Procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé. La. présente invention a. pour objet un procédé de préparation du sel potassique de pénicilline cristallisé.
Le processus d'isolement de la pénicilline du bouillon de fermentation comprend habi- tuellement l'extraction du bouillon, acidifié et filtré, par un solvant, organique, ordinaire- ment de l'acétate d'amyle, le traitement au carbone du liquide d'extraction, la.
purifica iion de ce liquide, par exemple par extraction répétée avec de l'eau ou des solvants organi ques, par adsorption chroinatographique ou par d'autres moyens et l'évaporation à basse teni- pérature de la solution aqueuse finalement obtenue du sel potassique ou sodique de péni cilline pour obtenir ce sel sous forme amor phe. C'es sels amorphes obtenus par dessicca tion à basse température présentent l'inconvé nient d'être impurs, hygroscopiques et relati vement instables.
()n a trouvé qu'une cristallisation efficace du sel potassique de pénicilline, avec produc tion (le cristaux pratiquement purs et blancs, peut être obtenue seulement. par la. combinai son de certaines opérations dont l'importance n'a pas été comprise jusqu'ici, soit qu'on les envisage seules, soit. qu'on envisage leurs combinaisons, et que l'inclusion de ces opérations dans le processus de puri fication est d'une importance capitale pour obtenir de bons rendements.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on extrait la pénicilline d'un bouil- Ion de fermentation acidifié contenant de la pénicilline, par un solvant organique, en ce qu'on transforme la pénicilline contenue dans l'extrait en le sel potassique de pénicilline amorphe par adjonction d'un composé alca lin du potassium, en ce qu'on prépare une solution de ce sel potassique amorphe dans un mélange d'ea.ii et de butanol normal, le sel ayant une activité d'au moins 800 unités internationales de pénicilline par milli gramme,
en ce qu'on traite cette solution avec dn charbon activé en quantité au phis égale à 10 % du poids de la solution, en ce qu'on sépare ensuite le charbon de la solution, en ce qu'on ajuste le<B>pH</B> de la solution à une valeur com prise entre 5,0 et 7,5,
en ce qu'on évapore la solution ainsi obtenue en maintenant la te neur en eau de la solution à une valeur d'au moins 5 % en volume jusqu'à ce que la con centration en sel potassique de pénicilline soit au moins de 15 mg par millilitre, en ce qu'on poursuit ensuite l'évaporation de la solution sans adjonction d'eau jusqu'à. ce que la cris tallisation du sel potassique se produise, et en ce qu'on recueille le sel potassique de pénicil line cristallisé.
Il est nécessaire que le solvant organique utilisé pour dissoudre le sel potas sique amorphe de pénicilline soit une solution aqueuse de butanol normal,-et ensuite que le sel potassique de pénicilline amorphe soumis à la cristallisation ait une activité d'au moins 800 et de préférence d'au moins 1000 unités internationales de pénicilline par milli- gramme. On a trouvé, d'une part, qu'avec des solvants organiques autres que le butanol nor mal, les rendements obtenus en cristaux de sel potassique de pénicilline sont notablement ré duits, et, d'autre part, que si la pureté du sel amorphe soumis à la cristallisation est.
infé rieure à celle indiquée ci-dessus, l'efficacité du procédé de cristallisation est diminuée et le produit obtenu est moins pur. En outre, bien que le traitement au charbon n'ait pas une influence notable sur la _pureté du sel. potassi que de pénicilline cristallisé finalement obtenu, il permet d'éliminer des petites quantités de certaines impuretés qui peuvent agir comme des inhibiteurs de cristallisation et dont la présence doit être évitée pour avoir une cris tallisation satisfaisante du sel.
De plus, la solution doit être pratiquement neutre, son pH étant. compris entre 5,0 et 7,5, et de pré férence entre 6,4 et 6,6, car il peut. se pro duire une décomposition de la pénicilline à des pH phis acides ou phis alcalins en pré sence de butanol normal. Enfin, la concen tration en pénicilline dans la solution de bu- tanol normal doit être d'au moins 15 mg par millilitre, et. de préférence de 20 à 35 mg par millilitre avant de laisser cristalliser le sel potassique de pénicilline.
Le butanol normal humide est un solvant pour le sel potassique de pénicilline amorphe, tandis que le butanol normal anhydre ne dissout pratiquement pas ce sel. I1 est évident par conséquent qu'en évaporant une solution du sel potassique de pénicilline amorphe dans du butanol normal humide, l'eau s'élimine sous forme d'un mé lange azéotropique avec une partie du butanol normal, ce qui entraîne la cristallisation ou la précipitation du sel potassique de pénicilline du butanol normal anhydre résultant.
Afin d'éviter le plus possible la destruction de la, pénicilline pendant le stade d'évaporation, il est avantageux d'effectuer cette évaporation par au moins deux passages dans un 6vapo- rat.eur à couche mince, en ajoutant de l'eau à la solution du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avant chaque passage dans l'évaporateur, de manière que la teneur en eau de cette solution ne tombe pas au-dessous de 5% en volume jusqu'à ce que la solution ait. été concentrée à. la valeur indiquée avant la cristallisation. Il est. avan tageux de recristalliser le sel potassique de pénicilline cristallisé obtenu en premier lieu.
Les plI de la solution sont déterminés en diluant tin échantillon de la solution avec dix fois son volume d'eau distillée, et en mesurant le pH de la solution obtenue.
L'ajustage du pH de la solution peut. se faire en ajoutant un. composé de potassium alcalin tel que l'hydroxyde, le carbonate ou le bicarbonate de potassium. , Le traitement au charbon de la solution peut. se faire, par exemple, en brassant la so lution avec 4 o!o en poids du produit marque Actibon C ou d'un autre charbon activé, en séparant le charbon par filtration et. en le lavant sur le filtre avec.
du butanol nornu 1, la première fraction de lavage étant ajoutée au filtrat, et les autres fractions étant utili sées pour le premier lavage et les lavages subséquents d'une autre charge de charbon.
Il faut noter que toutes les opérations de distillation et d'évaporation intervenant. dans le présent procédé et portant sur des solu tions eontenart de la pénicilline peuvent être effectuées à pression réduite, selon la prati que ordinaire, Pour éviter une décomposition de la pénicilline qui serait due aux tempéra tures élevées pendant. ces opérations. Une pression de moins de 50 mm Hg s'est montrée satisfaisante.
L'évaporateur à couche mince utilisable pour l'évaporation de la solution aqueuse dans le butanoi normal du sel potassique amorphe peut être un évaporateur à couche ascension nelle d'un type usuel, avant un débit suffi- samment élevé polir réduire, sinon supprimer, la destruction de la pénicilline due à de lon gues périodes (le contact avec le butanol nor mal à température élevée.
On poursuit l'éva poration de la solution jusqu'à atteindre une concentration en sel d'au moins 1:5 mg par millilitre (soit, par exemple, 2-1000 -unités par millilitre), et de préférence comprise entre 20 et 35 m@- par millilitre, et pendant cette concentration on ajoute, si nécessaire, une quantité déterminée d'eau à la solution aqueuse de butanol avant chaque passage dans l'évaporateur, de manière que la teneur en eau de la.
solution ne tombe pas au-dessous de 5 % en volume, pour.éviter qu'une cristal- lisation prématurée du sel potassique de péni- eilline ne se produise et pour réduire la dé composition du sel de pénicilline qui est beau coup plus lente en présence d'eau.
La concen tration en eau peut être avantageusement de ?0 % en volume avant chaque passage. Quand la concentration du sel de pénicilline dans la solution a atteint au moins 15 mg par milli litre pendant. le stade de concentration, la cristallisation peut. s'effectuer par un ou plu sieurs passages supplémentaires de la solution dans l'évaporateur et sans addition d'eau.
Ces passages finals de la solution concentrée à tra vers l'évaporateur peuvent être prévus par ré glage de la concentration de la solution, de la température et de la vitesse d'écoulement, de manière que la cristallisation du sel potassi que de pénicilline se produise dans un organe collecteur et non dans le tube d'évaporation. La liqueur-mère séparée peut être passée à nouveau dans l'évaporateur, afin d'augmenter le rendement en sel cristallisé.
I1 faut noter que la solution concentrée obtenue après plusieurs passages dans l'évapo rateur peut être évaporée plus avant par sim ple distillation ou évaporation sous pression réduite pour effectuer la cristallisation du sel potassique de pénicilline au lieu de passer clans l'évaporateur.
Le sel potassique cristallin et la liqueur- mère peuvent être séparés par filtration, et la liqueur-mère, qui a ordinairement une fai ble teneur en pénicilline G et une teneur rela- tivement haute en pénicilline F, peut être trai tée pour récupérer ces pénicillines.
Le sel cris tallisé séparé peut ensuite être recristallisé, par exemple par dissolution dans une solution aqueuse de butanolnormal etparadjonction de butanol normal sec à la solution, de préférence en deux fractions au moins et à la température de 0 C environ, pour amener la concentration ile l'alcool à. 95-99 % en vol-Lune environ, ce qui entraîne la cristallisation du sel.
On a constaté que si l'addition de butanol normal sec se poursuit jusqu'à une concentration fi- nale en butanol normal de 971% en volume, en veillant à ce que la cristallisation com mence avec une teneur en eau aussi haute que possible, on obtient des cristaux blancs du sel potassique de pénicilline d'une pureté de 100 11/o pratiquement,
avec un rendement de 72 à 77 % clans ce dernier stade de recristal- lisation. Quand on poursuit l'addition de bu- tanol normal sec. jusqu'à tue concentration finale de 99 % en volume, le rendement en produit cristallisé peut être augmenté,
mais le produit est aussi phis coloré. Comme la liqueur-mère séparée à ce stade peut être uti lisée à nouveau à. un stade antérieur du pro cédé, par exemple en l'ajoutant à la solution traitée au charbon, il n'y a pas d'avantage à continuer l'addition de butanol normal sec au-delà d'une concentration de 97 0/0.
Il faut noter aussi que, bien que la solu tion du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal utilisée puisse être obtenue de différentes manières, il est avanta geux que cette solution provienne de l'extrac tion aqueuse d'une solution du sel potassique de pénicilline dans un solvant organique, telle qu'obtenue dans le procédé ordinaire de pré paration de la pénicilline, suivie d'une extrac tion de l'extrait aqueux par du butanol nor mal.
Ces extractions peuvent se faire avanta geusement en continu à contre-courant dans une tour ou dans un élément à plusieurs étages, la proportion dut solvant à l'eau dans chaque extraction étant choisie de manière à assurer une extraction optimum de la péni- eilline, tout en évitant une dilution inutile de la solution de pénicilline ainsi traitée.
On a observé que le traitement de la solu tion du sel potassique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avec un charbon activé, particulièrement avec un charbon activé chimiquement, entraîne l'acidification de cette solution et nécessite, par conséquent, l'ajustement dit pH à une valeur comprise entre 5,0 et 7,5, et de préférence entre 6,4 et 6,6, avant de concentrer la solution. Cet ajus tement se fait de préférence en ajoutant à la solution une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium avant de commencer l'évaporation.
Si cependant la solution butylique est déjà saturée d'eau, il est impossible de neutraliser la. solution par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, et il est. nécessaire dans ce cas d'ajouter de l'hy droxyde de potassium aqueux après que la so lution a été partiellement concentrée et dés hydratée par un seul passage dans l'évapora teur.
L'exemple suivant expose une mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'activité de la pénicilline est donnée en unités inter nationales, et les pourcentages sont en poids, sauf indication contraire.
.Exemple: On agite une solution de sel potassique de pénicilline amorphe dans du butanol normal, obtenue comme indiqué plus haut à partir d'un bouillon acidifié, en présence d' Acti- bon C (charbon activé acide), à raison de 4 parties en poids de charbon pour 100 parties en volume de la solution,
on sépare le char bon par filtration et on lave le précipité de charbon sur le filtre avec 25 % du volume de la solution originale du butanol normal.
Le sel potassique de pénicilline récupéré dans le filtrat et dans la première fraction de la- vage représente les 97 % du sel original,
et la décoloration obtenue dans ce stade est de 80 %. La solution traitée au charbon est en- suite évaporée par plusieurs passages dans un évaporateur à couche mince ascensionnelle comprenant un tube d'évaporation en métal 1-lonel de 61 cm de long-Lieur et de 6 mm de diamètre intérieur,
et un système de con densation comportant une chemise en métal hlonel de 12,5 mm de diamètre intérieur.
Après le premier passage dans l'évapora teur, on neutralise la solution à un p_H de 6,2 au moyen d'une solution d'hydroxyde de po tassium. La teneur en eau de la solution est ajustée à une valeur d'environ ?0 % en vd- lume avant chaque passage. Le débit du liquide à travers l'évaporateur est d'environ 6,8 litres/heure.
Quand la. solution a été con- centrée jusqu'à. une valeur de 31,1 nig de sel potassique de pénicilline par millilitre, le sel est cristallisé par trois nouveaux passages de la solution dans l'évaporateur, la substance cristalline étant séparée dans le système col lecteur après chaque passage du liquide dans l'évaporateur.
La, substance cristalline est alors séparée par filtration de la. liqueur-mère, et consiste en sel potassique de pénicilline d'une pureté de 99 %, le rendement étant- de 791/o.
La. substance cristalline séparée est. dis soute dans deux fois son poids d'une solution aqueuse de butanol normal à<B>88</B> 0io en volume environ, et le sel potassique de pénicilline est recristallisé dans cette solution par addition, en plusieurs fractions, de butanol normal sec, à.
0 C, jusqu'à une concentration finale de 97 % en volume. La. substance cristalline obte- nue consiste en sel. potassique de pénicilline blanc d'une pureté (le 100 010, le rendement étant de 77 0/0.
Si l'on tient compte du sel potassique de pénicilline clans la. liqueur-mère, qui rentre dans le cycle au premier stade du procédé où on l'ajoute a la solution traitée au charbon, on obtient. un. rendement de 99 0io en substance cristalline dans ce stade de re- cristallisation.
Process for the preparation of crystallized penicillin potassium salt. The present invention a. for object a process for preparing the potassium salt of crystallized penicillin.
The process of isolating penicillin from the fermentation broth usually involves extracting the broth, acidified and filtered, with an organic solvent, usually amyl acetate, carbon treatment of the liquid d 'extraction, the.
purification of this liquid, for example by repeated extraction with water or organic solvents, by chromatographic adsorption or by other means and the evaporation at low temperature of the aqueous solution finally obtained from the potassium salt or sodium penicillin to obtain this salt in amor phe form. These amorphous salts obtained by drying at low temperature have the disadvantage of being impure, hygroscopic and relatively unstable.
() has found that an efficient crystallization of the potassium salt of penicillin, with production (the practically pure and white crystals, can be obtained only. by the. combination of certain operations, the importance of which has not been understood until now. Here, either they are considered alone or their combinations are considered, and the inclusion of these operations in the purification process is of paramount importance to obtain good yields.
The process according to the invention is characterized in that the penicillin is extracted from an acidified fermentation broth containing penicillin, with an organic solvent, in that the penicillin contained in the extract is converted into it. amorphous penicillin potassium salt by adding an alkaline potassium compound, in that a solution of this amorphous potassium salt is prepared in a mixture of water and normal butanol, the salt having an activity of at at least 800 international units of penicillin per milligram,
in that this solution is treated with activated carbon in an amount at phis equal to 10% of the weight of the solution, in that the carbon is then separated from the solution, in that the <B> pH is adjusted </B> of the solution to a value between 5.0 and 7.5,
in that the solution thus obtained is evaporated while maintaining the water content of the solution at a value of at least 5% by volume until the concentration of potassium salt of penicillin is at least 15 mg per milliliter, in that the evaporation of the solution is then continued without adding water to. that the crystallization of the potassium salt takes place, and in that the crystallized potassium salt of penicillin is collected.
It is necessary that the organic solvent used to dissolve the amorphous potassium salt of penicillin is an aqueous solution of normal butanol, and then that the amorphous potassium salt of penicillin subjected to crystallization has an activity of at least 800 and preferably at least 1000 international units of penicillin per milligram. It has been found, on the one hand, that with organic solvents other than normal butanol, the yields obtained of crystals of the potassium salt of penicillin are notably reduced, and, on the other hand, that if the purity of the salt amorphous subject to crystallization is.
lower than that indicated above, the efficiency of the crystallization process is reduced and the product obtained is less pure. Furthermore, although the charcoal treatment does not have a significant influence on the purity of the salt. potassium crystallized penicillin finally obtained, it allows to eliminate small amounts of certain impurities which can act as crystallization inhibitors and whose presence must be avoided to have a satisfactory crystallization of the salt.
In addition, the solution must be practically neutral, its pH being. between 5.0 and 7.5, and preferably between 6.4 and 6.6, because it can. Penicillin decomposes at phis acidic or phis alkaline in the presence of normal butanol. Finally, the penicillin concentration in the normal butanol solution should be at least 15 mg per milliliter, and. preferably 20 to 35 mg per milliliter before allowing the potassium salt of penicillin to crystallize.
Wet normal butanol is a solvent for the amorphous penicillin potassium salt, while anhydrous normal butanol does not substantially dissolve this salt. It is evident, therefore, that by evaporating a solution of the amorphous penicillin potassium salt in moist normal butanol, the water is removed as an azeotropic mixture with some of the normal butanol, resulting in crystallization or precipitation of the penicillin potassium salt from the resulting anhydrous normal butanol.
In order to avoid as much as possible the destruction of penicillin during the evaporation stage, it is advantageous to carry out this evaporation by at least two passages in a thin-film vaporizer, adding water. to the solution of the amorphous penicillin potassium salt in normal butanol before each passage through the evaporator, so that the water content of this solution does not fall below 5% by volume until the solution has . been concentrated at. the value indicated before crystallization. It is. advantage of recrystallizing the potassium salt of crystallized penicillin obtained in the first place.
The plI of the solution are determined by diluting a sample of the solution with ten times its volume of distilled water, and by measuring the pH of the solution obtained.
Adjusting the pH of the solution can. be done by adding a. an alkaline potassium compound such as potassium hydroxide, carbonate or bicarbonate. , Charcoal treatment of the solution can. be done, for example, by mixing the solution with 4% by weight of the product brand Actibon C or another activated carbon, separating the carbon by filtration and. washing it on the filter with.
butanol nornu 1, the first wash fraction being added to the filtrate, and the other fractions being used for the first wash and subsequent washes of another charge of carbon.
It should be noted that all the distillation and evaporation operations involved. in the present process and involving penicillin contenart solutions can be carried out at reduced pressure, according to ordinary practice, to avoid decomposition of the penicillin which would be due to the high temperatures during. these operations. A pressure of less than 50 mm Hg has been shown to be satisfactory.
The thin-film evaporator usable for the evaporation of the aqueous solution in the normal butanol of the amorphous potassium salt can be a rising film evaporator of a conventional type, before a sufficiently high flow rate polish reduce, if not remove, destruction of penicillin due to long periods (contact with butanol is normal at elevated temperature.
Evaporation of the solution is continued until a salt concentration of at least 1: 5 mg per milliliter (ie, for example 2-1000 units per milliliter), and preferably between 20 and 35, is reached. m @ - per milliliter, and during this concentration is added, if necessary, a determined amount of water to the aqueous solution of butanol before each passage through the evaporator, so that the water content of the.
solution does not fall below 5% by volume, to prevent premature crystallization of the potassium salt of penileillin from occurring and to reduce the decomposition of the penicillin salt which is much slower in volume. presence of water.
The water concentration can advantageously be 0% by volume before each pass. When the concentration of the penicillin salt in the solution has reached at least 15 mg per milli liter during. the concentration stage, crystallization can. be carried out by one or more additional passages of the solution in the evaporator and without adding water.
These final passages of the concentrated solution through the evaporator can be provided by controlling the concentration of the solution, the temperature and the flow rate, so that the crystallization of the potassium salt of penicillin occurs. in a collector and not in the evaporation tube. The separated mother liquor can be passed through the evaporator again, in order to increase the yield of crystallized salt.
It should be noted that the concentrated solution obtained after several passes through the evaporator can be further evaporated by simple distillation or evaporation under reduced pressure to effect crystallization of the potassium salt of penicillin instead of passing through the evaporator.
The crystalline potassium salt and the mother liquor can be separated by filtration, and the mother liquor, which usually has a low penicillin G content and a relatively high penicillin F content, can be treated to recover these penicillins. .
The separated crystallized salt can then be recrystallized, for example by dissolving in an aqueous solution of normal butanol and adding dry normal butanol to the solution, preferably in at least two fractions and at a temperature of approximately 0 C, to bring the concentration ile. alcohol to. 95-99% by vol-Moon approximately, resulting in crystallization of the salt.
It has been found that if the addition of dry normal butanol is continued up to a final normal butanol concentration of 971% by volume, ensuring that crystallization begins with as high a water content as possible, white crystals of the potassium salt of penicillin are obtained with a purity of practically 100 11 / o,
with a yield of 72 to 77% in this last stage of recrystallization. When the addition of dry normal butanol is continued. up to a final concentration of 99% by volume, the yield of crystallized product can be increased,
but the product is also phis colored. As the mother liquor separated at this point can be used again at. an earlier stage of the process, for example by adding it to the carbon treated solution, there is no advantage in continuing the addition of normal dry butanol beyond a concentration of 97% .
It should also be noted that, although the solution of the amorphous penicillin potassium salt in the normal butanol used can be obtained in different ways, it is advantageous that this solution comes from the aqueous extraction of a solution of the potassium salt. of penicillin in an organic solvent, as obtained in the ordinary process for the preparation of penicillin, followed by extraction of the aqueous extract with normal butanol.
These extractions can advantageously be carried out continuously against the current in a tower or in a multi-stage element, the proportion of solvent to water in each extraction being chosen so as to ensure optimum extraction of the penileillin, while avoiding unnecessary dilution of the penicillin solution thus treated.
It has been observed that the treatment of the solution of the amorphous penicillin potassium salt in normal butanol with an activated charcoal, particularly with a chemically activated charcoal, results in the acidification of this solution and therefore requires the so-called pH adjustment. to a value between 5.0 and 7.5, and preferably between 6.4 and 6.6, before concentrating the solution. This adjustment is preferably made by adding an aqueous solution of potassium hydroxide to the solution before starting the evaporation.
If, however, the butyl solution is already saturated with water, it is impossible to neutralize it. solution by adding an aqueous solution of potassium hydroxide, and it is. It is necessary in this case to add aqueous potassium hydroxide after the solution has been partially concentrated and dehydrated by a single pass through the evaporator.
The following example sets out an implementation of the method according to the invention. The activity of penicillin is given in international units, and percentages are by weight, unless otherwise indicated.
Example: A solution of amorphous penicillin potassium salt in normal butanol, obtained as indicated above from an acidified broth, is stirred in the presence of Acti- bon C (acid activated charcoal), in a proportion of 4 parts. by weight of carbon per 100 parts by volume of the solution,
the char bon is filtered off and the charcoal precipitate is washed on the filter with 25% of the volume of the original solution of normal butanol.
The potassium salt of penicillin recovered in the filtrate and in the first fraction of the wash represents 97% of the original salt,
and the discoloration obtained in this stage is 80%. The charcoal-treated solution is then evaporated by several passes in an ascending thin-film evaporator comprising a 1-lonel metal evaporation tube 61 cm long and 6 mm in internal diameter,
and a condensation system comprising a hlonel metal jacket with an internal diameter of 12.5 mm.
After the first passage through the evaporator, the solution is neutralized to a pH of 6.2 with a solution of potassium hydroxide. The water content of the solution is adjusted to a value of about 0% by volume before each pass. The flow rate of liquid through the evaporator is approximately 6.8 liters / hour.
When the. solution was concentrated until. a value of 31.1 nig of penicillin potassium salt per milliliter, the salt is crystallized by three more passes of the solution in the evaporator, the crystalline substance being separated in the reader neck system after each passage of the liquid in the evaporator .
The crystalline substance is then separated by filtration from the. mother liquor, and consists of penicillin potassium salt of 99% purity, the yield being 791%.
The separated crystalline substance is. dissolved in twice its weight of an aqueous solution of normal butanol to <B> 88 </B> 0io by volume approximately, and the potassium salt of penicillin is recrystallized in this solution by adding, in several fractions, of normal butanol that's it.
0 C, to a final concentration of 97% by volume. The crystalline substance obtained consists of salt. pure white penicillin potassium (100 010, the yield being 77%.
If we take into account the potassium salt of penicillin in the. mother liquor, which enters the cycle at the first stage of the process where it is added to the solution treated with coal, is obtained. a. 99% yield of crystalline substance in this recrystallization step.