CA2720203A1

CA2720203A1 - Composition osteogenique comprenant un complexe facteur de croissance/polymere amphiphile un sel soluble de cation et un support organique

Info

Publication number: CA2720203A1
Application number: CA2720203A
Authority: CA
Inventors: Remi Soula; Olivier Soula; Gerard Soula
Original assignee: Adocia SAS
Current assignee: Adocia SAS
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2009-04-14
Publication date: 2009-10-22
Also published as: MX2010011267A; AU2009237414A1; IL208139A0; US20110159068A1; BRPI0906553A2; US20090291114A1; KR20110014588A; WO2009127940A1; CN102065882A; ZA201006627B; EP2288370A1; JP2011519292A

Abstract

L'invention concerne un implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins : .cndot. un complexe facteur de croissance ostéogénique/polysaccharide anionique amphiphile, .cndot. un sel soluble de cation au moins divalent, et .cndot. un support organique .cndot. ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé. Dans un mode de réalisation ledit implant est sous forme de lyophilisât. Elle concerne également son procédé de préparation.

Description

COMPOSITION OSTEOGENIQUE COMPRENANT UN COMPLEXE FACTEUR
DE CROISSANCE/POLYMERE AMPHIPHILE UN SEL SOLUBLE DE CATION ET
UN SUPPORT ORGANIQUE
La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations des protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs.

Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965;'l 50, 893).

Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un cysteine knot (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP, J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à
l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.).

Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à
l'activation ou à la répression des gènes cibles.

Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur

2 différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery,.2003, 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération et la différentiation.

Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP 2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales.
Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE aux Etats-Unis et de InductOs en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à
imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.

La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires.
OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la solution de CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.

On connait de la demande de brevet US2008/014197 un implant ostéoinducteur constitué d'un support (scaffold) contenant une céramique minérale, d'une membrane solide liée intégralement au support et d'un agent ostéogénique. Le support est de préférence une éponge de collagène. La céramique minérale comprend un dérivé de calcium, de préférence une matrice minérale insoluble dans l'eau telle que le phosphate de calcium biphasique ([00241, p2). La membrane solide liée intégralement à l'implant doit être

3 imperméable de façon à limiter l'entrée de cellules des tissus mous environnants et également prévenir l'entrée de cellules inflammatoires ([0030], p 3).
L'entrée de ces cellules dans l'implant est décrite comme pouvant conduire à une réduction de la croissance osseuse et à un échec du traitement ([0007], p 1).
Cette invention est centrée sur l'ajout d'une membrane à l'implant pour améliorer l'ostéogénèse.

La demande de brevet US2007/0254041 décrit un dispositif en forme de feuillet contenant une matrice d'os déminéralisé (Demineralized Bone Matrix ou DBM), des particules de collagène et une matrice polysaccharidique réticulée physiquement. Cet implant peut par ailleurs contenir une substance ostéogénique telle qu'un facteur de croissance. Le polysaccharide réticulé physiquement sert d'agent de stabilisation des particules d'os déminéralisé ([0026], p 3) celui-ci à
base d'alginate est réticulé par ajout de chlorure de calcium.
La demande de brevet W096/39203 décrit un matériau composite ostéogénique et biocompatible doté d'une résistance physique. Ce matériau ostéoinductif est composé d'os déminéralisé, l'ostéoinduction ne pouvant avoir lieu qu'en présence d'os déminéralisé, ou en présence d'extraits protéiques d'os déminéralisé, ou en présence de ces deux éléments selon les auteurs (lignes 2-5, p 2). A ce matériau est ajouté un sel de calcium ou un sel minéral. Le sel minéral est décrit comme pouvant être de l'hydroxyde de sodium, du chlorure de sodium, du chlorure de magnésium ou de l'hydroxyde de magnésium (lignes 4-9, p 17). Le sel de calcium peut être un sel soluble ou non (lignes 20-21, p 17) et est de préférence de l'hydroxyde de calcium. La sélection des hydroxydes de différents cations, en particulier de calcium, à ajouter est justifié par l'effet d'augmentation de pH de la matrice favorable à l'augmentation de la synthèse de collagène dans cet environnement (lignes 7-11, p 15).
Cette invention couvre la formation de nouveaux implants à base d'os déminéralisés dont les propriétés physique et ostéogénique serait améliorée par l'augmentation du pH de l'implant.

Il a par ailleurs été démontré qu'il était particulièrement intéressant de former des complexes entre un facteur de croissance et un polymère dans le but de le stabiliser, d'augmenter sa solubilité et/ou d'augmenter son activité.

4 Ainsi, dans la demande de brevet FR0705536 au nom de la demanderesse, il a pu être démontré que la formation de complexe entre la BMP-2 et un polymère amphiphile permettait notamment d'augmenter la solubilité
de cette protéine très hydrophobe et peu soluble à pH physiologique.
Dans la demande de brevet FR0705536, la demanderesse a également mis en évidence l'augmentation de l'activité biologique de la BMP-2 en présence d'un dérivé du dextrane fonctionnalisé par un substituant hydrophobe.
In vitro, ce complexe de la BMP-2 apparaît en tout point supérieur à la BMP-2 seule.
Il reste cependant essentiel de trouver une formulation permettant d'améliorer la performance de ces facteurs de croissance BMPs afin de pouvoir, par exemple, diminuer les quantités à administrer.

Cette problématique est commune à de nombreuses formulations de facteurs de croissance puisque ces protéines sont en général utilisées à des doses dépassant de plusieurs ordres de grandeur les doses physiologiques.

Il est du mérite de la demanderesse d'avoir trouvé une formulation de facteurs de croissance permettant d'améliorer leur activité par addition d'une solution d'un sel soluble d'un cation au moins divalent à un hydrogel contenant lesdits facteurs de croissance, ledit sel soluble de cation, au moins divalent, potentialisant l'effet du facteur de croissance.

D'une façon surprenante, cette nouvelle formulation permet de produire le même effet ostéogénique avec des quantités moindres de facteurs de croissance.

L'invention concerne un implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins :
= un complexe facteur de croissance ostéogénique/polysaccharide anionique amphiphile, = un sel soluble de cation au moins divalent, et = un support organique = ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé.

On entend par implant ouvert, un implant ne comportant ni membrane ni enveloppe susceptible de limiter ou de réguler les échanges avec les tissus environnant l'implant et substantiellement homogène dans sa constitution.

5 On entend par matrice d'os déminéralisé (Demineralized Bone Matrix ou DBM) une matrice obtenue par extraction acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance.
Une telle matrice déminéralisée peut également être préparée sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques.

On entend par support organique, un support constitué par une matrice organique et/ou un hydrogel.
On entend par matrice organique, une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.

La matrice organique est un hydrogel obtenu par réticulation chimique de chaînes de polymère. Les liaisons covalentes inter-chaînes définissant une matrice organique. Les polymères pouvant être employés pour la constitution d'une matrice organique sont décrits dans la revue de Hoffman intitulée Hydrogels for biomédical applications (Adv. Drug Deliv. Rev, 2002, 43, 3-12).

Dans un mode de réalisation, la matrice est choisie parmi les matrices à
base de collagène naturel purifié, stérilisé réticulé.
Les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV
extraits à
partir de tendon ou d'os de boeuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés.

Les supports organiques selon l'invention peuvent être utilisés en mélange pour obtenir des matériaux qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau

6 aux propriétés mécaniques suffisantes pour être formé voire moulé ou encore sous la~forme d'un putty ou le collagène ou un hydrogel joue un rôle de liant.

Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques et qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un putty ou le collagène joue un rôle de liant.
Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TCP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes.
Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs.

On entend par hydrogel, un réseau tri-dimensionel hydrophile de polymère capable d'adsorber une quantité importante d'eau ou de liquides biologiques (Peppas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46). Un tel hydrogel est constitué d'interactions physiques et n'est donc pas obtenu par réticulation chimique des chaînes de polymère.

Parmi ces polymères, on peut trouver des polymères synthétiques ainsi que des polymères naturels. Les polysaccharides formant des hydrogels sont décrits par exemple dans l'article intitulé : Polysaccharide hydrogels for modified release formulations (Coviello et al. J. Control. Release, 2007, 119, 5-24).

7 Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel réticulé
ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.

Dans un mode de réalisation, le polymère formant un hydrogel est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.
Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.

Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.
On entend par polysaccharide amphiphile un polysaccharide choisi dans le groupe des polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.
Ces polysaccharides sont constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2). Ils peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteur de fonctions acides ou anioniques et porteurs de fonctions acides.
Ils sont fonctionnalisés par au moins un dérivé du tryptophane, noté
Trp :

8 = ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, - F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide, = Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'amine du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.

Selon l'invention, le polysaccharide comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane peut répondre à la formule générale I suivante :

Polysaccharide 1 [ Trp ]o .
~
[Trp]n Formule I
= le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2),

9 = F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine, = R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide = Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'amine du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.

n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1, (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité
saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2, - lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K.
lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na' ou K
lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.
Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.

Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué
par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
5 Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.

10 Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdiane.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :

11 F O O F O F
O
, OH OH OH OH

ou leurs sels de cations alcalins.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué
par le tryptophane, le -tryptophano, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le dérivé du tryptophane est choisi parmi les esters du tryptophane de formule Il.

O

OE
N
H Formule Il E étant un groupement pouvant être :
= un alkyle linéaire ou ramifié en Cl à C8.

= un alkylaryle ou un arylalkyle linéaire ou ramifié en C6 à C20.
Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.

12 Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des dextranes fonctionnalisés avec des acides aminés hydrophobes tels que le tryptophane et les dérivés du tryptophane tels que décrits dans la demande FR 07/02316.

Selon l'invention, le dextrane fonctionnalisé peut répondre à la formule générale III suivante :

Dextran AA]P
t Formule III

R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide = F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine, = AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'amine de !'amino-acide et un acide porté par le groupement R.

t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité
glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1.

Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na', K

13 ledit dextrane étant amphiphile à pH neutre.

Dans un mode de réalisation, le cation alcalin est Nâ .

Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un carboxymethyl dextrane de formule IV.
R=H
O

OR O R ~ ONa RO RO
Formule IV
ou l'acide correspondant.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane de formule V :

R = H
O O
OR O R ONa RO RO O
Formule V
ou l'acide correspondant.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :

F O O F O F

y Yy OH OH OH OH
ou leurs sels de cations alcalins.

14 Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que I'amino-acide hydrophobe est choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophano, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés du tryptophane sont choisis parmi les esters du tryptophane de formule II tels que définis précédemment.

Dans un mode de réalisation le dextrane selon l'invention est un carboxyméthyldextrane modifié par le tryptophane de formule VI :
RH
O =
OR 0 R - ONa RO RO
n - 0 C02Na R NH
/ Formule VI

Dans un mode de réalisation le dextrane selon l'invention est un ester monosuccinique de dextrane modifié par le tryptophane de formule VII :

RH
O O
OR 0 * R * ONa RO RO O
O C02Na R=
N NH

Formule Vii Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide ou décarboxylés.

Dans un mode de réalisation, le dextran selon l'invention est caractérisé en ce que les dérivés de la phenylalanine, de la leucine, de l'isoleucine et de la valine sont choisis parmi les esters de ces acides aminés de formule VIII.
O O O O

Formule VIII

E étant défini comme précédemment.

10 Dans un mode de réalisation, le dextrane selon l'invention est caractérisé en ce que l'amino-acide hydrophobe est la phénylalanine, et ses dérivés alcool, amide ou décarboxylés.

Le dextrane peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10

15 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles tels que ceux décrits dans la demande FR 08/05506 dont au moins un est substitué
par un dérivé d'alcool hydrophobe, noté Ah :
= ledit alcool hydrophobe (Ah) étant greffé ou lié au polysaccharide anionique par un bras de couplage R, ledit bras de couplage étant lié au polysaccharide anionique par une fonction F' ladite fonction F' résultant du couplage entre la fonction amine du bras de liaison R et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, et ledit bras de couplage étant lié
à l'alcool hydrophobe par une fonction G résultant du couplage entre une fonction carboxyle, isocyanate, thioacide ou alcool du bras de couplage et une fonction de l'alcool hydrophobe, les fonctions carboxyles du

16 polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na' ou K.

- F' étant une fonction amide, - G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide, = Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R.

ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre.

Le polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes est choisi parmi les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles de formule générale IX :

Polysaccharide + carboxyle F' R
G
Ah q Formule IX

- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7,

17 - F, R, G et Ah répondant aux définitions données ci-dessus, et lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides naturellement porteurs de groupes fonctionnels carboxyles et sont choisis dans le groupe constitué
par l'alginate, le hyaluronane, le galacturonane.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à
partir de polysaccharides comportant naturellement des groupes fonctionnels carboxyles ou à partir de polysaccharides neutres sur' lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été
greffées de formule générale X.

Polysaccharide I
Q
r X
- les polysaccharides naturels étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4) et/ou (1,3) et/ou (1,2), - L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate ou éther, - r représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité
saccharidique du polysaccharide Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, - CO2H

18 Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué
par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un hyaluronane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.

Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.

19 Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité
de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
â
Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe Q est choisi dans les groupes suivants :

L L L
O O -- y ,O
OH OH OH
OH
Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,1 et2.
Dans un mode de réalisation, r est compris entre 0,2 et 1,5.

Dans un mode de réalisation, le groupement R selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés.

Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés.
Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés naturels.

Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont choisis parmi la leucine, l'alanine, l'iso-leucine, la glycine, la phénylalanine, le tryptophane, la valine.

Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras.
Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée comprenant de 4 à

carbones.

Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline.

5 Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol.

Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol.
Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe Ah est choisi parmi les tocophérols.

Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol.
Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol.

Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle.

Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique.

Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.

Dans un mode de réalisation, ladite composition est sous forme de lyophilisat.

Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation au moins divalent est un sel soluble de cation divalent, choisi parmi les cations du calcium, du magnésium ou du zinc.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation au moins divalent est un sel soluble de calcium.

On entend par sel soluble de cation au moins divalent, un sel dont la solubilité est égale ou supérieure à 5 mg/mL, de préférence 10 mg/mL, de préférence 20 mg/mL.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, I'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est un sel de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, I'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.
Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.

Dans un mode de réalisation, le sel soluble de cation est un sel soluble de cation multivalent.

On entend par cations multivalents, des espèces portant plus de deux charges positives comme le fer, l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine.

On entend par facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.

Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5.
Dans un mode de réalisation la protéine ostéogénique est la BMP-2 (Dibotermine-alpha).
Dans un mode de réalisation la protéine ostéogénique est le GDF-5.
Les BMP utilisées sont des BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA).
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé juste avant l'implantation.

Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé et conservé
dans une seringue pré-remplie afin d'être ensuite implanté.

Dans un mode de réalisation, l'hydrogel peut être préparé par réhydratation d'un lyophilisat juste avant l'implantation ou être implanté
sous forme déshydraté.
La lyophilisation est une technique de sublimation de l'eau permettant une déshydratation de la composition. Cette technique est couramment utilisée pour la conservation et la stabilisation des protéines.

La réhydratation d'un lyophilisat est très rapide et permet l'obtention aisée d'une formulation prête à l'emploi, ladite formulation pouvant être réhydratée avant l'implantation ou implantée sous sa forme déshydratée, la réhydratation intervenant alors, après implantation, par le contact avec les fluides biologiques.

En outre, à ces facteurs de croissance ostéogéniques, il est possible d'ajouter d'autres protéines et en particulier des facteurs de croissance angiogéniques tel que le PDGF, le VEGF ou le FGF.

L'invention concerne donc une composition selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF.

Les compositions ostéogéniques selon l'invention sont utilisées par implantation par exemple pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement de l'absence de consolidation des fractures (pseudarthrose).

Dans ces différentes utilisations thérapeutiques la taille de la matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à combler.
Dans un mode de réalisation les solutions de polysaccharide anionique ont des concentrations comprises entre 0,1 mg/ml et 100 mg/ml, de préférence 1 mg/ml à 75 mg/ml, encore de préférence entre 5 et 50 mg/ml.
Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,05 mg à 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg.

Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral, les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg.
S'agissant des utilisations en réparation maxillo-faciale ou dans le traitement de la pseudarthrose, par exemple, les doses administrées seront inférieure au mg.

Dans un mode de réalisation, les solutions de cation divalent ont des concentrations comprises entre 0,01 et 1 M, de préférence entre 0,05 et 0,2 M.

Dans un mode de réalisation les solutions de polysaccharide anionique ont des concentrations comprises entre 0,1 mg/ml et 100 mg/ml, de préférence 1 mg/ml à 75 mg/ml, encore de préférence entre 5 et 50 mg/ml.

L'invention concerne également le procédé de préparation d'un implant selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes :
a) on dispose d'une solution comprenant un complexe facteur de croissance ostéogénique/polysaccharide anionique et d'une matrice organique et/ou d'un hydrogel, b) on ajoute la solution contenant le complexe à la matrice organique et/ou à l'hydrogel, et on homogénéise éventuellement le mélange, c) on additionne à l'implant obtenu en b) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, d) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à
l'étape c).

L'invention concerne également le procédé de préparation d'un implant selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes :

a) on dispose d'une solution comprenant un complexe facteur de croissance ostéogénique/polysaccharide anionique amphiphile et d'une matrice organique et/ou d'un hydrogel, b) on additionne à la matrice organique et/ou à l'hydrogel a) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, c) on ajoute la solution contenant le facteur de croissance à la matrice organique et/ou à l'hydrogel obtenu en b) et on homogénéise éventuellement le mélange, d) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à l'étape c).

Dans un mode de réalisation la matrice organique est une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.

Dans un mode de réalisation, la matrice est choisie parmi les matrices à
base de collagène naturel purifié, stérilisé de préférence réticulé.

Dans un mode de réalisation, à l'étape a), le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères 5 synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.

10 Dans un mode de réalisation, à l'étape a), le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, 15 la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.

Dans un mode de réalisation, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés,

20 le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.

Dans un mode de réalisation, à l'étape a), le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels 25 l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.

Dans un mode de réalisation à l'étape b) ou c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent.

Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de calcium dont le contre-ion est choisi parmi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.

Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.

Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.

Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.

Dans un mode de réalisation à l'étape b) ou c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation multivalent.

Dans un mode de réalisation les cations multivalents sont choisis dans le groupe consitué par les cations multivalents du fer, de l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine.

Dans un mode de réalisation à l'étape a), on dispose également d'une solution d'un facteur de croissance non ostéogénique.
L'invention concerne également l'utilisation de la composition selon l'invention comme implant osseux.

Dans un mode de réalisation ladite composition pourra être utilisée en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale.

Elle concerne également les méthodes thérapeutiques et chirurgicales utilisant ladite composition dans la reconstruction osseuse.
L'invention est illustrée par les exemples suivants.

Exemple 1: Préparation d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du L-tryptophane Le Polymère 1 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par le sel de sodium du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol, soit un degré de polymérisation de 154 (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316.
La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par le tryptophane, soit t dans la formule I, est de 1,03. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par le tryptophane, soit p dans la formule III, est de 0,36.

Exemple 2: Préparation d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique du L-tryptophane Le Polymère 2 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol, soit un degré de polymérisation de 154 (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FR07.02316.
La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par l'ester éthylique du tryptophane, soit t dans la formule III, est de 1,07. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester éthylique du tryptophane, soit p dans la formule III, est de 0,49.
Exemple 3: Préparation d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester décylique de la L-glycine Le Polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester décylique de la L-glycine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol, soit un degré de polymérisation de 154 (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FRO8.05506.
La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par l'ester décylique de la L-glycine, soit r dans la formule X, est de 1,04. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester décylique de la L-glycine, soit q dans la formule IX, est de 0,09.

Exemple 4: Préparation d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester octanoique de la L-phénylalanine Le Polymère 4 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié
par l'ester octanoique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol, soit un degré de polymérisation de 154 (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans la demande de brevet FRO8.05506. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium, modifiés ou non par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit r dans la formule X, est de 1,07. La fraction molaire de méthylcarboxylates de sodium modifiés par l'ester octanoique de la L-phénylalanine, soit q dans la formule IX, est de 0,08.

Exemple 5: Préparation du complexe rhGDF-5/Polymère 3 Formulation 1 : 50 pl d'une solution de rhGDF-5 à 2,0 mg/mi dans de I'HCI 5 mM sont mélangés à 50 pi d'une solution de Polymère 3 à 61,1 mg/ml. La solution de polymère est tamponnée par du phosphate à 20 mM (pH de 7,2). La solution de complexe GDF-5/Polymère 3 est à pH 6,4 et contient 10 mM de phosphate. Le ratio molaire GDF-5/Polymère 3 est de 1/20. Cette solution est enfin filtrée sur 0,22 pm. La solution finale est limpide et est caractérisée par Diffusion Dynamique de la Lumière. La majeure partie des objets présents mesure moins de 10 nm.
Exemple 6: Préparation du complexe rhGDF-5/Polymère 4 Formulation 2: 679 pl d'une solution de rhGDF-5 à 3,7 mg/ml dans de l'HCI 10 mM sont mélangés à 1821 pl d'une solution de Polymère 4 à 42,3 mg/mi (pH de 7,3). La solution de complexe GDF-5/Polymère 4 est à pH 6,5 et contient 1 mg/ml de GDF-5 et 30.8 mg/ml de Polymère 4. Le ratio molaire GDF-5/Polymère 4 est de 1/20. Cette solution est enfin filtrée sur 0,22 }gym.
La solution finale est limpide et est caractérisée par Diffusion Dynamique de la Lumière. La majeure partie des objets présents mesure moins de 10 nm.

Exemple 7: Préparation des implants éponge de collagène /
rhBMP-2 Implant 1 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant utilisation.
La dose de BMP-2 est de 2 pg.

Implant 2 : Il est préparé comme l'implant 1 avec 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml. La dose de BMP-2 est de 20 pg.

Exemple 8: Préparation du complexe rhBMP-2/Polymère 1 Formulation 3: 50 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,15 mg/ml est mélangé à 100 pl d'une solution de Polymère 1 à 37,5 mg/ml. Les solutions de rhBMP-2 et de Polymère 1 sont tamponnées à pH 7,4. Cette solution est laissée à
incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0,22 pm.
Formulation 4: Elle est préparée comme la Formulation 3 en mélangeant 50 pl d'une solution de rhBMP-2 à 1,5 mg/ml à 100 pl d'une solution de Polymère 1 à 37,5 mg/ml.

Exemple 9: Préparation des implants éponge collagène /
complexe BMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, lyophilisés Implant 3 : 40 pl de la Formulation 4 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 pl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. Après 15 minutes, l'éponge est prête à l'emploi. La dose de BMP-2 est de 20 pg.

Exemple 10 : Préparation des implants éponge collagène /
complexe BMP-2/ Polymère 1 en présence de chlorure de calcium, lyophilisés 5 Implant 4 : 40 pl de la Formulation 3 sont introduits dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 pl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est alors ensuite congelée 10 et lyophilisée stérilement. La dose de BMP-2 est de 2 pg.

Implant 5 : Il est préparé comme l'implant 4 avec 40 pl de la Formulation 4. La dose de BMP-2 est de 20 pg.

15 Exemple 11 : Evaluation du pouvoir ostéoinductif des différentes formulations L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir ostéoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat.
20 Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA - SD, Charles River Laboratories France, B.P. 109, 69592 l'Arbresle) sont utilisés pour cette étude.
Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic , Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage 25 sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à
l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine solution, Vetoquinol, France).
Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé
dans 30 une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site).
L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylène (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non-absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement.

A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETIL 25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France).
Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL , VETOQUINOL, France). Une observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et côtée selon le barème suivant : 0 : absence, faible, 2: modéré, 3: marqué, 4: important.
Chacun des implants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des implants sont ensuite déterminés. Chaque implant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée.

Résultats :
Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la BMP-2 en plaçant l'implant dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique.
Les observations macroscopiques des explants nous permettent d'évaluer la présence des tissus osseux et la masse des implants.

Implant Présence de tissus osseux Masse des implants (mg) Implant 1 Implants non retrouvés Implant 2 3,6 38 Implant 3 4.0 120 Implant 4 2,4 84 Implant 5 3.8 249 Une dose de 2 pg de BMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 1) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours.

Une dose de 20 pg de BMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 2) conduit à l'obtention d'implants ossifiés de 38 mg de masse moyenne après 21 jours.

Pour la même dose de BMP-2 d'environ 20 pg, le complexe BMP-2/
Polymère 1 (Implant 3) en présence de CaCl2 en solution dans l'éponge à
collagène permet d'augmenter l'activité ostéogénique de la BMP-2. La masse moyenne des implants 3 est environ 3 fois supérieure à celle des implants .2.
La lyophilisation permet d'amplifier ce gain d'activité ostéogénique puisque la masse moyenne des implants contenant .20 pg de BMP-2 sous forme de complexe avec le Polymère l en présence de CaCI2 lyophilisés dans l'éponge à
collagène (implant 5) est deux fois supérieure à celle des implants dans lesquels le complexe BMP-2/ Polymère 1 en présence de CaCl2 est en solution (implant 3).
Pour une dose de BMP-2 10 fois inférieure, le complexe BMP-2 en présence de CaCl2 lyophilisé dans l'éponge à collagène (Implant 4) permet de générer des implants ossifiés de masse 2 fois supérieure avec un score osseux équivalent à ceux avec la BMP-2 seule. Cette nouvelle formulation permet de réduire fortement les doses de BMP-2 à administrer tout en maintenant l'activité
ostéogénique de cette protéine.

Exemple 12: Préparation de formulations contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 Formulation 5: 552 pl d'une solution de rhBMP-2 à 1,35 mg/ml sont mélangés à 619 pl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml. Le volume de formulation 5 est complété à 1300 pl par ajout d'eau stérile. Cette solution est laissée à incuber deux heures à 4 C et filtrée stérilement sur 0.22 pm. La concentration en rhBMP-2 dans la formulation 5 est de 0,571 mg/ml et celle en polymère 1 de 28,6 mg/ml.

Formulation 6 : Elle est préparée comme la Formulation 5 en mélangeant 175 pl d'une solution de rhBMP-2 à 1,47 mg/ml à 1224 pl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml. Le volume de formulation 6 est complété à
1800 pl par ajout d'eau stérile. La concentration en rhBMP-2 dans la formulation 6 est de 0,14 mg/ml et celle en polymère 1 de 40,8 mg/ml.

Formulation 7: Elle est préparée comme la Formulation 5 en mélangeant 26,5 pl d'une solution de rhBMP-2 à 1,46 mg/ml à 321,7 pl d'une solution de polymère 1 à 60,0 mg/ml. Le volume de formulation est complété à
772 pl par jout d'eau stérile. La concentration en rhBMP-2 dans la formulation est de 0,05 mg/ml et celle en polymère 1 de 25 mg/ml.

Exemple 13: Préparation d'un gel de hyaluronate de sodium contenant du chlorure de calcium Gel 1 : 10,62 ml d'eau stérile sont introduits dans un Falcon de 50 ml.
0,44 g de hyaluronate de sodium (Pharma grade 80, Kibun Food Chemifa, LTD) sont ajoutés sous vive agitation au vortex. 0,14 g de chlorure de calcium sont ensuite ajoutés au gel de hyaluronate de sodium également sous agitation. La concentration en chlorure de calcium dans le gel est de 13,1 mg/ml.
Exemple 14: Préparation d'un gel de hyaluronate de sodium contenant le complexe rhBMP-2lPolymère -1 et du chlorure de calcium Gel 2 : 1230 pl de la Formulation 5 sont transférés dans une seringue stérile de 10 ml. 5,8 ml du gel 1 de hyaluronate de sodium à 4% contenant du chlorure de calcium à une concentration de 13,1 mg/ml sont transférés dans une seringue stérile de 10 ml. La solution de formulation 5 est ajoutée au gel 1 en couplant les deux seringues et le gel obtenu est homogénéisé par plusieurs passages d'une seringue à l'autre. Le gel opaque obtenu est transféré dans un Falcon de 50 ml. La concentration en rhBMP-2 dans le gel 2 est de 0,10 mg/ml et celle en polymère 1 de 5,0 mg/ml.
200 pl du gel 2 sont injectés par site d'implantation. La dose de rhBMP-2 implantée est de 20 pg.

Exemple 15: Préparation d'un gel de hyaluronate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 et du chlorure de calcium Gel 3: ce gel est préparé comme décrit à l'exemple 13 en employant 1697 pl de la formulation 6 et 8 ml de gel de hyaluronate de sodium à 4%
contenant du chlorure de calcium à une concentration de 15,8 mg/ml. La concentration en rhBMP-2 dans le gel 3 est de 0,025 mg/ml et celle en polymère de 7,14 mg/ml.
200 pl du gel 3 sont injectés par site d'implantation. La dose de rhBMP-2 implantée est de 5 pg.

Exemple 16: Préparation d'un gel d'alginate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 et-du chlorure de calcium Gel 4 : ce gel est préparé en employant 772 pl de la formulation 7 et 386 pl de gel d'alginate de sodium à 40 mg/ml. 40 pl d'une solution de chlorure de calcium à 45,5 mg/ml sont ajoutés à 60 pl du gel d'alginate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1. La concentration en rhBMP-2 dans le gel 4 est de 0,02 mg/mi et celle en polymère 1 de 10,0 mg/ml.
100 pl du gel 4 sont injectés par site d'implantation. La dose de rhBMP-2 implantée est de 2 lag.

Exemple 17 : Préparation d'un implant de collagène contenant un gel d'alginate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 et du chlorure de calcium Implant 6 : Le gel 5 est préparé en employant 645 pl de la formulation 7 et 323 pl de gel d'alginate de sodium à 40 mg/ml. 60 pl du gel d'alginate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 sont ajoutés à
une éponge de collagène réticulée de 200 mm3, stérile, de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). 40 pl d'une solution de chlorure de calcium à 45,5 mg/ml sont également ajoutés à cette éponge. Après 30 minutes de temps de contact, l'éponge est ensuite congelée et lyophilisée. Cette éponge peut être directement implantée chez le rat.

La dose de rhBMP-2 dans l'implant 1 est de 2 pg, celle de Polymère 1 est de 1 mg.

Exemple 18 : Evaluation du pouvoir osteoinductif des différentes 5 formulations Le pouvoir ostéoinductif est évalué selon le protocole décrit à
l'exemple 11.
Résultats :
10 Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 placée dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique. Les résultats des différentes exemples sont résumés dans le tableau suivant.

Présence de tissu osseux Masse des ex plants m Implant 1 Aucun expiant trouvé
Implant 2 3,6 38 Gel 2 3,7 247 Gel 3 3,6 354 Gel 4 2,7 63 Implant 6 2,4 165 Une dose de 2 pg de rhBMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 1) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver des expiants au bout de 21 jours.

Une dose de 20 pg de rhBMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 2) conduit à l'obtention d'explants ossifiés de 38 mg de masse moyenne après 21 jours.

Pour la même dose de rhBMP-2 de 20 pg, le gel de hyaluronate de sodium contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 (Gel 2) en présence de chlorure de calcium permet d'augmenter l'activité ostéogénique de la rhBMP-2.
La masse moyenne des expiants obtenus avec le gel 2 est environ 6 fois supérieure à celle des explants obtenus avec les implants de collagène contenant 20 pg de rhBMP-2 seule (Implant 8).

Pour une dose de rhBMP-2 4 fois inférieure, soit 5 pg de rhBMP-2, le complexe rhBMP-2/Polymère 1 en présence de CaCI2 dans le gel de hyaluronate de sodium (Gel 3) permet de générer des explants ossifiés de masse 9 fois supérieure avec un score osseux équivalent aux expiants obtenus avec les implants de collagène contenant 20 pg de rhBMP-2 seule (Implant 8). Cette nouvelle formulation permet de réduire fortement les doses de BMP-2 tout en maintenant l'activité ostéogénique de cette protéine.

Pour une dose de rhBMP-2 10 fois inférieure, le complexe rhBMP-2/Polymère 1 dans un gel d'alginate de sodium contenant du chlorure de calcium (Gel 4) permet de générer des expiants ossifiés de masse légèrement supérieure à ceux obtenus avec les implants de collagène contenant 20 pg de rhBMP-2 seule (Implant 8). Cette nouvelle formulation permet de réduire fortement les doses de rhBMP-2 tout en maintenant l'activité ostéogénique de cette protéine.
Le gel d'alginate contenant le complexe rhBMP-2/Polymère 1 peut également être déposé dans une éponge à collagène qui sert de support à la croissance des cellules osseuses. Dans ce cas également, 2 pg de rhBMP-2 (Implant 6) permet d'obtenir des explants ossifiés de masse supérieure à ceux obtenus avec les implants de collagène contenant 20 pg de rhBMP-2 seule (Implant 8).

Claims

1. Implant ouvert constitué d'une composition ostéogénique comprenant au moins :
.cndot. facteur de croissance ostéogénique, .cndot. un sel soluble de cation au moins divalent, et .cndot. un support organique .cndot. ledit support organique ne comprenant pas de matrice d'os déminéralisé.

2. Implant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support est constitué par une matrice organique et/ou un polymère formant un hydrogel.

3. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice organique est une matrice constituée par des hydrogels réticulés et/ou du collagène.

4. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé de préférence réticulé.

5. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé

est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.

6. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractériséen ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé
est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, le pullulane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.

7. Implant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, le pullulane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.

8. Implant selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, parmi lesquels l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables

9. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite composition est sous forme de lyophilisat.

10. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives.

11. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5.

12. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est la BMP-2 (Dibotermine-alpha).

13. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine ostéogénique est le GDF-5.

14. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF.

15. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le cation au moins divalent est un cation divalent choisi dans le groupe constitué par les cations du calcium, du magnésium ou du zinc.

16. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou I'ascorbate .

17. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.

18. Implant selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le cation au moins divaient est un cation multivalent choisi dans le groupe constitué par les cations du fer, de l'aluminium ou des polymères cationiques choisis parmi la polylysine, la spermine, la protamine et la fibrine, seuls ou en combinaison.

19. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides fonctionnalisés par des dérivés hydrophobes.

20. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide amphiphile est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides anioniques comportant majoritairement des liaisons glycosidiques de type (1,4), (1,3) et/ou (1,2), fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane répondant à la formule générale I suivante :

Formule I

.cndot. le polysaccharide étant constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), .cndot. F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH
du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine, .cndot. R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N et/ou S, et ayant au moins une fonction acide .cndot. Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'amine du dérivé du tryptophane et le au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique.

n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,05 et 0,7.
i représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1, (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité
saccharidique et est comprise entre 0,1 et 2, - lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na ou K.
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na+
ou K+.
lesdits polysaccharides étant amphiphiles à pH neutre.

21. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides anioniques fonctionnalisés de formule générale III suivante :

.cndot. R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide .cndot. F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH
du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou amine, .cndot. AA étant un reste amino-acide hydrophobe, L ou D, produit du couplage entre l'amine de l'amino-acide et un acide porté par le groupement R.
Ledit amino-acide hydrophobe étant choisi parmi les dérivés du tryptophane, tels que le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin ou choisi parmi la phenylalanine, la leucine, l'isoleucine et la valine et leurs dérivés alcool, amide au décarboxylés.

t représente la fraction molaire de substituant F-R-[AA]n par unité
glycosidique et est comprise entre 0,1 et 2, p représente la fraction molaire des R substitués par AA et est comprise entre 0,05 et 1.

Lorsque R n'est pas substitué par AA, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+, K+, ledit dextran étant amphiphile à pH neutre.

22. Implant selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide amphiphile est choisi dans le groupe constitué par les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles en partie substitués par des alcools hydrophobes de formule générale IX:

- dans laquelle, q représente la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est comprise entre 0,01 et 0,7, - F' étant une fonction amide, - G étant soit une fonction ester, thioester, carbonate, carbamate, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide, .cndot. Ah étant un reste d'un alcool hydrophobe, produit du couplage entre la fonction hydroxyle de l'alcool hydrophobe et au moins une fonction électrophile portée par le groupement R.

- lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-R-G-Ah, alors la ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K.
ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre.

23. Procédé de préparation d'un implant selon l'invention comprenant au moins les étapes suivantes :
a) on dispose d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, b) on dispose d'une matrice organique et/ou d'un polymère formant un hydrogel, c) on ajoute la solution contenant le facteur de croissance à la matrice organique et/ou à l'hydrogel, et on homogénéise éventuellement le mélange, d) on additionne à l'implant obtenu en c) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent, e) on procède éventuellement à la lyophilisation de l'implant obtenu à
l'étape d).

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la matrice organique est une matrice constituée par un hydrogel réticulé et/ou du collagène.

25. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé
de préférence réticulé.

26. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé est choisi dans le groupe des polymères synthétiques parmi lesquels les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide lactique, les copolymères de l'éthylène glycol et de l'acide glycolique, la poly(N-Vinyl pyrrolidone), les acides polyvinyliques, les polyacrylamides, les acides polyacryliques.

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 26 caractérisé en ce que, le polymère formant un hydrogel réticulé ou non réticulé

est choisi dans le groupe des polymères naturels parmi lesquels l'acide hyaluronique, le kératane, la pectine, le dextrane, la cellulose et les dérivés de cellulose, l'acide alginique, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine, le collagène, la gélatine, la polylysine, la fibrine et leurs sels biologiquement acceptables.

28. Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, constitué par l'acide hyaluronique, l'acide alginique, le dextrane, la pectine, la cellulose et ses dérivés, le pullulane, le xanthane, la carraghénane, le chitosane, la chondroitine et leurs sels biologiquement acceptables.

29. Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce que, le polymère naturel est choisi dans le groupe des polysaccharides formant des hydrogels, constitué par l'acide hyaluronique, l'acide alginique et leurs sels biologiquement acceptables.

30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 29 caractérisé en ce que la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent.

31. Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est choisi parmi les sels de magnésium dont le contre-ion est le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.

32. Procédé selon la revendication 31 caractérisé en ce que le sel soluble de cation divalent est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, le formiate, le D-saccharate, l'acétate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate, le propionate, le fumarate, le sorbate, le bicarbonate, le bromure ou l'ascorbate.

33. Procédé selon la revendication 31 caractérisé en ce qu'à l'étape d) le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium.

34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 35 caractérisé en ce qu'à l'étape a), on dispose également d'une solution d'un facteur de croissance non ostéogénique.