Verfahren zur Stabilisierung von Alkalisalzen von Adenosinpolyphosphorsäuren.
Die Adenosinpolyphosphorsäuren sind in Form ihrer Salze sowohl in festem Zustand als auch in flüssiger Form im Handel. Diese Präparate haben den Nachteil, dass sie nicht beständig sind. Dies beruht vor allem darauf, dass nach einiger Zeit Phosphorsäure abgespalten wird. Vermutlich bewirkt die dabei in Freiheit gesetzte Säure eine Beschleunigung der weiteren Zersetzung.
Es wurde nun gefunden, dass es gelingt, Alkalisalze von Adenosinpolyphosphorsäuren zu stabilisieren, indem man den Alkalisalzen basiseh reagierende Substanzen zusetzt, derart, dass in wässriger Losung ein im alkali schen Bereich liegender pH-Wert vorliegt. Es gelingt hierdurch, die Zersetzungsgesehwindig- keit der Adenosinpolyphosphorsäuresalze derart zu vermindern, dass die gemäss der Erfindung hergestellten Präparate sehr lange haltbar sind und infolgedessen gegenüber den früher im Handel befindlichen Präparaten erheblieh grosseren Wert besitzen.
Als zur Einstellung eines im alkalischen Bereich liegenden pH-Wertes geeignete Sub- stanzen haben sich besonders basisch reagierende anorganische Stoffe, wie Ätzalkali, Soda, Pyrophosphate und dergleichen, sowie basisch reagierende organische Stoffe, wie Glykokoll, Aminoäthylalkohol, Arginin, Cholin und dergleichen erwiesen. Es wurde ferner gefunden, dass eine Stabilisierung auch durch Zusatz von Puffersubstanzen erzielt werden kann, die in Lösung die aus der Adenosinpolyphosphorsäure abgespaltene Phosphorsäure abpuffern, wie beispielsweise Puffergemische aus Borax und Borsäure und dergleichen.
Es zeigte sich auch, dass besonders günstige Ergebnisse erzielt werden, wenn man die basisch reagierenden Substanzen in solcher Menge zugibt, dass der pH-Wert der L¯sung zwischen 7, 5 und 11, 5 liegt. Als besonders vorteilhaft f r diese Fälle wurden pH-Werte zwi schen 8 und 10 gefunden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann in verschiedener Weise durchgeführt werden.
Man kann z. B. die Zusatzstoffe einer L¯sung eines Alkalisalzes einer Adenosinpolyphosphorsäure zugeben ; man kann aber auch ein festes Alkalisalz einer Adenosinpolyphosphorsäure mit einem Zusatzstoff aus wässriger Losung gemeinsam auskristallisieren. Auch andere Mischungsarten können je nach den gewünschten Produkten und den zur Verfügung stehenden technischen Mitteln angewendet werden.
Meist gelangen die Adenosinpolyphosphorsäuren in Form der wässrigen Lösungen ihrer Alkalisalze in den Handel. Es hat sich jedoch gezeigt, dass das Verfahren gemäss der Erfindung auch auf feste Präparate mit gutem Erfolg anwendbar ist, da auch diese eine, wenn auch geringere, Zersetzung zeigen als die Lösungen, und da diese Zersetzung durch Anwendung der Erfindung ebenfalls erheblich herabgesetzt werden kann.
Die erfindungsgemä3 stabilisierten PrÏparate von Adenosinpolyphosphorsäuresalzen können für versehiedene Zweeke Verwendung finden. So werden sie beispielsweise in der Experimentalbiologie zur Löslichmachung von anorganischen und organisehen Salzen, zur Phosphorylierung und zu enzymatischen Synthesen verwendet. Man kann sie zu weiteren chemischen Umsetzungen benntzen, beispielsweise zur Gewinnung der therapeutisch wich- tigen Adenosinmonophosphorsäuren. Gegebenenfalls kann man beispielsweise das Natriumsalz der Adenosintriphosphorsäure unmittelbar in der Heilkunde anwenden.
Als Adenosinpolyphosphorsäuren kommen hauptsächlich Adenosindiphosphorsäure und Adenosintriphosphorsäure in Betracht.
Die Adenosinpolyphosphorsäuren können aus verschiedenen Ausgangsstoffen gewonnen werden, beispielsweise aus Muskelgeweben oder aus Adenosin und Phosphorsäure durch enzy- matische Umsetzung, beispielsweise unter der enzymatischen Einwirkung von Hefe. Die so gewonnenen Produkte werden zur Reindarstel- lmg am besten mehrfach abweehselnd mit Barium- und Queeksilbersalzen gefällt.
Beispiel 1 :
125 mg Natrium-Adenosintriphosphorsäure, in 5 em3 Wasser gelöst, wurden mit einer 1 % igen Pyrophosphatlösung versetzt, bis der ex p-Wert der Lösung ungefähr 8, 3 betrug.
Über mehrere Monate wurde diese Lösung bei einer Temperatur von 20 bzw. 35¯C gehalten.
Die Analyse ergab naeh zwei Monaten fol gende Ergebnisse :
Zersetzung des Na-ATP in % tomperatur mit Zusatz ohne Zusatz tomperatur pH 8,3 pH 6,8 bei 20 2, 8 12, 8 bei 35 21,5 53, 6 Diese Werte entsprechen einer monatlichen Zersetzung von etwa 1, 4% Adenosintriphos-. phorsäure bei Pyrophosphat-Zusatz, gegenüber 6, 4% ohne Pyrophosphat-Zusatz, jeweils bei 20 C Lagerungstemperatur.
Beispiel 9 :
125 mg Natrium-Adenosintriphosphorsäure, in 5 em3 Wasser gelöst, wurden mit einer Borax-Borsäure-Lösung versetzt, bis der pu- Wert der Lösung ungefähr 8, 5 betrug. Xber mehrere Monate wurde diese Lösung bei einer Temperatur von 20 bzw. 35 C gehalten.
Die Analyse ergab nach zwei Monaten eine Zerset zung der Natrium-Adenosintriphosphorsäure wie folgt : Zersetzung des Na-ATP in % Lagerungs temperatur + Borax-BorsÏurel¯sung ohne Zusatz pH 8,5 pH 6,8 bei 20¯ 3,6 18,4 bei 35¯ 12,6 51,8 Beispiel 3 :
125 mg Natriumsalz der Adenosintriphosphorsäure, in 5 em3 Wasser gelost, wurden mit einer Natronlauge-Glykokoll-L¯sung versetzt, bis der pg-'Wert der Lösung ungefähr 7, 5 betrug. Die L¯sung wurde bei 20 C gelagert, und naeh einem Monat ergab die Analyse 0% zersetzter Adenosintriphosphorsäure gegen über 1, 2% ohne Pufferzusatz.
Beispiel 4 :
Vor der Trocknung des Natriumsalzes der Adenosintriphosphor, säure wurden zu 1000 mg dieses Salzes 240 mg Natrium-Pyrophosphat zugesetzt und dieses Salzgemisch gemeinsam zum Auskristallisieren gebraeht. Die Lagerung dieses trockenen Salzes bei 20 ergab eine monatliche Abnahme an Adenosintriphosphorsäure von 1, 1% gegenüber 1, 4% Adenosintri phosphorsäure-Verlust ohne Pyrophosphat- zusatz.
Beispie. 5 :
In der folgenden Tabelle I sind die Ergebnisse von Versuchen zusammengestellt, bei denen das Natriumsalz der Adenosintriphosphorsaure in wässriger Losung jeweils 8 bis 13 Monate bei 20 C gelagert wurde. Es wurde hierbei die Zersetzung der Adenosintriphosphorsäure mit und ohne Zusatz gemessen. Die Ergebnisse zeigen die stabilisierende Wirkung der Zusätze.
Tabelle. 1 :
Zersetzungs-Verluste an ATP
Dauer der La- insgesamt je Monat Art und Menge des Zusatzsatzes ?H-Wert @@@@ mit ohne mit o@ gerung mit ohne mit ohne
Monate Zusatz Zusatz Zusatz Zusatz % % % % NaOH, bis auf pn 9, 3 zugesetzt 9, 3 11 13, 5 85, 5 1, 2 7, 8 Soda, bis auE pli 9, 3 zugesetzt 9, 3 8 6, 2 50, 0 0, 8 6, 2 Natriumpyrophosphat, 1, 0% 8, 3 13 17, 0 55, 5 1, 3 4, 3 Borat-Puffer = 0, 668 g Borax, + 0, 185 g Borsäure in 100 em3 des Gemisches mit dem Na triumsalz der Adenosintriphos pliorsäure 8, 3 11 4, 5 26, 5 0, 4 2, 4 Aminoäthylalkohol,
1, 0% 8, 9 11 9, 7 78, 0 0, 9 7, 1 Arginin, 1, 8% 8, 1 11 6, 0 61, 0 0, 5 5, 5 Cholin, 0, 62% 9, 4 8 7, 9 38, 5 1, 0 4, 8
Beispiel 6 :
In der folgenden Tabelle II sind die Ergebnisse von Vers-Lichen zusammengestellt, bei lenen das Natriumsalz der Adenosindiphos- phorsäure in wässriger Losung 7 Monate bei 20 C mit und ohne Zusätze gelagert wurde.
Die Ergebnisse der Versuche zeigen deutlich die stabilisierende Wirkung der Zusätze.
Tabelle ll :
Zersetzungs-Verluste an ADP Dauer der La- insgesamt je Monat Art und Menge des Zusatzes ?H-Wert gerung mit ohne mit ohne
Monate Zusatz Zusatz Zusatz Zusatz % % % % NaOH bis auf plI 8, 5 zugesetzt 8, 5 7 13, 4 40, 0 1, 9 5, 7 Borat-Puffer = 0, 668 g Borax, + 0, 185 g Borsäure in 100 ein3 des Gemisches mit dem Na triumsalz der Adenosindiphos phorsäure 8, 3 7 7, 9 31, 9 1, 1 4, 5
Beispiel 7:
Das Natriumsalz von Adenosintriphosphorsäure wurde mit 25% Natriumpyrophosphat gemeinsam aus wässriger Losung auskristallisiert und getrocknet. Die getrocknete Mischung wurde 8 Monate bei 20 C gelagert.
Danach betrug der Verlust an Adenosintriphosphorsäure 25, 6%. Bei einer Probe des festen Natriumsalzes von Adenosintriphosphorsäure ohne Zusatz. von Natriumpyrophosphat betrug er 45, 5%. Der Verlust war also im Monatsdurchschnitt mit Zusatz von Natriumpyro- phosphat 3, 2%, ohne Zusatz 5, 7%.
Process for stabilizing alkali salts of adenosine polyphosphoric acids.
The adenosine polyphosphoric acids are commercially available in the form of their salts both in the solid state and in the liquid form. These preparations have the disadvantage that they are not permanent. This is mainly due to the fact that phosphoric acid is split off after a while. Presumably the acid released in the process accelerates the further decomposition.
It has now been found that it is possible to stabilize alkali salts of adenosine polyphosphoric acids by adding substances which react to the alkali salts in such a way that the pH value in aqueous solution is in the alkaline range. This makes it possible to reduce the rate of decomposition of the adenosine polyphosphoric acid salts in such a way that the preparations produced according to the invention can be kept for a very long time and are consequently considerably more valuable than the preparations previously on the market.
Substances with a particularly alkaline reaction, such as caustic alkali, soda, pyrophosphates and the like, and alkaline organic materials, such as glycocoll, aminoethyl alcohol, arginine, choline and the like, have proven to be suitable substances for setting a pH value in the alkaline range. It was also found that stabilization can also be achieved by adding buffer substances which, in solution, buffer the phosphoric acid split off from the adenosine polyphosphoric acid, such as buffer mixtures of borax and boric acid and the like.
It was also shown that particularly favorable results are achieved if the basic reacting substances are added in such an amount that the pH of the solution is between 7.5 and 11.5. PH values between 8 and 10 have been found to be particularly advantageous for these cases.
The process according to the invention can be carried out in various ways.
You can z. B. add the additives to a solution of an alkali salt of an adenosine polyphosphoric acid; but you can also crystallize a solid alkali metal salt of an adenosine polyphosphoric acid together with an additive from aqueous solution. Other types of mixing can also be used, depending on the desired products and the technical means available.
Adenosine polyphosphoric acids are usually marketed in the form of aqueous solutions of their alkali salts. It has been shown, however, that the method according to the invention can also be successfully applied to solid preparations, since these also show, albeit less, decomposition than the solutions, and since this decomposition can likewise be reduced considerably by using the invention .
The inventive 3 stabilized preparations of adenosine polyphosphoric acid salts can be used for various purposes. For example, they are used in experimental biology for solubilizing inorganic and organic salts, for phosphorylation and for enzymatic syntheses. They can be used for further chemical reactions, for example to obtain the therapeutically important adenosine monophosphoric acids. If necessary, the sodium salt of adenosine triphosphoric acid, for example, can be used directly in medicine.
Adenosine diphosphoric acid and adenosine triphosphoric acid are mainly suitable as adenosine polyphosphoric acids.
The adenosine polyphosphoric acids can be obtained from various starting materials, for example from muscle tissue or from adenosine and phosphoric acid by enzymatic conversion, for example under the enzymatic action of yeast. The products obtained in this way are best precipitated repeatedly with barium and queek silver salts for their purification.
Example 1 :
125 mg of sodium adenosine triphosphoric acid, dissolved in 5 cubic meters of water, were mixed with a 1% pyrophosphate solution until the ex p value of the solution was approximately 8.3.
This solution was kept at a temperature of 20 or 35¯C for several months.
The analysis showed the following results after two months:
Decomposition of Na-ATP in% temperature with addition without addition temperature pH 8.3 pH 6.8 at 20 2, 8 12, 8 at 35 21.5 53, 6 These values correspond to a monthly decomposition of about 1.4% adenosine triphos -. phosphoric acid with pyrophosphate addition, compared to 6.4% without pyrophosphate addition, in each case at a storage temperature of 20 C.
Example 9:
A borax-boric acid solution was added to 125 mg of sodium adenosine triphosphoric acid, dissolved in 5 cubic meters of water, until the pu value of the solution was approximately 8.5. This solution was kept at a temperature of 20 and 35 ° C. for several months.
After two months the analysis showed a decomposition of the sodium adenosine triphosphoric acid as follows: decomposition of the Na-ATP in% storage temperature + borax boron acid solution without addition pH 8.5 pH 6.8 at 20¯ 3.6 18.4 at 35¯ 12.6 51.8 Example 3:
A sodium hydroxide glycocoll solution was added to 125 mg of the sodium salt of adenosine triphosphoric acid, dissolved in 5 cubic meters of water, until the pg value of the solution was approximately 7.5. The solution was stored at 20 C and after a month the analysis showed 0% decomposed adenosine triphosphoric acid compared to 1.2% without the addition of buffer.
Example 4:
Before the sodium salt of adenosine triphosphoric acid was dried, 240 mg of sodium pyrophosphate were added to 1000 mg of this salt and this salt mixture was brewed together to crystallize out. Storage of this dry salt at 20 resulted in a monthly decrease in adenosine triphosphoric acid of 1.1% compared to 1.4% adenosine triphosphoric acid loss without the addition of pyrophosphate.
Example 5:
The following table I summarizes the results of experiments in which the sodium salt of adenosine triphosphoric acid was stored in aqueous solution at 20 ° C. for 8 to 13 months. The decomposition of adenosine triphosphoric acid was measured with and without additives. The results show the stabilizing effect of the additives.
Table. 1 :
Decomposition losses of ATP
Duration of storage in total per month Type and quantity of the additional record? H value @@@@ with without with storage with without with without
Months Addition Addition Addition Addition%%%% NaOH, except for pn 9, 3 added 9, 3 11 13, 5 85, 5 1, 2 7, 8 soda, until auE pli 9, 3 added 9, 3 8 6, 2 50, 0 0, 8 6, 2 sodium pyrophosphate, 1, 0% 8, 3 13 17, 0 55, 5 1, 3 4, 3 borate buffer = 0, 668 g borax, + 0, 185 g boric acid in 100 em3 of the mixture with the sodium salt of adenosine triphosphoric acid 8, 3 11 4, 5 26, 5 0, 4 2, 4 aminoethyl alcohol,
1, 0% 8, 9 11 9, 7 78, 0 0, 9 7, 1 arginine, 1, 8% 8, 1 11 6, 0 61, 0 0, 5 5, 5 choline, 0, 62% 9, 4 8 7, 9 38, 5 1, 0 4, 8
Example 6:
In the following Table II the results of Vers-Lichen are compiled, in which the sodium salt of adenosine diphosphoric acid was stored in aqueous solution for 7 months at 20 C with and without additives.
The results of the tests clearly show the stabilizing effect of the additives.
Table ll:
Decomposition losses of ADP Duration of storage total per month Type and amount of additive? H-value with without with without
Months Addition Addition Addition Addition%%%% NaOH except for pI 8, 5 added 8, 5 7 13, 4 40, 0 1, 9 5, 7 borate buffer = 0.668 g borax, + 0.185 g boric acid in 100 a3 of the mixture with the sodium salt of adenosine diphosphoric acid 8, 3 7 7, 9 31, 9 1, 1 4, 5
Example 7:
The sodium salt of adenosine triphosphoric acid was crystallized out of aqueous solution together with 25% sodium pyrophosphate and dried. The dried mixture was stored at 20 ° C. for 8 months.
Thereafter, the loss of adenosine triphosphoric acid was 25.6%. In a sample of the solid sodium salt of adenosine triphosphoric acid without additives. from sodium pyrophosphate it was 45.5%. The monthly average loss was therefore 3.2% with the addition of sodium pyrophosphate, and 5.7% without the addition.