CA2328298A1 - Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre - Google Patents
Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre Download PDFInfo
- Publication number
- CA2328298A1 CA2328298A1 CA002328298A CA2328298A CA2328298A1 CA 2328298 A1 CA2328298 A1 CA 2328298A1 CA 002328298 A CA002328298 A CA 002328298A CA 2328298 A CA2328298 A CA 2328298A CA 2328298 A1 CA2328298 A1 CA 2328298A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- buffer solution
- nucleic
- membrane
- sample
- use according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
- B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Water Treatment By Electricity Or Magnetism (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique: a) on dispose d'une solution tampon; b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un côté avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique; c) on établit ledit champ électrique; d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique; caractérisé en ce que: on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane; on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare de l'échantillon biologique au moins le matériel nucléique, et dispositif pour le mettre en oeuvre.
Description
PROCÉDÉ D'ELECTRO-SÉPARATION D'UN ÉCHANTILLON BIOLOGIQUE ET
DISPOSITIF DE MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé d'électro-séparation d'une fraction nucléique à partir d'un lysat cellulaire, ainsi que tout dispositif, notamment à usage unique, pour la mise en oeuvre dudit procédé d'électro-séparation.
Différents procédés, mais aussi dispositifs, ont été à ce jour proposés ou décrits, aux fins de séparer un matériel nucléique ou une fraction nucléique, à partir d'un lysat cellulaire.
t o Par " séparation ", on entend de manière générique tout processus permettant d'enrichir ou concentrer un milieu, isoler ou déterminer (de manière qualitative et/ou quantitative) dans un milieu complexe, au moins un matériel nucléique, c'est à dire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou de l'acide ribonucléique (ARN).
Conformément au document de la Société ISCO, dénommé
ISCO Applications (Bulletin 54, ~ Electroelution of Nucleic Acids and Proteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 1989), mais aussi conformément au document US-G-4 164 464, i.l est décrit un dispositif d'électro-élution, et non d'électro-séparation, comprenant:
- un premier réservoir pour une première solution tampon, comportant deux compartiment opposés, fermés chacun par une membrane perméable, l'une de section importante, et l'autre de section faible, et présentant chacune un seuil de coupure permettant de retenir le matériel nucléique ou protéique d'intérët, - un second réservoir pour une deuxième solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir par lesdites membranes, - deux électrodes en contact électrique avec la seconde solution tampon, générant un champ électrique traversant les deux membranes perméables, de celle de section importante à celle de section faible, et donc traversant la premiêre solution tampon.
Ce dispositif sert à concentrer une fraction nucléique ou protéique, déjà relativement pure mais diluée, en disposant cette fraction sur la membrane de section importante, et en recueillant sur la membrane de section faible la même fraction, mais concentrée. La concentration est WO 99/53304 l'CT/FR99/00830
DISPOSITIF DE MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé d'électro-séparation d'une fraction nucléique à partir d'un lysat cellulaire, ainsi que tout dispositif, notamment à usage unique, pour la mise en oeuvre dudit procédé d'électro-séparation.
Différents procédés, mais aussi dispositifs, ont été à ce jour proposés ou décrits, aux fins de séparer un matériel nucléique ou une fraction nucléique, à partir d'un lysat cellulaire.
t o Par " séparation ", on entend de manière générique tout processus permettant d'enrichir ou concentrer un milieu, isoler ou déterminer (de manière qualitative et/ou quantitative) dans un milieu complexe, au moins un matériel nucléique, c'est à dire de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou de l'acide ribonucléique (ARN).
Conformément au document de la Société ISCO, dénommé
ISCO Applications (Bulletin 54, ~ Electroelution of Nucleic Acids and Proteins from Gels, and Electrophoretic Concentration of Macromolecules 1989), mais aussi conformément au document US-G-4 164 464, i.l est décrit un dispositif d'électro-élution, et non d'électro-séparation, comprenant:
- un premier réservoir pour une première solution tampon, comportant deux compartiment opposés, fermés chacun par une membrane perméable, l'une de section importante, et l'autre de section faible, et présentant chacune un seuil de coupure permettant de retenir le matériel nucléique ou protéique d'intérët, - un second réservoir pour une deuxième solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir par lesdites membranes, - deux électrodes en contact électrique avec la seconde solution tampon, générant un champ électrique traversant les deux membranes perméables, de celle de section importante à celle de section faible, et donc traversant la premiêre solution tampon.
Ce dispositif sert à concentrer une fraction nucléique ou protéique, déjà relativement pure mais diluée, en disposant cette fraction sur la membrane de section importante, et en recueillant sur la membrane de section faible la même fraction, mais concentrée. La concentration est WO 99/53304 l'CT/FR99/00830
2 obtenue du fait du transport des biomolécules par les lignes de champ électrique, qui se concentrent au niveau de la membrane de faible section:
II ne s'agit donc ni d'un procédé; ni d'un dispositif de séparation, au sens de la définition précédente, c'est à dire au sens où à
partir d'un milieu complexe on sépare ou isole un matériel biologique d'intérêt.
Conformément à la figure 5 du document US-C- 5 415 758, il est décrit un procédé d'électro-élution en parallèle, au sein d'une multiplicité de puits 42 d'une plaque de titration 41. La plâque 41 est 1 o immergée dans un tampon 52, sans débordement de ce dernier à l'intérieur de chaque puits 42, et chaque puits comporte une membrane 53 fermant une ouverture 54 ménagée dans son fond, en sorte que une communication osmotique puisse s'établir entre le tampon 52 et un tampon 55 disposé
dans chaque puits 42. Dans chaque puits 42 s'établit un champ électrique, grâce à une cathode 24, distribuée entre les différents puits 42, et l'anode unique 14. L'échantillon biologique 44, comportant un matériel nucléique, par exemple une goutte de sang disposée sur un support poreux, est élué
par le flux électrolytique, en sorte que dans chaque puits le matériel nucléique se trouve dissous ou distribué, pour un prélèvement ultérieur, par 20 exemple avec une pipette.
De manière générale, le document US-C-5 415 758 décrit un procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, libres et mobiles dans ledit 25 milieu liquide sous l'action du champ électrique, procédé selon lequel a) on dispose d'une solution tampon, b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un c&té
avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa 3o migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable.
d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, 35 en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique,
II ne s'agit donc ni d'un procédé; ni d'un dispositif de séparation, au sens de la définition précédente, c'est à dire au sens où à
partir d'un milieu complexe on sépare ou isole un matériel biologique d'intérêt.
Conformément à la figure 5 du document US-C- 5 415 758, il est décrit un procédé d'électro-élution en parallèle, au sein d'une multiplicité de puits 42 d'une plaque de titration 41. La plâque 41 est 1 o immergée dans un tampon 52, sans débordement de ce dernier à l'intérieur de chaque puits 42, et chaque puits comporte une membrane 53 fermant une ouverture 54 ménagée dans son fond, en sorte que une communication osmotique puisse s'établir entre le tampon 52 et un tampon 55 disposé
dans chaque puits 42. Dans chaque puits 42 s'établit un champ électrique, grâce à une cathode 24, distribuée entre les différents puits 42, et l'anode unique 14. L'échantillon biologique 44, comportant un matériel nucléique, par exemple une goutte de sang disposée sur un support poreux, est élué
par le flux électrolytique, en sorte que dans chaque puits le matériel nucléique se trouve dissous ou distribué, pour un prélèvement ultérieur, par 20 exemple avec une pipette.
De manière générale, le document US-C-5 415 758 décrit un procédé de traitement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, d'un échantillon biologique comprenant à la fois un matériel nucléique et un matériel non nucléique, par exemple protéique, libres et mobiles dans ledit 25 milieu liquide sous l'action du champ électrique, procédé selon lequel a) on dispose d'une solution tampon, b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un c&té
avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter le matériel nucléique, du côté de ladite solution tampon, lors de sa 3o migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable.
d) on dispose l'échantillon biologique dans la solution tampon, 35 en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique,
3 En pratique, un tel procédé ne permet pas de séparer le matériel nucléique de l'échantillon biologique, jusqu'au point d'éliminer pratiquement tout matériel non nucléique, par exemple protéique.
D'autre part, aux fins de séparer un matériel nucléique, on connaît la demande de brevet publiée sous le numéro WO 97/41219, qui divulgue un procédé pour capturer des acides nucléiques à partir d'un mélange constitué par exemple de cellules lysées. Le procédé nécessite de déposer une électrode dans le mélange, d'appliquer à l'électrode un voltage permettant d'attirer les acides nucléiques, puis d'enlever l'électrode recouverte par les acides nucléiques. L'électrode recouverte des acides nucléiques est alors plongée dans une solution permettant, par inversion du courant, de libérer les acides nucléiques qui sont ensuite directement amplifiables. Le voltage appliqué pour pouvoir effectuer une amplification est de préférence de 0,5 à 3 volts pendant environ 30 secondes. Ce ~ 5 procédé, bien qu'utile pour séparer des plasmides contenus dans des cellules E.coli lysées par chauffage, n'est pas adapté pour séparer l'ADN
et/ou l'ARN d'un lysat plus complexe de cellules, notamment provenant d'un échantillon biologique.
Conformément à la figure 1 du document WO 97134908, il est décrit un procédé de séparation d'un matériel nucléique à partir d'un échantillon biologique, en deux étapes - une première étape consiste à mettre en contact l'échantillon biologique lysé avec un adsorbant, de manière à fixer séparément le matériel nucléique, - une deuxième étape consiste à relarguer ce matériel nucléique, à partir de l'adsorbant.
Pour le refargage, on dispose dans un récipient 10 d'une solution tampon, soumise à un champ électrique entre deux électrodes 20a et 20b. Un récipient séparé 15, mais immergé dans ia solution tampon, est disposé dans le récipient 10: Ce récipient communique avec le reste du récipient 10, par l'intermédiaire d'un orifice 12, au travers duquel est disposée une membrane 30 permettant d'arréter le matériel nucléique en mouvement sous le champ électrique. Auprès de cet orifice est situé un puits 60 de prélèvement du matériel nucléique. Et c'est dans fa partie 17 du récipient 15, qu'est disposé l'élément adsorbant duquel ori veut relarguer le matériel nucléique.
D'autre part, aux fins de séparer un matériel nucléique, on connaît la demande de brevet publiée sous le numéro WO 97/41219, qui divulgue un procédé pour capturer des acides nucléiques à partir d'un mélange constitué par exemple de cellules lysées. Le procédé nécessite de déposer une électrode dans le mélange, d'appliquer à l'électrode un voltage permettant d'attirer les acides nucléiques, puis d'enlever l'électrode recouverte par les acides nucléiques. L'électrode recouverte des acides nucléiques est alors plongée dans une solution permettant, par inversion du courant, de libérer les acides nucléiques qui sont ensuite directement amplifiables. Le voltage appliqué pour pouvoir effectuer une amplification est de préférence de 0,5 à 3 volts pendant environ 30 secondes. Ce ~ 5 procédé, bien qu'utile pour séparer des plasmides contenus dans des cellules E.coli lysées par chauffage, n'est pas adapté pour séparer l'ADN
et/ou l'ARN d'un lysat plus complexe de cellules, notamment provenant d'un échantillon biologique.
Conformément à la figure 1 du document WO 97134908, il est décrit un procédé de séparation d'un matériel nucléique à partir d'un échantillon biologique, en deux étapes - une première étape consiste à mettre en contact l'échantillon biologique lysé avec un adsorbant, de manière à fixer séparément le matériel nucléique, - une deuxième étape consiste à relarguer ce matériel nucléique, à partir de l'adsorbant.
Pour le refargage, on dispose dans un récipient 10 d'une solution tampon, soumise à un champ électrique entre deux électrodes 20a et 20b. Un récipient séparé 15, mais immergé dans ia solution tampon, est disposé dans le récipient 10: Ce récipient communique avec le reste du récipient 10, par l'intermédiaire d'un orifice 12, au travers duquel est disposée une membrane 30 permettant d'arréter le matériel nucléique en mouvement sous le champ électrique. Auprès de cet orifice est situé un puits 60 de prélèvement du matériel nucléique. Et c'est dans fa partie 17 du récipient 15, qu'est disposé l'élément adsorbant duquel ori veut relarguer le matériel nucléique.
4 PCT/FR99/00830 Au terme de cet inventaire, aucun procédé n'apparaît permettre de séparer de manière simple et efficace, un matériel nucléique d'un matériel non nucléique, notamment protéique, à partir d'un lysat cellulaire complexe.
La présente invention se propose d'apporter une solution à ce problème non résolu.
Conformément à la présente invention, on a découvert qu'on pouvait électro-séparer au moins le matériel nucléique d'un échantillon biologique, de manière efficace, en traitant l'échantillon biologique directement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, et en choisissant les conditions opératoires suivantes - on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane arrêtant ie matériel nucléique, et fa présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève fe matériel nucléique au terme de ladite durée.
Par "ëlectro-séparation " dans la présente invention, on entend que des molécules présentes ensemble dans un milieu, et pouvant présenter des charges électriques identiques, sont distinguées les unes des autres dans ledit milieu en raison de leurs cinétiques respectivement différentes dans un même champ électrique.
Le procédé selon l'invention apporte l'avantage essentiel d'obtenir rapidement et facilement une fraction nucléique exempte d'autres constituants, notamment protéines, directement arnplifiable, à partir d'un lysat cellulaire. On contrait les difficultés liées aux techniques d'amplification, notamment pour les échantillons de type respiratoire, en ce que la fraction à amplifier doit être exempte d'inhibiteurs. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les inhibiteurs protéiques des techniques d'amplification sont pratiquement éliminés.
La fraction enrichie en matériel nucléique, comprenant l'ADN
et/ou l'ARN, que l'on obtient par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est directement amplifiable par les techniques couramment utilisées, telles que notamment la technique PCR pour les ADN et la technique NASBA ou TMA pour fes ARN.
Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, l'échantüfon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière
La présente invention se propose d'apporter une solution à ce problème non résolu.
Conformément à la présente invention, on a découvert qu'on pouvait électro-séparer au moins le matériel nucléique d'un échantillon biologique, de manière efficace, en traitant l'échantillon biologique directement sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, et en choisissant les conditions opératoires suivantes - on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane arrêtant ie matériel nucléique, et fa présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève fe matériel nucléique au terme de ladite durée.
Par "ëlectro-séparation " dans la présente invention, on entend que des molécules présentes ensemble dans un milieu, et pouvant présenter des charges électriques identiques, sont distinguées les unes des autres dans ledit milieu en raison de leurs cinétiques respectivement différentes dans un même champ électrique.
Le procédé selon l'invention apporte l'avantage essentiel d'obtenir rapidement et facilement une fraction nucléique exempte d'autres constituants, notamment protéines, directement arnplifiable, à partir d'un lysat cellulaire. On contrait les difficultés liées aux techniques d'amplification, notamment pour les échantillons de type respiratoire, en ce que la fraction à amplifier doit être exempte d'inhibiteurs. Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, les inhibiteurs protéiques des techniques d'amplification sont pratiquement éliminés.
La fraction enrichie en matériel nucléique, comprenant l'ADN
et/ou l'ARN, que l'on obtient par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, est directement amplifiable par les techniques couramment utilisées, telles que notamment la technique PCR pour les ADN et la technique NASBA ou TMA pour fes ARN.
Dans un autre mode de réalisation selon l'invention, l'échantüfon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté de cette dernière
5 en contact avec la solution tampon.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, la durée de migration de la fraction nucléique est de 10 à 20 minutes, de préférence encore de 15 minutes.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la valeur de la molarité de la solution tampon est au moins égaie à 0,1 mol/I, et préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 mol/I.
La molarité de la solution tampon étant comprise entre 0,1 et 5 mol/I, on peut effectivement, soit ne mettre qu'une méme solution tampon dans les deux compartiments, soit mettre deux solutions tampon différentes dans les deux compartiments.
La molarité de la solution tampon peut être la même dans les deux compartiments et sera comprise entre 0,1 et 1 mol/I, de préférence encore de 0,1 mol/I:
La molarité de la solution tampon peut être différente dans les deux compartiments et sera respectivement de préférence de 0,1 molli dans le premier compartiment et de 1 mol/I dans le second compartiment.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 150 V.
Dans un autre mode de réalisation très préféré selon l'invention, la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, en suivant les lignes de force du champ électrique, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm.
Le lysat cellulaire à partir duquel on effectue le procédé selon l'invention peut être un lysat cellulaire provenant d'une culture simple ou complexe, c'est à dire comprenant différentes cellules, ou peut être également un échantillon biologique, tel que notamment du sang, de l'urine et un crachat de type respiratoire.
s Le lysat cellulaire à partir duquel on obtient la fraction nucléique, soumis ensuite au procédé selon l'invention, peut étre obtenu par différentes techniques de lyse, notamment la lyse par choc mécanique, par choc électrique et autres.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon biologique résulte directement de la lyse d'un échantillon cellulaire, notamment par voie mécanique ou électrique. Ce mode de réalisation est effectué dans ie même dispositif, comme cela est décrit ci-après.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le lysat cellulaire est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, on préfère que le pH de la solution tampon soit de 7.
~ 5 La membrane récupérant la fraction enrichie en matériel nucléique présente un seuil de coupure prédéterminée, de préférence inférieure à 100 kDa.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, la porosité de la membrane à la cathode sera de préférence supérieure à 10 kDa.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification.
La lyse cellulaire sera de préférence encore effectuée , par lyse électrique en présence de protéinase K et d'un détergent.
Un second objet selon l'invention est un dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procëdé selon l'invention, comprenant un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi 3o qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage dudit support avec l'extérieur, d'une part pour ie transfert des différents fluides ou liquides vers etlou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont relie du champ électrique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend un moyen de réception de l'échantillon biologique; un rëservoir pour la solution tampon, comportant un compartiment fermé par la membrane perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment avec le moyen de réception de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes de génération du champ électrique, l'une au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé par la membrane.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le T5 réservoir comprend un autre compartiment, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, les deux réservoirs communiquent respectivement avec des évents d'aération, et avec au moins un cana! de remplissage.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, un puits intermédiaire est disposé et communique entre le moyen de réception de l'échantillon biologique et le premier réservoir.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, fe puits intermédiaire est pourvu d'électrodes assurant une lyse dudit échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse, et un compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le volume du compartiment de réception du iysat est supérieur au volume du compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon ('invention, la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre %2 et 1 /50, notamment entre 1 /5 et 1 /20.
Un troisième objet selon l'invention est l'utilisation du dispositif décrit ci-dessus paur électro-séparer une fraction d'acides nucléiques à
partir d'un lysat cellulaire.
Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour détecter etlou identifier des acides nucléiques directement après amplification.
La Figure 1 représente shématiquement un appareil ~ 5 d'éléctroélution d'acides nucléiques et de protéines à partir d'un gel, et de concentration électraphorétique de macromolécules (Isco, Nebraska, USA), que l'on utilise dans un procédé différent, à savoir d'électro-séparation selon l'invention. Les compartiments A et B, dans lequel sont plongés deux électrodes négative et positive respectivement, sont remplis de tampon 20 TBE 1x; le compartiment C, comprenant une partie C1 et une partie C2, et le compartiment Cf sont remplis de tampon TBE 0.1 x. Une membrane de dialyse est placée à l'interface des compartiments Cf et B (porosité
100 kDa), et des compartiments C1 et A (porosité 10 kDa).
La Figure 2 indique 1e pourcentage d'acides nucléiques de S.
25 epidermidis récupérés dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par analyse avec un appareil Vidas (BioMerieux, France), selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le 30 compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 3 présente !a cinétique de récupération des protéines d'un lysat cellulaire. Le pourcentage des protéines du fysat bactérien est récupéré dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par dosage Bradford, 35 selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en densité optique (DO) à 595 nm.
La Figure 4 présente la cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire. Le pourcentage d'acides nucléiques de Staphycoccus epidermidis, récupéré dans le compartiment Cf après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs électriques, est déterminé par analyse avec un appareil Vidas, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes?, et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
Lâ Figure 5 présente l'amplification des acides nucléiques purifiés à partir d'un lysat cellulaire. La quantité d'amplicons produits par PCR à partir de 10 NI de molécules d'ADN est récupérée dans le compartiment Cf, à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs ~ 5 mécaniques, après différents temps de migration, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté ie temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans ie compartiment Cf, exprimë en unités relatives de fluorescence.
La Figure 6 présente la quantité d'amplicons produits par 2o amplification PCR, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mëcaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous un champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 cul de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en 25 unités relatives de fluorescence.
La Figure 7 illustre la quantité d'ampücons produits par amplification TMA, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse 30 est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 ,ul de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La Figure 8 indique le pourcentage de protéines du sang récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un 35 échantillon clinique sanguin lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 3.
En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 9 indique le pourcentage de proteines d'un crachat récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un 5 échantillon clinique de type respiratoire lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 10 montre l'élimination des inhibiteurs de la PCR
t0 initialement présent dans l'échantillon clinique de type respiratoire. Elle indique la quantité d'amplicons ADN produits par PCR à partir de différentes quantités initiales d'ADN de S, epidermidis; selon l'exemple 5.
En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 10 NI
d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 11 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées et déposées dans le compartiment C1. Ghaque point représenté sur le graphe représente une valeur moyenne obtenue à partir de 13 crachats et aspirations bronchiques différents, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 ,ul d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 12 indique ia quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées par chocs mécaniques, et déposées dans le compartiment C1, selon l'exemple 5. L'ëtude a été
réalisée en parallèle sur 4 crachats différents. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 ,ul d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La figure 13 représente un dispositif à usage unique selon l'invention, vu en perspective.
La figure 14 représente une vue de dessous du dispositif représenté à la figure 13.
La figure 15 représente représente une vue de dessus du dispositif représenté à la figure 13.
La figure 1 F représente représente une vue en. coupe, selon le trait de coupe représenté à la figure 15, du dispositif selon la figure 13.
Exemple 1 : Mode opératoire général pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention.
Le mode opératoire est basé sur l'utilisation d'un appareil d'éléctroéfution d'acides nucléiques selon la figure 1. Un volume d'échantillon biologique est déposé soigneusement au fond du compartiment C1. Les deux électrodes du circuit sont reliées à un générateur électrique. Une tension constante de 150 V est appliquée aux bornes du générateur. L'intensité du circuit varie de 15 à 20 mA et la température du tampon dans le compartiment C varie de 23 à 30°C. Les molécules biologiques initialement déposées au fond du compartiment C1 migrent dans le champ électrique ainsi créé, à vitesse définie en fonction de leur charge et de leur taille. Après différents temps de migration, la tension aux bornes du générateur est arrêtée et les molécules ayant migré vers fa cathode et de poids moléculaire apparent inférieur ou égal à 10 kDa sont recueillies dans le compartiment Cf, dans un volume final de 200 ,ul.
L'échantillon ainsi récupéré est conservé dans la glace avant analyse.
L'échantillon biologique déposé dans ie compartiment C1 peut étre un matériel nucléique et/ou protéique purifié ou non, un lysat cellulaire, provenant d'un échantillon biologique tei que le sang, l'urine et un crachat de type respiratoire. Les lysats cellulaires étudiés ont été obtenus à partir de S. epidermidis, bactérie à paroi Gram+ (A054). Ces bactéries sont cultivées en milieu liquide BCC (Bouillon Coeur Cervelle, bioMerieux 410191. Avant lyse, elles sont mises en suspension, soit dans un prélèvement clinique (crachat liquéfié et décontaminé, sang, plasma, sérum, ....), soit en tampon de lyse (30 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI pH 7.2). 300 ,ul de cette suspension cellulaire ont été lysés en suivant essentiellement deux protocoles - Protocole de Ivse oar chocs mécaniaues : 90 ,ul de billes de verre de diamètre compris entre 90 et 150 Nm, 3 billes de fer de diamètre 2 mm et 5 billes de verre de diamètre 3 mm sont placés dans un tube Faicon en présence de 300Ni de la suspension cellulaire, comme décrit dans le brevet (FR-A-2 768 7431. 6 mg /ml final de protéinase K (PK) (E.C.
3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 10927661 peut être ajoutée à la suspension cellulaire. Le tube fermé est vortexé pendant deux minutes, à
W0 99/53304 PCTlFR99/00830 puissance maximale de l'appareil (Reax 2000, Heidolph). La suspension bacterienne ainsi traitée et récupérée est déposée immédiatement dans le compartiment C1 du dispositif décrit dans la Figure 1. Si la PK est présente dans la solution cellulaire, une incubation supplémentaire de 15 minutes à
37°C est réalisée.
Protocole de I~se par choc électrique : 300 ,ul de la suspension cellulaire sont déposés dans une cuve d'électroporation caractérisée par une distance entre les deux électrodes de 2 mm, en présence de 0.01 à 6 mg /ml final de PK: La cuve est placée dans un circuit ~ 0 électrique dont les paramètres sont choisis comme suit : tension 500 V, résistance 186 Ohms, capacité de 500 ou 1500 ,uFD. Après lancement d'une impulsion électrique, la décharge électrique se réalise en quelques millisecondes entre les deux électrodes. Le lysat ainsi récupéré est déposé
immédiatement dans le compartiment A du dispositif décrit dans la Figure 1 ~ 5 (FR-A-2 763 957).
Le pourcentage d'acides nucléiques recueilli du côté de la cathode, après migration dans le compartiment Cf, est déterminé par mesure de DO (densité optique) de l'échantillon récupéré à 260 nm. Le pourcentage recueilli est égal au rapport de fa valeur de DO à 260 nm après 20 migration, sur la valeur de DO à 260 nm avant migration. De méme, la quantité de protéines recueillies à la cathode après migration est déterminée par dosage Bradford et lecture de DO à 595 nm. Le pourcentage de protéines recueillies est égal au rapport de la quantité
protéique récupérée sur la quantité initiale.
25 La quantité des acides nucléiques récupérés du côté de la ' cathode après migration est vérifiée sur gel d'agarose 0.8% ; 10 NI de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous voltage constant (150 V) et le gel est coloré au bromure d'ethidium (BET) avant observation sous rayonnement - ultra-violet. En 30 parallèle, les protéines récupérées à 1a cathode après migration peuvent être observées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE
10%); - 5 à 10 NI de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous intensité constante (25 mA), et le gel est coloré au bleu de Coomassie.
35 La quantité d'acides nucléiques récupérés du côté de la cathode est déterminée par détection spécifique selon une technique d'hybridation dite sandwich, en utilisant l'appareil Vidas commercialisé par bioMérieux (France). Des sondes oligonucléotidiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis (EP-A-0 632 269) ont été choisies. Les oligonucléotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence : 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ
ID N° :1 ) et 5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID N° :2).
La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatase alcaline (AKP). L'hybridation spécifique de ces sondes avec les acides nucléiques libérés dans le lysat est fonction de la quantité d'acides nucléiques prësents, mais aussi de leur accessibilité pour les sondes utilisées.
Deux protocoles d'amplification spécifique des molécules d'ADN
et d'ARN de S. epidermidis ont été réalisés à partir des échantillons recueillis après migration : un protocole PCR pour l'amplification de /'ADN
et un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr16S et un protocole TMA pour l'amplification de l'ARNr 16S.
-Protocole PCR : la technique de PCR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR Strategies, Ed : Innis, Gelford et Sninsky Academic press 1995, pp 17-31. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1 : 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' (SEQ ID N ° :3) Amorce 2 : 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' (SEQ ID N° :4) Les cycles de température suivants ont été utilisés 1 fois 3 minutes à 94°C
2 minutes à 65 ° C
35 fois 1 minute à 72°C
1 minute à 94°C
2 minutes à 65°C
1 fois 5 minutes à 72°C
-Protocole TMA : la technique de TMA suivie est celle décrite par US-A-5 554 516. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elfes présentent les séquences suivantes Amorce 1 . 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA -3' (SEQ
ID N° :5) Amorce 2 : 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTT
TGTCACCGGCAGTCAACTTAGA -3' (SEQ ID N ° :6) ,ul ou 50 NI d'échantillon recueilli sont utilisés pour chaque essai PCR et TMA, respectivement. Les amplicons produits par PCR sont observés sur gel d'agarose 0.8% et quantifiés sur Vidas selon le protocole décrit ci-dessus. Les amplicons produits par TMA sont détectés et 5 quantifés sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection, spécifiques de S. epidermidis, selon ia méthode décrite par P. Cros et al., Lancet 1992, 240 :870. La sonde de détection est couplée à la " Horse Radish Peroxidase " (HRP). Les deux ~ sondes présentent les séquences suivantes 10 Sonde de capture : 5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' (SEQ ID
N° :7) Sonde de détection : 5'-GACATCCTCTGACCCCTCTA -3' tSEQ
ID N° :8) Exemple 2 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à
partir de lysat cellulaire.
Une suspension de Staphylococcus epidermidis (1-5.109 b./300,u1) est lysée par choc mécanique ou par choc électrique, comme décrit dans le protocole général ci-dessus. 200 cul de chaque lysat sont déposés au fond du compartiment C1. Le champ électrique est appliqué
2o pendant différents temps entre les deux électrodes. Les quantités d'acides nucléiques ou de protéines présentes dans l'échantillon recueilli dans le compartiment Cf sont déterminées par analyse avec un appareil Vidas ou dosage Bradford, respectivement. La qualité des molécules récupérées a été appréciée sur gel d'agarose ou d'acrylamide, en présence de SDS.
- LYsat cellulaire obtenu par choc mécaniaue Les acides nucléiques du lysat ont migré dans le compartiment Cf progressivement au cours du temps, comme montré à la figure 2. Après 60 minutes, la totalité du matériel nucléique du lysat est récupéré, quelque soit la présence ou non de protéinase K pendant l'étape de lyse. Ce résultat 3o est en faveur d'une bonne libération et accessibilité des acides nucléiques dans le lysat. Les molécules d'ADN récupérées ont le même profil de migration sur gel d'agarose 0:8% qu'avant migration dans le lysat. En présence de protéinase K pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 3, seul un pourcentage négligeable de protéines est récupéré aprës 60 minutes, tandis qu'en l'absence de protéase, environ 50% de protéines sont récupérées.
- L~at cellulaire obtenu par choc electrique.
En présence de PK pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 4, les acides nucléiques du lysat migrent progressivement jusqu'à la cathode. Après 60 minutes, un pourcentage important d'acides nucléiques 5 est récupéré. La récupération du matériel nucléique présent initialement dans ce lysat est similaire à celle du matériel nucléique présent initialement dans un lysat obtenu par choc mécanique (cf. ci-dessus). Par contre, en absence de PK pendant l'étape de lyse, aucun acide nucléique ne peut être détecté dans le compartiment Cf, même après 60 minutes de migration 10 (analyse Vidas et gel d'agarose 0.8%). Sur ge! d'agarose, les molécules d'ADN et d'ARN du lysat récupérées sont observables séparément après migration, alors qu'elles ne le sont pas initialement dans le lysat.
- Amplification des acides nucléiques purifiés à partir de Ivsat cellulaire 15 Les bactéries S. epidermidis diluées dans 300 NI de tampon de lyse sont lysées par choc mécanique en l'absence de PK, comme décrit dans ie protocole général de l'exemple 1. 200,u1 du lysat sont déposés au fond du compartiment C1. Un champ électrique est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps. I_e matériel nucléique qui a migré dans le compartiment Cf est amplifié par PCR (10 NI par essai) ou TMA (50 NI
par essai). La quantité d'amplicons produite est analysée par hybridation spécifique sur Vidas ou microplaque, respectivement.
- Amplification PCR des molécules d'ADN récupérées après migration Pour 104 bactéries initiales lycées, déposées dans le compartiment C1, différentes quantités d'amplicons sont produites, en fonction du temps de migration. Pour 15 minutes de migration, comme représenté à la figure 5, les molécules d'ADN récupérées permettent une production optimale d'amplicons par PCR. Avant 15 minutes, une quantité
3o inférieure de molécules d'ADN sont récupérées. Pour 20 minutes et après, une quantité supérieure de molécules d'ADN sont récupérées, mais de qualité moins adaptée à une amplification PCR optimale. Plus la migration dure, plus la structure de l'acide nucléique peut être altérëe. Afin d'obtenir une amplification PCR optimale, un compromis entre quantité et qualité des molécules d'ADN récupérées à la cathode doit être respecté. Ce résultat a été confirmé en utilisant des suspensions initiales de S. epidermidis plus concentrées (105-106 bactéries initiales /200,u1).
Comme représenté à le figure 6, l'ADN d'un nombre supérieur ou égal à 1.103 bactéries initiales (/200NI) peut être amplifié et détecté, après lyse mécanique des cellules et migration des constituants du lysat sous champ électrique; soit 102 molécules d'ADN ou bactéries par essai PCR, étant donné que le matëriel migré est récupéré dans 200 ,ul et que 10 ,ul de ce matériel est utilisé pour chaque essai PCR. 102 molécules d'ADN
correspondent à la limite de sensibilité du protocole PCR, de façon générale. Ce résultat démontre une grande sensibilité de rëcupération des molécules d'ADN bactérien après lyse cellulaire par choc mécanique et purification des molécules d'ADN intracellulaire par champ électrique en solution.
- Amplification TMA des molécules d'ARN rëcur~érées après migration Comme représenté à la figure 7, l'ARN de au moins 40 bactéries initiales (1200~r1) peut être détecté après lyse des bactéries, migration des constituants cellulaires sous champ électrique et amplification spécifique des ARNr16S de S epidermidis ; soit 10 bactéries initiales par essai TMA, compte tenu que le matériel nucléique migré est récupéré dans 200 NI final, et que 50 NI sont ajoutés par essai TMA. Ce résultat témoigne d'une grande sensibilité de récupération des molécules d'ARNr 16S
bactérien, après lyse par choc mécanique et purification des acides nucléiques du lysat par champ électrique.
Exemple 3 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à
partir d' un échantillon sanguin.
L'échantillon sanguin est utilisé sans pré-traitement préalable.
200 ~I de cet échantillon clinique est déposé au fond du compartiment C1.
Un voltage de 150 V est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps, puis le matériel récupérë du côté de la cathode dans le compartiment Cf est analysé par dosage de protéines selon la méthode de Bradford, et sur gel de polyacrylamide en présence de SDS iSDS-PAGE
10%).
Dans cet exemple, le pH du tampon TBE utilisé pour la migration a été fixé à pIH 7.0, ie point isoélectrique de l'hémoglobine étant égal à
7Ø
Des membranes de 50 ou 100 kDa ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B. Comme cela est représenté à la figure 8, après 60 minutes de migration, un pourcentage négligeable de protéines est récupéré
avec la membrane de 100 kDa, et 10% des protéines sont récupérées avec la membrane de 50 kDa. A pH 7.0, seulement 10% des protéines sanguines chargées négativement à pH 7.0 ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa et inférieur à 100 kDa. Un pourcentage négligeable de protéines sont récupérées après 15 minutes de migration, en utilisant indifféremment une membrane de 50 ou 100 kDa. Ces conclusions ont été vérifiées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-PAGE 10%.
La porosité de la membrane sera préférentielement supérieure à 10 kDa, afin de ne pas obtenir un pourcentage trop élevé de protéines.
Exemple 4 : Cinétique de récupération d'acides nuclëiques à
partir d'un échantillon de type respiratoire.
Avant utilisation, l'échantillon respiratoire est fluidifié, décontaminé selon le protocole standard au N-acetyl-L-cysteine et à la soude (NALC/NaOH); puis il est inactivé 20 minutes à 95°C.
Dans cet exempte, le tampon TBE utilisê pour la migration a un pH égal à 8.3 ou 7.0, et des membranes de différentes tailles de pores ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B: 10, 50 ou 100 kDa.
Comme cela est représenté à la figure 9, à pH 8.3, 10% des protéines sont récupérées après 30 minutes, et 70-80% après 60 minutes avec des membranes de 50 ou 10 kDa, ce qui suggère que 70-80% des protéines du crachat sont chargées négativement à ces pH et ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa. A pH 7.0, environ 0% des protéines sont récupérées après 30 ou fi0 minutes de migration, quelque soit la taille des pores de la membrane utilisée (dans la limite de sensibilité des techniques de détection utilisées). A ce pH, les 55-60% des protéines préalablement récupérées à pH 8.0 ne sont plus chargées négativement. Avec les membranes de 10 ou 50 kDa, un pourcentage négligeable des protéines du crachat est récupéré après 15 minutes de migration. On a vérifié ce point sur gel de polycrylamide en présence de SDS-PAGE 10%.
Exemple 5 : Levée d'inhibition de protocoles d'amplification par les échantillons de type respiratoire après migration.
Les échantillons de type respiratoire sont inhibiteurs des réactions PCR et TMA. 200 ,ul de ces échantillons ont été déposés au fond du compartiment C1 du système décrit Figure 1. Un voltage de 150 V
constant a été appliqué entre les deux électrodes pendant 15 minutes. Une membrane de séparation entre Cf et B de 10 kDa a été choisie. Après migration, l'échantillon récupéré dans le compartiment Cf (200 ,u!) a été
supplémenté avec différentes quantités d'acides nucléiques purifiés de S.
epidermidis. 10 NI ou 50 ,ul de cette solution ont été utilisés pour chaque essai PCR ou TMA, respectivement. Comme représenté à la figure 10, jusqu'à 102-103 copies initiales d'ADN peuvent être amplifiées dans 10 NI
d'échantillon migré. Ce résultat démontre que le crachat migré a perdu son caractère inhibiteur de la PCR. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'amplification TMA.
1-5.109 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ui de crachat fluidifié, décontaminés et inactivés comme décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc mécanique en absence de PK, et le lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec ~ 5 une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le schéma présenté à la Figure 1. La quantité d'acides nucléiques bactériens récupérés dans le compartiment Cf après migration a été quantifiée par analyse Vidas spécifique de l'espèce bactérienne étudiée. L'expérience a été réalisée à
partir de différents crachats. En moyenne, 80% d'acides nucléiques S.
2o epidermidis sont récupérés. Ce résultat indique que les molécules de la matrice du crachat ne gênent pas la migration des molécules d'ADN et d'ARN du lysat bactérien dans le champ électrique, dans ces conditions. Au contraire, il semble que l'environnement soit propice à une meilleure récupération et/ou migration de ces molécules.
25 Amplification PCR:
Les bactéries S. epidermidis ont été ensemencées dans 300 ul de crachat fluidifié, dëcontaminé, inactivé, puis lysées par choc mécanique en absence de PK comme décrit dans !'exempte 1. 200 ,ui du lysat a migrë
pendant 15 minutes sous 150V avec une membrane de 10 kDa entre les 3o compartiments Cf et B. Le matériel nucléique présent dans l'échantillon a été amplifié par PCR t10 ,ul par essai), et les ampücons produits ont été
quantifiés par analyse Vidas: Comme représenté à la figure 11, jusqu'à
104-103 bactéries initiales lysées (i200,u1 de lysat? peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 35 molécules d'ADN /10,u1 d'essai PCR). Ce résultat, d'une part confirme un très bon rendement de récupération des molécules d'ADN bactérien du lysat dans le crachat, et d'autre part démontre une très bonne élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présents dans les crachats.
Amplification TMA:
De même que pour l'étude de l'amplification PCR décrite ci avant, les bactéries S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ul de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé puis lysées par choc mécanique en absence de PK. 200 pl du lysat a migré pendant 15 minutes sous 150V
avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et A. Les molécules d'ARNr présentes dans l'ëchantillon récupéré ont été amplifiées 90 par TMA (50 ,ul par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par hybridation spécifique sandwich sur microplaque. Comme représenté à la figure 12, au moins 106-105 bactéries initiales lysées (i200p1 de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ARN (soit au moins 5.104-5.103 bactéries initiales /50 ,ul d'essai TMA).
Ce résultat démontre l'élimination des inhibiteurs de la TMA initialement présents dans les crachats.
Exemple 6: Electro-séparation après lyse par chocs électriques.
1-5.1 O9 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ul de crachat fluidifié, décontaminé et inactivé comme décrit dans l'exemple 4.
Ces cellules en suspension ont été lysées par choc électrique en présence de 102 mgiml final de PK et 2% final de LLS (Lithium Lauryl Sulfate, Sigma). 200 pl de lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le shéma présenté à la figure 1. Le matériel nucléique récupéré après migration (200 ,ul ) a été amplifié par PCR spécifique de S. epidermidis ( 10 pl/essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Jusqu'à 104-105 bactéries initiales lysées (Iml) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 molécules d'ADN/10 NI
d'essai PCR, ce qui représente la limite de sensibilité de la technique PCR
utilisée).
Conformément aux figures 13 à 16, on décrit ci-après un dispositif à usage unique, c'est-à-dire consommable, ou jetable après emploi, permettant de mettre en oeuvre le procédé d'électro-séparation décrit et exemplifié précédemment.
Un tel dispositif comprend un support 1, ou base, ayant généralement une forme parallèlépipédique, comprenant notamment une WU 99/53304 PCT/F'R99/00830 face supérieure 1 b, une face inférieure 1 c et un flanc latéral 1 a, montrés sur les Figures 13 et 14:
De manière générale dans ce support 1, sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment 5 électrodes requis pour l'électro-séparation, ainsi que des moyens d'interfaçage correspondant au flanc 1a du support 1 avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support 1, dont l'échantillon biologique traité, ie milieu liquide aqueux (tampons) et la fraction enrichie en matière nucléique, et d'autre part pour 10 l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour 1'électro-séparation, dont celle du champ électrique.
De manière non représentée, à titre d'exemple, les deux faces 1 a et 1 b du dispositif, ou carte, sont revêtues d'un film transparent, étanche; adhérant au support, et fermant ies différents conduits et cavités ~ 5 représentés en surface aux figures 13 et 14.
Ce dispositif comprend encore - un moyen de réception 2 de l'échantillon biologique traité
- un premier réservoir 3 pour un premier milieu liquide àqueux (tampons TBE dilué à 10 fois), comportant lui-même un compartiment 31 20 fermé par une membrane 4 perméable, ayant par exemple une capacité de l'ordre de 100 Nl, ainsi qu'un autre compartiment 32, ayant une capacité
de 1 ml, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir d'un échantillon biologique ; cet autre compartiment est disposé en amont du compartiment 31 selon le sens de circulation du matériel nucléique, sous l'effet du champ électrique, et communique lui-même avec le moyen de réception 2 de L'échantillon biologique - un second réservoir 5 pour un second milieu liquide aqueux (par exemple tampon TBE, une fois concentré), identique ou différent du premier liquide aqueux, séparé du premier réservoir 3, uniquement par la membrane 4 - deux électrodes 61 et 62 pour générer un champ électrique, communiquant avec deux plots 63 et 64 de contact électrique sur le flanc 1a ; l'une des électrodes, à savoir 61, ou cathode, est au contact du premier milieu liquide aqueux dans le premier réservoir 3, et l'autre électrode 62, ou anode, est au contact du second milieu aqueux dans le second réservoir 5 WO 99/53304 PCT/FR99/00$30 - un moyen d'extraction 9 de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment 31 fermé par la membrane 4 Les deux réservoirs 3 et 5 communiquent respectivement avec des évents d'aération 33 et 53, et avec au moins un canai de remplissage 34 communiquant en ce qui le concerne avec ie second réservoir 5.
Un puits intermédiaire 7 est disposé et communique entre le moyen de réception 2 de l'ëchantillon biologique et le premier réservoir 3.
Ce puits n'est pas obligatoire, puisque le lysat peut être déposé
directement dans le compartiment 32. Ce puits 7 est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire pour obtenir une fraction soumise ensuite à électra-séparation ; ces moyens sont des électrodes 81 et 82, permettant d'exposer l'échantillon à une ou plusieurs impulsions électriques, conformément au procédé décrit par ailleurs dans la demande de brevet frarfçais FR-A-2 7fi3 au nom de la Demanderesse. Ces électrodes 81 et 82 communiquent respectivement avec des plots de contact électrique 83 et 84 prévus sur le flanc 1 a. II existe donc deux circuits électriques, l'un associé aux électrodes 81 et 82, et l'autre associé aux électrodes 61 et 62.
I - Prénaratian du dispositif Avant de démarrer toute réaction, on remplit les réservoirs 3 et 5 de tampon. Ce dernier peut étre constitué par un tampon TBE (Tris-Borate-EDTA1 dont la concentration varie d'un réservoir à l'autre. On remplit le premier réservoir 3, supérieur, par le moyen de réception 2, avec du tampon dilué dix fois, et le second réservoir 5, inférieur, par le canal 34 avec du tampon une fois concentré. On perce les évents d'aération 33 et 53 au niveau des films étanches recouvrant les faces 1 a et 1 b, afin de permettre à l'air de s'échapper lors du remplissage des réservoirs.
1 ) Lyse L'échantillon est introduit dans le moyen de réception 2 à !'aide d'une pipette, manuellement ou par un automate. Le volume de l'échantillon est compris entre 0 et 1 ml. II arrive alors dans le puits intermédiaire 7 de lyse. La lyse est réalisée grâce à une décharge électrique de 500 V pendant environ 1 seconde, entre les électrodes 81 et 82.
Dans le cas où le volume d'échantillon est supérieur à 50 cul, plusieurs étapes de lyse sont réalisées les unes après les autres, les fractions lysées étant transférées au fur et à mesure dans le compartiment 32 de réception.
2) Electro-séparation Une fois l'échantillon lysé et transfëré en totalité dans le compartiment 32 de départ de I'électro-séparation, le premier circuit électrique des électrodes 81 et 82 est ouvert, le deuxième des électrodes 61 et 62 est fermé. Les constituants du iysat chargés négativement vont alors migrer jusqu'à l'anode 62. Les acides nucléiques étant fortement négatifs migreront plus vite. On pourra donc les récupérer sélectivement au-dessus de la membrane 4, au niveau du compartiment de réception 31 par le canal de prélèvement 9.
Le courant imposé pour cette migration est compris entre 0 et 30 mA, sous une tension de 150 V. La durée optimale de migration est d'environ 15 minutes.
Afin de récupérer ies acides nucléiques, on vide le réservoir 3 supérieur jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liaison fluidique entre le compartiment 32 et le compartiment de réception 31. On prélève alors avec une pipette, par le canal 9, les 100 ,ul de tampon contenus dans le compartiment 31. Le prélèvement peut se faire manuellement ou par l'intermédiaire de l'automate.
On peut prévoir de récupérer aussi les protéines purifiées. Pour cela, il faut effectuer deux passes successives d'électro-purification, la première permettant de récupérer la fraction enrichie en acides nucléiques et la deuxième la fraction enrichie en protéines. Dans ce cas précis, les acides nucléiques doivent être récupérés entre ies deux passes, et sans vider le réservoir 3 supérieur du tampon qui contient les protéines qui n'ont pas fini de migrer.
Un dispositif tel que précédemment décrit peut ne comprendre que trois électrodes. En effet, les deux cathodes 61 et 81, respectivement affectées au circuit d'électro-séparation et au circuit de lyse, deviennent la cathode commune aux deux circuits. Dans ce cas, la lyse de l'échantillon biologique s'effectue dans le compartiment 32. Un tel dispositif peut étre utilisé sur la tranche. II sera alors facile de l'intégrer dans un automate grâce à ce gain de place.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, la durée de migration de la fraction nucléique est de 10 à 20 minutes, de préférence encore de 15 minutes.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la valeur de la molarité de la solution tampon est au moins égaie à 0,1 mol/I, et préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 mol/I.
La molarité de la solution tampon étant comprise entre 0,1 et 5 mol/I, on peut effectivement, soit ne mettre qu'une méme solution tampon dans les deux compartiments, soit mettre deux solutions tampon différentes dans les deux compartiments.
La molarité de la solution tampon peut être la même dans les deux compartiments et sera comprise entre 0,1 et 1 mol/I, de préférence encore de 0,1 mol/I:
La molarité de la solution tampon peut être différente dans les deux compartiments et sera respectivement de préférence de 0,1 molli dans le premier compartiment et de 1 mol/I dans le second compartiment.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 150 V.
Dans un autre mode de réalisation très préféré selon l'invention, la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, en suivant les lignes de force du champ électrique, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm.
Le lysat cellulaire à partir duquel on effectue le procédé selon l'invention peut être un lysat cellulaire provenant d'une culture simple ou complexe, c'est à dire comprenant différentes cellules, ou peut être également un échantillon biologique, tel que notamment du sang, de l'urine et un crachat de type respiratoire.
s Le lysat cellulaire à partir duquel on obtient la fraction nucléique, soumis ensuite au procédé selon l'invention, peut étre obtenu par différentes techniques de lyse, notamment la lyse par choc mécanique, par choc électrique et autres.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, l'échantillon biologique résulte directement de la lyse d'un échantillon cellulaire, notamment par voie mécanique ou électrique. Ce mode de réalisation est effectué dans ie même dispositif, comme cela est décrit ci-après.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le lysat cellulaire est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, on préfère que le pH de la solution tampon soit de 7.
~ 5 La membrane récupérant la fraction enrichie en matériel nucléique présente un seuil de coupure prédéterminée, de préférence inférieure à 100 kDa.
Lorsque l'échantillon biologique est du sang, la porosité de la membrane à la cathode sera de préférence supérieure à 10 kDa.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à une étape subséquente d'amplification.
La lyse cellulaire sera de préférence encore effectuée , par lyse électrique en présence de protéinase K et d'un détergent.
Un second objet selon l'invention est un dispositif à usage unique pour la mise en oeuvre d'un procëdé selon l'invention, comprenant un support ou base, dans lequel sont rassemblés et intégrés, ainsi 3o qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment électrodes, requis pour l'électroséparation, ainsi que des moyens d'interfaçage dudit support avec l'extérieur, d'une part pour ie transfert des différents fluides ou liquides vers etlou hors du support, dont l'échantillon biologique, la solution tampon, et la fraction enrichie en matériel nucléique, et d'autre part pour l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour l'électroséparation, dont relie du champ électrique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend un moyen de réception de l'échantillon biologique; un rëservoir pour la solution tampon, comportant un compartiment fermé par la membrane perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment avec le moyen de réception de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes de génération du champ électrique, l'une au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation du matériel nucléique, et l'autre au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment fermé par la membrane.
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le T5 réservoir comprend un autre compartiment, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, les deux réservoirs communiquent respectivement avec des évents d'aération, et avec au moins un cana! de remplissage.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, un puits intermédiaire est disposé et communique entre le moyen de réception de l'échantillon biologique et le premier réservoir.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le puits intermédiaire est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, fe puits intermédiaire est pourvu d'électrodes assurant une lyse dudit échantillon cellulaire.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le dispositif comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse, et un compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, le volume du compartiment de réception du iysat est supérieur au volume du compartiment de réception de la fraction enrichie en matériel nucléique.
Dans encore un autre mode de réalisation préféré selon ('invention, la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre %2 et 1 /50, notamment entre 1 /5 et 1 /20.
Un troisième objet selon l'invention est l'utilisation du dispositif décrit ci-dessus paur électro-séparer une fraction d'acides nucléiques à
partir d'un lysat cellulaire.
Un quatrième objet selon l'invention est l'utilisation de la fraction électro-séparée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour détecter etlou identifier des acides nucléiques directement après amplification.
La Figure 1 représente shématiquement un appareil ~ 5 d'éléctroélution d'acides nucléiques et de protéines à partir d'un gel, et de concentration électraphorétique de macromolécules (Isco, Nebraska, USA), que l'on utilise dans un procédé différent, à savoir d'électro-séparation selon l'invention. Les compartiments A et B, dans lequel sont plongés deux électrodes négative et positive respectivement, sont remplis de tampon 20 TBE 1x; le compartiment C, comprenant une partie C1 et une partie C2, et le compartiment Cf sont remplis de tampon TBE 0.1 x. Une membrane de dialyse est placée à l'interface des compartiments Cf et B (porosité
100 kDa), et des compartiments C1 et A (porosité 10 kDa).
La Figure 2 indique 1e pourcentage d'acides nucléiques de S.
25 epidermidis récupérés dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par analyse avec un appareil Vidas (BioMerieux, France), selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le 30 compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 3 présente !a cinétique de récupération des protéines d'un lysat cellulaire. Le pourcentage des protéines du fysat bactérien est récupéré dans le compartiment Cf, après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs mécaniques, déterminé par dosage Bradford, 35 selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en densité optique (DO) à 595 nm.
La Figure 4 présente la cinétique de récupération d'acides nucléiques à partir de lysat cellulaire. Le pourcentage d'acides nucléiques de Staphycoccus epidermidis, récupéré dans le compartiment Cf après migration à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs électriques, est déterminé par analyse avec un appareil Vidas, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes?, et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans le compartiment Cf, exprimé en unités relatives de fluorescence.
Lâ Figure 5 présente l'amplification des acides nucléiques purifiés à partir d'un lysat cellulaire. La quantité d'amplicons produits par PCR à partir de 10 NI de molécules d'ADN est récupérée dans le compartiment Cf, à partir d'un lysat cellulaire obtenu par chocs ~ 5 mécaniques, après différents temps de migration, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté ie temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage d'acides nucléiques récupérés dans ie compartiment Cf, exprimë en unités relatives de fluorescence.
La Figure 6 présente la quantité d'amplicons produits par 2o amplification PCR, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mëcaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous un champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 cul de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en 25 unités relatives de fluorescence.
La Figure 7 illustre la quantité d'ampücons produits par amplification TMA, après lyse de différentes concentrations initiales de bactéries par chocs mécaniques, et migration de leur matériel nucléique pendant 15 minutes sous champ électrique, selon l'exemple 2. En abscisse 30 est représenté le nombre de bactéries initiales pour 200 ,ul de lysat, et en ordonnée est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La Figure 8 indique le pourcentage de protéines du sang récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un 35 échantillon clinique sanguin lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 3.
En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 9 indique le pourcentage de proteines d'un crachat récupéré dans le compartiment Cf en fonction du temps de migration d'un 5 échantillon clinique de type respiratoire lysé par chocs mécaniques, selon l'exemple 2. En abscisse est représenté le temps de migration (minutes), et en ordonnée est représenté le pourcentage de protéines récupéré dans le compartiment Cf, exprimé en DO à 595 nm.
La Figure 10 montre l'élimination des inhibiteurs de la PCR
t0 initialement présent dans l'échantillon clinique de type respiratoire. Elle indique la quantité d'amplicons ADN produits par PCR à partir de différentes quantités initiales d'ADN de S, epidermidis; selon l'exemple 5.
En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 10 NI
d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 11 indique la quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées et déposées dans le compartiment C1. Ghaque point représenté sur le graphe représente une valeur moyenne obtenue à partir de 13 crachats et aspirations bronchiques différents, selon l'exemple 5. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 ,ul d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après PCR, exprimé en unités relatives de fluorescence.
La Figure 12 indique ia quantité d'amplicons produits à partir de différentes quantités initiales de bactéries lysées par chocs mécaniques, et déposées dans le compartiment C1, selon l'exemple 5. L'ëtude a été
réalisée en parallèle sur 4 crachats différents. En abscisse est représenté le nombre de copies d'ADN initiales pour 200 ,ul d'échantillon, et en ordonnées est représenté le signal obtenu après TMA, exprimé en DO x 1000.
La figure 13 représente un dispositif à usage unique selon l'invention, vu en perspective.
La figure 14 représente une vue de dessous du dispositif représenté à la figure 13.
La figure 15 représente représente une vue de dessus du dispositif représenté à la figure 13.
La figure 1 F représente représente une vue en. coupe, selon le trait de coupe représenté à la figure 15, du dispositif selon la figure 13.
Exemple 1 : Mode opératoire général pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention.
Le mode opératoire est basé sur l'utilisation d'un appareil d'éléctroéfution d'acides nucléiques selon la figure 1. Un volume d'échantillon biologique est déposé soigneusement au fond du compartiment C1. Les deux électrodes du circuit sont reliées à un générateur électrique. Une tension constante de 150 V est appliquée aux bornes du générateur. L'intensité du circuit varie de 15 à 20 mA et la température du tampon dans le compartiment C varie de 23 à 30°C. Les molécules biologiques initialement déposées au fond du compartiment C1 migrent dans le champ électrique ainsi créé, à vitesse définie en fonction de leur charge et de leur taille. Après différents temps de migration, la tension aux bornes du générateur est arrêtée et les molécules ayant migré vers fa cathode et de poids moléculaire apparent inférieur ou égal à 10 kDa sont recueillies dans le compartiment Cf, dans un volume final de 200 ,ul.
L'échantillon ainsi récupéré est conservé dans la glace avant analyse.
L'échantillon biologique déposé dans ie compartiment C1 peut étre un matériel nucléique et/ou protéique purifié ou non, un lysat cellulaire, provenant d'un échantillon biologique tei que le sang, l'urine et un crachat de type respiratoire. Les lysats cellulaires étudiés ont été obtenus à partir de S. epidermidis, bactérie à paroi Gram+ (A054). Ces bactéries sont cultivées en milieu liquide BCC (Bouillon Coeur Cervelle, bioMerieux 410191. Avant lyse, elles sont mises en suspension, soit dans un prélèvement clinique (crachat liquéfié et décontaminé, sang, plasma, sérum, ....), soit en tampon de lyse (30 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA, 100 mM NaCI pH 7.2). 300 ,ul de cette suspension cellulaire ont été lysés en suivant essentiellement deux protocoles - Protocole de Ivse oar chocs mécaniaues : 90 ,ul de billes de verre de diamètre compris entre 90 et 150 Nm, 3 billes de fer de diamètre 2 mm et 5 billes de verre de diamètre 3 mm sont placés dans un tube Faicon en présence de 300Ni de la suspension cellulaire, comme décrit dans le brevet (FR-A-2 768 7431. 6 mg /ml final de protéinase K (PK) (E.C.
3.4.21.14 Boehringer-Mannheim, ref. 10927661 peut être ajoutée à la suspension cellulaire. Le tube fermé est vortexé pendant deux minutes, à
W0 99/53304 PCTlFR99/00830 puissance maximale de l'appareil (Reax 2000, Heidolph). La suspension bacterienne ainsi traitée et récupérée est déposée immédiatement dans le compartiment C1 du dispositif décrit dans la Figure 1. Si la PK est présente dans la solution cellulaire, une incubation supplémentaire de 15 minutes à
37°C est réalisée.
Protocole de I~se par choc électrique : 300 ,ul de la suspension cellulaire sont déposés dans une cuve d'électroporation caractérisée par une distance entre les deux électrodes de 2 mm, en présence de 0.01 à 6 mg /ml final de PK: La cuve est placée dans un circuit ~ 0 électrique dont les paramètres sont choisis comme suit : tension 500 V, résistance 186 Ohms, capacité de 500 ou 1500 ,uFD. Après lancement d'une impulsion électrique, la décharge électrique se réalise en quelques millisecondes entre les deux électrodes. Le lysat ainsi récupéré est déposé
immédiatement dans le compartiment A du dispositif décrit dans la Figure 1 ~ 5 (FR-A-2 763 957).
Le pourcentage d'acides nucléiques recueilli du côté de la cathode, après migration dans le compartiment Cf, est déterminé par mesure de DO (densité optique) de l'échantillon récupéré à 260 nm. Le pourcentage recueilli est égal au rapport de fa valeur de DO à 260 nm après 20 migration, sur la valeur de DO à 260 nm avant migration. De méme, la quantité de protéines recueillies à la cathode après migration est déterminée par dosage Bradford et lecture de DO à 595 nm. Le pourcentage de protéines recueillies est égal au rapport de la quantité
protéique récupérée sur la quantité initiale.
25 La quantité des acides nucléiques récupérés du côté de la ' cathode après migration est vérifiée sur gel d'agarose 0.8% ; 10 NI de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous voltage constant (150 V) et le gel est coloré au bromure d'ethidium (BET) avant observation sous rayonnement - ultra-violet. En 30 parallèle, les protéines récupérées à 1a cathode après migration peuvent être observées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE
10%); - 5 à 10 NI de l'échantillon sont déposés par puits, la migration électrophorétique est réalisée sous intensité constante (25 mA), et le gel est coloré au bleu de Coomassie.
35 La quantité d'acides nucléiques récupérés du côté de la cathode est déterminée par détection spécifique selon une technique d'hybridation dite sandwich, en utilisant l'appareil Vidas commercialisé par bioMérieux (France). Des sondes oligonucléotidiques de capture et de détection spécifiques des acides nucléiques de S. epidermidis (EP-A-0 632 269) ont été choisies. Les oligonucléotides de capture et de détection ont respectivement pour séquence : 5'-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3' (SEQ
ID N° :1 ) et 5'-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3' (SEQ ID N° :2).
La sonde de détection est marquée par couplage avec la phosphatase alcaline (AKP). L'hybridation spécifique de ces sondes avec les acides nucléiques libérés dans le lysat est fonction de la quantité d'acides nucléiques prësents, mais aussi de leur accessibilité pour les sondes utilisées.
Deux protocoles d'amplification spécifique des molécules d'ADN
et d'ARN de S. epidermidis ont été réalisés à partir des échantillons recueillis après migration : un protocole PCR pour l'amplification de /'ADN
et un protocole NASBA pour l'amplification de l'ARNr16S et un protocole TMA pour l'amplification de l'ARNr 16S.
-Protocole PCR : la technique de PCR suivie est celle décrite par Goodman dans PCR Strategies, Ed : Innis, Gelford et Sninsky Academic press 1995, pp 17-31. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elles présentent les séquences suivantes Amorce 1 : 5'-ATCTTGACATCCTCTGACC-3' (SEQ ID N ° :3) Amorce 2 : 5'-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3' (SEQ ID N° :4) Les cycles de température suivants ont été utilisés 1 fois 3 minutes à 94°C
2 minutes à 65 ° C
35 fois 1 minute à 72°C
1 minute à 94°C
2 minutes à 65°C
1 fois 5 minutes à 72°C
-Protocole TMA : la technique de TMA suivie est celle décrite par US-A-5 554 516. Deux amorces d'amplification ont été utilisées, elfes présentent les séquences suivantes Amorce 1 . 5'-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA -3' (SEQ
ID N° :5) Amorce 2 : 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGGTT
TGTCACCGGCAGTCAACTTAGA -3' (SEQ ID N ° :6) ,ul ou 50 NI d'échantillon recueilli sont utilisés pour chaque essai PCR et TMA, respectivement. Les amplicons produits par PCR sont observés sur gel d'agarose 0.8% et quantifiés sur Vidas selon le protocole décrit ci-dessus. Les amplicons produits par TMA sont détectés et 5 quantifés sur microplaque par hybridation avec une sonde de capture et une sonde de détection, spécifiques de S. epidermidis, selon ia méthode décrite par P. Cros et al., Lancet 1992, 240 :870. La sonde de détection est couplée à la " Horse Radish Peroxidase " (HRP). Les deux ~ sondes présentent les séquences suivantes 10 Sonde de capture : 5'-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3' (SEQ ID
N° :7) Sonde de détection : 5'-GACATCCTCTGACCCCTCTA -3' tSEQ
ID N° :8) Exemple 2 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à
partir de lysat cellulaire.
Une suspension de Staphylococcus epidermidis (1-5.109 b./300,u1) est lysée par choc mécanique ou par choc électrique, comme décrit dans le protocole général ci-dessus. 200 cul de chaque lysat sont déposés au fond du compartiment C1. Le champ électrique est appliqué
2o pendant différents temps entre les deux électrodes. Les quantités d'acides nucléiques ou de protéines présentes dans l'échantillon recueilli dans le compartiment Cf sont déterminées par analyse avec un appareil Vidas ou dosage Bradford, respectivement. La qualité des molécules récupérées a été appréciée sur gel d'agarose ou d'acrylamide, en présence de SDS.
- LYsat cellulaire obtenu par choc mécaniaue Les acides nucléiques du lysat ont migré dans le compartiment Cf progressivement au cours du temps, comme montré à la figure 2. Après 60 minutes, la totalité du matériel nucléique du lysat est récupéré, quelque soit la présence ou non de protéinase K pendant l'étape de lyse. Ce résultat 3o est en faveur d'une bonne libération et accessibilité des acides nucléiques dans le lysat. Les molécules d'ADN récupérées ont le même profil de migration sur gel d'agarose 0:8% qu'avant migration dans le lysat. En présence de protéinase K pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 3, seul un pourcentage négligeable de protéines est récupéré aprës 60 minutes, tandis qu'en l'absence de protéase, environ 50% de protéines sont récupérées.
- L~at cellulaire obtenu par choc electrique.
En présence de PK pendant l'étape de lyse, comme montré à la figure 4, les acides nucléiques du lysat migrent progressivement jusqu'à la cathode. Après 60 minutes, un pourcentage important d'acides nucléiques 5 est récupéré. La récupération du matériel nucléique présent initialement dans ce lysat est similaire à celle du matériel nucléique présent initialement dans un lysat obtenu par choc mécanique (cf. ci-dessus). Par contre, en absence de PK pendant l'étape de lyse, aucun acide nucléique ne peut être détecté dans le compartiment Cf, même après 60 minutes de migration 10 (analyse Vidas et gel d'agarose 0.8%). Sur ge! d'agarose, les molécules d'ADN et d'ARN du lysat récupérées sont observables séparément après migration, alors qu'elles ne le sont pas initialement dans le lysat.
- Amplification des acides nucléiques purifiés à partir de Ivsat cellulaire 15 Les bactéries S. epidermidis diluées dans 300 NI de tampon de lyse sont lysées par choc mécanique en l'absence de PK, comme décrit dans ie protocole général de l'exemple 1. 200,u1 du lysat sont déposés au fond du compartiment C1. Un champ électrique est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps. I_e matériel nucléique qui a migré dans le compartiment Cf est amplifié par PCR (10 NI par essai) ou TMA (50 NI
par essai). La quantité d'amplicons produite est analysée par hybridation spécifique sur Vidas ou microplaque, respectivement.
- Amplification PCR des molécules d'ADN récupérées après migration Pour 104 bactéries initiales lycées, déposées dans le compartiment C1, différentes quantités d'amplicons sont produites, en fonction du temps de migration. Pour 15 minutes de migration, comme représenté à la figure 5, les molécules d'ADN récupérées permettent une production optimale d'amplicons par PCR. Avant 15 minutes, une quantité
3o inférieure de molécules d'ADN sont récupérées. Pour 20 minutes et après, une quantité supérieure de molécules d'ADN sont récupérées, mais de qualité moins adaptée à une amplification PCR optimale. Plus la migration dure, plus la structure de l'acide nucléique peut être altérëe. Afin d'obtenir une amplification PCR optimale, un compromis entre quantité et qualité des molécules d'ADN récupérées à la cathode doit être respecté. Ce résultat a été confirmé en utilisant des suspensions initiales de S. epidermidis plus concentrées (105-106 bactéries initiales /200,u1).
Comme représenté à le figure 6, l'ADN d'un nombre supérieur ou égal à 1.103 bactéries initiales (/200NI) peut être amplifié et détecté, après lyse mécanique des cellules et migration des constituants du lysat sous champ électrique; soit 102 molécules d'ADN ou bactéries par essai PCR, étant donné que le matëriel migré est récupéré dans 200 ,ul et que 10 ,ul de ce matériel est utilisé pour chaque essai PCR. 102 molécules d'ADN
correspondent à la limite de sensibilité du protocole PCR, de façon générale. Ce résultat démontre une grande sensibilité de rëcupération des molécules d'ADN bactérien après lyse cellulaire par choc mécanique et purification des molécules d'ADN intracellulaire par champ électrique en solution.
- Amplification TMA des molécules d'ARN rëcur~érées après migration Comme représenté à la figure 7, l'ARN de au moins 40 bactéries initiales (1200~r1) peut être détecté après lyse des bactéries, migration des constituants cellulaires sous champ électrique et amplification spécifique des ARNr16S de S epidermidis ; soit 10 bactéries initiales par essai TMA, compte tenu que le matériel nucléique migré est récupéré dans 200 NI final, et que 50 NI sont ajoutés par essai TMA. Ce résultat témoigne d'une grande sensibilité de récupération des molécules d'ARNr 16S
bactérien, après lyse par choc mécanique et purification des acides nucléiques du lysat par champ électrique.
Exemple 3 : Cinétique de récupération d'acides nucléiques à
partir d' un échantillon sanguin.
L'échantillon sanguin est utilisé sans pré-traitement préalable.
200 ~I de cet échantillon clinique est déposé au fond du compartiment C1.
Un voltage de 150 V est appliqué entre les deux électrodes pendant différents temps, puis le matériel récupérë du côté de la cathode dans le compartiment Cf est analysé par dosage de protéines selon la méthode de Bradford, et sur gel de polyacrylamide en présence de SDS iSDS-PAGE
10%).
Dans cet exemple, le pH du tampon TBE utilisé pour la migration a été fixé à pIH 7.0, ie point isoélectrique de l'hémoglobine étant égal à
7Ø
Des membranes de 50 ou 100 kDa ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B. Comme cela est représenté à la figure 8, après 60 minutes de migration, un pourcentage négligeable de protéines est récupéré
avec la membrane de 100 kDa, et 10% des protéines sont récupérées avec la membrane de 50 kDa. A pH 7.0, seulement 10% des protéines sanguines chargées négativement à pH 7.0 ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa et inférieur à 100 kDa. Un pourcentage négligeable de protéines sont récupérées après 15 minutes de migration, en utilisant indifféremment une membrane de 50 ou 100 kDa. Ces conclusions ont été vérifiées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS-PAGE 10%.
La porosité de la membrane sera préférentielement supérieure à 10 kDa, afin de ne pas obtenir un pourcentage trop élevé de protéines.
Exemple 4 : Cinétique de récupération d'acides nuclëiques à
partir d'un échantillon de type respiratoire.
Avant utilisation, l'échantillon respiratoire est fluidifié, décontaminé selon le protocole standard au N-acetyl-L-cysteine et à la soude (NALC/NaOH); puis il est inactivé 20 minutes à 95°C.
Dans cet exempte, le tampon TBE utilisê pour la migration a un pH égal à 8.3 ou 7.0, et des membranes de différentes tailles de pores ont été placées à l'interface des compartiments Cf et B: 10, 50 ou 100 kDa.
Comme cela est représenté à la figure 9, à pH 8.3, 10% des protéines sont récupérées après 30 minutes, et 70-80% après 60 minutes avec des membranes de 50 ou 10 kDa, ce qui suggère que 70-80% des protéines du crachat sont chargées négativement à ces pH et ont un poids moléculaire apparent supérieur à 50 kDa. A pH 7.0, environ 0% des protéines sont récupérées après 30 ou fi0 minutes de migration, quelque soit la taille des pores de la membrane utilisée (dans la limite de sensibilité des techniques de détection utilisées). A ce pH, les 55-60% des protéines préalablement récupérées à pH 8.0 ne sont plus chargées négativement. Avec les membranes de 10 ou 50 kDa, un pourcentage négligeable des protéines du crachat est récupéré après 15 minutes de migration. On a vérifié ce point sur gel de polycrylamide en présence de SDS-PAGE 10%.
Exemple 5 : Levée d'inhibition de protocoles d'amplification par les échantillons de type respiratoire après migration.
Les échantillons de type respiratoire sont inhibiteurs des réactions PCR et TMA. 200 ,ul de ces échantillons ont été déposés au fond du compartiment C1 du système décrit Figure 1. Un voltage de 150 V
constant a été appliqué entre les deux électrodes pendant 15 minutes. Une membrane de séparation entre Cf et B de 10 kDa a été choisie. Après migration, l'échantillon récupéré dans le compartiment Cf (200 ,u!) a été
supplémenté avec différentes quantités d'acides nucléiques purifiés de S.
epidermidis. 10 NI ou 50 ,ul de cette solution ont été utilisés pour chaque essai PCR ou TMA, respectivement. Comme représenté à la figure 10, jusqu'à 102-103 copies initiales d'ADN peuvent être amplifiées dans 10 NI
d'échantillon migré. Ce résultat démontre que le crachat migré a perdu son caractère inhibiteur de la PCR. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'amplification TMA.
1-5.109 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ui de crachat fluidifié, décontaminés et inactivés comme décrit dans l'exemple 4 ci-dessus. Ces cellules en suspension ont été lysées par choc mécanique en absence de PK, et le lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec ~ 5 une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le schéma présenté à la Figure 1. La quantité d'acides nucléiques bactériens récupérés dans le compartiment Cf après migration a été quantifiée par analyse Vidas spécifique de l'espèce bactérienne étudiée. L'expérience a été réalisée à
partir de différents crachats. En moyenne, 80% d'acides nucléiques S.
2o epidermidis sont récupérés. Ce résultat indique que les molécules de la matrice du crachat ne gênent pas la migration des molécules d'ADN et d'ARN du lysat bactérien dans le champ électrique, dans ces conditions. Au contraire, il semble que l'environnement soit propice à une meilleure récupération et/ou migration de ces molécules.
25 Amplification PCR:
Les bactéries S. epidermidis ont été ensemencées dans 300 ul de crachat fluidifié, dëcontaminé, inactivé, puis lysées par choc mécanique en absence de PK comme décrit dans !'exempte 1. 200 ,ui du lysat a migrë
pendant 15 minutes sous 150V avec une membrane de 10 kDa entre les 3o compartiments Cf et B. Le matériel nucléique présent dans l'échantillon a été amplifié par PCR t10 ,ul par essai), et les ampücons produits ont été
quantifiés par analyse Vidas: Comme représenté à la figure 11, jusqu'à
104-103 bactéries initiales lysées (i200,u1 de lysat? peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 35 molécules d'ADN /10,u1 d'essai PCR). Ce résultat, d'une part confirme un très bon rendement de récupération des molécules d'ADN bactérien du lysat dans le crachat, et d'autre part démontre une très bonne élimination des inhibiteurs de la PCR initialement présents dans les crachats.
Amplification TMA:
De même que pour l'étude de l'amplification PCR décrite ci avant, les bactéries S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ul de crachat fluidifié, décontaminé, inactivé puis lysées par choc mécanique en absence de PK. 200 pl du lysat a migré pendant 15 minutes sous 150V
avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et A. Les molécules d'ARNr présentes dans l'ëchantillon récupéré ont été amplifiées 90 par TMA (50 ,ul par essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par hybridation spécifique sandwich sur microplaque. Comme représenté à la figure 12, au moins 106-105 bactéries initiales lysées (i200p1 de lysat) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ARN (soit au moins 5.104-5.103 bactéries initiales /50 ,ul d'essai TMA).
Ce résultat démontre l'élimination des inhibiteurs de la TMA initialement présents dans les crachats.
Exemple 6: Electro-séparation après lyse par chocs électriques.
1-5.1 O9 S. epidermidis ont été ensemencés dans 300 ,ul de crachat fluidifié, décontaminé et inactivé comme décrit dans l'exemple 4.
Ces cellules en suspension ont été lysées par choc électrique en présence de 102 mgiml final de PK et 2% final de LLS (Lithium Lauryl Sulfate, Sigma). 200 pl de lysat a migré pendant 15 minutes sous 150 V avec une membrane de 10 kDa entre les compartiments Cf et B, selon le shéma présenté à la figure 1. Le matériel nucléique récupéré après migration (200 ,ul ) a été amplifié par PCR spécifique de S. epidermidis ( 10 pl/essai), et les amplicons produits ont été quantifiés par analyse Vidas. Jusqu'à 104-105 bactéries initiales lysées (Iml) peuvent être détectées après migration et amplification des molécules d'ADN (soit 100-10 molécules d'ADN/10 NI
d'essai PCR, ce qui représente la limite de sensibilité de la technique PCR
utilisée).
Conformément aux figures 13 à 16, on décrit ci-après un dispositif à usage unique, c'est-à-dire consommable, ou jetable après emploi, permettant de mettre en oeuvre le procédé d'électro-séparation décrit et exemplifié précédemment.
Un tel dispositif comprend un support 1, ou base, ayant généralement une forme parallèlépipédique, comprenant notamment une WU 99/53304 PCT/F'R99/00830 face supérieure 1 b, une face inférieure 1 c et un flanc latéral 1 a, montrés sur les Figures 13 et 14:
De manière générale dans ce support 1, sont rassemblés et intégrés, ainsi qu'agencés entre eux, les différents moyens, notamment 5 électrodes requis pour l'électro-séparation, ainsi que des moyens d'interfaçage correspondant au flanc 1a du support 1 avec l'extérieur, d'une part pour le transfert des différents fluides ou liquides vers et/ou hors du support 1, dont l'échantillon biologique traité, ie milieu liquide aqueux (tampons) et la fraction enrichie en matière nucléique, et d'autre part pour 10 l'alimentation et la commande des moyens électriques requis au moins pour 1'électro-séparation, dont celle du champ électrique.
De manière non représentée, à titre d'exemple, les deux faces 1 a et 1 b du dispositif, ou carte, sont revêtues d'un film transparent, étanche; adhérant au support, et fermant ies différents conduits et cavités ~ 5 représentés en surface aux figures 13 et 14.
Ce dispositif comprend encore - un moyen de réception 2 de l'échantillon biologique traité
- un premier réservoir 3 pour un premier milieu liquide àqueux (tampons TBE dilué à 10 fois), comportant lui-même un compartiment 31 20 fermé par une membrane 4 perméable, ayant par exemple une capacité de l'ordre de 100 Nl, ainsi qu'un autre compartiment 32, ayant une capacité
de 1 ml, pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir d'un échantillon biologique ; cet autre compartiment est disposé en amont du compartiment 31 selon le sens de circulation du matériel nucléique, sous l'effet du champ électrique, et communique lui-même avec le moyen de réception 2 de L'échantillon biologique - un second réservoir 5 pour un second milieu liquide aqueux (par exemple tampon TBE, une fois concentré), identique ou différent du premier liquide aqueux, séparé du premier réservoir 3, uniquement par la membrane 4 - deux électrodes 61 et 62 pour générer un champ électrique, communiquant avec deux plots 63 et 64 de contact électrique sur le flanc 1a ; l'une des électrodes, à savoir 61, ou cathode, est au contact du premier milieu liquide aqueux dans le premier réservoir 3, et l'autre électrode 62, ou anode, est au contact du second milieu aqueux dans le second réservoir 5 WO 99/53304 PCT/FR99/00$30 - un moyen d'extraction 9 de la fraction enrichie en matériel nucléique du compartiment 31 fermé par la membrane 4 Les deux réservoirs 3 et 5 communiquent respectivement avec des évents d'aération 33 et 53, et avec au moins un canai de remplissage 34 communiquant en ce qui le concerne avec ie second réservoir 5.
Un puits intermédiaire 7 est disposé et communique entre le moyen de réception 2 de l'ëchantillon biologique et le premier réservoir 3.
Ce puits n'est pas obligatoire, puisque le lysat peut être déposé
directement dans le compartiment 32. Ce puits 7 est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire pour obtenir une fraction soumise ensuite à électra-séparation ; ces moyens sont des électrodes 81 et 82, permettant d'exposer l'échantillon à une ou plusieurs impulsions électriques, conformément au procédé décrit par ailleurs dans la demande de brevet frarfçais FR-A-2 7fi3 au nom de la Demanderesse. Ces électrodes 81 et 82 communiquent respectivement avec des plots de contact électrique 83 et 84 prévus sur le flanc 1 a. II existe donc deux circuits électriques, l'un associé aux électrodes 81 et 82, et l'autre associé aux électrodes 61 et 62.
I - Prénaratian du dispositif Avant de démarrer toute réaction, on remplit les réservoirs 3 et 5 de tampon. Ce dernier peut étre constitué par un tampon TBE (Tris-Borate-EDTA1 dont la concentration varie d'un réservoir à l'autre. On remplit le premier réservoir 3, supérieur, par le moyen de réception 2, avec du tampon dilué dix fois, et le second réservoir 5, inférieur, par le canal 34 avec du tampon une fois concentré. On perce les évents d'aération 33 et 53 au niveau des films étanches recouvrant les faces 1 a et 1 b, afin de permettre à l'air de s'échapper lors du remplissage des réservoirs.
1 ) Lyse L'échantillon est introduit dans le moyen de réception 2 à !'aide d'une pipette, manuellement ou par un automate. Le volume de l'échantillon est compris entre 0 et 1 ml. II arrive alors dans le puits intermédiaire 7 de lyse. La lyse est réalisée grâce à une décharge électrique de 500 V pendant environ 1 seconde, entre les électrodes 81 et 82.
Dans le cas où le volume d'échantillon est supérieur à 50 cul, plusieurs étapes de lyse sont réalisées les unes après les autres, les fractions lysées étant transférées au fur et à mesure dans le compartiment 32 de réception.
2) Electro-séparation Une fois l'échantillon lysé et transfëré en totalité dans le compartiment 32 de départ de I'électro-séparation, le premier circuit électrique des électrodes 81 et 82 est ouvert, le deuxième des électrodes 61 et 62 est fermé. Les constituants du iysat chargés négativement vont alors migrer jusqu'à l'anode 62. Les acides nucléiques étant fortement négatifs migreront plus vite. On pourra donc les récupérer sélectivement au-dessus de la membrane 4, au niveau du compartiment de réception 31 par le canal de prélèvement 9.
Le courant imposé pour cette migration est compris entre 0 et 30 mA, sous une tension de 150 V. La durée optimale de migration est d'environ 15 minutes.
Afin de récupérer ies acides nucléiques, on vide le réservoir 3 supérieur jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liaison fluidique entre le compartiment 32 et le compartiment de réception 31. On prélève alors avec une pipette, par le canal 9, les 100 ,ul de tampon contenus dans le compartiment 31. Le prélèvement peut se faire manuellement ou par l'intermédiaire de l'automate.
On peut prévoir de récupérer aussi les protéines purifiées. Pour cela, il faut effectuer deux passes successives d'électro-purification, la première permettant de récupérer la fraction enrichie en acides nucléiques et la deuxième la fraction enrichie en protéines. Dans ce cas précis, les acides nucléiques doivent être récupérés entre ies deux passes, et sans vider le réservoir 3 supérieur du tampon qui contient les protéines qui n'ont pas fini de migrer.
Un dispositif tel que précédemment décrit peut ne comprendre que trois électrodes. En effet, les deux cathodes 61 et 81, respectivement affectées au circuit d'électro-séparation et au circuit de lyse, deviennent la cathode commune aux deux circuits. Dans ce cas, la lyse de l'échantillon biologique s'effectue dans le compartiment 32. Un tel dispositif peut étre utilisé sur la tranche. II sera alors facile de l'intégrer dans un automate grâce à ce gain de place.
Claims (21)
1/ Utilisation d'un procédé de traitement d'un échantillon sous l'action d'un champ électrique en milieu liquide, ledit échantillon étant libre et mobile dans ledit milieu liquide sous l'action du champ électrique, procédé selon lequel a) on dispose d'une solution tampon, b) on dispose d'une membrane perméable, en contact d'un côté
avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter ledit échantillon, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, d) on dispose l'échantillon dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique, caractérisée en ce que pour séparer un matériel nucléique d'un échantillon biologique comprenant à la fois ledit matériel nucléique, et un matériel non nucléique, par exemple un protéique, - on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare au moins le matériel nucléique de l'échantillon biologique.
avec la solution tampon, et ayant un seuil de coupure prédéterminé pour arrêter ledit échantillon, du côté de ladite solution tampon, lors de sa migration sous l'action du champ électrique, c) on établit ledit champ électrique, en sorte que ses lignes de force passent au sein de la solution tampon, et traversent la membrane perméable, d) on dispose l'échantillon dans la solution tampon, en amont de la membrane, selon le sens de circulation du matériel nucléique sous l'action du champ électrique, caractérisée en ce que pour séparer un matériel nucléique d'un échantillon biologique comprenant à la fois ledit matériel nucléique, et un matériel non nucléique, par exemple un protéique, - on applique le champ électrique directement à l'échantillon biologique dans la solution tampon, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare au moins le matériel nucléique de l'échantillon biologique.
2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'échantillon biologique comprend un lysat cellulaire.
3/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est disposé sur une autre membrane, du côté
de cette dernière en contact avec la solution tampon.
de cette dernière en contact avec la solution tampon.
4/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le temps d'application du champ électrique est au plus de 30 minutes, et préférentiellement compris entre 5 et 30 minutes.
5/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la valeur de la molarité de la solution tampon est au moins égale à 0,1 mol/l, et préférentiellement comprise entre 0,1 et 5 mol/l.
6/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le champ électrique a une valeur comprise entre 100 et 250 V, et préférentiellement égale à 150 V.
7/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la distance séparant l'échantillon biologique de la membrane perméable, est au moins égale à 30 mm, et préférentiellement à 75 mm.
8/ Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est obtenu à partir d'un prélèvement d'un liquide corporel, par exemple sang ou crachat respiratoire.
9/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'on ajoute une protéinase à l'échantillon biologique.
10/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la fraction enrichie en matériel nucléique est directement soumise à
une étape subséquente d'amplification.
une étape subséquente d'amplification.
11/ Utilisation d'un dispositif de traitement d'un échantillon, ledit dispositif comprenant un moyen de réception (2) dudit échantillon ;
un réservoir (3) pour une solution tampon, comportant un compartiment (31) fermé par une membrane (4) perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment (31) avec le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir (5) pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes (61, 62) de génération du champ électrique, l'une (61) au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation de l'échantillon, et l'autre (62) au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction (9) d'une fraction du compartiment fermé (31) par la membrane, caractérisé en ce que, pour séparer un matériel nucléique d'un échantillon biologique, comprenant à la fois ledit matériel nucléique, et un matériel non nucléique, par exemple protéique:
- on applique le champ électrique, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la première solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare au moins le matériel nucléique de l'échantillon biologique.
un réservoir (3) pour une solution tampon, comportant un compartiment (31) fermé par une membrane (4) perméable, communiquant à une extrémité opposée audit compartiment (31) avec le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique, ledit réservoir étant destiné à recevoir une première solution tampon; et un second réservoir (5) pour une seconde solution tampon, identique ou différente de la première solution tampon, séparé du premier réservoir uniquement par ladite membrane; deux électrodes (61, 62) de génération du champ électrique, l'une (61) au contact de la première solution tampon, en amont de la membrane selon le sens de circulation de l'échantillon, et l'autre (62) au contact de la seconde solution tampon; et un moyen d'extraction (9) d'une fraction du compartiment fermé (31) par la membrane, caractérisé en ce que, pour séparer un matériel nucléique d'un échantillon biologique, comprenant à la fois ledit matériel nucléique, et un matériel non nucléique, par exemple protéique:
- on applique le champ électrique, pendant une durée limitée et définie, d'une part par le temps suffisant pour l'arrivée sur la membrane et la présence de matériel nucléique du côté de la première solution tampon, et d'autre part par le fait qu'au terme de ladite durée le matériel non nucléique n'a pas migré et/ou demeure en cours de migration vers ladite membrane, - on prélève le matériel nucléique au terme de ladite durée, moyennant quoi on électro-sépare au moins le matériel nucléique de l'échantillon biologique.
12/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le réservoir (3) du dispositif de traitement comprend un autre compartiment (32), pour la réception d'au moins une fraction obtenue à partir de l'échantillon biologique, disposé en amont dudit compartiment (31) selon le sens de circulation du matériel nucléique, communiquant avec le moyen de réception de l'échantillon biologique.
13/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que les deux réservoirs (3,5) du dispositif de traitement communiquent respectivement avec des évents d'aération (33, 53), et avec au moins un canal de remplissage (34).
14/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que un puits intermédiaire (7) du dispositif de traitement est disposé et communique entre le moyen de réception (2) de l'échantillon biologique et le premier réservoir (3).
15/ Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu de moyens permettant de lyser un échantillon cellulaire.
16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le puits intermédiaire (7) est pourvu d'électrodes (81,82) assurant une lyse dudit échantillon cellulaire.
17/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le dispositif de traitement comprend, communiquant les uns avec les autres, un compartiment (32) de réception du lysat, un puits intermédiaire de lyse (7), et un compartiment de réception (31) de la fraction enrichie en matériel nucléique.
18/ Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que, dans le dispositif de traitement, le volume du compartiment de réception (32) du lysat est supérieur au volume du compartiment de réception (31) de la fraction enrichie en matériel nucléique.
19/ Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que la proportion entre les volumes des compartiments de réception du lysat et de réception de la fraction nucléique est comprise entre 1/2 et 1/50, notamment entre 1/5 et 1/20.
20/ Utilisation selon la revendication 11, pour électro-séparer une fraction ou la totalité des acides nucléiques, à partir d'un lysat cellulaire.
21/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que la fraction étectro-séparée est utilisée pour détecter et/ou identifier des acides nucléiques directement après amplification.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR98/04878 | 1998-04-10 | ||
| FR9804878A FR2777293B1 (fr) | 1998-04-10 | 1998-04-10 | Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre |
| PCT/FR1999/000830 WO1999053304A1 (fr) | 1998-04-10 | 1999-04-09 | Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2328298A1 true CA2328298A1 (fr) | 1999-10-21 |
Family
ID=9525403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002328298A Abandoned CA2328298A1 (fr) | 1998-04-10 | 1999-04-09 | Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1070246A1 (fr) |
| JP (1) | JP2002511583A (fr) |
| AU (1) | AU745247B2 (fr) |
| CA (1) | CA2328298A1 (fr) |
| FR (1) | FR2777293B1 (fr) |
| WO (1) | WO1999053304A1 (fr) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7338805B2 (en) | 2001-05-04 | 2008-03-04 | Bio Merieux | Labeling reagents, methods for synthesizing such reagents and methods for detecting biological molecules |
| FR2855832B1 (fr) | 2003-06-03 | 2007-09-14 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique |
| FR2857375B1 (fr) | 2003-07-10 | 2007-11-09 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries de genre staphylococcus |
| JP2005110503A (ja) * | 2003-10-02 | 2005-04-28 | Arkray Inc | 核酸の精製方法及びデバイス |
| FR2868071B1 (fr) | 2004-03-26 | 2006-06-09 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| FR2868433B1 (fr) | 2004-04-06 | 2008-01-18 | Biomerieux Sa | Procede pour le pronostic et/ou le diagnostic d'un cancer |
| JP4735119B2 (ja) * | 2004-08-09 | 2011-07-27 | 日本精工株式会社 | 反応器及びその製造方法 |
| FR2881437B1 (fr) | 2005-01-31 | 2010-11-19 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic/pronostic d'un syndrome septique |
| FR2886735B1 (fr) | 2005-06-01 | 2015-09-11 | Biomerieux Sa | Procede de marquage ou de traitement d'un echantillon biologique contenant des molecules biologiques d'interet, notamment des acides nucleiques |
| FR2902430B1 (fr) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence des genes h5 et n1 du virus d'influenza a |
| FR2900158A1 (fr) | 2006-04-25 | 2007-10-26 | Biomerieux Sa | Nouvelle sonde de detection agissant par reconnaissance moleculaire |
| FR2906537A1 (fr) | 2006-09-28 | 2008-04-04 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic in vitro du cancer broncho-pulmonaire par detection des transcrits majoritaires alternatifs du gene klk8 codant la kallicreine 8 et son utilisation pour le pronostic de survie |
| FR2917090B1 (fr) | 2007-06-11 | 2012-06-15 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage portant des fonctions diazo et nitro, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| FR2934595B1 (fr) | 2008-07-29 | 2013-04-05 | Biomerieux Sa | Reactifs de marquage ayant un noyau pyridine portant une fonction diazomethyle, procedes de synthese de tels reactifs et procedes de detection de molecules biologiques |
| ES2556771T3 (es) | 2009-01-19 | 2016-01-20 | bioMérieux S.A. | Procedimientos para determinar la susceptibilidad de contraer una infección nosocomial en un paciente y para establecer un pronóstico de evolución de un síndrome séptico |
| EP2576815B1 (fr) | 2010-06-04 | 2018-02-14 | Biomérieux | Procédé pour le pronostic du cancer colorectal |
| EP2588860A4 (fr) * | 2010-06-30 | 2017-01-25 | ANPAC Bio-Medical Science Co., Ltd. | Appareil de détection d'une maladie |
| WO2012129758A1 (fr) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Biomerieux | Procédé et kit pour déterminer in vitro la probabilité qu'un individu soit atteint d'un cancer colorectal |
| US9333463B2 (en) * | 2013-07-26 | 2016-05-10 | General Electric Company | Devices and systems for elution of biomolecules |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4164464A (en) * | 1977-03-25 | 1979-08-14 | Instrumentation Specialties Company | Sample concentrator |
| US4750982A (en) * | 1985-03-21 | 1988-06-14 | Lifecodes Corp. | Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA |
| US5415758A (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-16 | Theobald Smith Research Institute, Inc. | Method and apparatus for electro-elution of biological molecules |
| DE19610354C1 (de) * | 1996-03-15 | 1997-11-20 | Innova Gmbh | Vorrichtung, Verfahren und Einrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren |
| GB9608644D0 (en) * | 1996-04-26 | 1996-07-03 | Scient Genarics Ltd | Nucleic acid manipulation |
-
1998
- 1998-04-10 FR FR9804878A patent/FR2777293B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-04-09 WO PCT/FR1999/000830 patent/WO1999053304A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1999-04-09 JP JP2000543820A patent/JP2002511583A/ja not_active Withdrawn
- 1999-04-09 EP EP99913375A patent/EP1070246A1/fr not_active Withdrawn
- 1999-04-09 AU AU31518/99A patent/AU745247B2/en not_active Ceased
- 1999-04-09 CA CA002328298A patent/CA2328298A1/fr not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002511583A (ja) | 2002-04-16 |
| AU745247B2 (en) | 2002-03-14 |
| FR2777293A1 (fr) | 1999-10-15 |
| WO1999053304A1 (fr) | 1999-10-21 |
| FR2777293B1 (fr) | 2000-05-19 |
| EP1070246A1 (fr) | 2001-01-24 |
| AU3151899A (en) | 1999-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2328298A1 (fr) | Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre | |
| JP6212488B2 (ja) | 電気的な試料調製のための方法及びデバイス | |
| KR102458490B1 (ko) | 핵산 정제 카트리지 | |
| US5340449A (en) | Apparatus for electroelution | |
| US7217513B2 (en) | Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample | |
| EP1056758B1 (fr) | Technique de purification d'acide nucleique par electrophorese | |
| US20080131949A1 (en) | Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample | |
| EP2152850B1 (fr) | Dispositif de lyse de microorganismes presents dans un echantillon environnemental ou clinique et d'extraction des acides nucleiques desdits microorganismes aux fins d'analyse | |
| EP0187586B1 (fr) | Perfectionnements aux procédés et appareils d'électrophorèse préparative | |
| EP3629000B1 (fr) | Procédé de préparation d'un échantillon biologique | |
| US9333463B2 (en) | Devices and systems for elution of biomolecules | |
| US11033859B2 (en) | Methods for electroelution of biomolecules | |
| FR3049061A1 (fr) | Dispositif d'analyse d'un echantillon biologique | |
| US10750928B2 (en) | Simultaneous extraction and separation of RNA and DNA from single cells using electrophoretic techniques | |
| JP2005110503A (ja) | 核酸の精製方法及びデバイス | |
| US11584926B2 (en) | Method and system for magnetic extraction of components in a liquid sample | |
| US11612839B2 (en) | Systems, devices, and methods for point-of-use testing for fluid contamination | |
| US7338796B1 (en) | Vesicle-based method and apparatus for collecting, manipulating, and chemically processing trace macromolecular species | |
| JP2014033663A (ja) | 核酸抽出装置及び核酸抽出方法 | |
| EP0348275B1 (fr) | Procédé et installation pour l'obtention de plasmides et de cosmides | |
| US6713299B1 (en) | Apparatus for separating biological materials | |
| EP3654011B1 (fr) | Procédé de préparation d'un échantillon à analyser obtenu à partir de matrice alimentaire | |
| JP2005218332A (ja) | ウイルス遺伝子の検出方法 | |
| KR20060058523A (ko) | 은 나노 입자를 이용한 핵산의 정제 방법 | |
| JPS62115353A (ja) | 電気泳動チユ−ブ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Dead |