<B>Procédé de</B> préparation <B>d'un nouvel</B> antibiotique La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un nouvel antibiotique.
Ce nouvel antibiotique, la tétracycline, a la formule brute C.,,2H,,@N.,O, et la formule de structure:
EMI0001.0005
Selon l'invention, on prépare ce nouvel an tibiotique par un procédé qui est caractérisé en ce qu'on hydrogène de la chlortétracycline jusqu'à ce qu'au moins une molécule d'hydro gène ait été absorbée par molécule de chlor- tétracycline, de manière à remplacer l'atome de chlore par un atome d'hydrogène.
La tétracycline est amphotère et forme des sels à la fois avec les acides et les bases. Par exemple, la tétracycline forme des sels avec des acides organiques et minéraux et on peut l'obtenir sous forme du chlorhydrate, du brom- hydrate, du sulfate, du nitrate, du phosphate, de l'ascorbate, du citrate, du succinate, de l'acé tate, du sulfamate et autres sels d'addition avec des acides de nature semblable. La tétra cycline forme également des sels avec des ba ses, par exemple les bases des métaux alcalins ou alcalino-terreux ou les bases aminées ou ammoniacales.
Des exemples particuliers en sont les sels de calcium, d'éthylène-diamine, de sodium, de pipéridine, de potassium, et de lithium. Cette matière amphotère forme éga lement des sels, ou plus exactement des com plexes, avec les sels basiques de l'acide bo rique, par exemple avec le borate de sodium.
Les sels des types ci-dessus décrits sont précieux dans les processus d'isolement et de purification car, dans chaque cas, on peut fa cilement les neutraliser pour obtenir la matière amphotère libre. Ces sels possèdent également des propriétés antiseptiques et chimiothérapeu- tiques et, en fait, on peut dans de nombreux cas les employer de préférence à la matière amphotère libre.
La tétracycline et ses sels ont, dans une large mesure, les propriétés avantageuses de la chlorotétracycline et de l'oxytétracycline (vendue sous la désignation commerciale Terramycine ) et de leurs sels. La chloroté- tracycline et ses sels sont peut-être les ma tières antibiotiques les plus actives que l'on connaisse, mais présentent l'inconvénient d'être assez instables en solution aqueuse<I>à pH 7,4.</I> L'oxytétracycline, bien que pas aussi active que la chlorotétracycline, a l'avantage d'être considérablement plus stable dans ces condi tions.
Comme on le verra, la stabilité en so lution aqueuse<I>à pH 7,4</I> est une caractéristique désirable car ce<I>pH</I> est fréquemment voisin de celui du sang et c'est celui auquel sont exécutés de nombreux essais. En fait, la stabilité accrue de l'oxytétracycline en solution aqueuse à ce <I>pH</I> lui donne fréquemment une activité ap parente supérieure à celle de la chlorotétra- cycline. Il est vraiment surprenant que la té tracycline et ses sels aient des -activités voisines dans certains cas de celles de la chlortétra- cycline et soient plus stables que l'oxytétra-
cycline. Le tableau suivant indique les activités comparées du chlorhydrate de chlortétracycline, du chlorhydrate d'oxytétracycline et du chlor- hydrate de tétracycline. On a choisi systéma tiquement les organismes pour montrer le large champ d'activité que présente le nouveau com posé selon l'invention.
Toutes les détermina tions ont été effectuées au moyen d'un essai de diffusion sur agar de 24 heures, sauf pour le Mycobacterium pour lequel il s'agit d'un essai de 48 heures ; les valeurs données pour l'activité sont la mesure en mm du bord de la coupe au bord de la zone d'inhibition. Toutes les plaques sont à base d'agar nutritif sauf in dication contraire.
EMI0002.0020
<I>TABLEAU <SEP> 1</I>
<tb> <I>Activité <SEP> comparée <SEP> des <SEP> antibiotiques: <SEP> chlortétracycline <SEP> (A), <SEP> oxytétracycline <SEP> (T) <SEP> et <SEP> tétracycline <SEP> (D)</I>
<tb> Agar <SEP> 100 <SEP> gamma/ml <SEP> 10 <SEP> gamma/ml
<tb> Organisme <SEP> H <SEP> A <SEP> T <SEP> I <SEP> D <SEP> A <SEP> T <SEP> D
<tb> Bâtonnet <SEP> Gram <SEP> négatifs <SEP> 7,8 <SEP> 2,1 <SEP> (a) <SEP> 2,3 <SEP> (a) <SEP> 2,6 <SEP> (a) <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> E. <SEP> Typhosa <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> i <SEP> 6,0 <SEP> 5,4 <SEP> 4,2 <SEP> 4,3 <SEP> 3,2 <SEP> (a) <SEP> I <SEP> légère <SEP> I <SEP> légère
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> j <SEP> 7,8 <SEP> 3,6 <SEP> 3,7 <SEP> 3,9 <SEP> légère <SEP> <SEP> i <SEP>
<tb> (N <SEP> 8) <SEP> 6,0 <SEP> 8,9 <SEP> 6,7 <SEP> 7,4 <SEP> 2,4 <SEP> ! <SEP> <SEP>
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> 3.0 <SEP> 5,6 <SEP> 4,4 <SEP> légère <SEP> <SEP>
<tb> (No <SEP> 28) <SEP> 6,0 <SEP> i <SEP> 7,2 <SEP> 5,8 <SEP> 5,8 <SEP> 4,3 <SEP> (a) <SEP> 2,1 <SEP> (a) <SEP> 2,0 <SEP> (a)
<tb> E. <SEP> ol9# <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> 2,6 <SEP> (a) <SEP> 2,2 <SEP> (a) <SEP> !. <SEP> 2,4 <SEP> (a) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <B>(N-</B> <SEP> 6,0 <SEP> 4,3 <SEP> 3,8 <SEP> 3,8 <SEP> légère <SEP> légère <SEP> légère
<tb> Alcaligenes <SEP> sp. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 7,8 <SEP> 3,5 <SEP> 2,1 <SEP> 2,4 <SEP> <SEP> 0 <SEP>
<tb> (PC <SEP> 13) <SEP> '@ <SEP> 6,0 <SEP> 6,7 <SEP> 4,5 <SEP> 5,4 <SEP> 3,7 <SEP> (c) <SEP> ; <SEP> 2,5 <SEP> (c) <SEP> 2,7 <SEP> (c)
<tb> Cocci <SEP> Gram <SEP> positifs <SEP> 7,8 <SEP> 5,6 <SEP> 5,2 <SEP> 5,5 <SEP> 2,6 <SEP> 1,3 <SEP> 2,2
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,0 <SEP> 10,1 <SEP> 8,4 <SEP> 9,0 <SEP> 7,2 <SEP> 4,4 <SEP> 5,5
<tb> S. <SEP> albus <SEP> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> chlor tétracycline <SEP> et <SEP> à <SEP> l'oxy- <SEP> 7,8 <SEP> légère <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> tétracycline) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ;
<SEP> 6,0 <SEP> 0,5 <SEP> (c) <SEP> légère <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> \ <SEP> 0
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7.4 <SEP> (b) <SEP> 12,1 <SEP> 11,0 <SEP> 11,4 <SEP> 8,2 <SEP> 6.3 <SEP> 7,0
<tb> (C-203) <SEP> i
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,4 <SEP> (b) <SEP> 11,0 <SEP> 10,1 <SEP> <B>110.0</B> <SEP> 1 <SEP> 7,8 <SEP> 7,3 <SEP> 7.1
<tb> (NY-5)
<tb> S. <SEP> lutea <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> 7,6 <SEP> 7,0 <SEP> 7,5 <SEP> 3,5 <SEP> 3,4
<tb> 3,1
<tb> 6,0 <SEP> 12,9 <SEP> 10,2 <SEP> 11,1 <SEP> 8,5 <SEP> 5,5 <SEP> 1 <SEP> 6,8
<tb> Bâtonnets <SEP> Gram <SEP> positifs <SEP> B. <SEP> 7,8 <SEP> ' <SEP> 7,4 <SEP> 7,0 <SEP> 7,1 <SEP> 5,1 <SEP> <I>4,2 <SEP> 4,5</I>
<tb> cerus <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 6,0 <SEP> 12,6 <SEP> 10,4 <SEP> 10,9 <SEP> 11,0 <SEP> 8,1 <SEP> 9,4
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> 7,6 <SEP> Î <SEP> 7,2 <SEP> 7,0 <SEP> 3,4 <SEP> 1,7 <SEP> 2,5
<tb> (N,, <SEP> 17) <SEP> 6,0 <SEP> <B>113,7</B> <SEP> 9,8 <SEP> ' <SEP> l <SEP> 1,7 <SEP> 9,6 <SEP> i <SEP> 5,0 <SEP> <B>1</B> <SEP> 7,1
<tb> Mycobacteria <SEP> M. <SEP> Tubercu losis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,0 <SEP> (d) <SEP> 112,1 <SEP> 9,2 <SEP> 9.8 <SEP> 6,8 <SEP> 3,3 <SEP> 4,0
<tb> (TB <SEP> No <SEP> 607) <SEP> ,
<tb> a) <SEP> zone <SEP> trouble
<tb> b) <SEP> agar <SEP> pour <SEP> infusion <SEP> interne
<tb> c) <SEP> zone <SEP> claire <SEP> contenant <SEP> des <SEP> colonies <SEP> dans <SEP> la <SEP> zone <SEP> d'inhibition
<tb> d) <SEP> glycérine <SEP> ajoutée <SEP> à <SEP> l'agar <SEP> nutritif.
On notera dans le tableau ci-dessus que dans deux cas le chlorhydrate de tétracycline montre une activité supérieure à celle du chlor- hydrate de chlortétracycline et du chlorhydrate d'oxytétracycline. Dans 25 cas, la tétracycline montre une activité supérieure à celle de l'oxy- tétracycline, mais inférieure à celle de la chlor- tétracycline. Dans un cas, la tétracycline mon tre une activité supérieure à celle de la chlor- tétracycline,
mais inférieure à celle de l'oxy- tétracycline. Dans 12 cas, la tétracycline mon tre une activité au moins aussi élevée que celle de l'oxytétracycline, et dans seulement 6 cas, la tétracycline montre une activité légèrement inférieure à celle de la chlorotétracycline et de l'oxytétracycline. Si l'on considère la stabilité et autres avantages de la tétracycline et de ses sels il est évident que ce sont des composés de grande valeur.
Le tableau suivant donne le résultat d'es sais de détermination de la stabilité relative de la chlorotétracycline, de l'oxytétracycline et de la tétracycline. Les essais sont réalisés sur des solutions aqueuses, préparées à partir des chlorhydrates des trois composés en milieu tampon phosphaté<I>à pH 7,4.</I> On emploie dans chaque cas un essai standard de turbidimétrie avec le Staphylococcus aureus (Ann. New York Academy of Sciences, 5 P. 218 (1940)).
EMI0003.0026
<B><I>TA</I></B><I> <SEP> BLEA <SEP> U <SEP> 11</I>
<tb> Temps <SEP> en <SEP> heures
<tb> <I>à <SEP> pH <SEP> 7,4</I> <SEP> 37o <SEP> C <SEP> Tétracycline <SEP> Chlorotétracycline <SEP> Oxytétracycline
<tb> 0 <SEP> 24,8 <SEP> 100 <SEP> 20
<tb> 12 <SEP> 20,7 <SEP> 1,83 <SEP> 13,3
<tb> 24 <SEP> 12,2 <SEP> 0,3 <SEP> 8,9
<tb> 36 <SEP> 6,2 <SEP> 0,16 <SEP> 5,4
<tb> 60 <SEP> 2,16 <SEP> 0,98 <SEP> 1,84
<tb> 84 <SEP> 1,21 <SEP> 0,82 <SEP> 0,94 Les valeurs sont calculées en activité du chlorhydrate de chlortétracycline en microgrammes par cc.
Pour être une matière thérapeutique d'effi cacité maximum, un composé doit être relati vement stable pendant au 'moins douze heures dans presque n'importe quelles conditions qu'il rencontrera vraisemblablement et on voit d'après le tableau ci-dessus que la tétra cycline est, dans les conditions d'essai, consi dérablement plus stable que la chlorotétracy- cline et notablement plus stable que l'oxytétra- cycline. Au bout de douze heures, la chloroté- tracycline a perdu 98,
17 % de son activité et l'oxytétracycline 33,5 % de son activité, mais la tétracycline n'a perdu que 16,5 % de son activité.
En fait, la stabilité remarquable de la tétracycline en solution aqueuse<I>à pH 7,4</I> peut constituer la base d'un test simple pour sa présence. Les sels d'acides de la tétracycline sont pré parés d'une manière analogue aux méthodes employées habituellement pour la préparation des sels d'acides de la chlorotétracycline et de l'oxytétracycline. Par exemple, on peut prépa rer les sels d'acides en ajoutant l'acide orga nique ou minéral désiré à la matière ampho tère dans l'eau, puis en évaporant la- solution résultante sous vide à température réduite.
Dans certains cas, il est plus commode de pré parer les sels d'acides par addition de l'acide désiré à une suspension de la matière ampho tère libre dans un solvant organique tel que le butanol, puis en laissant le sel d'acide cristal liser dans le mélange. En plus d'être très actifs et stables, ces nouveaux sels ont l'avantage supplémentaire d'être dans la plupart des cas plus solubles que les sels correspondants de chlorotétracycline ou d'oxytétracycline. La so lubilité dans l'eau, bien que pas toujours avan tageuse, est dans de nombreux cas très dési rable.
Par exemple, dans la préparation d'un remède pour l'administration parentérale, une matière à solubilité dans l'eau relativement élevée est nécessaire.
L'excellente stabilité et solubilité dans l'eau des sels d'acides de la tétracycline les rend idéaux pour la préparation de remèdes pour l'administration parentérale.
On prépare de même les sels avec les bases, par des méthodes analogues à celles utilisées pour la préparation de sels basiques de chloro- tétracycline et d'oxytétracycline. Les sels avec les bases, qui sont relativement insolubles dans l'eau, tels que les sels de métaux alcalino- terreux, peuvent être préparés par addition d'une base choisie à une solution aqueuse de la matière amphotère libre ou à un sel d'acide de celle-ci et en laissant précipiter dans la solution le sel insoluble dans l'eau résultant.
Dans la préparation des sels solubles dans l'eau tels que les sels des métaux alcalins et des ba ses aminées, il est ordinairement nécessaire d'éliminer partiellement le solvant par évapo ration à température et pression réduites pour effectuer les précipitations. Les sels de la tétra cycline avec des bases sont très semblables aux sels analogues de la chlorotétracycline sauf qu'ils sont généralement plus solubles dans l'eau, les sels de calcium et de magnésium étant approximativement dix fois plus solubles que les sels correspondants de la chlorotétra- cycline, et ils sont fréquemment plus sensibles à l'oxydation superficielle.
En plus de leurs propriété chimiques et chimiothérapeutiques indiquées ci-dessus, la tétracycline et les sels de tétracycline préparés selon l'invention peu vent être caractérisés par leurs propriétés phy siques. On a montré qu'ils sont différents de tous les autres composés connus et qu'ils cons tituent des entités chimiques à la fois par leur forme cristalline et leurs spectres infrarouge et ultraviolet.
Recristallisée dans un mélange eau-métha- nol à la température ambiante, la -matière am- photère libre cristallise sous forme d'un tri- hydrate. Les cristaux du trihydrate sont de couleur jaune et de forme tétraédrique et ta bulaire. Les indices de réfraction de cette for me cristalline sont: alpha = 1,530 0,003 ; bêta = 1,646 0,003 ; gamma = 1,798 0,003 ; l'angle optique 2V est de<B>80 - 85,,</B> et le signe optique est positif.
Le trihydrate perd son eau de cristallisation par chauffage sous vide en donnant la matière anhydre sous forme de cristaux hygroscopiques jaunes. Le chlorhydrate de la tétracycline, cristallisé dans le butanol humide à la température ambiante forme des cristaux semblant appartenir au système orthorombique et de forme tabulaire. Les indices de réfraction de cette forme cris talline sont alpha = 1,602 0,005 ; bêta = 1,684 0,002 ; gamma = 1,714 0,003 ; les angles optiques sont les suivants 2 V = 64o 5o et 2E = 128o 50, le signe opti que est négatif.
La tétracycline et les sels de tétracycline sont optiquement actifs et ont des pouvoirs rotatoires spécifiques caractéristiques. On a noté cependant que le pouvoir rotatoire opti que diminue par repos à la température am biante et on doit effectuer les lectures sur une solution fraîchement préparée. Le pouvoir ro tatoire spécifique, lu peu après la préparation d'une solution du chlorhydrate de la matière amphotère dans HCl 0,1<I>N</I> est [a] n - = - 257,9o.
La tétracycline et les sels de tétracycline présentent des bandes d'absorption caractéris tiques dans l'ultra-violet. Un échantillon du chlorhydrate dissous à une concentration de 20 gammas par cc dans l'acide chlorhydrique aqueux 1 N présente une absorption maxi mum à 220 mu, 268 mu, et 358 mu. On ob serve une absorption minimum à 233 mu et 298 mu. En général, ces bandes d'absorption maximum et minimum ne sont pas définies avec précision et des observateurs différents peuvent choisir le point exact d'inflexion à des longueurs d'ondes légèrement différentes.
Comme dans l'ultra-violet, la tétracycline et les sels de tétracycline présentent égale- ment un spectre d'absorption caractéristique dans l'infrarouge. Un échantillon du chlor- hydrate dans une huile d'hydrocarbure présente les caractéristiques suivantes : bande d'absorp tion de<I>OH</I> et<I>NH</I> vers 3300 cm-' ; carbonyle d'amide possible vers 1676 cm-' ; fréquence d'allongement C = C possible vers 1622 cm-'; vibration de flexion de<I>NH</I> possible à <B>1588</B> cm-' ; autres marques caractéristiques vers 824 cm-' ; 864 cm-' ; 952 cm-' ; 967 cm-' ; 1228 cm-' ; et 1247 cm-'.
Le tri- hydrate de tétracycline présente de même une forte bande<I>OH</I> ou<I>NH</I> au voisinage de 300 cm-', un carbonyle d'amide possible vers <B>1670</B> cm-', une fréquence d'allongement C = C possible vers 1625 cm-', une vibration de flexion<I>NH</I> possible vers 1593 cm-' et d'au tres maximums caractéristiques vers 728 cm-'. 782 cm-', 806 cm-', 824 cm-', 862 cm-', 962 cm-', 995 cm-', et 1180 cm-'.
Bien que le spectre infrarouge du trihydrate soit assez semblable au spectre infrarouge du dihydrate d'oxytétracycline, on peut facilement distinguer les deux composés par leur spectre infrarouge. Par exemple, le dihydrate d'oxyté- tracycline présente une forte bande unique dans la région de 725 cm-' tandis que le trihydrate de tétracycline présente un fort tri plet dans le voisinage de 925 à 975 cm-'.
La tétracycline anhydre libre, dans une huile d'hydrocarbure, présente une forte bande <I>OH</I> ou<I>NH à</I> 3300 - 3400 cm-', un carbonyle d'amide possible vers 1655 cm-', une fré quence d'allongement :C = C possible vers 1613 cm-' ; une vibration de flexion de<I>NH</I> possible vers 1580 cm-' et d'autres maximums caractéristiques vers 703 cm-', 722 cm-', 785 cm-', 862 cm-', 950 cm-', 1178 cm-', et 1228 cm-'. Le spectre infrarouge de la té tracycline anhydre prouve qu'elle est assez pa rente de la chlorotétracycline mais on peut éga lement distinguer facilement les deux composés au moyen de leurs spectres d'absorption.
Par exemple la chlorotétracycline présente un fort doublet dans le voisinage de 950 cm-', tandis que la tétracycline anhydre ne présente qu'un faible point d'inflexion et la chlorotétracycline présente un fort triplet dans le voisinage de 800 cm-' tandis que la tétracycline présente encore également un faible point d'inflexion.
On a représenté sur la fig. 1 le spectre in frarouge dans la gamme de 650 cm-' à 1200 cm-' caractéristique du chlorhydrate, sur la fig. 2 le spectre infrarouge dans la même gamme pour le trihydrate de la matière am photère et sur la fig. 3 le spectre infrarouge dans la même gamme pour la tétracycline anhydre.
La tétracycline amphotère libre est so luble dans le méthanol et le bêta-méthoxy- éthanol (environ 200 mg par cc) et assez so luble dans l'éthanol et le n-butanol. La tétra cycline amphotère libre n'est que très légère ment soluble dans l'eau et relativement inso luble dans des solvants tels que l'éther, le ben zène et l'éther de pétrole. Le chlorhydrate est soluble dans l'eau à raison de 100 à 200 mg par cc, légèrement soluble dans le méthanol et très légèrement soluble dans le bêta-méthoxy- éthanol et le n-butanol. Le chlorhydrate est relativement insoluble dans les autres solvants organiques habituels.
Le sel de calcium de la tétracycline est soluble dans l'eau à raison d'environ 890 gammas par cc<I>à pH 8,55</I> et le sel de magnésium est soluble dans l'eau à <I>pH 7,0.</I>
Des catalyseurs d'hydrogénation utilisables dans le procédé de l'invention sont les sui vants : les métaux du groupe VIII de la qua trième période, par exemple le palladium et les métaux du groupe VIII de la cinquième période, par exemple le platine. Naturellement dans certains cas, le métal peut être initiale ment présent sous forme de son oxyde mais ceci équivaut à utiliser le métal libre car l'oxyde est réduit en métal par l'hydrogène pré sent dans le mélange réactionnel. Le catalyseur le plus avantageux est le palladium sur char bon de bois. Le catalyseur est efficace en quan tités catalytiques mais un excès n'est pas gênant.
On conduit de préférence l'hydrogénation dans un solvant inerte tel que les alcools ali phatiques inférieurs, les éthers de glycol et au tres liquides organiques dans lesquels est so luble la chlorotétracycline. Des exemples par ticuliers de solvants convenables sont le bêta- éthoxyéthanol, le bêta-méthoxyméthanol, le n- butanol, le méthanol et l'éthanol.
On a obtenu d'excellents résultats en employant un mé lange contenant approximativement un kg de chlorotétracycline pour trois litres d'un sol vant comprenant du bêta-méthoxyéthanol ou du bêta-éthoxyéthanol. On a obtenu de bons résultats en employant un mélange contenant approximativement 10 g de chlorotétracycline pour 60 cc d'un solvant comprenant du mé thanol et une petite quantité de triéthylamine. L'hydrogénation peut également être réalisée en solution aqueuse et on a obtenu une hydro génation satisfaisante en employant un mé lange contenant 15 g de chlorotétracycline par litre de solvant aqueux.
Cependant, en raison de la solubilité limitée de la chlorotétracycline en solution aqueuse, ce processus n'est pas préférable.
On peut réaliser l'hydrogénation pratique ment à n'importe quelle température et pres sion. Si on recherche une décomposition mini mum on peut employer de basses températures par exemple 00, bien que l'on puisse employer des températures de réaction de 100 ou même plus sans pertes prohibitives. En règle géné rale, on préfère des températures de réaction de l'ordre de 20 à 40o. Un avantage de ce nou veau procédé est que des pressions élevées ne sont pas nécessaires, quelle que soit la tempé rature employée, et que l'on peut conduire ce procédé à toute pression commode. Par exemple, on peut commodément effectuer l'hy drogénation sous 1 à 10 atmosphères ou même à des pressions plus élevées. Pour des raisons de commodité, on préfère des pressions de 1 à 3 atmosphères.
La meilleure mesure du temps de réaction, est donnée par la quantité d'hydrogène absor bée, car le temps réel varie largement selon un certain nombre de facteurs, tels que la tem pérature, la pression et le type et l'état du ca talyseur. La réaction est théoriquement ache vée quand une molécule d'hydrogène a été ab sorbée par molécule de chlorotétracycline ini tialement présente dans le mélange réactionnel.
Comme cependant la réaction n'est pas sélec- tive à 100 %, et qu'une petite quantité d'hydro- gène est ordinairement dissipée dans des réac tions autres que la réaction désirée, on ob tient souvent des rendements plus élevés si on emploie un petit excès, par exemple 0,1 à 0,2 molécule en excès par molécule de chloro- tétracycline. L'intervalle préféré est de 1,0 à 1,
2 molécule d'hydrogène par molécule de chlorotétracycline initialement présente dans le mélange réactionnel. On doit rencontrer peu de difficultés, car la vitesse d'absorption d'hy drogène diminue notablement quand approxi- jmativement une molécule d'hydrogène par molécule de chlorotétracycline a été absorbée. En fait, avec un catalyseur au palladium dans les conditions optimum, il est difficile de faire que le mélange réactionnel absorbe plus que la quantité optimum d'hydrogène et avec un catalyseur au platine il ne faut exercer qu'en core un peu plus de surveillance.
La réaction doit en général être interrompue avant qu'en viron 1,6 molécule d'hydrogène par molécule de chlorotétracycline ait été absorbée, bien qu'il soit possible dans certains cas d'obtenir de petites quantités du produit désiré quand 2 ou même 3 molécules d'hydrogène ont été absorbées.
Le mélange réactionnel peut être à tout<I>pH</I> auquel la chlorotétracycline est relativement stable, en d'autres termes de<I>pH 1 à pH</I> 9 en viron. Cependant, on a trouvé que le produit de réaction désirée est isolé plus facilement sous forme pure quand on exécute la réduction à un<I>pH</I> neutre ou alcalin. Les réductions à <I>pH</I> neutre ou alcalin ont également les autres avantages que l'on obtient généralement des rendements plus élevés et que des périodes de réaction plus courtes suffisent habituellement. Pour ces raisons, on préfère un mélange réac tionnel ayant un<I>pH</I> d'environ 7 à 8,5.
On va illustrer maintenant l'invention par les exemples suivants dont les parties sont en poids sauf indication contraire.
<I>Exemple 1</I> Préparation <I>de la tétracycline amphotère libre</I> <I>en conditions neutres</I> On dissout 25 g de chlorotétracycline libre dans 300 cc de bêta-méthoxyéthanol. On trai- te la solution par environ 2 g de produit mar que Norit-A et on filtre le mélange. Au filtrat on ajoute 5 g de catalyseur à 10 % de palladium sur charbon de bois et on agite le mélange avec de l'hydrogène à température et pression atmosphériques. Après 50 - 60 mi nutes, 1,25 litre d'hydrogène a été absorbé (approximativement un équivalent moléculaire) et la vitesse d'absorption d'hydrogène devient négligeable.
On sépare le catalyseur par filtration et on dilue le filtrat avec 1600 cc d'eau contenant 20 g d'acétate de sodium. Le produit cristallise au refroidissement et après deux heures on filtre le produit cristallin et on le sèche ; il pèse 16,3 g.
On recristallise deux fois 1/2 g de ce pro duit brut en le dissolvant dans environ 5 cc d'éthanol chaud, en diluant la solution avec environ 25 cc d'eau et en refroidissant le mé lange. Le produit recristallisé deux fois, quand on vérifie son point de fusion, commence à se recroqueviller à 168 - 169 C puis se bour soufle et devient foncé à 172().
Au lieu du bêta-méthoxy-éthanol employé comme solvant dans l'exemple ci-dessus, on peut employer d'autres solvants. Par exemple, on peut obtenir des résultats également satis faisants en le remplaçant par le bêta-éthoxy- éthanol. De même, on peut remplacer le ca talyseur au palladium par un catalyseur à l'oxyde de platine avec des résultats satisfai sants.
On peut transformer la tétracycline obte nue en sels, par exemple de la manière décrite ci-après <I>Préparation du chlorhydrate de tétracycline</I> Dans 20 cc de butanol on met en suspen sion 2 g de tétracycline amphotère libre, pré parée selon l'exemple 1 et, à cette suspension, on ajoute un demi-cc d'acide chlorhydrique concentré. Le chlorhydrate cristallise lentement. On recueille les cristaux par filtration et on les remet en suspension dans 50 cc de butanol hu mide. On ajoute lentement de la triéthvlamine jusqu'à dissolution de la matière. On filtre la solution et on acidifie le filtrat par l'acide chlorhydrique.
On recueille les cristaux résul tants de chlorhydrate, de formule C22H2.1N#,08-HC1 on les lave au butanol et à l'éther et on les sèche.
D'une manière similaire, on peut préparer d'autres sels d'acides de la tétracycline. Par exemple en remplaçant l'HCl par une quantité équivalente d'acide sulfurique ou nitrique on peut préparer le sulfate et le nitrate.
<I>Préparation du ,sel de calcium de la tétracycline</I> On met en suspension une millimolécule gramme de tétracycline amphotère libre pré parée selon le présent exemple dans une so lution aqueuse contenant une millimolécule- gramme de chlorure de calcium, puis on ajoute une quantité mesurée d'acide chlorhy drique, suffisante pour effectuer la dissolution. A cette solution, on ajoute une quantité mo laire de soude égale à quatre fois la quantité de HCl précédemment ajoutée. On recueille par filtration le précipité de sel de calcium résultant.
On peut préparer d'une manière identique d'autres sels de bases de la tétracycline re lativement insolubles dans l'eau. Par exemple, on peut préparer le sel de magnésium comme le sel de calcium, sauf que l'on remplace le chlorure de calcium par une millimolécule- gramme de chlorure de magnésium.
<I>Préparation du borate de tétracycline</I> On met en suspension dans 200 cc d'eau 5 g de tétracycline amphotère libre préparée selon le présent exemple et 1/100 de molécule- gramme de borate de sodium. On obtient une solution pratiquement limpide. On filtre la so lution, on la précipite par addition d'acétone, on reconstitue le précipité dans l'eau, on ajuste le<I>pH à 7,4,</I> on précipite à nouveau par l'acé tone et on sèche le produit final. Le précipité résultant de borate est une poudre jaune clair soluble dans l'eau.
<I>Exemple 2</I> <I>Préparation de la</I> tétracyline <I>amphotère libre</I> <I>en conditions acides</I> On dissout 2 g de chlorotétracycline libre dans 25 cc d'acide acétique glacial, on traite au charbon de bois et on filtre. On ajoute 200 mg d'un catalyseur à 10 1% <B>de</B> palladium sur charbon de bois et on agite le mélange avec de l'hydrogène pendant 23 heures. L'absorp tion totale d'hydrogène est de<B>130</B> cc (en viron 15 % d'excès par rapport à une molé cule). On filtre le catalyseur, puis on dilue le filtrat par 125 cc d'éther, ce qui précipite un solide jaune. On filtre le solide, on le sèche et on trouve qu'il pèse 1,01 g.
Cet exemple illustre la réduction en mi lieu acide. Ce processus n'est pas préférable. Après que la -matière amphotère libre obte nue selon cet exemple a été transformée en chlorhydrate et recristallisée dans le métha nol aqueux, on trouve encore par l'essai micro- biologique et les déterminations d'absorption dans l'ultra-violet qu'elle est considérablement moins pure que la matière préparée selon l'exemple 1.
<B> Process for </B> Preparation <B> of a New Antibiotic </B> The present invention relates to a process for the preparation of a novel antibiotic.
This new antibiotic, tetracycline, has the molecular formula C. ,, 2H ,, @ N, O, and the structural formula:
EMI0001.0005
According to the invention, this new tibiotic year is prepared by a process which is characterized in that chlortetracycline is hydrogenated until at least one hydrogen molecule has been absorbed per chlor-tetracycline molecule, so as to replace the chlorine atom with a hydrogen atom.
Tetracycline is amphoteric and forms salts with both acids and bases. For example, tetracycline forms salts with organic and inorganic acids and can be obtained as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate, ascorbate, citrate, succinate, acetate, sulfamate and other addition salts with acids of a similar nature. Tetra cyclin also forms salts with bases, for example bases of alkali or alkaline earth metals or amino or ammoniacal bases.
Particular examples are the calcium, ethylene diamine, sodium, piperidine, potassium, and lithium salts. This amphoteric material also forms salts, or more exactly complexes, with the basic salts of bo ric acid, for example with sodium borate.
The salts of the types described above are valuable in the isolation and purification processes because in each case they can be easily neutralized to obtain the free amphoteric material. These salts also have antiseptic and chemotherapeutic properties and indeed can in many cases be employed in preference to free amphoteric material.
Tetracycline and its salts have, to a large extent, the advantageous properties of chlorotetracycline and oxytetracycline (sold under the trade designation Terramycin) and their salts. Chlorotetracycline and its salts are perhaps the most active antibiotic materials known to exist, but have the disadvantage of being quite unstable in aqueous solution <I> at pH 7.4. </I> Oxytetracycline, although not as active as chlorotetracycline, has the advantage of being considerably more stable under these conditions.
As will be seen, stability in aqueous solution <I> at pH 7.4 </I> is a desirable characteristic because this <I> pH </I> is frequently close to that of blood and it is that at which many tests are carried out. In fact, the increased stability of oxytetracycline in aqueous solution at this <I> pH </I> frequently gives it an apparent activity greater than that of chlorotetracycline. It is really surprising that te tracycline and its salts have -activities in some cases similar to those of chlortetracycline and are more stable than oxytetra-.
cycline. The following table shows the comparative activities of chlortetracycline hydrochloride, oxytetracycline hydrochloride and tetracycline hydrochloride. The organisms were systematically chosen to show the wide field of activity presented by the new compound according to the invention.
All determinations were made using a 24 hour agar diffusion test, except for Mycobacterium for which this is a 48 hour test; the values given for the activity are the measurement in mm from the edge of the cut to the edge of the zone of inhibition. All plates are nutrient agar based unless otherwise specified.
EMI0002.0020
<I> TABLE <SEP> 1 </I>
<tb> <I> Comparative <SEP> activity <SEP> of <SEP> antibiotics: <SEP> chlortetracycline <SEP> (A), <SEP> oxytetracycline <SEP> (T) <SEP> and <SEP> tetracycline < SEP> (D) </I>
<tb> Agar <SEP> 100 <SEP> gamma / ml <SEP> 10 <SEP> gamma / ml
<tb> Body <SEP> H <SEP> A <SEP> T <SEP> I <SEP> D <SEP> A <SEP> T <SEP> D
<tb> Rod <SEP> Gram <SEP> negative <SEP> 7.8 <SEP> 2.1 <SEP> (a) <SEP> 2.3 <SEP> (a) <SEP> 2.6 <SEP > (a) <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> E. <SEP> Typhosa <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> i <SEP> 6.0 <SEP> 5.4 <SEP> 4.2 <SEP> 4.3 <SEP> 3.2 <SEP> (a) <SEP> I <SEP> light <SEP > I <SEP> light
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> j <SEP> 7.8 <SEP> 3.6 <SEP> 3.7 <SEP> 3.9 <SEP> light <SEP> <SEP> i <SEP>
<tb> (N <SEP> 8) <SEP> 6.0 <SEP> 8.9 <SEP> 6.7 <SEP> 7.4 <SEP> 2.4 <SEP>! <SEP> <SEP>
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.8 <SEP> 3.0 <SEP> 5.6 <SEP> 4.4 <SEP> light <SEP> <SEP>
<tb> (No <SEP> 28) <SEP> 6.0 <SEP> i <SEP> 7.2 <SEP> 5.8 <SEP> 5.8 <SEP> 4.3 <SEP> (a) <SEP> 2,1 <SEP> (a) <SEP> 2,0 <SEP> (a)
<tb> E. <SEP> ol9 # <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.8 <SEP> 2.6 <SEP> (a) <SEP> 2.2 <SEP> (a) <SEP>!. <SEP> 2,4 <SEP> (a) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <B> (N- </B> <SEP> 6.0 <SEP> 4.3 <SEP> 3.8 <SEP> 3.8 <SEP> light <SEP> light <SEP> light
<tb> Alcaligenes <SEP> sp. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 7.8 <SEP> 3.5 <SEP> 2.1 <SEP> 2.4 <SEP> <SEP> 0 <SEP>
<tb> (PC <SEP> 13) <SEP> '@ <SEP> 6.0 <SEP> 6.7 <SEP> 4.5 <SEP> 5.4 <SEP> 3.7 <SEP> (c ) <SEP>; <SEP> 2.5 <SEP> (c) <SEP> 2.7 <SEP> (c)
<tb> Cocci <SEP> Gram <SEP> positive <SEP> 7.8 <SEP> 5.6 <SEP> 5.2 <SEP> 5.5 <SEP> 2.6 <SEP> 1.3 <SEP > 2.2
<tb> S. <SEP> aureus <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 6.0 <SEP> 10.1 <SEP> 8.4 <SEP> 9.0 <SEP> 7.2 <SEP> 4.4 <SEP> 5.5
<tb> S. <SEP> albus <SEP> (resistant <SEP> to <SEP> <SEP> chlor tetracycline <SEP> and <SEP> to <SEP> oxy- <SEP> 7.8 <SEP > slight <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> tetracycline) <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>;
<SEP> 6.0 <SEP> 0.5 <SEP> (c) <SEP> light <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> \ <SEP> 0
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.4 <SEP> (b) <SEP> 12.1 <SEP> 11.0 <SEP> 11.4 <SEP> 8.2 <SEP> 6.3 <SEP> 7.0
<tb> (C-203) <SEP> i
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.4 <SEP> (b) <SEP> 11.0 <SEP> 10.1 <SEP> <B> 110.0 </B> <SEP> 1 <SEP> 7.8 <SEP> 7, 3 <SEP> 7.1
<tb> (NY-5)
<tb> S. <SEP> lutea <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.8 <SEP> 7.6 <SEP> 7.0 <SEP> 7.5 <SEP> 3.5 <SEP> 3.4
<tb> 3.1
<tb> 6.0 <SEP> 12.9 <SEP> 10.2 <SEP> 11.1 <SEP> 8.5 <SEP> 5.5 <SEP> 1 <SEP> 6.8
<tb> Gram positive <SEP> rods <SEP> B. <SEP> 7.8 <SEP> '<SEP> 7.4 <SEP> 7.0 <SEP> 7.1 <SEP> 5, 1 <SEP> <I> 4.2 <SEP> 4.5 </I>
<tb> cerus <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 6.0 <SEP> 12.6 <SEP> 10.4 <SEP> 10.9 <SEP> 11.0 <SEP> 8.1 <SEP> 9.4
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7.8 <SEP> 7.6 <SEP> Î <SEP> 7.2 <SEP> 7.0 <SEP> 3.4 <SEP> 1.7 <SEP> 2.5
<tb> (N ,, <SEP> 17) <SEP> 6,0 <SEP> <B> 113,7 </B> <SEP> 9,8 <SEP> '<SEP> l <SEP> 1, 7 <SEP> 9.6 <SEP> i <SEP> 5.0 <SEP> <B> 1 </B> <SEP> 7.1
<tb> Mycobacteria <SEP> M. <SEP> Tubercu losis <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 6.0 <SEP> (d) <SEP> 112.1 <SEP> 9.2 <SEP> 9.8 <SEP> 6.8 <SEP> 3.3 <SEP> 4.0
<tb> (TB <SEP> No <SEP> 607) <SEP>,
<tb> a) <SEP> zone <SEP> trouble
<tb> b) <SEP> agar <SEP> for internal <SEP> infusion <SEP>
<tb> c) <SEP> clear <SEP> zone <SEP> containing <SEP> of <SEP> colonies <SEP> in <SEP> the <SEP> zone <SEP> of inhibition
<tb> d) <SEP> glycerin <SEP> added <SEP> to <SEP> nutrient <SEP> agar.
It will be noted from the table above that in two cases the tetracycline hydrochloride shows a higher activity than that of the chlortetracycline hydrochloride and the oxytetracycline hydrochloride. In 25 cases, tetracycline shows higher activity than oxytetracycline, but lower than chlortetracycline. In one case, tetracycline shows greater activity than chlor-tetracycline,
but lower than that of oxytetracycline. In 12 cases, tetracycline shows an activity at least as high as that of oxytetracycline, and in only 6 cases, tetracycline shows a slightly lower activity than that of chlorotetracycline and oxytetracycline. Considering the stability and other advantages of tetracycline and its salts it is evident that these are valuable compounds.
The following table gives the result of tests for determining the relative stability of chlorotetracycline, oxytetracycline and tetracycline. The tests are carried out on aqueous solutions prepared from the hydrochlorides of the three compounds in a phosphate buffer medium <I> at pH 7.4. </I> A standard turbidimetry test with Staphylococcus aureus is used in each case (Ann New York Academy of Sciences, 5 P. 218 (1940)).
EMI0003.0026
<B><I>TA</I></B> <I> <SEP> BLEA <SEP> U <SEP> 11 </I>
<tb> Time <SEP> in <SEP> hours
<tb> <I> at <SEP> pH <SEP> 7.4 </I> <SEP> 37o <SEP> C <SEP> Tetracycline <SEP> Chlorotetracycline <SEP> Oxytetracycline
<tb> 0 <SEP> 24.8 <SEP> 100 <SEP> 20
<tb> 12 <SEP> 20.7 <SEP> 1.83 <SEP> 13.3
<tb> 24 <SEP> 12.2 <SEP> 0.3 <SEP> 8.9
<tb> 36 <SEP> 6.2 <SEP> 0.16 <SEP> 5.4
<tb> 60 <SEP> 2.16 <SEP> 0.98 <SEP> 1.84
<tb> 84 <SEP> 1.21 <SEP> 0.82 <SEP> 0.94 Values are calculated as activity of chlortetracycline hydrochloride in micrograms per cc.
To be a therapeutic material of maximum effectiveness, a compound must be relatively stable for at least twelve hours under almost any conditions which it is likely to encounter and it will be seen from the table above that the tetra cyclin is, under the test conditions, considerably more stable than chlorotetracycline and notably more stable than oxytetracycline. After twelve hours the chlorotetracycline had lost 98,
17% of its activity and oxytetracycline 33.5% of its activity, but tetracycline lost only 16.5% of its activity.
In fact, the remarkable stability of tetracycline in aqueous solution <I> at pH 7.4 </I> may form the basis of a simple test for its presence. The acid salts of tetracycline are prepared in a manner analogous to the methods usually employed for the preparation of the acid salts of chlorotetracycline and oxytetracycline. For example, the acid salts can be prepared by adding the desired organic or inorganic acid to the amphoric material in water, then evaporating the resulting solution in vacuo at reduced temperature.
In some cases, it is more convenient to prepare the acid salts by adding the desired acid to a suspension of the free amphoric material in an organic solvent such as butanol, and then leaving the acid salt crystal clear. read into the mixture. In addition to being very active and stable, these new salts have the additional advantage of being in most cases more soluble than the corresponding salts of chlorotetracycline or oxytetracycline. So lubility in water, although not always beneficial, is in many cases very desirable.
For example, in the preparation of a remedy for parenteral administration, a relatively high water solubility material is required.
The excellent stability and water solubility of the acid salts of tetracycline makes them ideal for the preparation of remedies for parenteral administration.
The salts with the bases are likewise prepared by methods analogous to those used for the preparation of basic salts of chlorotetracycline and oxytetracycline. Salts with bases, which are relatively insoluble in water, such as alkaline earth metal salts, can be prepared by adding a selected base to an aqueous solution of the free amphoteric material or to a salt of. acid thereof and allowing the resulting water-insoluble salt to precipitate out of solution.
In the preparation of water soluble salts such as the alkali metal and amine salts, it is usually necessary to partially remove the solvent by evaporation at reduced temperature and pressure to effect precipitation. The salts of tetra cyclin with bases are very similar to analog salts of chlorotetracycline except that they are generally more soluble in water, the calcium and magnesium salts being approximately ten times more soluble than the corresponding salts of the chlorotetracyclin, and they are frequently more sensitive to surface oxidation.
In addition to their chemical and chemotherapeutic properties indicated above, the tetracycline and the tetracycline salts prepared according to the invention can be characterized by their physical properties. They have been shown to be different from all other known compounds and to constitute chemical entities both in their crystalline form and in their infrared and ultraviolet spectra.
Recrystallized from a water-methanol mixture at room temperature, the free am- photer material crystallizes in the form of a trihydrate. The crystals of the trihydrate are yellow in color and tetrahedral and bular in shape. The refractive indices of this crystal form are: alpha = 1.530 0.003; beta = 1.646 0.003; gamma = 1.798 0.003; the optical angle 2V is <B> 80 - 85 ,, </B> and the optical sign is positive.
The trihydrate loses its water of crystallization on heating in vacuo to give the anhydrous material as yellow hygroscopic crystals. Tetracycline hydrochloride, crystallized from wet butanol at room temperature, forms crystals which appear to belong to the orthorombic system and are tabular in shape. The refractive indices of this crystalline form are alpha = 1.602 0.005; beta = 1.684 0.002; gamma = 1.714 0.003; the optical angles are as follows 2 V = 64o 5o and 2E = 128o 50, the optical sign is negative.
Tetracycline and tetracycline salts are optically active and have characteristic specific rotational powers. It was noted, however, that the optical optical rotation decreases on standing at room temperature and the readings should be taken on a freshly prepared solution. The specific rotatory power, read shortly after the preparation of a solution of the hydrochloride of the amphoteric material in 0.1 <I> N </I> HCl is [a] n - = - 257.9o.
Tetracycline and tetracycline salts show characteristic absorption bands in the ultraviolet. A sample of the hydrochloride dissolved at a concentration of 20 gammas per cc in 1N aqueous hydrochloric acid exhibits maximum absorption at 220 mu, 268 mu, and 358 mu. A minimum absorption is observed at 233 mu and 298 mu. In general, these maximum and minimum absorption bands are not precisely defined and different observers may choose the exact point of inflection at slightly different wavelengths.
As in ultraviolet, tetracycline and tetracycline salts also exhibit a characteristic absorption spectrum in the infrared. A sample of the hydrochloride in a hydrocarbon oil exhibits the following characteristics: <I> OH </I> and <I> NH </I> absorption band around 3300 cm- '; amide carbonyl possible around 1676 cm- '; lengthening frequency C = C possible around 1622 cm- '; bending vibration of <I> NH </I> possible at <B> 1588 </B> cm- '; other characteristic marks around 824 cm- '; 864 cm- '; 952 cm- '; 967 cm- '; 1228 cm- '; and 1247 cm- '.
Tetracycline trihydrate likewise exhibits a strong <I> OH </I> or <I> NH </I> band around 300 cm- ', a possible amide carbonyl around <B> 1670 </ B> cm- ', an elongation frequency C = C possible around 1625 cm-', a bending vibration <I> NH </I> possible around 1593 cm- 'and other maximum characteristics around 728 cm- '. 782 cm- ', 806 cm-', 824 cm- ', 862 cm-', 962 cm- ', 995 cm-', and 1180 cm- '.
Although the infrared spectrum of trihydrate is quite similar to the infrared spectrum of oxytetracycline dihydrate, the two compounds can be easily distinguished by their infrared spectrum. For example, oxytetracycline dihydrate has a strong single band in the region of 725 cm- 'while tetracycline trihydrate has a strong triplet in the vicinity of 925 to 975 cm-'.
The free anhydrous tetracycline, in a hydrocarbon oil, has a strong <I> OH </I> or <I> NH band at </I> 3300 - 3400 cm- ', a possible amide carbonyl around 1655 cm - ', an elongation frequency: C = C possible around 1613 cm-'; a bending vibration of <I> NH </I> possible around 1580 cm- 'and other characteristic maximums around 703 cm-', 722 cm- ', 785 cm-', 862 cm- ', 950 cm-' , 1178 cm- ', and 1228 cm-'. The infrared spectrum of anhydrous tetracycline shows that it is quite related to chlorotetracycline, but the two compounds can also be easily distinguished by their absorption spectra.
For example, chlorotetracycline has a strong doublet in the vicinity of 950 cm- ', while anhydrous tetracycline has only a weak inflection point and chlorotetracycline has a strong triplet in the vicinity of 800 cm-' while the tetracycline still also exhibits a low inflection point.
There is shown in FIG. 1 the infrared spectrum in the range of 650 cm- 'to 1200 cm-' characteristic of the hydrochloride, in fig. 2 the infrared spectrum in the same range for the trihydrate of the bitter material and in fig. 3 the infrared spectrum in the same range for anhydrous tetracycline.
The free amphoteric tetracycline is soluble in methanol and beta-methoxyethanol (about 200 mg per cc) and fairly soluble in ethanol and n-butanol. The free amphoteric tetra cyclin is only very slightly soluble in water and relatively insoluble in solvents such as ether, benzene and petroleum ether. The hydrochloride is soluble in water at 100-200 mg per cc, slightly soluble in methanol and very slightly soluble in beta-methoxyethanol and n-butanol. The hydrochloride is relatively insoluble in other common organic solvents.
The calcium salt of tetracycline is soluble in water at the rate of approximately 890 gammas per cc <I> at pH 8.55 </I> and the magnesium salt is soluble in water at <I> pH 7.0. </I>
Hydrogenation catalysts which can be used in the process of the invention are the following: metals of group VIII of the fourth period, for example palladium and metals of group VIII of the fifth period, for example platinum. Of course in some cases the metal may initially be present as its oxide but this is equivalent to using the free metal because the oxide is reduced to the metal by the hydrogen present in the reaction mixture. The most advantageous catalyst is palladium on charcoal. The catalyst is effective in catalytic amounts but an excess is not troublesome.
The hydrogenation is preferably carried out in an inert solvent such as lower aliphatic alcohols, glycol ethers and very organic liquids in which the chlorotetracycline is soluble. Particular examples of suitable solvents are beta-ethoxyethanol, beta-methoxymethanol, n-butanol, methanol and ethanol.
Excellent results have been obtained by employing a mixture containing approximately one kg of chlorotetracycline per three liters of a solvent comprising beta-methoxyethanol or beta-ethoxyethanol. Good results have been obtained using a mixture containing approximately 10 g of chlorotetracycline per 60 cc of a solvent comprising methanol and a small amount of triethylamine. Hydrogenation can also be carried out in aqueous solution and satisfactory hydrogenation has been obtained by employing a mixture containing 15 g of chlorotetracycline per liter of aqueous solvent.
However, due to the limited solubility of chlorotetracycline in aqueous solution, this process is not preferable.
The hydrogenation can be carried out at practically any temperature and pressure. If minimum decomposition is desired, low temperatures, for example 00, can be employed, although reaction temperatures of 100 or even higher can be employed without prohibitive losses. As a general rule, reaction temperatures of the order of 20 to 40 ° are preferred. An advantage of this new process is that high pressures are not necessary regardless of the temperature employed, and that this process can be carried out at any convenient pressure. For example, the hydrogenation can conveniently be carried out at 1 to 10 atmospheres or even at higher pressures. For convenience, pressures of 1 to 3 atmospheres are preferred.
The best measure of reaction time is given by the amount of hydrogen absorbed, since the actual time varies widely depending on a number of factors, such as temperature, pressure and the type and condition of the catalyst. . The reaction is theoretically complete when one molecule of hydrogen has been absorbed per molecule of chlorotetracycline initially present in the reaction mixture.
As, however, the reaction is not 100% selective, and a small amount of hydrogen is usually dissipated in reactions other than the desired reaction, higher yields are often obtained if one employs. a small excess, for example 0.1 to 0.2 excess molecules per molecule of chlorotetracycline. The preferred range is 1.0 to 1,
2 molecule of hydrogen per molecule of chlorotetracycline initially present in the reaction mixture. Few difficulties should be encountered, since the rate of hydrogen uptake decreases markedly when approximately one molecule of hydrogen per molecule of chlorotetracycline has been absorbed. In fact, with a palladium catalyst under the optimum conditions, it is difficult to make the reaction mixture absorb more than the optimum amount of hydrogen and with a platinum catalyst it is only necessary to exercise a little more monitoring. .
The reaction should generally be stopped before about 1.6 molecules of hydrogen per molecule of chlorotetracycline has been absorbed, although it is possible in some cases to obtain small amounts of the desired product when 2 or even 3 hydrogen molecules have been absorbed.
The reaction mixture can be at any <I> pH </I> at which chlorotetracycline is relatively stable, in other words from <I> pH 1 to about pH </I> 9. However, it has been found that the desired reaction product is more easily isolated in pure form when the reduction is carried out at neutral or alkaline <I> pH </I>. Reductions to neutral or alkaline <I> pH </I> also have the other advantages that higher yields are generally obtained and shorter reaction periods are usually sufficient. For these reasons, a reaction mixture having a <I> pH </I> of about 7 to 8.5 is preferred.
The invention will now be illustrated by the following examples, the parts of which are by weight unless otherwise indicated.
<I> Example 1 </I> Preparation <I> of the free amphoteric tetracycline </I> <I> under neutral conditions </I> 25 g of free chlorotetracycline are dissolved in 300 cc of beta-methoxyethanol. The solution is treated with about 2 g of Norit-A product and the mixture is filtered. To the filtrate was added 5 g of 10% palladium-on-charcoal catalyst and the mixture was stirred with hydrogen at atmospheric temperature and pressure. After 50 - 60 minutes, 1.25 liters of hydrogen has been absorbed (approximately one molecular equivalent) and the rate of hydrogen uptake becomes negligible.
The catalyst is filtered off and the filtrate is diluted with 1600 cc of water containing 20 g of sodium acetate. The product crystallizes on cooling and after two hours the crystalline product is filtered off and dried; it weighs 16.3 g.
1/2 g of this crude product is recrystallized twice by dissolving it in about 5 cc of hot ethanol, diluting the solution with about 25 cc of water and cooling the mixture. The twice recrystallized product, when its melting point is checked, begins to curl up at 168 - 169 C then puffs and becomes dark at 172 ().
Instead of the beta-methoxy-ethanol employed as a solvent in the example above, other solvents can be employed. For example, equally satisfactory results can be obtained by replacing it with beta-ethoxyethanol. Likewise, the palladium catalyst can be replaced by a platinum oxide catalyst with satisfactory results.
The tetracycline obtained can be transformed into salts, for example in the manner described below <I> Preparation of tetracycline hydrochloride </I> In 20 cc of butanol, 2 g of free amphoteric tetracycline, prepared, are suspended. according to Example 1 and, to this suspension, half a cc of concentrated hydrochloric acid is added. The hydrochloride crystallizes slowly. The crystals were collected by filtration and resuspended in 50 cc of wet butanol. Slowly add triethylamine until the material dissolves. The solution is filtered and the filtrate is acidified with hydrochloric acid.
The resulting crystals of hydrochloride, of formula C22H2.1N #, 08-HC1 are collected, washed with butanol and with ether and dried.
In a similar manner, other acid salts of tetracycline can be prepared. For example, by replacing the HCl with an equivalent amount of sulfuric or nitric acid, the sulfate and the nitrate can be prepared.
<I> Preparation of the calcium salt of tetracycline </I> One millimolecule gram of free amphoteric tetracycline prepared according to the present example is suspended in an aqueous solution containing one millimolecule gram of calcium chloride, then one add a measured quantity of hydrochloric acid sufficient to effect the dissolution. To this solution is added a moderate amount of sodium hydroxide equal to four times the amount of HCl previously added. The resulting calcium salt precipitate is collected by filtration.
Other relatively water-insoluble tetracycline base salts can be prepared in an identical manner. For example, the magnesium salt can be prepared like the calcium salt, except that the calcium chloride is replaced by one millimolecule-gram of magnesium chloride.
<I> Preparation of tetracycline borate </I> 5 g of free amphoteric tetracycline prepared according to the present example and 1/100 of a gram-molecule of sodium borate are suspended in 200 cc of water. A practically clear solution is obtained. The solution is filtered, it is precipitated by adding acetone, the precipitate is reconstituted in water, the <I> pH is adjusted to 7.4, </I> it is precipitated again with acetone and the final product is dried. The resulting borate precipitate is a light yellow powder soluble in water.
<I> Example 2 </I> <I> Preparation of the </I> tetracyline <I> free amphoteric </I> <I> under acidic conditions </I> 2 g of free chlorotetracycline are dissolved in 25 cc of glacial acetic acid, treated with charcoal and filtered. 200 mg of a 10% <B> palladium </B> charcoal catalyst was added and the mixture stirred with hydrogen for 23 hours. The total absorption of hydrogen is <B> 130 </B> cc (approximately 15% excess relative to one molecule). The catalyst is filtered off, then the filtrate is diluted with 125 cc of ether, which precipitates a yellow solid. The solid is filtered, dried and found to weigh 1.01 g.
This example illustrates the reduction in an acidic location. This process is not preferable. After the free amphoteric material obtained according to this example has been transformed into the hydrochloride and recrystallized from aqueous methanol, it is still found by the microbiological test and the absorption determinations in the ultraviolet is considerably less pure than the material prepared according to Example 1.