographique ou tout autre processus de purification et/ou de
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concentration.
On peut soumettre l'extrait concentré à une séparation chroma- tographique par des processus tels que ceux décrits dans les exemples.
La matière purifiée contient ordinairement diverses substances en plus des coprogènes désirés, de sorte qu'un certain nombre de bandes distinctes se développent dans la colonne de chromatographie. Ces substances peuvent consister en pigments et autres substances de compositions connues et in- connues. Les coprogènes désirés de la présente invention présentent une bande rouge orange qui donne une forte couleur pourpre par traitement par une solution aqueuse de chlorure ferrique. On peut démontrer la présence de matière active dans cette bande par l'essai biologique décrit ci-dessus.
Pour obtenir le produit on recueille la bande présentant l'activité et on évapore la solution pour récupérer le facteur de croissance. On peut en- suite purifier la matière par cristallisation dans des solvants organiques.
La chromatographie dont il est question ici est une forme d'extraction à contre-courant dans laquelle on emploie deux solvants non- miscibles ou paires de solvants. On choisit,les solvants selon les solu- bilités relatives de la matière désirée et des impuretés présentes de sorte que le rapport de répartition favorise la séparation optimum pendant le pas- sage à travers la colonne qui est remplie d'une charge inerte. Une phase de ce système est appelée phase stationnaire car elle ne passe pas à travers la colonne mais reste associée à la charge inerte. L'autre phase qui tra- verse la colonne est appelée phase mobile. Pour le coprogène, la terre à diatomées est une charge inerte utilisée de préférence, mais d'autres ma- tières convenables sont la pulpe de papier, le gel de silice, le sable et analogues.
Ordinairement, la phase mobile consiste en un solvant hydroxylé . non miscible à l'eau auquel on ajoute un autre solvant organique qui y est soluble, tel que l'acétate d'éthyle, pour diminuer la solubilité du coprcgè- ne dans la phase mobile (solvant) de sorte qu'il y ait un rapport convena- ble avec la solubilité du coprogène dans la phase stationnaire. La phase stationnaire est aqueuse. Le coefficient de répartition du coprogène dans l'eau et dans le n-butanol est d'environ 5 : 1. L'addition d'un solvant diminuant la solubilité tel que l'acétate d'éthyle à la phase mobile modi- fie ce coefficient en faveur nettement de l'eau.
Comme l'eau est la phase stationnaire, l'accroissement du coefficient ralentit le déplacement du coprogène à travers la colonne et permet le lavage d'une plus grande pro- portion d'impuretés dans la colonne en avant du produit actif, ce qui as- sure une meilleure séparation. Le réglage des colonnes chromatographiques de ce type et leur opération sont bien connus des spécialistes et il n'est pas nécessaire d'en donner davantage d'explications.
Naturellement on peut employer d'autres méthodes si on le désire.
Comme il apparaît d'après la nature de l'invention, son principal but est de séparer la matière active des impuretés avec laquelle elles peuvent être associées, de sorte qu'on puisse la concentrer, puis la cristalliser.
Comme indiqué ci-dessus,on peut obtenir plusieurs coprogènes aidant à la croissance des organismes Pilobolus par le procédé de la pré- sente invention. Ces coprogènes, bien que possédant des propriétés d'acti- vation de croissance semblables, sont des composés distincts comme on le montrera ci-après. Les différents membres de ce groupe sont produits par des micro-organismes différents. On peut les identifier et les séparer l'un de l'autre quand cela est nécessaire grace à leurs propriétés physiques et chimiques distinctes telles que des solubilités différentes dans les sol- vants organiques et des valeurs de Rf différentes dans la chromatographie sur bande de papier.
On va donner maintenant pour illuster l'invention des exemples particuliers de l'isolément des coprogène I et de coprogène II à partir de liqueurs de fermentation particulières.
EXEMPLE 1
On filtre environ 280 litres d'une solution aqueuse résultant
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de la fermentation d'un milieu nutritif par une espèce productrice de péni- cilline (Pénicillium P - 5, Collection Lederle) à pH 8,2 et contenant
3,474 kg de solide au total. On dissout dans le filtrat 500 g/litre de sul- fate d'ammonium et on l'extrait deux fois par le quart de son-volume de n-butanol. On réunit les deux extraits au butanol et on les concentre sous vide. Pendant la concentration, on ajoute de l'eau, de sorte que le résul- tat final est une solution aqueuse exempte de butanol. Le volume de cette solution aqueuse est d'environ 6,5 litres.
On sépare par filtration quel- ques matières insolubles et on extrait le filtrat cinq fois par un cinquiè- me de volume chaque fois d'alcool benzylique. On réunit les extraits à l'alcool benzylique et on lave la solution résultante une fois par un dixième de volume d'eau, ce qui donne 6,5 litres d'une solution d'alcool benzylique lavée à l'eau contenant 43,52 g de solides au total.
On ajoute 2 volumes d'acétate d'éthyle à la solution dans 1' alcool benzylique lavée à l'eau, que l'on extrait ensuite cinq fois, par un dixième de volume d'eau chaque fois. Le rôle de l'acétate d'éthyle dans cette phase est de diminuer la solubilité du coprogène I dans la phase solvant de sorte que l'extraction dans l'eau se produit. Selon une variante, on peut également utiliser à cet effet l'éther, le benzéne et le chloroforme. Le coprogène I est extrêmement soluble dans l'alcool benzyli- que, mais insoluble dans l'acétate d'éthyle, l'éther le benzène et le chlo- roforme.
On réunit les cinq extraits aqueux de couleur rouge foncé puis on les lave avec un demi volume d'acétate d'éthyle pour éliminer l'alcool benzylique. On concentre rapidement sous vide la solution aqueuse lavée 'pour éliminer les traces de solvants organiques, puis on la soumet à une lyophilisation, ce qui donne 45 g de solide au total.
Les solides lyophilisés contiennent alors environ 50 % de co- progène I pur, les impuretés étant principalement trois autres composés comme le montre la séparation chromatographique.
La dernière phase, la lyophilisation n'est pas nécessaire pour l'isolement et la purification du coprogène I, mais on l'emploie souvent, car elle constitue, un moyen de recueillir des échantillons relativement stables de coprogène I brut de différentes charges. On peut conserver ces échantillons et les réunir pour les raffiner encore davantage, comme il est décrit ci-après. Selon une variante, on peut omettre la phase de lyophilisation et on peut préparer la concentration aqueuse lavée et débarrassée de solvant pour la séparation chromatographique par l'un des processus décrits dans les deux paragraphes suivants.
On mélange approximativement 10 ce du concentrat aqueux avec
20 g de terre à 'diatomées (celite) puis on entasse le mélange résultant sui- vant une couche ne dépassant pas environ 5 cm d'épaisseur au sommet d'une colonne chromatographique destinée à être utilisée-pour la séparation.
Selon une variante, on extrait quatre fois 50 cc du concentrat aqueux, chaque fois par approximativement 15 cc d'une solution de deux parties de n-butanol pour 1 partie d'acétate d'éthyle. On combine ensuite les quatre extraits et on peut utiliser la solution résultante d'environ
50 ce pour la séparation chromatographique.
On prépare la colonne chromatographiqtze utilisée pour la sépa- ration du facteur de croissance contenu dans le concentrat avec un sup- port inerte pour la phase aqueuse, telle que la terre à diatomées, du gel de silice ou de la pulpe de papier. Evidemment, cette matière ne doit pas avoir comme le charbon de bois activé un pouvoir d'adsorption élevé pour le coprogène. Une colonne convenable consiste -en un tube de 60 cm de long ayant un diamètre intérieur de 3,7 cm et rempli de 45 cm de terre à diato- mées .
On prépare de la façon suivante la phase solvant et la phase aqueuse de la séparation chromatographique : agite soigneusement dans une ampoule à décantation un mélange de 2 parties de n-butanol, 1 partie
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d'acétate d'éthyle et 1 partie d'acide chlorhydrique aqueux 0,01 N puis on le sépare. On ajoute ensuite la couche aqueuse à la colonne où elle fonne la phase aqueuse.
Après mélange du concentrat aqueux à la terre à diatomées et addition au sommet de la colonne cornue décrit ci-dessus, on ajoute lente- ment à la colonne le mélange de n-butanol et d'acétate d'éthyle solvant saturé d'eau. Quand on emploie les solides lyophilisés à la place, on en dissout 1,5 g dans 15 ce de la phase solvant et on introduit dans la colonne toute la solution. Immédiatement après on ajoute 250 cc de la phase solvant, puis on ajoute encore davantage de phase solvant (environ
2 litres au total) pour développer le chromatogramme. Il se développe quatre bandes distinctes, la première en haut étant colorée en pourpre, la seconde qui contient le facteur de croissance désiré en rouge orange, une bande blanche que l'on peut déceler à l'aide de chlorure ferrique aqueux à 2% et une bande rose.
Quand les bandes sont lavées dans le chromato- gramme on opère des coupures à intervalles appropriés et on recueille d'abord le rouge orange.
On trouve que la solution représentant la troisième bande du chromatogramme ci-dessus contient le coprogène I comme l'indique un échan- tillon donnant une forte couleur pourpre par traitement au chlorure fer- rique aqueux et par essai biologique. On concentre sous vide à une tempé- rature de 30 - 40 cette solution d'un volume d'environ 400 cc. On ajoute de l'eau pendant la concentration, de sorte qu'on obtient finalement une solution aqueuse exempte de solvants organiques et d'un volume d'environ 50 ce. On ajuste à pH 7 par NaOH aqueuse cette solution rouge foncé, puis on l'extrait 5 fois par un cinquième de volume chaque fois d'alcool benzylique. On réunit les extraits à l'alcool benzylique et on lave une fois la solution résultante,, par un dixième de volume d'eau.
On ajoute 2 volumes d'acétate d'éthyle à la solution dans l'alcool benzylique lavé à l'eau et on extrait la solution dans le solvant résultant 4 fois, par un dixième de volume d'eau chaque fois. On réunit les extraits aqueux et on lave la solution combinée une fois avec un demi-volume d'acétate d'éthy- le, on la débarrasse du solvant et on la lyophilise. On utilise la poudre sèche de couleur orange résultante pour préparer le coprogène I cristallisé comme décrit ci-dessus.
On dissout dans l'éthanol absolu sec 7 g de coprogène I puri- fiée c'est-à-dire le produit solide lyophilisé qui vient d'être décrit.
On laisse la solution à température ambiante pendant 5 minutes, temps pendant lequel le coprogène I cristallise. On filtre les cristaux, on les lave d'abord à l'éthanol absolu, puis à l'éther, on on les sèche, ce qui donne 5,85 g de produit. On réalise le séchage dans un pistolet d'Abder- halden sur pentoxyde de phosphore avec de l'éthanol bouillant comme sour- ce de chaleur. On redissout 1 g de coprogène I cristallisé une fois dans 50 cc d'eau et on le lyophilise. On recristallise ensuite les solides secs dans l'éthanol sec.
Le coprogène I cristallise dans l'éthanol absolu sec et touffes de petites aiguilles rouge brique ou en rosettes rouge brique. On peut également réaliser la cristallisation dans le 2-éthoxyéthanol, le méthanol et l'alcool n-propylique. Le composé cristallin est extrêmement déli- quescent et doit être protégé del'humidité atmosphérique. Des échantillons cristallins purifiés foncent nettement à 205 dans un appareillage de point de fusion à microbloc, mais ne fondent pas.
Des solutions donnent une couleur pourpre intense quand on les traite au chlorure ferrique aqueux, Le coprogène I est extrêmement soluble dans l'alcool benzylique et un peu moins soluble dans l'eau ; est un peu soluble dans le méthanol, l'éthanol et le propanol et légèrement moins so- luble dans le butanol,le 2-éthoxyéthanol, l'éther monoéthylique du diéthy- lène glycol, le phénol, l'acide acétique et la pyridine. Le coprogène I est essentiellement insoluble dans les solvants tels que l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le toluène, etc.
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Un certain nombre d'analyses élémentaires sur le coprogène I purifie donnent les valeurs moyennes suivantes : C ' 50,83 %
H 6,83
N 10,33
Ee 6,64
0 25,37 (par différence)
C méthyle 7,13
Poids moléculaire (825). , où la valeur probable de x est 2
Hydrogène actif 0,638
Molécules de H2 fixées par traitement par LIAIS, = 2,08
L'absorption maxima dans l'ultra-violet dans HC1, 0,1 N est à 440 milli ; E 1%, 1 cm = 36,6.
La courbe d'absorption dans l'infrarouge est représentée figure 1 (abscisse : longueur d'onde en cm-1; ordon- née :pourcentage de transmission) qui est une reproduction de la courbe d'absorption.dans l'infra-rouge obtenue dans un spectrophotomètre enre- gistreur Perkin-Elmer, modèle 21, en utilisant un gâchis de coprogène I dans une huile d'hydrocarbure sur une plaque de sel gemme. Il y a une bande d'absorption à 3240 cm-1 (non représentée) fortement liée à -OH ou -NE. A 1733 cm-1,il y a une bande d'absorption intermédiaire de carbony- le,peut-être un ester;à 1860 cm-1, il y a une forte bande d'absorption de carbonyle, ,peut être d'amide, et à 1835 cm-1, il y a une forte bande d'absorption, probablement un groupement -NH.
D'autres bandes d'absorp- tion se présentent à 1733 m, 1660 fo, 1535 fo, 1330 fa, 1300 fa, 1275 fa,
1240 fa, 1220 m, 1170 m, 1140 fa, 1112 fa, 1055 fa, 1020 fo, 985 fa, 950 m,
840 f o .
EXEMPLE 2
On filtre 40 litres de bière fermentée au moyen de Pénicillium chrysogenum, type 1128, grand producteur d pigments, à travers un filtre
Büchner à l'aide de 1000 g de terre à diatomées. Le volume'du filtrat est de 28,5 litres, mais on n'en utilise que la moitié, soit 14,25 litres pour l'isolement suivant -
On dissout 500 g/litre de filtrat de sulfate d'ammonium dans les 14,25 litres de filtrat ce qui provoque la formation d'un précipité.
On ajoute un demi-volume de n-butanol et on agite soigneusement le mélan- ge. On filtre l'émulsion résultante, ce qui donne un filtrat à deux phases que l'on sépare. On re-extrait la couche aqueuse par un demi-volume de butanol et on combine cet extrait au butanol avec la couche de butanol initiale. On concentre sous vide la solution butanolique d'ensemble avec addition constante d'eau, jusqu'à ce qu'il reste une lourde boue aqueuse.
On extrait ce dernier mélange par l'acétate d'éthyle et on rejette l'ex- trait à l'acétate d'éthyle. On filtre le mélange aqueux résiduel et on extrait le filtrat trois fois par des portions de 500 cc d'alcool benzyli- que. - On réunit les extraits à l'alcool benzylique et on lave une fois la solution résultante avec 100 cc d'eau. On ajoute 3 litres d'éther à la solution de 1,5.litre d'alcool benzylique lavé à l'eau et on extrait trois fois la solution dans le solvant résultant par des portions de 100 ce d'eau. en réunit les extraits aqueux, puis on les lave avec 250 ce d' acétate d'éthyle. On débarrasse la solution de solvant et on la lyophilise ce qui donne 2,14 ?- de poudre sèche.
On développe les 2,14 g de solide lyophilisé sur un chromato- gramme de séparation de 80 g de Celite dans une-colonne de 25 mm de dia- mètre. Par ailleurs, la colonne et les phases sont les mêmes qu'à l'exem- ple 1. On entraine- par lavage au bas de la colonne la bande orange clair
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(seule bande donnant un test positif au chlorure ferrique) ce qui donne une solution à deux solvants. On concentre cette dernière solution sous vide avec addition d'eau pour obtenir une solution aqueuse de 50 ce que l'on lave une fois avec 500 cc d'éther. On débarrasse du solvant la solution aqueuse lavée à l'éther et on la lyophilise, ce qui donne 400 mg de poudre sèche.
Le chromatogramme sur bande de papier du système à
10 parties d'eau, 8 parties de butanol et 1 partie d'acide acétique, mon- tre que la valeur du Rf de cette poudre est de 0,238 au lieu de 0,268 pour la coprogène I.
On soumet à une séparation chromatographique les 400 mg de poudre sèche, à nouveau de la même manière, sauf qu'on utilise une plus grande colonne; 120 g de Celite dans un tube de 3,75 cm. On entraîne également par lavage la bande orange à l'extrémité du chromatogramme et on concentre la solution dans deux solvants en une solution aqueuse.
On neutralise cette solution aqueuse à pH 7,0 et on l'extrait par l'al- cool benzylique. On lave l'extrait à l'alcool benzylique une fois par un dixième de volume d'eau. On ajoute deux volumes d'éther à la solution dans l'alcool benzylique lavée à l'eau, et on re-extrait par l'eau la solution résultante. On lave ensuite l'extrait aqueux à l'éther, on le débarrasse du solvant et on le lyophilise. On dissout la poudre sèche résultante dans un minimum d'eau et on ajoute de l'acétone jusqu'à ce que la solution présente un léger trouble. Après environ 2 heures, la cris- tallisation est achevée, on sépare les cristaux, on les lave, on les sè- che; on trouve qu'ils pèsent 120 mg. On dissout ces cristaux dans le minimum d'eau et on ajoute du méthanol jusqu'à ce que la solution présente un léger trouble.
La cristallisation est à nouveau achevée en environ 2 heures. On la fait suivre par une seconde cristallisation dans le mélange eau-acétone. On sèche le coprogène II recristallisé deux fois pendant une heure sur P205 dans le pistolet Abderhalden en utilisant de l'éthanol bouillant comme source de chaleur.
Le coprogène II cristallise en solution dans les mélanges eau- acétone en fines aiguilles oranges qui dans un appareil à point de fusion à micro-bloc se décomposent à 1750 en devenant brusquement noires à cette température. L'analyse d'un échantillon purifié donne les valeurs suivan- tes :
C 40,62 %
H 6,47
N 14,95
Fe 6,59
0-méthylique 5 ,20
Hydrogène actif 0,76
Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge d'échantillons de coprogène II purifié présente un aspect caractéristique. La figure 2 (abscisse : longueur d'onde en cm-1; ordonnée : pourcentage de transmis- sion) est une reproduction d'une portion de la courbe d'absorption dans l'infra-rouge du coprogène II. Il y a une large absorption -NH ou -OH cas- trée à environ 3340 cm-1 (non représentée).
Deux bandes d'absorption de car- bonyle se présentent à 1635 et 1646 cm-1. Une absorption d'amine probable se présente à 1585 cm-1 et une absorption de - NH probable à 1525 cm-1.
De plus, des bandes d'absorption se présentent aux longueurs d'onde sui- vantes et sont indiquées par les symboles Fa (faible), m-moyenne) et fo (forte). Ces absorption sont : 1300 fa, 1303 fa, 1280 fa, 1245 fa, 1225 tfa 1210 tfa, 1193 tfa, 1105 fa, 1803 fa, 1065 fa, 1028 m, 990 fa, 977 m, 935 fa 855 fa, 835 fa, 815 fa.
EXEMPLE 3.
On filtre 40 litres de bière fermentée à partir de Penicillium chrysogenum, race C-1849, donnant naissance à peu de pigments à travers un
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entonnoir Büchner à l'aide de 1000 g de terre à diatomées (Hyflo-Super-Cel) On acidifie les 30 litres de filtrat à pH 2,2 à l'aide d'acide chlorhydri- que et on filtre un précipité brun lourd. On lave une fois le filtrat à l'aide de 8 litres d'acétate d'éthyle. On neutralise la solution lavée à pH 7,0 à l'aide de NaOH aqueuse. On dissout 500 g/litre de sulfate d'ammo- nium dans la solution neutralisée et on filtre le précipité résultant. On extrait 4 fois le filtrat chaque fois par 4 litres de n-butanol. On réu- nit les extraits au butanol et on concentre la solution résultante sous vide à 1300 cc.
On ajoute au concentrat 2 volumes d'acétate d'éthyle et on extrait la solution résultante dans deux solvants quatre f@is par des portions de 100 ce d'eau. On réunit les extraits aqueux et on les re-ex- trait quatre fois par l'alcool benzylique. On réunit les quatre extraits à l'alcool benzylique, on lave une fois la solution de 340 cc résultante par un dixième de volume d'eau. On ajoute deux volumes d'acétate d'éthyle à la solution lavée d'alcool benzylique -et on extrait la solution, dans deux solvants, résultante par environ 100 ce d'eau. On lave l'extrait aqueux par un demi-volume d'acétate d'éthyle, puis on la débarrasse du solvant et on la lyophilise.
On soumet les solides lyophilisés à une opération chro- matographique de la même manière que dans les exemples précédents et -on obtient 42,3 mg de cristaux à partir de la bande orange. La cristallisation et le séchage sont les mêmes qu'il est décrit à l'exemple 2. On trouve que les 42,3 mg de matière cristalline ainsi obtenue sont identiques, par com- paraison des spectres d'absorption dans l'infra-rouge., au coprogène II iso- lé et cristallisé comme il est décrit à l'exemple 2.
EXEMPLE4.
On filtre 188 litres d'une masse fermentée provenant d'une fermentation de Pénicillium à l'aide d'Hyflo-Super-Cel et on obtient 140 litres de filtrat. On ajuste le pH du filtrat à 2,0 - 2,2 et on filtre le mélange. On lave le filtrat avec 1/4 de volume d'acétate d'éthyle. On ajuste le pH de la solution aqueuse lavée à environ 7,0 et on ajoute 70 kg de sulfate d'ammonium. On extrait ensuite cette solution cinq fois par du n-butanol en utilisant un cinquième de volume pour chaque extraction.
On réunit les cinq extraits au butanol et on concentre sous vide les 132 litres de solution butanolique résultante. Pendant la concentration, on ajoute de l'eau de telle sorte que la solution résultante finale est un concentrat aqueux exempt de butanol, d'environ 5 litres. On filtre ce concentrat aqueux et on lyophilise le filtrat.
On extrait les solides lyophilisés secs (environ 200 g) par du n-butanol saturé d'eau. 130 g sont dissous de façon à donner une so- lution de 1300 cc au total. On verse cette solution dans une colonne chromatographique de 7,5 cm de diamètre et 1,20 m de long, remplie de 1500 g de Celite humectée par 750 cc de butanol saturé d'eau. On développe la colonne par approximativement 7,7 litres de phase solvant (butanol satu- ré d'eau). Ce volume est suffisant pour laver à travers la colonne la bande caractéristique de couleur orange contenant le coprogène II.
On concentre sous vide à sec le percolat contenant le coprogène II (approxi- mativement 4 litres et 23,54 g de solide) et on soumet de la même façon le concentrat résultant à une chromatographie en utilisant une colonne de 1500 g de Celite et le système solvant eau-butanol-acétate d'éthyle dans le rapport 1 : 2 : 1. On recueille la bande orange caractéristique sous forme de percolat. On concentre cette solution sous vide avec addition fréquente d'eau de façon à obtenir un concentrat aqueux final d'environ 25 ce. On filtre cette solution et on ajoute de l'éthanol au filtrat jusqu'à ce qu'il présente un léger trouble. On refroidit alors ce mé- lange à 5 pendant 2 heures, ce qui provoque la cristallisation du copro- gène II dans la solution.
En plus des paires de solvants ci-dessus, grâce auxquels on peut faire passer le coprogène d'une phase aqueuse à la phase solvant et ainsi le purifier, on peut utiliser comme phase solvant d'autres solvants organiques hydroxylés non miscibles à l'eau. Comme on l'a précédemment noté, on peut ajouter au solvant hydroxylé des solvants organiques ayant
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de mauvaises propriétés de solubilité pour le coprogène pour y diminuer la solubilité du coprogène de façon à obtenir une séparation satisfaisante.
Pendant l'extraction, on peut utiliser les paires de solvants suivantes : butanol-eau, butanol-HOI 0,01 N, alcool n-amylique-eau, CHC1 - phénol-eau alcool benzylique-eau, alcool isobutylique-eau, alcool benzylique- CO1, - eau et diverses autres combinaisons pouvant être suggérées par les pro- priétés de stabilité des coprogènes. On notera que quand on utilise un système de solvants organiques mixtes, comme phase solvant, la solubili- té du coprogène dans cette phase et son coefficient de répartition à la phase aqueuse peuvent être ajustés en proportionnant le solvant hydroxylé et les autres solvants organiques pour obtenir le coefficient de répar- tition désiré.
On doit également noter que le coprogène est fortement adsor- bé sur certains adsorbants tels que le charbon de bois activé, et ce fait procure un moyen distinct de concentration de matière active. On peut mettre en contact des solutions aqueuses contenant du coprogène avec ces adsorbants, les laver et ensuite soumettre le coprogène à une élution avec des solvants tels que le méthanol ou autres solvants comme il est apparent de la description précédente.
REVENDICATIONS
1. Procédé de récupération de coprogènes (tels que définis plus haut) à partir de leurs solutions aqueuses, caractérisé en ce qu'on extrait la solution aqueuse par un solvant organique hydroxylé non miscible à l'eau, on sépare la. phase solvant et on réduit son volume.