CA2210166C - Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque - Google Patents
Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque Download PDFInfo
- Publication number
- CA2210166C CA2210166C CA002210166A CA2210166A CA2210166C CA 2210166 C CA2210166 C CA 2210166C CA 002210166 A CA002210166 A CA 002210166A CA 2210166 A CA2210166 A CA 2210166A CA 2210166 C CA2210166 C CA 2210166C
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- troponin
- cardiac
- antibody
- monoclonal
- coupled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque effectuée par chemiluminescence.
Description
Procédé de dosage ultrasensible de la trononine I cardiacrue La présente invention concerne un procédé de dosage ultrasensible de la troponine I cardiaque, effectué par chimiluminescence.
L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardio-vasculaire dans le monde.
Dans tous les cas, le traitement instauré. a pour but de protéger le tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens thérapeutiques, o comme les thrombolytiques ou l'angioplastie de première intention, permettent aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à
limiter la taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la morbidité.
Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis ts en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les cliniciens confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques de plus en plus performants.
Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est 2o devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde et pour l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T.
25 La troponine I cardiaque est une protéine contractile exclusivement présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271, p. 31-35 ; Wade R. et ai, Genomics (1990), 7, p. 346-357].
Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium, 30 l'activité ATPasique du complexe active-myosine et donc d'empêcher la contraction musculaire [ferry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593-617].
Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de l'une des artères nourricières du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose myocardique 35 qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération de la troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur très spécifique de l'infarctus du myocarde.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 96/22535 _ 2 _ PCT/FR96/00095 Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981 ), 110, p.
1344 ; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].
De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut être associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort subite.
Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que l'apparition de ces complications était très sowent précédée de micro-infarctus cardiaques i o [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708].
Le dosage de la troponine I cardiâque semble donc être particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les patients atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des micro-infarctus.
Par ailleurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou l'échec de la reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en chirurgie cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la troponine I
trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes cardiaques 2o après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques utilisant par exemple des anthracyclines.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 2 , p. 271-
L'infarctus du myocarde (IDM) représente toujours une urgence médicale et demeure la principale cause de mortalité et de morbidité cardio-vasculaire dans le monde.
Dans tous les cas, le traitement instauré. a pour but de protéger le tissu myocardique de la nécrose irréversible. De nouveaux moyens thérapeutiques, o comme les thrombolytiques ou l'angioplastie de première intention, permettent aujourd'hui de restaurer rapidement la circulation coronarienne, de façon à
limiter la taille de la zone infarcie et de réduire l'incidence de la mortalité et de la morbidité.
Ces outils thérapeutiques sont d'autant plus efficaces qu'ils sont mis ts en oeuvre au plus tôt après le début des manifestations cliniques. Les cliniciens confrontés à cette pathologie doivent pouvoir disposer d'outils diagnostiques de plus en plus performants.
Le dosage des protéines sériques et en particulier des enzymes est 2o devenu un élément déterminant pour le diagnostic de l'infarctus du myocarde et pour l'appréciation du succès ou de l'échec d'une reperfusion.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de 3 protéines, les troponines C, I et T.
25 La troponine I cardiaque est une protéine contractile exclusivement présente dans le muscle cardiaque [Wilkinson J.M. et al, Nature (1978), 271, p. 31-35 ; Wade R. et ai, Genomics (1990), 7, p. 346-357].
Son rôle physiologique est d'inhiber, en l'absence de calcium, 30 l'activité ATPasique du complexe active-myosine et donc d'empêcher la contraction musculaire [ferry S.V., Biochem. Soc. Trans (1979), 7, p. 593-617].
Lors de l'infarctus dû à l'obstruction de l'une des artères nourricières du coeur (artère coronaire), il apparaît une ischémie puis une nécrose myocardique 35 qui se traduit par une destruction des cellules cardiaques et la libération de la troponine I cardiaque dans le sang. La troponine I représente donc un marqueur très spécifique de l'infarctus du myocarde.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
WO 96/22535 _ 2 _ PCT/FR96/00095 Ainsi on a récemment préconisé le dosage de la troponine I pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde [Am. Heart J. (1981 ), 110, p.
1344 ; Molecular Immunology (1992), 29 (2), p. 271-278].
De plus, il est désormais acquis que chez certains patients l'angor instable - qui représente une étape critique de l'ischémie myocardique -, peut être associé à un haut risque de survenue d'infarctus du myocarde ou de mort subite.
Les études post-mortem sur cette catégorie de patients ont montré que l'apparition de ces complications était très sowent précédée de micro-infarctus cardiaques i o [Davies M.J. et al, Circulation (1985), 71, p. 699-708].
Le dosage de la troponine I cardiâque semble donc être particulièrement intéressant dans la détection des sujets à risque, chez les patients atteints d'angor instable, plus spécialement pour le diagnostic des micro-infarctus.
Par ailleurs, le dosage de la troponine I peut être envisagé lors de la surveillance d'un traitement thrombolytique pour confirmer le succès ou l'échec de la reperfusion, comme aussi lors du suivi postopératoire des interventions en chirurgie cardiaque (pontages coronariens, angioplasties etc.). Le dosage de la troponine I
trouve aussi son application dans le diagnostic des rejets de greffes cardiaques 2o après transplantation et le suivi des thérapeutiques cardiotoxiques utilisant par exemple des anthracyclines.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I. Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29 2 , p. 271-
2~ 27 ô ; Cli, ~. Cfiem. (1993), 39 6, p. 9r 2-979] décrivent un procécé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)- H2O2. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 ~Cg/I.
Un autre procédé immunoenzymométrique de ia troponine I Cscr~t par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 Ng/I [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38 11, p. 2203-2214 ; Adams J. et a., Circulation (1993), 88 1 , p. 101-706]. Ce dosage utilise pour la révélation 3s enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après le FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
Un autre procédé immunoenzymométrique de ia troponine I Cscr~t par Bodor et al permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 Ng/I [Bodor et al, Clin. Chem. (1992), 38 11, p. 2203-2214 ; Adams J. et a., Circulation (1993), 88 1 , p. 101-706]. Ce dosage utilise pour la révélation 3s enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
Grâce à ces dosages, il a été possible de mettre en évidence la présence de la troponine I dans le plasma des patients, environ 4 heures après le FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26~
3 début des manifestations cliniques de l'infarctus du myocarde (Adams J. et al, Circulation (1993), 88(1), p. 101-106).
Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des méthodes très sophistiquées et difficiles â mettre en oewre, par exemple des dosages basés sur la mesure de 1a radioactivité [Am. Heart Journal, (Jupe 1987), 113 6 , p.
1334J.
On sait aussi que des dérivés cyclïques d'hydrazines, notamment les diacylhydrazines, pewent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 5,~7, p. 409-423J. L'utilisation de ces 1 o réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosàges immunoenzymatiques [Thrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 1335-1341 ; Thrope G.H.G. et al, Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353J (Demande WO 88/00695). Par ailleurs, on connaît des méthodes de détection par chimïiuminescence mettant en oeuvre la décomposition enzymatique de dérivés du 1,2-dioxetane.
Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à
de multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles (affinité des différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps, marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un choix adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose. II est évident que l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de la 2 o mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le rapport signal/bruit de la mesure est trap petit. Or justement ce bruit de la mesure dépend des différents réactifs et conditions de dosage choisis.
II a été maintenant trauvé qu'il était possible, en utilisant un certain type d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque et de substrats adéquats pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage par chimiluminescence de la troponine I avec une très grande sensïbüité. En effet, en appliquant le procédé de l'invention il est passible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5 ng/l, ce qui représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des procédés immunoenzymométriques de la troponine I les c.:~lus sensibles connus jusqu'à
3 0 ~resent.
i i ,. . ,
Toutefois, la sensibilité de ces dosages immunoenzymométriques est largement inférieure à celle obtenue par des dosages basés sur des méthodes très sophistiquées et difficiles â mettre en oewre, par exemple des dosages basés sur la mesure de 1a radioactivité [Am. Heart Journal, (Jupe 1987), 113 6 , p.
1334J.
On sait aussi que des dérivés cyclïques d'hydrazines, notamment les diacylhydrazines, pewent être utilisés comme réactifs de chimiluminescence [Roswell et al, Methods Enzymol. (1978), 5,~7, p. 409-423J. L'utilisation de ces 1 o réactifs a été envisagée ou effectuée lors de certains dosàges immunoenzymatiques [Thrope G.H.G. et al, Clin. Chem. (1985), 31, p. 1335-1341 ; Thrope G.H.G. et al, Medors. Enzymol. (1988), 133, p. 331-353J (Demande WO 88/00695). Par ailleurs, on connaît des méthodes de détection par chimïiuminescence mettant en oeuvre la décomposition enzymatique de dérivés du 1,2-dioxetane.
Toutefois, il est connu que la mise en oeuvre de ces réactifs nécessite des recherches intensives puisque l'homme de l'art est confronté à
de multiples facteurs limitant pour la mise au point des dosages sensibles (affinité des différents composants de dosage et notamment du système antigène/anticorps, marqueur enzymatique, substrat, principe de détection etc.). En effet, un choix adéquat des différents réactifs et conditions de dosage s'impose. II est évident que l'on ne peut pas imaginer un dosage sensible et spécifique lorsque le bruit de la 2 o mesure (bruit de fond ou bruit de blanc) est important ou lorsque le rapport signal/bruit de la mesure est trap petit. Or justement ce bruit de la mesure dépend des différents réactifs et conditions de dosage choisis.
II a été maintenant trauvé qu'il était possible, en utilisant un certain type d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque et de substrats adéquats pour la révélation enzymatique, de procéder au dosage par chimiluminescence de la troponine I avec une très grande sensïbüité. En effet, en appliquant le procédé de l'invention il est passible d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 2 à 5 ng/l, ce qui représente une sensibilité 40 à environ 1500 fois supérieure à celles des procédés immunoenzymométriques de la troponine I les c.:~lus sensibles connus jusqu'à
3 0 ~resent.
i i ,. . ,
4 La présente invention vise un procédé de dosage immuno-enzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) des échantillons ou des standards sont mis en contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation IO à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, b) le mélange réactionnel est lavé, c) une révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle hydrazine ou du 1,2-dioxétane, d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
De préférence, la présente invention a plus précisément comme objet, un procédé de dosage immuno-enzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque:
20 - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps ont, soit naturellement, soit par coopérativité une grande affinité pour la troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à
l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M; et - qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent qui est soit un dérivé d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane.
30 De préférence, la présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type 4a sandwich de la troponi.ne I ca:â~d:iac.[ue, <<aractérisé en ce que l'on met en contact ~es échantil:.ons à doser ou les standards avec: un arti~.Jorps monocl ~rna1 anti-troponine I
cardiaque coLUplé à un marqtzeux~ en._.jrm~tr_que et avec un autre anticorps monoclonal ~.~rit_i l.rc.x~«r~ir~~_ I cardiaque, ces anticorps monoclonaux, ::soit :ua~~urellement, soit par effet de coopératiwi.té, ayant pou:r la t ro~onine 1 cardiaque une constante de dissociation a~ l'équi.~;_ii.,re égale ou inférieure à 10-8 M, de prêférenc;e égale ou infr~rieure à 10-~9 M, puis 1.0 que l'on effectue la révélation ena.ymatique par addition d' un substrat chz.m.i.lumircesceznt chc:>is i et ensuite que l' on procède â la lecture dirFact.e du sz.gnal lumineux obtenu.
Le procédé de l' irurention L~E:ut entre réalisé soit par un système manuel (ki.t de dosage de d:iagno~>tic) soit par un systëme automatisa. Selon .Le nuode de réalisation, il est possible d'effectuer soit. ~zn do..age en un temps, soit un dosage en deux temps.
La présente invention v:i.se aussi une utilisation du luminol comme substra.zt~ chïrtlilcnrnir.~escent pour le dosage 20 immunoenzymatique de t,rpF~ sanc:~w,_cr~ de la troponine I
cardiaque mettant, en c>euvre des_~x Ç~nticorps monoclonaux anti-troponine I ~;~~rdi_aquc~ dc_~,cnt. u~m couplé avec la peroxydase, -wesquels , nticvo:cl.~ :;o:it~ mt ur~el_Lement. soin par coopérativité, ont L..~our ~~.a tx:a.:>~>or~.s..cze I cardiaque une constante de diss~.~ci~zt iow ait 1 ' é ~uï_ LVL r~~ égale ol.z infér::ieure à 1C-~ M.
La p.nésez,Fte îr~rVerutz.or~ ~~-.à.~~e a~.assi une utilisation du lumigen PPD cc.~mme ~ubstr,ar c:r~:i ni.lun~inescent. pour le dosage immunoenz~y,nar_-wc~ue ~:~Fe tr~p~~ >a:2rïcïw:ich de la troponine I
30 cardiaque mettant, en «e~_'m~~~ ~am.~~~ <.tntic,orps monoclonaux anti-troponine I :-v~~-diaque dc.COt. ur. couplé avec la ~b phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativitë, ont pour la troponine I cardiaque une constante de di.ssmcâ.ation ~-i 1. ~ équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
La présente invente ion vi se a~uss i une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux asti-trop>on:i.ne I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, :soit par cc>c~pérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation â
l'équilibre égale au inférieure â 1!~-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivTé d' une di.acy i hydrazine ou du 1, 2-dioxetane.
De préférence, pour le dosage en un temps, les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec. un ani~icorps mc~mocl~ona:l_ anti-tr_oponïne I
cardiaque couplé à un marqueur en-~ymatique et avec un deuxième anticorps mc.~no~lc~nal anti--~=roponine I cardiaque éventuellement fixé sur urr suppc~zt:, scl.ide. Après :incubation et lavage, on procède G. ~.a r_évélat_ion enzymatique. Cette dernière est ef fectuée ~e lon ~ ' .iruvent.ion par addition d' un substrat chimiluminesc.~ent dêri~~-é d'tne diacylhydrazine ou du 1, 2-dioxet;ane. I~~~ ~ya~ntit:.~-~ ~i~~ l.a t roponine I cardiaque présente dans les éc~:~.ant.:.Llons 4~ doser ou 1 es standards, est évaluée par 1a le~,tt:m.~e ~_~.=ir-e:ect~ï du signal lumineux obtenu.
De préférence, pv.~u.z: ïe ~:iosa<~e en deux temps, on met en contact: 1_es êc:ha.nt:i.l L~:n~ï ;'=v d.>;~er. ou les standards,
a) des échantillons ou des standards sont mis en contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation IO à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, b) le mélange réactionnel est lavé, c) une révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle hydrazine ou du 1,2-dioxétane, d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
De préférence, la présente invention a plus précisément comme objet, un procédé de dosage immuno-enzymatique de type sandwich, de la troponine I cardiaque:
20 - qui met en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps ont, soit naturellement, soit par coopérativité une grande affinité pour la troponine I cardiaque, donc une constante de dissociation à
l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M; et - qui utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent qui est soit un dérivé d'une diacylhydrazine, soit un dérivé de 1,2-dioxetane.
30 De préférence, la présente invention concerne un procédé de dosage immunoenzymatique quantitatif de type 4a sandwich de la troponi.ne I ca:â~d:iac.[ue, <<aractérisé en ce que l'on met en contact ~es échantil:.ons à doser ou les standards avec: un arti~.Jorps monocl ~rna1 anti-troponine I
cardiaque coLUplé à un marqtzeux~ en._.jrm~tr_que et avec un autre anticorps monoclonal ~.~rit_i l.rc.x~«r~ir~~_ I cardiaque, ces anticorps monoclonaux, ::soit :ua~~urellement, soit par effet de coopératiwi.té, ayant pou:r la t ro~onine 1 cardiaque une constante de dissociation a~ l'équi.~;_ii.,re égale ou inférieure à 10-8 M, de prêférenc;e égale ou infr~rieure à 10-~9 M, puis 1.0 que l'on effectue la révélation ena.ymatique par addition d' un substrat chz.m.i.lumircesceznt chc:>is i et ensuite que l' on procède â la lecture dirFact.e du sz.gnal lumineux obtenu.
Le procédé de l' irurention L~E:ut entre réalisé soit par un système manuel (ki.t de dosage de d:iagno~>tic) soit par un systëme automatisa. Selon .Le nuode de réalisation, il est possible d'effectuer soit. ~zn do..age en un temps, soit un dosage en deux temps.
La présente invention v:i.se aussi une utilisation du luminol comme substra.zt~ chïrtlilcnrnir.~escent pour le dosage 20 immunoenzymatique de t,rpF~ sanc:~w,_cr~ de la troponine I
cardiaque mettant, en c>euvre des_~x Ç~nticorps monoclonaux anti-troponine I ~;~~rdi_aquc~ dc_~,cnt. u~m couplé avec la peroxydase, -wesquels , nticvo:cl.~ :;o:it~ mt ur~el_Lement. soin par coopérativité, ont L..~our ~~.a tx:a.:>~>or~.s..cze I cardiaque une constante de diss~.~ci~zt iow ait 1 ' é ~uï_ LVL r~~ égale ol.z infér::ieure à 1C-~ M.
La p.nésez,Fte îr~rVerutz.or~ ~~-.à.~~e a~.assi une utilisation du lumigen PPD cc.~mme ~ubstr,ar c:r~:i ni.lun~inescent. pour le dosage immunoenz~y,nar_-wc~ue ~:~Fe tr~p~~ >a:2rïcïw:ich de la troponine I
30 cardiaque mettant, en «e~_'m~~~ ~am.~~~ <.tntic,orps monoclonaux anti-troponine I :-v~~-diaque dc.COt. ur. couplé avec la ~b phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativitë, ont pour la troponine I cardiaque une constante de di.ssmcâ.ation ~-i 1. ~ équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
La présente invente ion vi se a~uss i une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux asti-trop>on:i.ne I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, :soit par cc>c~pérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation â
l'équilibre égale au inférieure â 1!~-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivTé d' une di.acy i hydrazine ou du 1, 2-dioxetane.
De préférence, pour le dosage en un temps, les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec. un ani~icorps mc~mocl~ona:l_ anti-tr_oponïne I
cardiaque couplé à un marqueur en-~ymatique et avec un deuxième anticorps mc.~no~lc~nal anti--~=roponine I cardiaque éventuellement fixé sur urr suppc~zt:, scl.ide. Après :incubation et lavage, on procède G. ~.a r_évélat_ion enzymatique. Cette dernière est ef fectuée ~e lon ~ ' .iruvent.ion par addition d' un substrat chimiluminesc.~ent dêri~~-é d'tne diacylhydrazine ou du 1, 2-dioxet;ane. I~~~ ~ya~ntit:.~-~ ~i~~ l.a t roponine I cardiaque présente dans les éc~:~.ant.:.Llons 4~ doser ou 1 es standards, est évaluée par 1a le~,tt:m.~e ~_~.=ir-e:ect~ï du signal lumineux obtenu.
De préférence, pv.~u.z: ïe ~:iosa<~e en deux temps, on met en contact: 1_es êc:ha.nt:i.l L~:n~ï ;'=v d.>;~er. ou les standards,
5 _ 5 _ PCT/FR96100095 - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé
à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide et ensuite on incube de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un éventuel lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à
' un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau.
Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage, i o puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ôu du 1,2-dioxetane. La quantité de ta troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau.
Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut 2o utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la troponine I
cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou inférieure à
10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser tout couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la troponine I
cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre s 10-8 M) lorsque la troponine I
cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps.
De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux anti troponïne I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux 11 E12 et 8E1 de 3o souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de manière surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal 11 E12 bloque la libération de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en évidence en utilisant le système BIACORET" de PHARMACIA, et en mesurant les constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I
cardiaque (cTnl) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de l'anticorps 11E12.
Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I.
FEU~LI.E DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide et ensuite on incube de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé sur un support solide, puis après incubation et un éventuel lavage, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à
' un marqueur enzymatique et ensuite on incube à nouveau.
Dans les deux cas, on procède ensuite éventuellement à un lavage, i o puis à la révélation enzymatique qui est effectuée selon l'invention, par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ôu du 1,2-dioxetane. La quantité de ta troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou les standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
Pour le dosage en deux temps, de manière préférentielle, les échantillons à doser et les standards sont mis en contact d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé sur un support solide et ensuite incubés de nouveau.
Comme anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque, on peut 2o utiliser tout anticorps monoclonal ayant une grande affinité pour la troponine I
cardiaque et dont la constante de dissociation à l'équilibre est égale ou inférieure à
10-8 M, de préférence égale ou inférieure à 10-9 M. On peut aussi utiliser tout couple d'anticorps monoclonaux ayant une liaison coopérative vis à vis de la troponine I cardiaque, cette coopérativité produisant comme résultat une augmentation de l'affinité de l'un des deux anticorps monoclonaux pour la troponine I
cardiaque (constante de dissociation à l'équilibre s 10-8 M) lorsque la troponine I
cardiaque est déjà liée avec le deuxième anticorps.
De manière préférentielle, comme anticorps monoclonaux anti troponïne I cardiaque, on peut utiliser les anticorps monoclonaux 11 E12 et 8E1 de 3o souris décrits dans Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979. En effet, de manière surprenante il a été constaté que l'anticorps monoclonal 11 E12 bloque la libération de la troponine I cardiaque liée à l'anticorps 8E1. Ce phénomène a été mis en évidence en utilisant le système BIACORET" de PHARMACIA, et en mesurant les constantes cinétiques d'association et de dissociation de la troponine I
cardiaque (cTnl) sur l'anticorps monoclonal 8E1, en présence ou en l'absence de l'anticorps 11E12.
Les différents résultats sont donnés dans le Tableau I.
FEU~LI.E DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
-6-TABLEAU I
AcM 8E1 : cTnl AcM 8E1 : cTnl+11E12 seule CONSTANTE CINETIQUE DE DISSOCIATION3,2.10-3 2,8.10-4 Koff(SW ) CONSTANTE CINETfQUE D'ASSOCIATION5,8.105 4,5.1 OS
Kon (M-1 x S-1 ) ' CONSTANTE DE DISSOCL4TION A 5,7.10-9 0,6.10-9 L'EQUILIBRE
Koff/ Kon (M) s Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1, l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence de l'anticorps monoclonal 11 E12. Plus précisément, la constante de dissociation à
l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne varie pas). II
existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux anti-io troponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de "blocage" de la dissociation du complexe il est possible de réaliser le procédé de dosage immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps monoclonaux.
15 Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la phosphatase alcaline soit la peroxydase.
On utilise la phosphatase alcaline lorsque le substrat chimiluminescent est un dérivé de 1,2-dioxetane et la peroxydase lorsque le 2o substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine.
On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou 11 E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal 11 E12 avec la peroxydase et des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline.
25 - Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support , solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-troponine I
cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques (notamment ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque (dosage automatisé).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) .7 Les conjugués anticorps monoclon~~l anti-troponine I - marqueur enzymatique sont préparés se~on les méthodes cornues [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p 1084-1091].
La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée selon des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunofogical Methods, (1979), ,~1, p.
231-23fiJ .
Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des standards avec un anticorps monoclonal antï-troponine I cardiaque et/ou un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, z o le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le pH doit notamment être compris entre 5 et 6, plus prëcisément entre 5,4 et 5,7. Pour ajuster le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide succinique ayant un pH de 5,2 à 5,4.
L'incubation entre le plasma ou 1e serum et les anticorps anti-troponine I ou les standards, est effectuée entre 20'C et 3TC et le temps d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes.
Après incubation, on procède à un ou plusieurs lavages qui sont effectués à une température de 2' à 3TC, de préférence à une température inférieure à 10'C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentielle une solution de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tampon tris pH 8.
De ~~7_ms, de p-~~~êf ë:.re-nce , 1 ~:. s solut ions de lavage utilisées avant révé=!_~~tiori peuvcent avoir ~.~n pH égal â 6,8-8 et une températ:mre c:~e '~'" <-x 3'ï°C', <1e préférence à une température s_nférieure â 1ta°c~.
Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat luminescent on utilise soit un dérivé de diacyihydrazine, plus spécialement le luminol [5-amino-2,3-dihydrophtalazine--1,4-dioneJ, soifi un dérivé de 1,2-dioxetane, plus spécialement le lumigen PPD [sel disodique de 4-methoxy 4-(3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3-adamantane-2')J. Des sub:~trats luminescents contenant du ' o luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le luminol ECL-immunoessai signal reagent HP~J 190*commercialisé par Amersharn ou le luminol BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950*commercialisé par Boehringer * (marques de cornme:rc~E
'i a Mannheim. On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de iodophénol. Des substrats luminescents contenant du lumigen PPD sont aussi disponibles dans le commerce comme, par exemple, le Lurni-Phos 53U*
commercialisé par Analytical Luminescence i_aboratory. Ce réactif contient du lumigen PPD et un promoteur de la chimiluminescence qui est un tensioactif déri~ré
de la fluorescéine.
* (marque de cc~mmert=c La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température comprise entre 20'C et 3TC. La lecture de la chimiluminescence est effectuée de préférence après environ 2-10 minutes.
Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque humaine purifiée (Larve C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979).
L'invention concerne aussi l'utilisation du luminol et du lumigen PPD
comme substrats chimiluminescents pour le dosage immunoenrymatique de type io sandwich de la troponine I cardiaque mettant en. oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un coûplé avec un marqueur enzymatique, en particulier la peroxydase, si le substrat est le luminol, et la phosphatase alcaline, si le substrat est le lumigen PPD, lesquels anticorps (soit naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
L'invention a également pour objet une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenanf deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante 2o de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol ou un dérivé, de 1,2-dioxetane, de préférence le lumigen PPD.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent 2s l'invention.
EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access~ immuoessai, système commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur.
Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du dosage sont introduits 50 NI de l'échantillon à doser, 25 girl d'une solution ' d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 ~I d'une solution d'acide succinique 0,1 M, 50 girl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris ' 8E1-phosphatase alcaline (C = 5 ~Cg/ml).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Après incubation pendant 5 minutes à 37'C sont introduits 50 NI de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI---070!60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12.
Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 3TC, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon iris pH 8 on ajaute ensuite 200 ~I de substrat Lumi-Phos'" 530.
1 o La révélation est effectuée à 3TC et on mesure la iumïnescence générée par la réaction avec un luminomètre.
Le temps total d'analyse est de 15 minutes.
Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine purifiée.
On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 ~g/I.
La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est de 3,5 ng/I.
EXEMPLE II
Dosage de la trooonine I cardiaque avec un kit immunoenzymatlaue Dans des tubes en polystyrène revétus d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, vn introduit 150 ul d'une solution tampon succincte contenant du Tween*20 â 0,2 %, des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon* 50 ~f du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12-peroxydase. et 200 NI d'échantillon â
doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.
Pour la gamme ëtalonnage on utilise du sérum humain contenant de 3 0 0 â 2 ~g/I de troponine i cardiaque r7umaine purifiée.
* (marques de r_~omrnerrc,E-) ~0 On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à
température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante - on renverse le contenu des tubes dans un récipïent et on éponge les tubes sur un papier absorbant, - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 P~", pH 6,8 contenant du Tween~20 à 0,1 '~'o et 0,3 % de Kathon* en maintenant la température au plus à 8'C. On répète cette étape 3 fois.
Après avoir procédé au lavage et élim'né toute trace de 1a soluticn utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 1 o d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent ELISA
reagent~oehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée.
On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30 secondes ou exactement 10 secondes.
La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/I.
Les valeurs des rapports signal net/bruit de la mesure (S-B)/B
obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/f p. 972-979]
sont données dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU Il Concentration en Procédé décrit par Procedé de I"exemple ~ponine I cardiaque _ _ Larue et al 5..~_ __..; ~QO - ~5;~5 _ __e S ~ 150 - 50 100 ngh _~_ - _ _.____~~-.. - i i ,g B - _ SO - 2,0 ng/I s~ _ ~5 ~5 95 ~ 1.~x SB = 0 ~S = B) Les valeurs des rapports signa.l/bruit de la mesure obtenue en appliquant le procédé de l'invention prouvent .sa grande sensibilité et sa spécificité
* (marqu.es de cornmerrE~;
AcM 8E1 : cTnl AcM 8E1 : cTnl+11E12 seule CONSTANTE CINETIQUE DE DISSOCIATION3,2.10-3 2,8.10-4 Koff(SW ) CONSTANTE CINETfQUE D'ASSOCIATION5,8.105 4,5.1 OS
Kon (M-1 x S-1 ) ' CONSTANTE DE DISSOCL4TION A 5,7.10-9 0,6.10-9 L'EQUILIBRE
Koff/ Kon (M) s Les résultats du Tableau I démontrent que pour l'anticorps 8E1, l'affinité est 10 fois plus élevée si la troponine I cardiaque est en présence de l'anticorps monoclonal 11 E12. Plus précisément, la constante de dissociation à
l'équilibre est 10 fois plus faible (la constante cinétique d'association ne varie pas). II
existe donc une coopérativité de la liaison des deux anticorps monoclonaux anti-io troponine I vis à vis de la troponine I cardiaque. Grâce à cette effet de "blocage" de la dissociation du complexe il est possible de réaliser le procédé de dosage immunoenzymatique, objet de la présente invention, avec ce couple d'anticorps monoclonaux.
15 Pour la formation du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque-marqueur enzymatique on utilise comme marqueur enzymatique soit la phosphatase alcaline soit la peroxydase.
On utilise la phosphatase alcaline lorsque le substrat chimiluminescent est un dérivé de 1,2-dioxetane et la peroxydase lorsque le 2o substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine.
On peut utiliser notamment les anticorps monoclonaux 8E1 ou 11 E12 pour préparer les conjugués avec un marqueur enzymatique. De préférence on prépare des conjugués de l'anticorps monoclonal 11 E12 avec la peroxydase et des conjugués de l'anticorps monoclonal 8E1 avec la phosphatase alcaline.
25 - Selon le mode de réalisation, on peut envisager somme support , solide soit des tubes en polystyrène sur lesquels est fixé l'anticorps anti-troponine I
cardiaque (cas du kit de diagnostic), soit des particules magnétiques (notamment ferriques) ou non sur lesquelles est fixé l'anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque (dosage automatisé).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) .7 Les conjugués anticorps monoclon~~l anti-troponine I - marqueur enzymatique sont préparés se~on les méthodes cornues [J. Histochem Cytochem (1974), 22, p 1084-1091].
La préparation des anticorps monoclonaux anti-troponine I fixés par exemple par des liaisons covalentes sur une phase solide, est aussi réalisée selon des méthodes décrites dans la littérature [J. Immunofogical Methods, (1979), ,~1, p.
231-23fiJ .
Lors de la mise en contact des échantillons à doser ou des standards avec un anticorps monoclonal antï-troponine I cardiaque et/ou un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, z o le pH du milieu réactionnel doit être de préférence légèrement acide. Le pH doit notamment être compris entre 5 et 6, plus prëcisément entre 5,4 et 5,7. Pour ajuster le pH on peut utiliser différents tampons adéquats ou des solutions d'acides organiques faibles, par exemple des solutions ou des tampons d'acide succinique ayant un pH de 5,2 à 5,4.
L'incubation entre le plasma ou 1e serum et les anticorps anti-troponine I ou les standards, est effectuée entre 20'C et 3TC et le temps d'incubation peut varier entre 5 et 20 minutes.
Après incubation, on procède à un ou plusieurs lavages qui sont effectués à une température de 2' à 3TC, de préférence à une température inférieure à 10'C. Pour les lavages, on utilise de manière préférentielle une solution de tampon phosphate pH 6,8 ou une solution tampon tris pH 8.
De ~~7_ms, de p-~~~êf ë:.re-nce , 1 ~:. s solut ions de lavage utilisées avant révé=!_~~tiori peuvcent avoir ~.~n pH égal â 6,8-8 et une températ:mre c:~e '~'" <-x 3'ï°C', <1e préférence à une température s_nférieure â 1ta°c~.
Comme il a été indiqué précédemment, comme substrat luminescent on utilise soit un dérivé de diacyihydrazine, plus spécialement le luminol [5-amino-2,3-dihydrophtalazine--1,4-dioneJ, soifi un dérivé de 1,2-dioxetane, plus spécialement le lumigen PPD [sel disodique de 4-methoxy 4-(3-phosphatephenyl) spiro (1,2-dioxetane 3-adamantane-2')J. Des sub:~trats luminescents contenant du ' o luminol sont disponibles dans le commerce comme par exemple le luminol ECL-immunoessai signal reagent HP~J 190*commercialisé par Amersharn ou le luminol BM Chimiluminescence ELISA reagent 1582950*commercialisé par Boehringer * (marques de cornme:rc~E
'i a Mannheim. On préfère des substrats qui contiennent un mélange de luminol et de iodophénol. Des substrats luminescents contenant du lumigen PPD sont aussi disponibles dans le commerce comme, par exemple, le Lurni-Phos 53U*
commercialisé par Analytical Luminescence i_aboratory. Ce réactif contient du lumigen PPD et un promoteur de la chimiluminescence qui est un tensioactif déri~ré
de la fluorescéine.
* (marque de cc~mmert=c La révélation enzymatique est aussi effectuée à une température comprise entre 20'C et 3TC. La lecture de la chimiluminescence est effectuée de préférence après environ 2-10 minutes.
Pour réaliser la gamme d'étalonnage d'un dosage quantitatif on utilise des solutions standards (standards) de la troponine I cardiaque humaine purifiée (Larve C. et al, Clin. Chem. (1993), 39, p. 972-979).
L'invention concerne aussi l'utilisation du luminol et du lumigen PPD
comme substrats chimiluminescents pour le dosage immunoenrymatique de type io sandwich de la troponine I cardiaque mettant en. oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un coûplé avec un marqueur enzymatique, en particulier la peroxydase, si le substrat est le luminol, et la phosphatase alcaline, si le substrat est le lumigen PPD, lesquels anticorps (soit naturellement, soit par coopérativité) ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M.
L'invention a également pour objet une trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenanf deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante 2o de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine, de préférence le luminol ou un dérivé, de 1,2-dioxetane, de préférence le lumigen PPD.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, illustrent 2s l'invention.
EXEMPLE I
Dosage de la troponine I cardiaque avec un système automatisé
Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système Access~ immuoessai, système commercialisé par Sanofi Diagnostics Pasteur.
Le dosage est effectué de la manière suivante : Dans la cupule du dosage sont introduits 50 NI de l'échantillon à doser, 25 girl d'une solution ' d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10 ~I d'une solution d'acide succinique 0,1 M, 50 girl du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris ' 8E1-phosphatase alcaline (C = 5 ~Cg/ml).
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) Après incubation pendant 5 minutes à 37'C sont introduits 50 NI de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI---070!60) sur lesquelles sont fixés par des liaisons covalentes des anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12.
Le mélange est incubé pendant 36 secondes à 3TC, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon iris pH 8 on ajaute ensuite 200 ~I de substrat Lumi-Phos'" 530.
1 o La révélation est effectuée à 3TC et on mesure la iumïnescence générée par la réaction avec un luminomètre.
Le temps total d'analyse est de 15 minutes.
Pour la gamme d'étalonnage on utilise des solutions de la troponine I cardiaque humaine purifiée.
On effectue une gamme d'étalonnage correspondant à des concentrations comprises entre 0 et 50 ~g/I.
La sensibilité du procédé, évaluée par la courbe d'étalonnage, est de 3,5 ng/I.
EXEMPLE II
Dosage de la trooonine I cardiaque avec un kit immunoenzymatlaue Dans des tubes en polystyrène revétus d'anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque de la souris 8E1, vn introduit 150 ul d'une solution tampon succincte contenant du Tween*20 â 0,2 %, des immunoglobulines de souris non spécifiques et 0,1 % de Kathon* 50 ~f du conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque de souris 11 E12-peroxydase. et 200 NI d'échantillon â
doser ou d'une solution étalon utilisée pour la gamme d'étalonnage.
Pour la gamme ëtalonnage on utilise du sérum humain contenant de 3 0 0 â 2 ~g/I de troponine i cardiaque r7umaine purifiée.
* (marques de r_~omrnerrc,E-) ~0 On incube 15 minutes précisément sous agitation horizontale à
température ambiante, puis on procède au lavage des tubes de la façon suivante - on renverse le contenu des tubes dans un récipïent et on éponge les tubes sur un papier absorbant, - on procède au lavage en ajoutant 1 ml de tampon phosphate 0,1 P~", pH 6,8 contenant du Tween~20 à 0,1 '~'o et 0,3 % de Kathon* en maintenant la température au plus à 8'C. On répète cette étape 3 fois.
Après avoir procédé au lavage et élim'né toute trace de 1a soluticn utilisée pour ce dernier, la révélation enzymatique est effectuée en utilisant 1 o d'un mélange constitué de 100 parties de luminol (BM chimiluminescent ELISA
reagent~oehringer Mannheim) et 1 partie d'eau oxygénée.
On laisse à température ambiante et on mesure la luminescence avec un luminomètre après 3 minutes. Chaque tube est lu pendant exactement 30 secondes ou exactement 10 secondes.
La sensibilité de ce dosage est de 3 ng/I.
Les valeurs des rapports signal net/bruit de la mesure (S-B)/B
obtenues selon le procédé décrit ci-dessus et selon le procédé décrit par Larue C. et al [Mol. Immunol. (1992), 29(2), p. 271-278 ; Clin Chem. (1993), 39/f p. 972-979]
sont données dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU Il Concentration en Procédé décrit par Procedé de I"exemple ~ponine I cardiaque _ _ Larue et al 5..~_ __..; ~QO - ~5;~5 _ __e S ~ 150 - 50 100 ngh _~_ - _ _.____~~-.. - i i ,g B - _ SO - 2,0 ng/I s~ _ ~5 ~5 95 ~ 1.~x SB = 0 ~S = B) Les valeurs des rapports signa.l/bruit de la mesure obtenue en appliquant le procédé de l'invention prouvent .sa grande sensibilité et sa spécificité
* (marqu.es de cornmerrE~;
Claims (17)
1. Procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) des échantillons ou des standards sont mis en contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, b) le mélange réactionnel est lavé, c) une révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle hydrazine ou du 1,2-dioxétane, d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
a) des échantillons ou des standards sont mis en contact avec deux anticorps monoclonaux anti-troponine I
cardiaque pour former un mélange réactionnel, un des anticorps est couplé avec un marqueur enzymatique, lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10-8 M, b) le mélange réactionnel est lavé, c) une révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé du diacyle hydrazine ou du 1,2-dioxétane, d) la quantité de troponine I cardiaque est évaluée par une lecture directe d'un signal lumineux obtenu.
2. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes:
a) les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé éventuellement à un support solide, b) le mélange réactionnel est incubé, c) puis lavé, d) la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé du 1,2-dioxetane, e) la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou des standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
a) les échantillons à doser ou les standards sont mis en contact simultanément avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé éventuellement à un support solide, b) le mélange réactionnel est incubé, c) puis lavé, d) la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent, dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé du 1,2-dioxetane, e) la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou des standards, est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
3. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes:
a) les échantillons à doser ou des standards sont mis en contact, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé
sur un support solide, et incubés de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé sur un support solide puis après incubation et lavage éventuel, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et incubés à nouveau, b) le mélange réactionnel est ensuite lavé, c) la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé de 1,2-dioxetane, d) la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou dans les standards est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
a) les échantillons à doser ou des standards sont mis en contact, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque couplé à un marqueur enzymatique, puis après incubation, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque éventuellement fixé
sur un support solide, et incubés de nouveau, - soit, d'abord avec un anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque fixé sur un support solide puis après incubation et lavage éventuel, avec un deuxième anticorps monoclonal anti-troponine I
cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et incubés à nouveau, b) le mélange réactionnel est ensuite lavé, c) la révélation enzymatique est effectuée par addition d'un substrat chimiluminescent dérivé d'une diacylhydrazine ou dérivé de 1,2-dioxetane, d) la quantité de la troponine I cardiaque présente dans les échantillons à doser ou dans les standards est évaluée par la lecture directe du signal lumineux obtenu.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le substrat chimiluminescent est le luminol.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le substrat chimiluminescent est le lumigen PPD.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les anticorps monoclonaux anti-troponine I, sont des anticorps monoclonaux de souris 11 E12 et 8E1.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le marqueur enzymatique couplé à l'anticorps monoclonal anti-troponine I, est la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique est un conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque-peroxydase ledit anticorps étant un anticorps monoclonal de souris 11 E12, et le substrat chimiluminescent est un dérivé d'une diacylhydrazine.
9. Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce que l'anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique est un conjugué anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque- phosphatase alcaline, ledit anticorps étant un anticorps de souris 8E1, et le substrat chimiluminescent est un dérivé du 1,2-dioxetane.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que 1e substrat chimiluminescent est un mélange de luminol et de 4-iodophénol.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la mise en contact des échantillons à doser ou des standards, avec un anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque couplé à un marqueur enzymatique et éventuellement à un deuxième anticorps anti-troponine I, est effectuée à un pH légèrement acide compris entre 5 et 6.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit pH
légèrement acide est compris entre 5,4 et 5,7.
légèrement acide est compris entre 5,4 et 5,7.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que l'étape où le mélange réactionnel est lavé avant l'étape de la révélation utilise des solutions de pH égal à 6,8 ou 8 et une température comprise entre 2° et 37°C.
3, caractérisé en ce que l'étape où le mélange réactionnel est lavé avant l'étape de la révélation utilise des solutions de pH égal à 6,8 ou 8 et une température comprise entre 2° et 37°C.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite température est inférieure à 10°C.
15. Utilisation du luminol comme substrat chimiluminescent pour le dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé
avec la peroxydase, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativité, ont pour fa troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10 -8 M.
avec la peroxydase, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativité, ont pour fa troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10 -8 M.
16. Utilisation du lumigen PPD comme substrat chimiluminescent pour le dosage immunoenzymatique de type sandwich de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un couplé avec la phosphatase alcaline, lesquels anticorps soit naturellement soit par coopérativité, ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à l'équilibre égale ou inférieure à 10 -8 M.
17. Trousse de dosage de la troponine I cardiaque comprenant deux anticorps monoclonaux anti-troponine I cardiaque dont un est couplé avec un marqueur enzymatique lesquels anticorps, soit naturellement, soit par coopérativité ont pour la troponine I cardiaque une constante de dissociation à
l'équilibre égale ou inférieure à 10 -9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé
d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane.
l'équilibre égale ou inférieure à 10 -9 M, et un substrat chimiluminescent dérivé
d'une diacylhydrazine ou du 1,2-dioxetane.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR95/00597 | 1995-01-19 | ||
| FR9500597A FR2729759A1 (fr) | 1995-01-19 | 1995-01-19 | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque |
| PCT/FR1996/000095 WO1996022535A1 (fr) | 1995-01-19 | 1996-01-19 | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2210166A1 CA2210166A1 (fr) | 1996-07-25 |
| CA2210166C true CA2210166C (fr) | 2006-04-11 |
Family
ID=36178133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002210166A Expired - Lifetime CA2210166C (fr) | 1995-01-19 | 1996-01-19 | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CA (1) | CA2210166C (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111175497A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-05-19 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种磁微粒化学发光法地高辛测定试剂盒及其使用方法 |
-
1996
- 1996-01-19 CA CA002210166A patent/CA2210166C/fr not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2210166A1 (fr) | 1996-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0804736B1 (fr) | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque | |
| FR2664699A1 (fr) | Procede d'amplification du signal d'emission d'un compose luminescent. | |
| WO1980002460A1 (fr) | Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques | |
| CH645725A5 (fr) | Procede pour la determination homogene d'une substance biologique. | |
| FR2490826A1 (fr) | Procede pour la mesure de la thyroxine libre ou de la 3,5,3'-triiodothyronine libre dans un echantillon liquide | |
| EP0539435B1 (fr) | Procede de reduction d'interferences dans un dosage par fluorescence | |
| FR2621128A1 (fr) | Trousse et methode de dosage immunometrique applicables a des cellules entieres | |
| EP0055751B1 (fr) | Procede de detection et de dosage d'une substance biologique par erythroadsorption | |
| JPH10511776A (ja) | レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット | |
| FR2700855A1 (fr) | Dosage immunométrique d'un antigène ou d'un haptène. | |
| Thiele et al. | Formation and immunological properties of aldehyde-derived protein adducts following alcohol consumption | |
| EP0132170B1 (fr) | Procédé de détection d'un oligomère dans un milieu liquide contenant des monomères correspondants, dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé, et application notamment à la recherche d'allergènes | |
| CA2210166C (fr) | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque | |
| FR2637897A1 (fr) | Dosages immunologiques de l'azt, derives et conjugues et anticorps | |
| EP0667897B1 (fr) | Methode d'immunodosage specifique de la glutathion peroxydase plasmatique humaine | |
| US20030045004A1 (en) | Prevention and treatment of atherosclerosis by reducing carbamylation of LDL or the effects of carbamylated LDL | |
| FR2774473A1 (fr) | Procede de dosage des troponines dans des milieux biologiques permettant d'eviter les interferences dues a l'heparine | |
| EP0495971B1 (fr) | Determination des thrombopenies | |
| FR2577048A1 (fr) | Reactif pour le dosage par hemagglutination des anticorps contre les toxines bacteriennes, procede de preparation et son application | |
| JPH0737986B2 (ja) | 免疫的検出方法 | |
| FR2502786A1 (fr) | Procede de fixation d'antigenes et d'anticorps sur support de polysaccharides, et utilisation du produit ainsi obtenu pour les dosages immunologiques | |
| FR2608767A1 (fr) | Procede pour la detection et le dosage des anticorps anti-(sporozoaires de p. falciparum) dans le sang humain et trousses de diagnostic pour mettre en oeuvre ce procede | |
| EP0192565B1 (fr) | Procédé de dosage immunologique des amines, anticorps monoclonaux et ensemble de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé | |
| FR2729761A1 (fr) | Procede de dosage ultrasensible de la troponine i cardiaque | |
| FR2902884A1 (fr) | Procede pour la detection des anticorps heparine-dependants et le diagnostic des pathologies immunes ou auto-immnues potentialisees par l'heparine telle que la thrombopenie induite par l'heparine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| MKEX | Expiry |
Effective date: 20160119 |