CA2087536A1 - Compositions a base de principes actifs de medicaments hydrophobes solubilisables dans un solvant aqueux - Google Patents
Compositions a base de principes actifs de medicaments hydrophobes solubilisables dans un solvant aqueuxInfo
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Abstract
2087536 9201475 PCTABS00110 L'invention concerne toute composition caractérisée en ce qu'elle comprend: d'une part, un principe actif de médicament ou substance pharmacologiquement active, insoluble dans l'eau, cette substance étant substituée par au moins un groupement lipophile, et d'autre part, un dérivé osidique dont l'une au moins des fonctions hydroxyles est substituée par un ou plusieurs groupe(s) phosphate ou sulfate, ce composé étant également substitué par un groupement lipophile, cette composition étant susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène dans un solvant aqueux. L'invention concerne également l'utilisation de telles compositions, notamment en tant que compositions pharmaceutiques en solution dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable.
Description
W O 92/0147~ PC~r/FR91/00595 ~7~3~
COMPOSITIONS A BASE DE PRINCIPES ACTIFS DE MEDICAMENTS ' -HYDROPHOBES SOLUBILISABLES DANS UN SOLVANr AQUEUX
L'invention concerne des compositions comprenant des principes actifs de médicaments hydrophobes, néanmoins solubilisables dans un solvant aqueux.
L'invention concerne egalement un procedé
d'obtention de telles compositions, et leurs utilisations notamment en tant que compositions pharmaceutiques.
De nombreux produits utilises dans le domaine pharmaceutique, ou susceptibles de l'être, ne peuvent être solubilisés dans un solvant aqueux.
Cette insolubilité dans un solvant aqueux est particulièrement desavantageuse pour des produits -destines a être administres dans une solution physiologique agueuse du type de celles habituellement utilisees pour les préparations injectables. Elle l'est aussi pour les produits destinés a être administrés par voie orale et gui présentent une efficacite et une biodisponibilité réduite.
Parmi ces produits pharmacologiquement actifs et insolubles dans un solvant aqueux, on peut citer notamment, les derives lipophiles de mura~yl-peptides, tels que ceux decrits dans le brevet européen n- 0 165 123 du 10/05/1985, ou encore dans le brevet europeen 4512 du 20/03/1979.
De fait, ces produits sont des immunomodulateurs capables d'augmenter la reponse immune specifique (adjuvant de vaccin), ou de renforcer la resistance non-specifique (agent anti-infectieux).
: ,. . ~ :~ , , De nature très hydrophobe, ils donnent des suspensions aqueuses difficiles à disperser de façon totalement satisfaisante (notamment en regard du niveau de dispersion compatible avec la possibilite de les injecter à un patient)l en utilisant les divers moyens de mise en solution ou de dispersion aqueuse, bases sur des techniques connues, notamment des traitements mecaniques, ou encore l'utilisation de solvants organiques ou de surfactants.
La presente invention a precisément pour but de fournir des moyens permettant la solubilisation ou la dispersion homogene dans un solvant aqueux de produits hydrophobes, tels que les muramyl-peptides lipophiles, ou d'autres principes actifs de medicaments lipophiles, porteurs de chaînes hydrocarbonées.
Celles-ci contribuent parfois elles-mêmes à la faible solubilite, de ces produits dans l'eau, voire à
l'instabilite de leurs dispersions aqueuses.
L'invention concerne d'une maniere generale une composition susceptible d'être solubilisee ou dispersée de facon homogene et stable dans une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable, caractérisée par l'association :
- d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarbone comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérive osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarbone comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au ~oins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce derive osidique etant en une proportion suffisante par rapport au principe actif lipophile pour ,, . .-' . ~.: ,' . ' '.: '~ '' ' '',.' ' -~087~3~
promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
La mise en solution ou en dispersion des deux constituants sus-définis de la composition fait apparemment intervenir la constitution de liaisons de type Van der Walls entre leurs chaînes hydrocarbonées respectives. Souvent les liaisons de Van der Walls seront d'autant plus efficaces qu'elles seront nombreuses et donc, que les chaînes hydrocarbonées seront plus longues. Il va de soi que ces longueurs de chaînes ne doivent pas, surtout en ce qui concerne le derivé osidique hydrosoluble, exceder celles qui auraient pour effet de trop accroître sa lipophilie.
Il est entendu que, dans ce qui précède et ce qui suit, "lipophile" doit être entendu comme signifiant que la substance concernee présente dans un système bi-phasique (solution aqueuse - solution organique) un coefficient de partage favorable à la phase organique , en d'autres termes la substance lipophile est plus soluble dans la solution organique que dans la solution aqueuse. La substance lipophile peut même être pratiquement insoluble dans l'eau.
A l'inverse, et dans la présente description, l'adjectif "hydrosoluble" a la signification inverse.
Le coefficient de partage de la substance hydrosoluble dans le susdit systeme bi-phasique est en faveur de la phase aqueuse.
On peut faire l'hypothese que le pouvoir solubilisateur du dérive osidique est attribuable aux présences simultanees dans la structure de ce derive osidique dudit (ou desdits) groupement(s) hypocarbone(s) et du (ou des) groupe(s) sulfate ou phosphate. Les groupements hydrocarbonés permettent l'établissement de liaisons du type Van der Waals avec ' ' " :
WO~2/01475 pCT/FR91/00595 la (les~ chaine(s) hydrocarbonée(s) du principe actif et le (ou les) groupe(s) sulfate ou phosphate permet(tent) la solubilisation du complexe non covalent ainsi forme.
Le cas echeant, les longueurs des chaînes hydrocarbonées respectivement portées par la substance active lipophile d'une part, le dérivé solubilisateur hydrosoluble , d'autre part, sont choisies de façon a favoriser l'établissement des susdites liaisons de type Van der Waals.
La substance pharmacologiquement active peut être constituée par toute substance répondant aux critères indiqués plus haut. D'une façon génerale, on remarque que la lipophilie de la substance pharmacologiquement active peut résulter soit de la longueur des chaînes hydrocarbonées qu'elle porte, soit - et en particulier lorsque ces chaines hydrocarbonées sont courtes - du nombre de ces chaines, soit encore, bien entendu, de la conjugaison des longueurs et du nombre de ces chaines hydrocarbonées.
On l'a déja vu, la substance active peut être constituée par tout dérivé de muramyl-peptide comportant une chaîne hydrocarbonee tendant a reduire l'hydrosolubilite du muramyl-peptide correspondant, dès lors qu'il serait dépourvu de ladite chaîne hydrocarbonée. Une catégorie préféree de tels muramyl-peptides dits "lipophiles" est encore illustrée ci-apres.
Une autre catégorie de composés préferes est constituée par des dérives ou analogues saccharidiques, notamment mono- ou di-saccharidiques du lipide A. Certains exemples préferes de ces analogues sont évoques plus loin.
. . ., ., .. . : ~ . . : , .... . .: ~ . . .
2087~3~
D'autres substances pharmaceutiques peuvent également être solubilisees en mettant en oeuvre les techni~ues de l'invention. ~ -Parmi celles-ci, il faut citer en particulier les peptides cycliques de la famille de la cyclosporine, par exemple la cyclosporine A (J.F. Borel et al, Agents Actions - 6 (1976) l + 68; is, Immumnology 32 (1977) 1017 ; P.J. Tudchka et al., Blood 61 (1983) 318) mais aussi les pseudopeptides cycliques, par exemple la valinomycine ou des macrolides polyéniques, par exemple la lucensomycine, et les vitamines liposolubles, notamment vitamines A, D, E, K, D'une façon genérale toute substance pharmacologiquement active du type polyenique, mono ou poly-saccharidique, polypeptidique, à caractere cyclique ou non, ou encore glycopeptidique, qui porte --au moins une chaine hydrocarbonee telle qu'elle a eté
definie plus haut, peut être former le constitutant lipophile des compositions selon l'invention.
L'invention s'appligue en particulier a la solubilisation de substances pharmacologiquement actives, dont le caractere de solubilité s'avérerait insuffisant pour une application médicale, quelle que soit la voie d'administration envisagée, des lors qu'elle comporte une chaîne hydrocarbonée qui peut s'associer, par l'intermediaire de liaisons de type Van de Waals, avec une chaîne hydrocarbonee correspondante portée par un derivé osidique, tel qu'il a eté defini plus haut.
Quant au derive osidique hydrosoluble, il convient de noter que l'expression "osidique" telle qu'utilisee ci-dessus, et dans ce qui suit, se rapporte de faqon generale a tout produit comprenant dans sa structure un (ou plusieurs) residu(s) saccharidique(s).
., ! , ' 'j~ ;
' ' ' , :
.i, ' ' ' ' , "
COMPOSITIONS A BASE DE PRINCIPES ACTIFS DE MEDICAMENTS ' -HYDROPHOBES SOLUBILISABLES DANS UN SOLVANr AQUEUX
L'invention concerne des compositions comprenant des principes actifs de médicaments hydrophobes, néanmoins solubilisables dans un solvant aqueux.
L'invention concerne egalement un procedé
d'obtention de telles compositions, et leurs utilisations notamment en tant que compositions pharmaceutiques.
De nombreux produits utilises dans le domaine pharmaceutique, ou susceptibles de l'être, ne peuvent être solubilisés dans un solvant aqueux.
Cette insolubilité dans un solvant aqueux est particulièrement desavantageuse pour des produits -destines a être administres dans une solution physiologique agueuse du type de celles habituellement utilisees pour les préparations injectables. Elle l'est aussi pour les produits destinés a être administrés par voie orale et gui présentent une efficacite et une biodisponibilité réduite.
Parmi ces produits pharmacologiquement actifs et insolubles dans un solvant aqueux, on peut citer notamment, les derives lipophiles de mura~yl-peptides, tels que ceux decrits dans le brevet européen n- 0 165 123 du 10/05/1985, ou encore dans le brevet europeen 4512 du 20/03/1979.
De fait, ces produits sont des immunomodulateurs capables d'augmenter la reponse immune specifique (adjuvant de vaccin), ou de renforcer la resistance non-specifique (agent anti-infectieux).
: ,. . ~ :~ , , De nature très hydrophobe, ils donnent des suspensions aqueuses difficiles à disperser de façon totalement satisfaisante (notamment en regard du niveau de dispersion compatible avec la possibilite de les injecter à un patient)l en utilisant les divers moyens de mise en solution ou de dispersion aqueuse, bases sur des techniques connues, notamment des traitements mecaniques, ou encore l'utilisation de solvants organiques ou de surfactants.
La presente invention a precisément pour but de fournir des moyens permettant la solubilisation ou la dispersion homogene dans un solvant aqueux de produits hydrophobes, tels que les muramyl-peptides lipophiles, ou d'autres principes actifs de medicaments lipophiles, porteurs de chaînes hydrocarbonées.
Celles-ci contribuent parfois elles-mêmes à la faible solubilite, de ces produits dans l'eau, voire à
l'instabilite de leurs dispersions aqueuses.
L'invention concerne d'une maniere generale une composition susceptible d'être solubilisee ou dispersée de facon homogene et stable dans une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable, caractérisée par l'association :
- d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarbone comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérive osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarbone comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au ~oins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce derive osidique etant en une proportion suffisante par rapport au principe actif lipophile pour ,, . .-' . ~.: ,' . ' '.: '~ '' ' '',.' ' -~087~3~
promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
La mise en solution ou en dispersion des deux constituants sus-définis de la composition fait apparemment intervenir la constitution de liaisons de type Van der Walls entre leurs chaînes hydrocarbonées respectives. Souvent les liaisons de Van der Walls seront d'autant plus efficaces qu'elles seront nombreuses et donc, que les chaînes hydrocarbonées seront plus longues. Il va de soi que ces longueurs de chaînes ne doivent pas, surtout en ce qui concerne le derivé osidique hydrosoluble, exceder celles qui auraient pour effet de trop accroître sa lipophilie.
Il est entendu que, dans ce qui précède et ce qui suit, "lipophile" doit être entendu comme signifiant que la substance concernee présente dans un système bi-phasique (solution aqueuse - solution organique) un coefficient de partage favorable à la phase organique , en d'autres termes la substance lipophile est plus soluble dans la solution organique que dans la solution aqueuse. La substance lipophile peut même être pratiquement insoluble dans l'eau.
A l'inverse, et dans la présente description, l'adjectif "hydrosoluble" a la signification inverse.
Le coefficient de partage de la substance hydrosoluble dans le susdit systeme bi-phasique est en faveur de la phase aqueuse.
On peut faire l'hypothese que le pouvoir solubilisateur du dérive osidique est attribuable aux présences simultanees dans la structure de ce derive osidique dudit (ou desdits) groupement(s) hypocarbone(s) et du (ou des) groupe(s) sulfate ou phosphate. Les groupements hydrocarbonés permettent l'établissement de liaisons du type Van der Waals avec ' ' " :
WO~2/01475 pCT/FR91/00595 la (les~ chaine(s) hydrocarbonée(s) du principe actif et le (ou les) groupe(s) sulfate ou phosphate permet(tent) la solubilisation du complexe non covalent ainsi forme.
Le cas echeant, les longueurs des chaînes hydrocarbonées respectivement portées par la substance active lipophile d'une part, le dérivé solubilisateur hydrosoluble , d'autre part, sont choisies de façon a favoriser l'établissement des susdites liaisons de type Van der Waals.
La substance pharmacologiquement active peut être constituée par toute substance répondant aux critères indiqués plus haut. D'une façon génerale, on remarque que la lipophilie de la substance pharmacologiquement active peut résulter soit de la longueur des chaînes hydrocarbonées qu'elle porte, soit - et en particulier lorsque ces chaines hydrocarbonées sont courtes - du nombre de ces chaines, soit encore, bien entendu, de la conjugaison des longueurs et du nombre de ces chaines hydrocarbonées.
On l'a déja vu, la substance active peut être constituée par tout dérivé de muramyl-peptide comportant une chaîne hydrocarbonee tendant a reduire l'hydrosolubilite du muramyl-peptide correspondant, dès lors qu'il serait dépourvu de ladite chaîne hydrocarbonée. Une catégorie préféree de tels muramyl-peptides dits "lipophiles" est encore illustrée ci-apres.
Une autre catégorie de composés préferes est constituée par des dérives ou analogues saccharidiques, notamment mono- ou di-saccharidiques du lipide A. Certains exemples préferes de ces analogues sont évoques plus loin.
. . ., ., .. . : ~ . . : , .... . .: ~ . . .
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D'autres substances pharmaceutiques peuvent également être solubilisees en mettant en oeuvre les techni~ues de l'invention. ~ -Parmi celles-ci, il faut citer en particulier les peptides cycliques de la famille de la cyclosporine, par exemple la cyclosporine A (J.F. Borel et al, Agents Actions - 6 (1976) l + 68; is, Immumnology 32 (1977) 1017 ; P.J. Tudchka et al., Blood 61 (1983) 318) mais aussi les pseudopeptides cycliques, par exemple la valinomycine ou des macrolides polyéniques, par exemple la lucensomycine, et les vitamines liposolubles, notamment vitamines A, D, E, K, D'une façon genérale toute substance pharmacologiquement active du type polyenique, mono ou poly-saccharidique, polypeptidique, à caractere cyclique ou non, ou encore glycopeptidique, qui porte --au moins une chaine hydrocarbonee telle qu'elle a eté
definie plus haut, peut être former le constitutant lipophile des compositions selon l'invention.
L'invention s'appligue en particulier a la solubilisation de substances pharmacologiquement actives, dont le caractere de solubilité s'avérerait insuffisant pour une application médicale, quelle que soit la voie d'administration envisagée, des lors qu'elle comporte une chaîne hydrocarbonée qui peut s'associer, par l'intermediaire de liaisons de type Van de Waals, avec une chaîne hydrocarbonee correspondante portée par un derivé osidique, tel qu'il a eté defini plus haut.
Quant au derive osidique hydrosoluble, il convient de noter que l'expression "osidique" telle qu'utilisee ci-dessus, et dans ce qui suit, se rapporte de faqon generale a tout produit comprenant dans sa structure un (ou plusieurs) residu(s) saccharidique(s).
., ! , ' 'j~ ;
' ' ' , :
.i, ' ' ' ' , "
2~8r~ 3 ~ 6 ~.
D'une manière génerale, tout dérivé osidique tel ::
que défini ci-dessus est utilisable dans les compositions de l'invention, dès lors que ce derivé
n'entraîne pas une modification des propriétes pharmacologiques de la substance active sus-mentionnée, telle que cette dernière deviendrait inactive ou toxique.
Les chaînes hydrocarbonées portées, soit par la .
substance pharmacologiquement active, soit par le derivé d'oside, sont avantageusement elles-mêmes des groupements lipophiles. Elles sont notamment constituées :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 a 20, notamment de 4 a 20 atomes de carbone, comprenant le cas echeant, une ou plusieurs :
liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-apres par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonee ramifiee de 5 à 50, notamment de lO à 50 atomes de carbone, comprenant le cas écheant, une ou plusieurs liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou .
amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- ~:
apres par groupement lipophile "de type B".
Une catégorie de dérives osidiques préférés pour la production de compositions conformes à l'invention sont ceux qui repondent a la formule (I) suivante : :
7 ~87~3~ -~' dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarbone comportant au moins 3 atomes de carbones, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acetamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou differents, representent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un residu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position l (Cll est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituees par des groupes R ' 2, R ' 3, et R'4 ayant respectivement les significations donnees ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R ' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2, R3~ R'3~ R4 ou R'4 représentant un residu sulfate ou phosphate.
A titre d'exemple de derives osidiques répondant à la formule (I) sus-mentionnee, on peut citer les composes suivants :
- a ou ~-methyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, , : ' :'' ','',, 75~
- N-acetyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - ~ ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-a,~'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée ci-dessus.
Il va de soi que les groupements lipophiles ne doivent pas être d'une longueur telle ou en un nombre tel que l'ensemble du dérivé osidique tendrait a devenir insoluble.
Des dérives osidiques préférés sont choisis parmi les composés suivants :
- ~ ou ~-méthyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - ~ ou ~-methyl-glycoside-N-acetyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glyceroyl-2-desoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glyceroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - a ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - ~ ou ~-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glyceroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl~ '-D-trehalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl~-glyceroyl-~
D-trehalose.
Certaines categories de compositions conformes à
l'invention seront encore davantage - et de façon non limitative - illustrées dans ce qui suit.
Les deux groupements hydrocarbones, le cas echeant, lipophiles par eux-mêmes, assurant respectivement une association non covalente entre la 2n~7~3~
9 ,.
substance pharmacologiquement active et le dérivé
d'oside, sont des structures hydrocarbonées linéaires.
Cependant de manière avantageuse, ces groupements sont tels que 1'un d'entre eux est compose d'une structure hydrocarbonee linéaire, tandis que l'autre est constitué d'une structure hydrocarbonée ramifiée.
La structure hydrocarbonée ramifiée est alors de préference choisie parmi celles constituées d'-une chaîne hydrocarbonee ramifiée, dont les ramifications prennent naissance sur deux atomes de carbone adjacents, ou au plus séparés par un atome de carbone.
De preférence la structure hydrocarbonee linéaire doit alors, pour s'associer à la chaine hydrocarbonée ramifiée, avoir une longueur suffisante permettant l'instauration de liaisons non covalentes, notamment du type Van der Walls, avec l'une au moins des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
Ainsi, l'association de la substance pharmacologiquement active et du dérive osidique s'effectue-t-elle par l'intermédiaire de leurs groupements hydrocarbonés, voire lipophiles respectifs, des lors que s'établissent des liaisons non covalentes suffisamment fortes pour permettre à la structure hydrocarbonée linéaire, d'être maintenue dans une position dite en "sandwich" entre les deux ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
De preference, la structure hydrocarbonee linéaire possède un nombre d'atomes de carbone au plus egal au no~bre d'atomes de carbone des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
L'association du derivé osidique tel que decrit ci-dessus, de nature amphiphile et hydrosoluble, ~ la substance pharmacologiquement active hydrophobe et - . . .
.~. .. . . . .
. , : ,., ::: : .. . : .
2 ~ 3 ~
insoluble dans l'eau, permet la dispersion homogene de cette dernière dans un solvant aqueux.
- L'invention a plus particulièrement pour objet, toute composition susceptible d'être solubilisee ou dispersee de façon homogene dans un solvant aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par un groupement lipophile "de type A", . soit par un groupement lipophile "de type B", (2) un dérive osidique associe de façon non covalente a la substance (1), ce derive osidique etant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
D'une manière génerale, toute substance pharmacologiquement active, notamment de nature insoluble dans un solvant agueux, et sur lequel est - susceptible d'être greffé au moins un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" sus-mentionnés ou plus généralement une chafne hydrocarbonée plus courte, peut être utilisé en tant que substance pharmocologiquement active entrant dans les compositions de l'invention.
Les techniques decrites plus loin à titre d'exemples ~, .. ,. , ,' ' . ' ''` .
~8~53l~
pour le greffage de ces groupements lipophiles ou chaines hydrocarbonees sur des derives d'oside sont egalement applicables au greffage de chaines de même nature sur les substances phamacologiquement actives insolubles, des lors qu'elles en seraient elles-mêmes depourvues.
Parmi les substances pharmacologiquement actives (ou principes actifs lipophiles) entrant dans les compositions de l'invention, on peut citer les dérivés lipophiles de muramyl-peptide répondant a la formule (II) suivante :
L-(31)nl~0 ~
~_, O H
HO\~/
/\
R5 Co-x-NH-clH-co-R6 CH2-cO- ~ Al ) n2 Y
dans laquelle ~ Rs représente H ou CH3 ;
- R6 represente un groupe -NH2, -OH ou un groupe -OW1, W1 etant un groupe hydrocarboné comportant de l à l0 atomes de carbone ;
- X représente un residu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, threonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
: ' .- ': '" : ' : : ' WO92/01475 PCT~FR91/00595 - 2 Q ~ ~ ~ J ~ 12 - Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 etant un groupe hydrocarbone de l à 4 atomes de carbone, ou encore un groupement lipophile du type A
ou du type B, -- Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", etant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et Z est toujours constitué par un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" ;
- nl et n2, identiques ou différents, représentent . .
zéro ou l, - A~ et B1 sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de l à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et lO.
Une composition particulièrement preferée de l'invention, comprend des composés de formule (II) - ~
sus-mentionnée, dans laquelle -- n1 et n2 représentent zéro, -- R5 représente CH3, - R~ représente -OH, -NH2 ou -On (CH2) H avec x1 compris entre l et 6, avec une preference pour x1=4, --X est L ou D-alanyle, L-threonyle, L-valyle, : :
- lorsque Y représente -O-CH2-CHO(R7)-CH2O(RB), Z représente H, et lorsque Z représente O
Il . ,.
-C-CHO(R7)-CH2O(R8), Y represente -OH, -NH2 ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiguee ci-dessus, et R7 et R8 etant des groupes palmitoyle.
Une autre composition preferée de l'invention comprend des composes de formule (II) sus-mentionnee, dans laquelle :
, .,. , , , , ., ~ ,. : . , ~ . , - 20~53', - nl et n2 representent zero, - ~ represente CH3 - ~ represente -OH, ou -NH2 ou On (CH2) 1H avec x~
compris entre l et 6, avec une preference pour x1=4, -X est k ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y represente -O-(CH2)X2H avec x2 8, Z
représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)~2H, avec x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée ci-dessus.
La substance biologiquement active susceptible d'être associee avec les dérives d'osides, definis plus haut, pour former des compositions solubilisables ou dispersables conformes a l'invention, peut encore appartenir à d'autres catégories de produits.~ Il s'agit, par exemple de substances immunomodulat_ices, sélectionnées parmi :
- des constituants d'origine bactérienne, entre autres des constituants de la paroi bacterienne : derives du tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la classe des tréhalose dimycolates), et lipolysaccharides (LPS) qui comportent d'une part des chaines lipidiques et, d'autre part, au moins un groupe phosphate ou sulfate :
- des fractions lipidiques obtenus à partir de ces LPS, en particulier le "Lipide A" (cf par exemple article de Ernst Th. Rietschel et al intitule "Molecular structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity" (Structure moléculaire des endotoxines bactériennes en relation avec leur bioactivite) dans l'ouvrage lui-même intitule "Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions" (Aspects cellulaires et moléculaires des réactions mettant en oeuvre des endotoxines), sous la 7~3~
direction de A. Nowotny, J.J. Spitzer et E.J.
Ziegler ; 1990, Elsevier Science Publishers B.V.
(Division biomedicale), pages 15-32); on rappelle pour memoire la formule du "Lipide A" (III) :
HO
COO--C ~ CH
(~H2)y (CH2~x CONH HO CH - OOC
CH~ CH~ CH2 CONH (CH2)X (CH2)y COO ~ CH CH2 CH~ 3 ~CH2)y (cH2)x COO CH
CH3 CH~ (CH2)y (cH2)x CH~ CH~ x - ~o - des analogues des précedents constituants d'origine bacterienne ou des produits (naturels, hémisynthetiques ou de synthèse) correspondant a des fragments de ces constituants d'origine bactérienne, notamment des derivés detoxifiés. On mentionnera tout particulierement des dérivés ou analogues du lipide A, mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés, porteurs de chaines ramifiees ou encore de chaines hydrocarbonees lin~aires, pouvant être elles-mêmes substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées lineaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther ou thioether, produits qui, obtenus par synthèse ou hémisynthese, ont une toxicit~ attenuée par rapport au Lipide A naturel.
~7~
Une première famille est celle des analogues ou derives disaccharidiques du Lipide A, tel que les MPL
(monophophoryl Lipid A, produit par Ribi immunochem, Research Inc.). Ce sont des structures très hydrophobes dispersables dans l'eau de façon homogene, en presence des susdits derivés d'osides.
Ces analogues du Lipide A repondent a la formule genérale (IV), HO -R 40$
NHR2 OR t dans laquelle:
R4 et R'1 representent H ou P04, avec au moins R4 ou R' etant un groupe P04 R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)X-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y etant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
Une deuxième famille est celle des analogues ou dérivés monosaccharidiques du Lipide A, notamment le MRL 953 (produit decrit dans P.L. Stuetz et al, in Cellular and molecular aspects of endotoxin reactian A. Nowotny, J.J. Spitzec, E.J. Zlegler editeurs.
(Elsevier Science Publishers) 1990, pages 129-144).
Ces analogues et dérives monosaccharidiques du Lipide A repondent ~ la formule generale (V) :
WO 92/01475 PCI'/FR91/00595 r~ ~) 3 b HO--~ORI
dans laquelle : -R~ représente H ou PO3 R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(C~2)x-CH3, x etant compris entre 5 et 15, avec une pré~érence pour x = l0, et R etant H ou OH ou encore CO-(CH2)y~CH3, y etant compris entre S et 15 avec une preférence pour y = lO ou 12, R4 représente PO3 si R1 n'est pas PO3, ou H ou encore l'une des significations données à R2 et R3.
Pour les mêmes raisons d'hydrophobicite que dejà
évoquees a propos de certains Muramylpeptides, leur formulation galenique est souvent diffici}e.
Néanmoins, comme les Muramylpeptides lipophiles ils peuvent conduire à des solutions ou dispersions aqueuses homogenes en presence du susdit derivé
d'oside.
La presente invention concerne donc l'utilisation des compositions selon l'invention soit seules pour stimuler les defenses génerales de l'organisme, soit avec un antigene.
Le dérive d'oside et la substance pharmacologiquement active sont, dans l'association, avantageusement dans un rapport ponderal de 0,25 a 5, notamment de 0,5 à l,5.
2og7r~,3~j L'invention a egalement pour objet les dérivés osidiques de formule (I) eux-mêmes, des lors qu'ils comportent au moins un groupe sulfate, ainsi que leur procedé d'obtention selon des methodes qui sont classiquement utilisees en chimie de synthèse des mono et des oligosaccharides.
A titre illustratif, cette méthodologie procède par etapes successives a partir de l'ose ou de l'oligosaccharide a modifier chimiquement, pour parvenir au dérive recherche, specifiquement substitue sur la position voulue. Pour ce faire, les fonctions en positions C1, C2, C3, C4 et C6 d'un ose et celles correspondantes d'un oligosaccharide, sont protégées temporairement par des groupements protecteurs (tels que benzyle, benzylidene, acetyle...) introduits specifiquement et sequentiellement sur les positions qui ne seront pas finalement l'objet de la modification chimique envisagée, en tirant partie des différences de reactivité desdites fonctions.
Puis l'introduction des groupements lipophiles "de type A" ou "de type ~" sus-mentionnés ou d'ailleurs de chaînes hydrocarbonées plus courtes, est avantageusement effectuée de la maniere suivante :
les (ou la) fonctions hydroxyles primaires non protégées, peuvent reagir soit sous forme substituée par un groupe tosyle avec un sel d'acide gras, en presence d'ether couronne, soit sous forme libre avec un chlorure d'acide gras, ou avec la fonction carboxylique d'un acide gras en presence d'un réactif de couplage.
Après introduction des (ou de la) modifications chimiques envisagees sur les (ou la) positions restees -~
libres, le derive obtenu est libere (etape de déprotection) de tous ses groupements protecteurs pour aboutir au derive mono ou oligosaccharidique voulu.
~2 ~ ~r`~ r~ 18 Le cas echéant, l'introduction des (ou du) groupes phosphates est realisee préalablement à l'etape de deprotection sus-mentionnee, par la méthode dite phosphite triester decrite dans Perich, J.W. et al, Tetrahedron Lett., (1988), 29, 2369.
L'introduction du (ou des), groupe(s) sulfate est réalisee après l'etape de déprotection sus-mentionnee, notamment par utilisation du complexe trimethylamine- -anhydride sulfurique selon la méthode notamment decrite dans Ichikawa Y. et al, Carbohydrate Research, 172, ('988), 37-64.
L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant une composition du type de celles décrites ci-dessus, ou un mélange de ces compositions, dispersee(s) dans un solvant a~ueux physiologiquement acceptable.
De manière avantageuse, les compositions de l'invention peuvent être lyophilisées a partir de leur solution ou dispersion aqueuse, et se présentent alors sous forme de poudre.
Ces compositions sous forme de poudre sèche, sont aisément solubilisees ou dispersées à nouveau dans un volume approprié de solvant aqueux.
L'invention concerne également un procede de modification des propriétés de solubilité d'une substance pharmacologiquement active du type (l) décrite ci-dessus, ce procédé consistant en -- `-l'association de la substance (l) avec un derive osidique de type (2) tel que decrit ci-dessus, dans des conditions telles que lorsque cette association de (l) et (2) est mise dans l'eau, on obtient une solution (ou une dispersion) utilisable notamment en tant que préparation injectable, lorsque l'eau sus-mentionnée est sterile.
. ; . ' ~ :
~0~7~31`
La solubilisation de la substance phar-macologiquement active (1) est telle que l'on obtient un fluide caracterisé par une faible opalescence (mesurable par nephelométrie), celle-ci étant même souvent absente.
Ce fluide se comporte comme une solution et est susceptible d'être administre dans l'organisme en tant que solution injectable. La dispersion d'une substance dans un milieu aqueux correspond a une répartition stable et homogene des molécules de cette substance dans la masse de ce milieu, résultant d'une solvatation totale ou partielle par des molécules d'eau, et non a une dispersion de cette substance sedimentable avec le temps. En particulier on n'observe aucun changement d'etat physique dans la dispersion dans les 24 heures qui suivent sa préparation.
L'invention a egalement pour objet un procede d'obtention des compositions décrites ci-dessus comprenant : -- la solubilisation du (ou des) derivé osidique dans une quantité déterminee d'un solvant aqueux, - l'addition sous agitation à la solution précedemment obtenue, d'une quantité déterminée d'une (ou plusieurs) substance pharmacologiquement active, soit en suspension dans un solvant aqueux, soit en solution dans un solvant organique, `
- le cas echéant, l'elimination du solvant organique, - le cas écheant encore, la lyophilisation de la solution précédente.
En variante, le procede d'obtention des compositions de l'invention est realise en additionnant, dans les conditions prec~demment decrites, le (ou les) derivé(s) osidique(s) à une :
, . .
W092/Ot475 PCTtFR9t/00595 ~ 0 ~
quantite determinee d'une (ou plusieurs) substance(s) pharmacologiquement active(s).
L'invention est davantage illustree dans la description detaillee qui suit, sans que cette dernière ne revête un caractère limitatif.
Description de la ~ynthese du sel de sodium du 6,6' di-octanoyl-~,4'-disulfonyl-~,~-D-tréhalose ~ou com-posé P1) .6,6'octanoyl-2,3-2~,3',tétra-0-benzyl-~,~'-D-tréhalo-se Dissolution dans le THF sec (50 ml), sous argon, a l'abri de la lumiere de 3 mmoles de 2,3-2',3'-tetra-0-benzyl~ -D-tréhalose (A.F. Hadfield, L. Hough, and A.C. Richardson - Carbohyd. Res. 63, (1978), 51) de 7,5 mmoles d'acide octanoïque, et de 7,87 mmoles de triphénylphosphine. A la solution refroidie a O-C, addition en 15 minutes d'une solution de diisopropylazodicarboxylate (8,02 mmoles) dans le THF sec (25 ml). Purification sur silice 60 H sous -pression dans le mélange de toluène/CH2Cl2/AcoET
30/10/5. Huile : m = 2,58 g (90 %).
. Sel de sodium ~u 6,6'-dioctanoyl-2,3-2~,3'-tetra-0-benzyl-4.4~-di-~ulfonyl-,a~-D-trehalose.
A 1,5 mmole du produit précédent en solution dans le DMF sec (15 ml), addition de 15 oles de complexe trimethylamine/anhydride sulfurique (2,1 g~ et incubation a 50 C en conditions anhydrides pendant 2 jours. Addition de C~30H (10 ml), puis, extension par du chloroforme (10 ml) et percolation sur Sephadex LH20 dans le melange CHCl3-CH30H : I/I. Apres concentration, purification sur colonne de silice 60H
sous pression, dans le melange CHCl3-CH30~-H20 15/5/05 (1,7 g : huile). Dissolution dans le melange DMF-H20 : I/I (80 ml) et percolation sur colonne de ~' ~ . ' . . ' ' . ' .' ' . ` . '' ' ' ' '~` "; ' ................ 1 1' ; '. ... ' `, `', , ' ~ , ' . ' .
WO92/01475 pCT/FR9l/00595 ~0875'~
resine Dowex 50 WX4 ~ (85 ml) par élution avec le même mélange de solvants : neutralisation par NaOH
O,lN : lyophilisation m = 1, 51 g (87 %).
. Sel de sodium du 6,6~-dioctanoyl-4,4~-di-O-sulfonyl-a~ts~-D-treh~lOse (C28H~8Na2019B2 798,79) 1,5 g du derive precedent, solubilisé dans 150 ml d'un melange eau/alcool (6,5/10), est hydrogene en présence de 750 mg de Pd/C a 10 ~. Après filtration, concentration,lyophilisation en solution aqueuse.
Purification sur silice 60-G dans CHCl3-CH30H-CH3COOH-H2O : 40/20/8/2. Concentration, coévaporation avec du toluene, lyophilisation en solution aqueuse.
Percolation sur Sephadex LH20 dans le méthanol.
Concentration dessiccation, lyophilisation en solution dans l'eau m = 525 mg (51 %). -Teneur en sulfate : 2,7 Eq/g (conductimetrie).
teneur en acide octanoïque : 1,97 Eq/mole (CPV).
EXE~PLES DE MISE8 EN OEUVR~ DU DERIVE D'OSIDE P~ DAN8 DES CONPOSITION8 CONFORME8 a L~INVENTION
EXEMP~E - I :
1): Desicription de mises en oeuvre de la diseersion aqueuise de MDP-GDP, ¢'est-~-dire le a~N-~cetyl-mura-myl~ lanyl- D-iisoglutamine) -~B,~-dip~lmitoyl-sn-Gly-cerol, avec le compoisié Pl - Premier mode de mise en oeuvre mg de P1 sont dissous dans 10 ml d'eau distillee. A la solution sont ajoutés 10 mg de MDP-GDP, sous forte agitation. La dispersion aqueuse obtenue est d'aspect opalescent et ne sédimente pas ou tres peu, (une nouvelle agitation permet d'obtenir a nouveau la dispersion homogène). Après lyophilisation, on peut par addition d'eau ou de solute physiologique, reconstituer une dispersion d'aspect identique.
- Deuxième mode de mise en oeuvre WO92/01475 PCTtFR91/00C~5 r~ ~ 3 ~j 22 Mode de mise en oeuvre 2.20,57 mg de MDP-GDP sont dissous dans 2 ml de chloroforme (solution A). 20 mg de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont reunies. On ajoute de 5 à l0 ml d'eau distillée et on fait barboter un courant d'azote a partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à elimination complète du chloroforme.
~ n obtient une dispersion aqueuse homogene et stable, légerement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la concentration desiree. On obtient une dispersion de même aspect et qualite que precedemment.
Le procéde permet une formulation galénique aisée des principes actifs de medicaments lipophiles correspondant à }a formule genérale (II). Il en résulte des preparations qui conservent les activités pharmacologiques de ces produits, notamment en tant que regulateur de la réponse immune, telles qu'elles ont été revendiquées dans le brevet européen n- 0 165 123 .
2~ : Influence de l~utilisation de Pl sur l' wtivité
adjuvante du MDP-GDP étudiée chez le cobaye.
a) PréParation de l~émulsion l mg de P1 est dissous dans 0.5 ml de solute physiologique, cette solution est ajoutee goutte à
goutte à l mg de MDP-GDP en poudre.
La dispersion obtenue est mélangée a 0,5 ml d'une solution isotonique en ovalbumine a 20 mg/ml. Elle est additionnee de l ml d'huile minerale (Adjuvant Incomplet de Freund, AIF) et on procede à l'emulsion.
Cette preparation contient donc par ml, 0,5 mg d'adjuvant, 0,5mg de Pl et 5 mg d'ovalbumine .~
~87~t'~u b) Methodoloqie Les lots temoins reçoivent a) de l'emulsion eau/huile minerale contenant l'antigène seul, b) la même emulsion contenant les molecules adjuvantes seules (MDP-GDP). Les lots expérimentaux reçoivent les emulsions contenant le dérivé osidique P1. Les injections se font par voie sous cutanee dans les coussinets plantaires arrieres de cobayes mâles Hartley pesant 350 g. Apres 3 semaines les animaux reçoivent par voie intradermique 0,1 ml de soluté
physiologique seul ou contenant 0,1 ml d'ovalbumine.
Après 48 heures, on mesure le diametre d'induration qui est le signe de l'etablissement d'un état d'hypersensibilité retardée. Après 24 heures, les animaux sont sacrifies par ponction cardiaque et les serums recueillis. Le titrage des anticorps circulant se fait par la methode Elisa suivant les modalites classiques, notamment celles decrites dans :
F.AUDIBERT, L. CHEDID, P. LEFR~NCIER and J. CHOAY, Immunol. tl976), (21), 143 ; et M. JOLIVET, F.
AUDIBERT, H. GRAS-MASSE, A. TARTAR, D. SC~hESSINGER, R. WITZ and ~. CHEDID, Infect. Immunol. (1987), (55), 1498.
', ' , , ' WO92/01475 PCT/FR91/00~a5 i~a'~,'l 'à3 ~ -c) Résultats Les resultat3 obtenus sont con~ignes d~ns le tableau suivant :
IMMUNISATION~ HYPERSENSIBILITE TITRE ANTI-RETARDEE - CORPS ELISA
diamètre d'indu-ration mm AIF oØ0.0 22.000, 37.000, 65.000, 95.000 AIF+P1 o.O.o.0 7.000, 8.000, 100 ~g 21.000.
AIF+MDP-GDP 100~g 8,14,15,17 241.000,295.000 325.000,641.000.
AIF+MDP-GDP 5,16,20,25 157.000,275.000, 100~g+P1 275.000,318.0000 100 ~g : Tous les animaux ont reçu 1 mg d'ovalbumine.
Les chiffres représentent la dilution maximum du sérum permettant d'obtenir une densité optique égale à celle obtenue en utilisant un sérum normal dilué 50 fois.
Ces resultats montrent que le MDP-GDP est un fort adjuvant de la reponse a médiation cellulaire et de la réponse humorale et que l'addition de P1 n'a pas modifié leur activite.
D'une manière génerale, tout dérivé osidique tel ::
que défini ci-dessus est utilisable dans les compositions de l'invention, dès lors que ce derivé
n'entraîne pas une modification des propriétes pharmacologiques de la substance active sus-mentionnée, telle que cette dernière deviendrait inactive ou toxique.
Les chaînes hydrocarbonées portées, soit par la .
substance pharmacologiquement active, soit par le derivé d'oside, sont avantageusement elles-mêmes des groupements lipophiles. Elles sont notamment constituées :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 a 20, notamment de 4 a 20 atomes de carbone, comprenant le cas echeant, une ou plusieurs :
liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-apres par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonee ramifiee de 5 à 50, notamment de lO à 50 atomes de carbone, comprenant le cas écheant, une ou plusieurs liaison(s) ether, ester, thioether, thioester, ou .
amide, cette structure ramifiée étant désignée ci- ~:
apres par groupement lipophile "de type B".
Une catégorie de dérives osidiques préférés pour la production de compositions conformes à l'invention sont ceux qui repondent a la formule (I) suivante : :
7 ~87~3~ -~' dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarbone comportant au moins 3 atomes de carbones, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acetamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou differents, representent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un residu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position l (Cll est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituees par des groupes R ' 2, R ' 3, et R'4 ayant respectivement les significations donnees ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R ' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2, R3~ R'3~ R4 ou R'4 représentant un residu sulfate ou phosphate.
A titre d'exemple de derives osidiques répondant à la formule (I) sus-mentionnee, on peut citer les composes suivants :
- a ou ~-methyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, , : ' :'' ','',, 75~
- N-acetyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - ~ ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-a,~'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée ci-dessus.
Il va de soi que les groupements lipophiles ne doivent pas être d'une longueur telle ou en un nombre tel que l'ensemble du dérivé osidique tendrait a devenir insoluble.
Des dérives osidiques préférés sont choisis parmi les composés suivants :
- ~ ou ~-méthyl-glycoside N-acetyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - ~ ou ~-methyl-glycoside-N-acetyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glyceroyl-2-desoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glyceroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - a ou ~-methyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - ~ ou ~-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glyceroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl~ '-D-trehalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl~-glyceroyl-~
D-trehalose.
Certaines categories de compositions conformes à
l'invention seront encore davantage - et de façon non limitative - illustrées dans ce qui suit.
Les deux groupements hydrocarbones, le cas echeant, lipophiles par eux-mêmes, assurant respectivement une association non covalente entre la 2n~7~3~
9 ,.
substance pharmacologiquement active et le dérivé
d'oside, sont des structures hydrocarbonées linéaires.
Cependant de manière avantageuse, ces groupements sont tels que 1'un d'entre eux est compose d'une structure hydrocarbonee linéaire, tandis que l'autre est constitué d'une structure hydrocarbonée ramifiée.
La structure hydrocarbonée ramifiée est alors de préference choisie parmi celles constituées d'-une chaîne hydrocarbonee ramifiée, dont les ramifications prennent naissance sur deux atomes de carbone adjacents, ou au plus séparés par un atome de carbone.
De preférence la structure hydrocarbonee linéaire doit alors, pour s'associer à la chaine hydrocarbonée ramifiée, avoir une longueur suffisante permettant l'instauration de liaisons non covalentes, notamment du type Van der Walls, avec l'une au moins des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
Ainsi, l'association de la substance pharmacologiquement active et du dérive osidique s'effectue-t-elle par l'intermédiaire de leurs groupements hydrocarbonés, voire lipophiles respectifs, des lors que s'établissent des liaisons non covalentes suffisamment fortes pour permettre à la structure hydrocarbonée linéaire, d'être maintenue dans une position dite en "sandwich" entre les deux ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
De preference, la structure hydrocarbonee linéaire possède un nombre d'atomes de carbone au plus egal au no~bre d'atomes de carbone des ramifications de la structure hydrocarbonée ramifiée.
L'association du derivé osidique tel que decrit ci-dessus, de nature amphiphile et hydrosoluble, ~ la substance pharmacologiquement active hydrophobe et - . . .
.~. .. . . . .
. , : ,., ::: : .. . : .
2 ~ 3 ~
insoluble dans l'eau, permet la dispersion homogene de cette dernière dans un solvant aqueux.
- L'invention a plus particulièrement pour objet, toute composition susceptible d'être solubilisee ou dispersee de façon homogene dans un solvant aqueux, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par un groupement lipophile "de type A", . soit par un groupement lipophile "de type B", (2) un dérive osidique associe de façon non covalente a la substance (1), ce derive osidique etant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
D'une manière génerale, toute substance pharmacologiquement active, notamment de nature insoluble dans un solvant agueux, et sur lequel est - susceptible d'être greffé au moins un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" sus-mentionnés ou plus généralement une chafne hydrocarbonée plus courte, peut être utilisé en tant que substance pharmocologiquement active entrant dans les compositions de l'invention.
Les techniques decrites plus loin à titre d'exemples ~, .. ,. , ,' ' . ' ''` .
~8~53l~
pour le greffage de ces groupements lipophiles ou chaines hydrocarbonees sur des derives d'oside sont egalement applicables au greffage de chaines de même nature sur les substances phamacologiquement actives insolubles, des lors qu'elles en seraient elles-mêmes depourvues.
Parmi les substances pharmacologiquement actives (ou principes actifs lipophiles) entrant dans les compositions de l'invention, on peut citer les dérivés lipophiles de muramyl-peptide répondant a la formule (II) suivante :
L-(31)nl~0 ~
~_, O H
HO\~/
/\
R5 Co-x-NH-clH-co-R6 CH2-cO- ~ Al ) n2 Y
dans laquelle ~ Rs représente H ou CH3 ;
- R6 represente un groupe -NH2, -OH ou un groupe -OW1, W1 etant un groupe hydrocarboné comportant de l à l0 atomes de carbone ;
- X représente un residu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, threonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
: ' .- ': '" : ' : : ' WO92/01475 PCT~FR91/00595 - 2 Q ~ ~ ~ J ~ 12 - Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 etant un groupe hydrocarbone de l à 4 atomes de carbone, ou encore un groupement lipophile du type A
ou du type B, -- Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", etant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et Z est toujours constitué par un groupement lipophile "de type A" ou "de type B" ;
- nl et n2, identiques ou différents, représentent . .
zéro ou l, - A~ et B1 sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de l à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et lO.
Une composition particulièrement preferée de l'invention, comprend des composés de formule (II) - ~
sus-mentionnée, dans laquelle -- n1 et n2 représentent zéro, -- R5 représente CH3, - R~ représente -OH, -NH2 ou -On (CH2) H avec x1 compris entre l et 6, avec une preference pour x1=4, --X est L ou D-alanyle, L-threonyle, L-valyle, : :
- lorsque Y représente -O-CH2-CHO(R7)-CH2O(RB), Z représente H, et lorsque Z représente O
Il . ,.
-C-CHO(R7)-CH2O(R8), Y represente -OH, -NH2 ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiguee ci-dessus, et R7 et R8 etant des groupes palmitoyle.
Une autre composition preferée de l'invention comprend des composes de formule (II) sus-mentionnee, dans laquelle :
, .,. , , , , ., ~ ,. : . , ~ . , - 20~53', - nl et n2 representent zero, - ~ represente CH3 - ~ represente -OH, ou -NH2 ou On (CH2) 1H avec x~
compris entre l et 6, avec une preference pour x1=4, -X est k ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y represente -O-(CH2)X2H avec x2 8, Z
représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)~2H, avec x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée ci-dessus.
La substance biologiquement active susceptible d'être associee avec les dérives d'osides, definis plus haut, pour former des compositions solubilisables ou dispersables conformes a l'invention, peut encore appartenir à d'autres catégories de produits.~ Il s'agit, par exemple de substances immunomodulat_ices, sélectionnées parmi :
- des constituants d'origine bactérienne, entre autres des constituants de la paroi bacterienne : derives du tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la classe des tréhalose dimycolates), et lipolysaccharides (LPS) qui comportent d'une part des chaines lipidiques et, d'autre part, au moins un groupe phosphate ou sulfate :
- des fractions lipidiques obtenus à partir de ces LPS, en particulier le "Lipide A" (cf par exemple article de Ernst Th. Rietschel et al intitule "Molecular structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity" (Structure moléculaire des endotoxines bactériennes en relation avec leur bioactivite) dans l'ouvrage lui-même intitule "Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions" (Aspects cellulaires et moléculaires des réactions mettant en oeuvre des endotoxines), sous la 7~3~
direction de A. Nowotny, J.J. Spitzer et E.J.
Ziegler ; 1990, Elsevier Science Publishers B.V.
(Division biomedicale), pages 15-32); on rappelle pour memoire la formule du "Lipide A" (III) :
HO
COO--C ~ CH
(~H2)y (CH2~x CONH HO CH - OOC
CH~ CH~ CH2 CONH (CH2)X (CH2)y COO ~ CH CH2 CH~ 3 ~CH2)y (cH2)x COO CH
CH3 CH~ (CH2)y (cH2)x CH~ CH~ x - ~o - des analogues des précedents constituants d'origine bacterienne ou des produits (naturels, hémisynthetiques ou de synthèse) correspondant a des fragments de ces constituants d'origine bactérienne, notamment des derivés detoxifiés. On mentionnera tout particulierement des dérivés ou analogues du lipide A, mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés, porteurs de chaines ramifiees ou encore de chaines hydrocarbonees lin~aires, pouvant être elles-mêmes substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées lineaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther ou thioether, produits qui, obtenus par synthèse ou hémisynthese, ont une toxicit~ attenuée par rapport au Lipide A naturel.
~7~
Une première famille est celle des analogues ou derives disaccharidiques du Lipide A, tel que les MPL
(monophophoryl Lipid A, produit par Ribi immunochem, Research Inc.). Ce sont des structures très hydrophobes dispersables dans l'eau de façon homogene, en presence des susdits derivés d'osides.
Ces analogues du Lipide A repondent a la formule genérale (IV), HO -R 40$
NHR2 OR t dans laquelle:
R4 et R'1 representent H ou P04, avec au moins R4 ou R' etant un groupe P04 R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)X-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y etant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
Une deuxième famille est celle des analogues ou dérivés monosaccharidiques du Lipide A, notamment le MRL 953 (produit decrit dans P.L. Stuetz et al, in Cellular and molecular aspects of endotoxin reactian A. Nowotny, J.J. Spitzec, E.J. Zlegler editeurs.
(Elsevier Science Publishers) 1990, pages 129-144).
Ces analogues et dérives monosaccharidiques du Lipide A repondent ~ la formule generale (V) :
WO 92/01475 PCI'/FR91/00595 r~ ~) 3 b HO--~ORI
dans laquelle : -R~ représente H ou PO3 R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(C~2)x-CH3, x etant compris entre 5 et 15, avec une pré~érence pour x = l0, et R etant H ou OH ou encore CO-(CH2)y~CH3, y etant compris entre S et 15 avec une preférence pour y = lO ou 12, R4 représente PO3 si R1 n'est pas PO3, ou H ou encore l'une des significations données à R2 et R3.
Pour les mêmes raisons d'hydrophobicite que dejà
évoquees a propos de certains Muramylpeptides, leur formulation galenique est souvent diffici}e.
Néanmoins, comme les Muramylpeptides lipophiles ils peuvent conduire à des solutions ou dispersions aqueuses homogenes en presence du susdit derivé
d'oside.
La presente invention concerne donc l'utilisation des compositions selon l'invention soit seules pour stimuler les defenses génerales de l'organisme, soit avec un antigene.
Le dérive d'oside et la substance pharmacologiquement active sont, dans l'association, avantageusement dans un rapport ponderal de 0,25 a 5, notamment de 0,5 à l,5.
2og7r~,3~j L'invention a egalement pour objet les dérivés osidiques de formule (I) eux-mêmes, des lors qu'ils comportent au moins un groupe sulfate, ainsi que leur procedé d'obtention selon des methodes qui sont classiquement utilisees en chimie de synthèse des mono et des oligosaccharides.
A titre illustratif, cette méthodologie procède par etapes successives a partir de l'ose ou de l'oligosaccharide a modifier chimiquement, pour parvenir au dérive recherche, specifiquement substitue sur la position voulue. Pour ce faire, les fonctions en positions C1, C2, C3, C4 et C6 d'un ose et celles correspondantes d'un oligosaccharide, sont protégées temporairement par des groupements protecteurs (tels que benzyle, benzylidene, acetyle...) introduits specifiquement et sequentiellement sur les positions qui ne seront pas finalement l'objet de la modification chimique envisagée, en tirant partie des différences de reactivité desdites fonctions.
Puis l'introduction des groupements lipophiles "de type A" ou "de type ~" sus-mentionnés ou d'ailleurs de chaînes hydrocarbonées plus courtes, est avantageusement effectuée de la maniere suivante :
les (ou la) fonctions hydroxyles primaires non protégées, peuvent reagir soit sous forme substituée par un groupe tosyle avec un sel d'acide gras, en presence d'ether couronne, soit sous forme libre avec un chlorure d'acide gras, ou avec la fonction carboxylique d'un acide gras en presence d'un réactif de couplage.
Après introduction des (ou de la) modifications chimiques envisagees sur les (ou la) positions restees -~
libres, le derive obtenu est libere (etape de déprotection) de tous ses groupements protecteurs pour aboutir au derive mono ou oligosaccharidique voulu.
~2 ~ ~r`~ r~ 18 Le cas echéant, l'introduction des (ou du) groupes phosphates est realisee préalablement à l'etape de deprotection sus-mentionnee, par la méthode dite phosphite triester decrite dans Perich, J.W. et al, Tetrahedron Lett., (1988), 29, 2369.
L'introduction du (ou des), groupe(s) sulfate est réalisee après l'etape de déprotection sus-mentionnee, notamment par utilisation du complexe trimethylamine- -anhydride sulfurique selon la méthode notamment decrite dans Ichikawa Y. et al, Carbohydrate Research, 172, ('988), 37-64.
L'invention concerne également des compositions pharmaceutiques comprenant une composition du type de celles décrites ci-dessus, ou un mélange de ces compositions, dispersee(s) dans un solvant a~ueux physiologiquement acceptable.
De manière avantageuse, les compositions de l'invention peuvent être lyophilisées a partir de leur solution ou dispersion aqueuse, et se présentent alors sous forme de poudre.
Ces compositions sous forme de poudre sèche, sont aisément solubilisees ou dispersées à nouveau dans un volume approprié de solvant aqueux.
L'invention concerne également un procede de modification des propriétés de solubilité d'une substance pharmacologiquement active du type (l) décrite ci-dessus, ce procédé consistant en -- `-l'association de la substance (l) avec un derive osidique de type (2) tel que decrit ci-dessus, dans des conditions telles que lorsque cette association de (l) et (2) est mise dans l'eau, on obtient une solution (ou une dispersion) utilisable notamment en tant que préparation injectable, lorsque l'eau sus-mentionnée est sterile.
. ; . ' ~ :
~0~7~31`
La solubilisation de la substance phar-macologiquement active (1) est telle que l'on obtient un fluide caracterisé par une faible opalescence (mesurable par nephelométrie), celle-ci étant même souvent absente.
Ce fluide se comporte comme une solution et est susceptible d'être administre dans l'organisme en tant que solution injectable. La dispersion d'une substance dans un milieu aqueux correspond a une répartition stable et homogene des molécules de cette substance dans la masse de ce milieu, résultant d'une solvatation totale ou partielle par des molécules d'eau, et non a une dispersion de cette substance sedimentable avec le temps. En particulier on n'observe aucun changement d'etat physique dans la dispersion dans les 24 heures qui suivent sa préparation.
L'invention a egalement pour objet un procede d'obtention des compositions décrites ci-dessus comprenant : -- la solubilisation du (ou des) derivé osidique dans une quantité déterminee d'un solvant aqueux, - l'addition sous agitation à la solution précedemment obtenue, d'une quantité déterminée d'une (ou plusieurs) substance pharmacologiquement active, soit en suspension dans un solvant aqueux, soit en solution dans un solvant organique, `
- le cas echéant, l'elimination du solvant organique, - le cas écheant encore, la lyophilisation de la solution précédente.
En variante, le procede d'obtention des compositions de l'invention est realise en additionnant, dans les conditions prec~demment decrites, le (ou les) derivé(s) osidique(s) à une :
, . .
W092/Ot475 PCTtFR9t/00595 ~ 0 ~
quantite determinee d'une (ou plusieurs) substance(s) pharmacologiquement active(s).
L'invention est davantage illustree dans la description detaillee qui suit, sans que cette dernière ne revête un caractère limitatif.
Description de la ~ynthese du sel de sodium du 6,6' di-octanoyl-~,4'-disulfonyl-~,~-D-tréhalose ~ou com-posé P1) .6,6'octanoyl-2,3-2~,3',tétra-0-benzyl-~,~'-D-tréhalo-se Dissolution dans le THF sec (50 ml), sous argon, a l'abri de la lumiere de 3 mmoles de 2,3-2',3'-tetra-0-benzyl~ -D-tréhalose (A.F. Hadfield, L. Hough, and A.C. Richardson - Carbohyd. Res. 63, (1978), 51) de 7,5 mmoles d'acide octanoïque, et de 7,87 mmoles de triphénylphosphine. A la solution refroidie a O-C, addition en 15 minutes d'une solution de diisopropylazodicarboxylate (8,02 mmoles) dans le THF sec (25 ml). Purification sur silice 60 H sous -pression dans le mélange de toluène/CH2Cl2/AcoET
30/10/5. Huile : m = 2,58 g (90 %).
. Sel de sodium ~u 6,6'-dioctanoyl-2,3-2~,3'-tetra-0-benzyl-4.4~-di-~ulfonyl-,a~-D-trehalose.
A 1,5 mmole du produit précédent en solution dans le DMF sec (15 ml), addition de 15 oles de complexe trimethylamine/anhydride sulfurique (2,1 g~ et incubation a 50 C en conditions anhydrides pendant 2 jours. Addition de C~30H (10 ml), puis, extension par du chloroforme (10 ml) et percolation sur Sephadex LH20 dans le melange CHCl3-CH30H : I/I. Apres concentration, purification sur colonne de silice 60H
sous pression, dans le melange CHCl3-CH30~-H20 15/5/05 (1,7 g : huile). Dissolution dans le melange DMF-H20 : I/I (80 ml) et percolation sur colonne de ~' ~ . ' . . ' ' . ' .' ' . ` . '' ' ' ' '~` "; ' ................ 1 1' ; '. ... ' `, `', , ' ~ , ' . ' .
WO92/01475 pCT/FR9l/00595 ~0875'~
resine Dowex 50 WX4 ~ (85 ml) par élution avec le même mélange de solvants : neutralisation par NaOH
O,lN : lyophilisation m = 1, 51 g (87 %).
. Sel de sodium du 6,6~-dioctanoyl-4,4~-di-O-sulfonyl-a~ts~-D-treh~lOse (C28H~8Na2019B2 798,79) 1,5 g du derive precedent, solubilisé dans 150 ml d'un melange eau/alcool (6,5/10), est hydrogene en présence de 750 mg de Pd/C a 10 ~. Après filtration, concentration,lyophilisation en solution aqueuse.
Purification sur silice 60-G dans CHCl3-CH30H-CH3COOH-H2O : 40/20/8/2. Concentration, coévaporation avec du toluene, lyophilisation en solution aqueuse.
Percolation sur Sephadex LH20 dans le méthanol.
Concentration dessiccation, lyophilisation en solution dans l'eau m = 525 mg (51 %). -Teneur en sulfate : 2,7 Eq/g (conductimetrie).
teneur en acide octanoïque : 1,97 Eq/mole (CPV).
EXE~PLES DE MISE8 EN OEUVR~ DU DERIVE D'OSIDE P~ DAN8 DES CONPOSITION8 CONFORME8 a L~INVENTION
EXEMP~E - I :
1): Desicription de mises en oeuvre de la diseersion aqueuise de MDP-GDP, ¢'est-~-dire le a~N-~cetyl-mura-myl~ lanyl- D-iisoglutamine) -~B,~-dip~lmitoyl-sn-Gly-cerol, avec le compoisié Pl - Premier mode de mise en oeuvre mg de P1 sont dissous dans 10 ml d'eau distillee. A la solution sont ajoutés 10 mg de MDP-GDP, sous forte agitation. La dispersion aqueuse obtenue est d'aspect opalescent et ne sédimente pas ou tres peu, (une nouvelle agitation permet d'obtenir a nouveau la dispersion homogène). Après lyophilisation, on peut par addition d'eau ou de solute physiologique, reconstituer une dispersion d'aspect identique.
- Deuxième mode de mise en oeuvre WO92/01475 PCTtFR91/00C~5 r~ ~ 3 ~j 22 Mode de mise en oeuvre 2.20,57 mg de MDP-GDP sont dissous dans 2 ml de chloroforme (solution A). 20 mg de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont reunies. On ajoute de 5 à l0 ml d'eau distillée et on fait barboter un courant d'azote a partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à elimination complète du chloroforme.
~ n obtient une dispersion aqueuse homogene et stable, légerement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la concentration desiree. On obtient une dispersion de même aspect et qualite que precedemment.
Le procéde permet une formulation galénique aisée des principes actifs de medicaments lipophiles correspondant à }a formule genérale (II). Il en résulte des preparations qui conservent les activités pharmacologiques de ces produits, notamment en tant que regulateur de la réponse immune, telles qu'elles ont été revendiquées dans le brevet européen n- 0 165 123 .
2~ : Influence de l~utilisation de Pl sur l' wtivité
adjuvante du MDP-GDP étudiée chez le cobaye.
a) PréParation de l~émulsion l mg de P1 est dissous dans 0.5 ml de solute physiologique, cette solution est ajoutee goutte à
goutte à l mg de MDP-GDP en poudre.
La dispersion obtenue est mélangée a 0,5 ml d'une solution isotonique en ovalbumine a 20 mg/ml. Elle est additionnee de l ml d'huile minerale (Adjuvant Incomplet de Freund, AIF) et on procede à l'emulsion.
Cette preparation contient donc par ml, 0,5 mg d'adjuvant, 0,5mg de Pl et 5 mg d'ovalbumine .~
~87~t'~u b) Methodoloqie Les lots temoins reçoivent a) de l'emulsion eau/huile minerale contenant l'antigène seul, b) la même emulsion contenant les molecules adjuvantes seules (MDP-GDP). Les lots expérimentaux reçoivent les emulsions contenant le dérivé osidique P1. Les injections se font par voie sous cutanee dans les coussinets plantaires arrieres de cobayes mâles Hartley pesant 350 g. Apres 3 semaines les animaux reçoivent par voie intradermique 0,1 ml de soluté
physiologique seul ou contenant 0,1 ml d'ovalbumine.
Après 48 heures, on mesure le diametre d'induration qui est le signe de l'etablissement d'un état d'hypersensibilité retardée. Après 24 heures, les animaux sont sacrifies par ponction cardiaque et les serums recueillis. Le titrage des anticorps circulant se fait par la methode Elisa suivant les modalites classiques, notamment celles decrites dans :
F.AUDIBERT, L. CHEDID, P. LEFR~NCIER and J. CHOAY, Immunol. tl976), (21), 143 ; et M. JOLIVET, F.
AUDIBERT, H. GRAS-MASSE, A. TARTAR, D. SC~hESSINGER, R. WITZ and ~. CHEDID, Infect. Immunol. (1987), (55), 1498.
', ' , , ' WO92/01475 PCT/FR91/00~a5 i~a'~,'l 'à3 ~ -c) Résultats Les resultat3 obtenus sont con~ignes d~ns le tableau suivant :
IMMUNISATION~ HYPERSENSIBILITE TITRE ANTI-RETARDEE - CORPS ELISA
diamètre d'indu-ration mm AIF oØ0.0 22.000, 37.000, 65.000, 95.000 AIF+P1 o.O.o.0 7.000, 8.000, 100 ~g 21.000.
AIF+MDP-GDP 100~g 8,14,15,17 241.000,295.000 325.000,641.000.
AIF+MDP-GDP 5,16,20,25 157.000,275.000, 100~g+P1 275.000,318.0000 100 ~g : Tous les animaux ont reçu 1 mg d'ovalbumine.
Les chiffres représentent la dilution maximum du sérum permettant d'obtenir une densité optique égale à celle obtenue en utilisant un sérum normal dilué 50 fois.
Ces resultats montrent que le MDP-GDP est un fort adjuvant de la reponse a médiation cellulaire et de la réponse humorale et que l'addition de P1 n'a pas modifié leur activite.
3) : Influence du dérivé osidigue Pl 8US les proprietés immunostimulante~ des muramyl-peptides.
a - Activite anti-infectieuse Les souris Swiss ont reçu Pl, le MDP-GDP , ou le MDP-GDP + P1 par voie veineuse 24 heures avant ~ - . , ' ` ' : . . . .
' . : ' ' '.
'~ a 87 ~ 3lj 1'infection par 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. La solution de P~ est ajoutee au MDP-GDP pour obtenir une preparation contenant une quantité équivalente de 2 produits (poids/poids).
Les resultats du tableau I montrent que P1 seul -n'a aucune action protectrice contre l'infection. La comparaison de l'activité des différentes doses de MDP-GDP, seul ou avec P1, ne montre pas de differences significatives.
On peut conclure de ces expérimentations que le compose P1 n'inhibe pas l'activité anti-infectieuse du MDP-GDP.
b - Action du MDP-GDP sur la ~roduction de TNF
circulant Le TNF (tumor necrosis factor), est une protéine - synthétisée par les cellules c- la lignee monocytes/macrophages lorsqu'elles son~ stimulees. Le LPS (lipopolysaccharide bactérien) est un inducteur tres puissant de la production TNF. Les muramyl-peptides stimulent in vitro la production de TNF mais ils sont nettement moins efficaces que le LPS. In vivo, les taux de TNF serique produit après l'administration de muramyl-peptides sont au-dessous ou a la limite des possibilités de détection.
Le MDP-GDP, et ~es autres dérivés, qui ont une action anti-infectieu~e, ont la propriéte d'augmenter la reponse au LPS injecté apres, provoquant une augmentation considérable du taux de TNF sérique. Le tableau II represente les résultats d'une experience de ce type. On voit que le prétraitement est plus efficace 6 heures avant le LPS, en particulier dans le cas de l'association MDP-GPD + P1, mais que 16 heures avant, l'injection de MDP-GDP a encore un effet de potentialisation de la reponse.
" ' . ' ': ~ ' ' ~ ' ' ' ~ ' ' ' ' ' " .
WO 92tO1475 PCr/FR91/00.
~8~ rj3~ 26 c - Action du MDP-GDP in vitro sur les monocYtes du sana humain.
~es monocytes du sang sont isoles et incubés pendant 24 heures avec différentes doses de produit. ~ -Les surnageants sont préleves pour doser le TNF et l'IL-6, cytokines qui sont produites par les monocytes actives.
Le Tableau III montre que la production de TNF
n'est significative qu'avec 10 ~g/ml de MDP-GDP et que le produit solubilisé avec le composé P1 est d'une activite légerement plus élevee. Le dosage de l'IL-6 donne des résultats plus nets et montre également une stimulation compara~le des monocytes entre le MDP-GDP
et le MDP-GDP solubilisé en association avec P1.
d - Action sur les Pol~nucléaires humains Les muramyl-peptides ont une action directe sur les polynucleaires qui est mise en evidence notamment par la phagocytose et la destruction de Candida ~:
albicans.
L'estimation de cette action est faite par la capacite d'incorporer du glucose traité par les cellules du champignon restees viables.
Dans les deux expériences reportées sur le Tableau IV, les cellules temoins non stimulées ont deja une activite de base relativement elevée.
Toutefois, l'addition du muramyl-peptide, avec ou sans Pl, produit une augmentation de l'activite inhibitrice des cellules sur la croissance du champignon.
En conclusion, que ce soit dans les experiences faites in vivo chez la souris ou in vitro avec les cellules humaines, la solubilisation du MDP-GDP par le compose P~ ne diminue jamais son activite. Le compose P1seul est toujours inactif.
- ; . -- ~
,:, : , ' ' - ,.~ " ':
- ~. ..
~,a87~3,~
~ABI,EAU I
Action Protectrice du MDP-GDP solubilise Par le com~osé P, chez la souris infectee Par Klebsiella pneumoniae :
Traitement i.v., Survie a J + 15 % Protection~
a J-1 .
Témoins 1/16 P~ 100 ~g 0/8 MDP-GDP 3 ~g 3/8 37,5 ns .-3/8 37,5 ns 12/16 68,7 P < 0.01 - -100 4/8 37,5 ns MDP-GDP/ Pl 3/3~g 3/8 37,5 ns 10/10 3/8 37,5 ns 30/30 8/16 43,7 P < 0.02 100/100 7/8 75 P < 0.02 * : Les calculs statistiques sont faits en tenant compte pour chaque lot de leurs témoins respectifs.
:. . ~, . , . , ., ~ , WO92/0147s PCT/FR91/00~5 ~ ~ ~ 7 j 3 j 28 TABLEA~ II
Influence du Prétraitement Par le MDP-GDP solubilise par P, sur la re~onse TNF induite par le LPS
Traitement avec lOO~g LPS iv Activité TNF dans le iv/souris avant le LPS 25 ~g serum U/ml ~g/ml : - ' ' h-6 P1 189 3,4 h--6 MDP-GDP/P, - < 10 < O ,18 h-6 MDP-GDP +11.475 206,55 h-6 MDP-GDP/Pl +19.038 342,68 h-16 MDP-GDP +1.899 34,18 h-16 MDP-GDP/Pt 4.296 77,33 : 2 heures après l'injection d'epreuve avec le LPS
Activité exprimee en U/ml et en équivalent TNF
recombinant murin, dans le test de cytotoxicité de la lignée cellulaire L292.
, , .. . , .. , . ,~ , : ` '~ ; ~
' :, . : ' '.,., .~ ' "' . ., .: .
~7~
~A~LEAU III
Action du MDP-GDP in vitro sur les monocvtes humains .
Stimulant ~g/ml Activite dans le surnageant TNF U/mlIL-6 U/ml .. . .
Pl O < 10 MDP-GDP 0,1 0 < 10 0,1 0 < 10 :. , 1 0,3 < 10 ~ .
6,9 94,9 MDP-GDP/Pl 0,01 0 ~ 10 0,1 0 < 10 -.-1 5,9 83 10,5 594 ..
:'' Cellules a 2 x 106/ml, incubées pendant 24 heures avec les produits.
WO92/01475 PCT/FR91/00C~
`2~ 3~ 30 $ABLEA~ IV
Action du MDP-GDP sur les PolYnucléaires humains Stimulant ~g/ml Inhibition de croissance du Candida (%) lere exp. 2ème exp.
Témoins 35,3 41,5 Pl 10 34,6 38,7 MDP-GDP 0,1 44,1 47,2 1 7S,1 78,1 86,2 86,1 MDP-GDP/P1 0,1 32,2 77,2 1 41,4 93,6 65,9 95,1 .
Les polynucleaires (1 x 106/ml) sont incubes avec les stimulants pendant 30 minutes et distribués dans les puits des microplaques avec une suspension de C.
albicans à 1 x 104/ml. Après 18 heures, le milieu de culture est éliminé et l'incorporation de 3~-D-glucose par les cellules de Candida est mesurée apres une incubation de 3 heures.
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31 ~7~3i3
a - Activite anti-infectieuse Les souris Swiss ont reçu Pl, le MDP-GDP , ou le MDP-GDP + P1 par voie veineuse 24 heures avant ~ - . , ' ` ' : . . . .
' . : ' ' '.
'~ a 87 ~ 3lj 1'infection par 1 x 104 Klebsiella pneumoniae. La solution de P~ est ajoutee au MDP-GDP pour obtenir une preparation contenant une quantité équivalente de 2 produits (poids/poids).
Les resultats du tableau I montrent que P1 seul -n'a aucune action protectrice contre l'infection. La comparaison de l'activité des différentes doses de MDP-GDP, seul ou avec P1, ne montre pas de differences significatives.
On peut conclure de ces expérimentations que le compose P1 n'inhibe pas l'activité anti-infectieuse du MDP-GDP.
b - Action du MDP-GDP sur la ~roduction de TNF
circulant Le TNF (tumor necrosis factor), est une protéine - synthétisée par les cellules c- la lignee monocytes/macrophages lorsqu'elles son~ stimulees. Le LPS (lipopolysaccharide bactérien) est un inducteur tres puissant de la production TNF. Les muramyl-peptides stimulent in vitro la production de TNF mais ils sont nettement moins efficaces que le LPS. In vivo, les taux de TNF serique produit après l'administration de muramyl-peptides sont au-dessous ou a la limite des possibilités de détection.
Le MDP-GDP, et ~es autres dérivés, qui ont une action anti-infectieu~e, ont la propriéte d'augmenter la reponse au LPS injecté apres, provoquant une augmentation considérable du taux de TNF sérique. Le tableau II represente les résultats d'une experience de ce type. On voit que le prétraitement est plus efficace 6 heures avant le LPS, en particulier dans le cas de l'association MDP-GPD + P1, mais que 16 heures avant, l'injection de MDP-GDP a encore un effet de potentialisation de la reponse.
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WO 92tO1475 PCr/FR91/00.
~8~ rj3~ 26 c - Action du MDP-GDP in vitro sur les monocYtes du sana humain.
~es monocytes du sang sont isoles et incubés pendant 24 heures avec différentes doses de produit. ~ -Les surnageants sont préleves pour doser le TNF et l'IL-6, cytokines qui sont produites par les monocytes actives.
Le Tableau III montre que la production de TNF
n'est significative qu'avec 10 ~g/ml de MDP-GDP et que le produit solubilisé avec le composé P1 est d'une activite légerement plus élevee. Le dosage de l'IL-6 donne des résultats plus nets et montre également une stimulation compara~le des monocytes entre le MDP-GDP
et le MDP-GDP solubilisé en association avec P1.
d - Action sur les Pol~nucléaires humains Les muramyl-peptides ont une action directe sur les polynucleaires qui est mise en evidence notamment par la phagocytose et la destruction de Candida ~:
albicans.
L'estimation de cette action est faite par la capacite d'incorporer du glucose traité par les cellules du champignon restees viables.
Dans les deux expériences reportées sur le Tableau IV, les cellules temoins non stimulées ont deja une activite de base relativement elevée.
Toutefois, l'addition du muramyl-peptide, avec ou sans Pl, produit une augmentation de l'activite inhibitrice des cellules sur la croissance du champignon.
En conclusion, que ce soit dans les experiences faites in vivo chez la souris ou in vitro avec les cellules humaines, la solubilisation du MDP-GDP par le compose P~ ne diminue jamais son activite. Le compose P1seul est toujours inactif.
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~,a87~3,~
~ABI,EAU I
Action Protectrice du MDP-GDP solubilise Par le com~osé P, chez la souris infectee Par Klebsiella pneumoniae :
Traitement i.v., Survie a J + 15 % Protection~
a J-1 .
Témoins 1/16 P~ 100 ~g 0/8 MDP-GDP 3 ~g 3/8 37,5 ns .-3/8 37,5 ns 12/16 68,7 P < 0.01 - -100 4/8 37,5 ns MDP-GDP/ Pl 3/3~g 3/8 37,5 ns 10/10 3/8 37,5 ns 30/30 8/16 43,7 P < 0.02 100/100 7/8 75 P < 0.02 * : Les calculs statistiques sont faits en tenant compte pour chaque lot de leurs témoins respectifs.
:. . ~, . , . , ., ~ , WO92/0147s PCT/FR91/00~5 ~ ~ ~ 7 j 3 j 28 TABLEA~ II
Influence du Prétraitement Par le MDP-GDP solubilise par P, sur la re~onse TNF induite par le LPS
Traitement avec lOO~g LPS iv Activité TNF dans le iv/souris avant le LPS 25 ~g serum U/ml ~g/ml : - ' ' h-6 P1 189 3,4 h--6 MDP-GDP/P, - < 10 < O ,18 h-6 MDP-GDP +11.475 206,55 h-6 MDP-GDP/Pl +19.038 342,68 h-16 MDP-GDP +1.899 34,18 h-16 MDP-GDP/Pt 4.296 77,33 : 2 heures après l'injection d'epreuve avec le LPS
Activité exprimee en U/ml et en équivalent TNF
recombinant murin, dans le test de cytotoxicité de la lignée cellulaire L292.
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~7~
~A~LEAU III
Action du MDP-GDP in vitro sur les monocvtes humains .
Stimulant ~g/ml Activite dans le surnageant TNF U/mlIL-6 U/ml .. . .
Pl O < 10 MDP-GDP 0,1 0 < 10 0,1 0 < 10 :. , 1 0,3 < 10 ~ .
6,9 94,9 MDP-GDP/Pl 0,01 0 ~ 10 0,1 0 < 10 -.-1 5,9 83 10,5 594 ..
:'' Cellules a 2 x 106/ml, incubées pendant 24 heures avec les produits.
WO92/01475 PCT/FR91/00C~
`2~ 3~ 30 $ABLEA~ IV
Action du MDP-GDP sur les PolYnucléaires humains Stimulant ~g/ml Inhibition de croissance du Candida (%) lere exp. 2ème exp.
Témoins 35,3 41,5 Pl 10 34,6 38,7 MDP-GDP 0,1 44,1 47,2 1 7S,1 78,1 86,2 86,1 MDP-GDP/P1 0,1 32,2 77,2 1 41,4 93,6 65,9 95,1 .
Les polynucleaires (1 x 106/ml) sont incubes avec les stimulants pendant 30 minutes et distribués dans les puits des microplaques avec une suspension de C.
albicans à 1 x 104/ml. Après 18 heures, le milieu de culture est éliminé et l'incorporation de 3~-D-glucose par les cellules de Candida est mesurée apres une incubation de 3 heures.
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31 ~7~3i3
4) : Influence du derivé osidique Pl sur l'effet pyrogène du MDP-GDP.
Les essais de pyrogénicite ont éte réalises sur des lapins neozelandais de 3 a 4 kilogrammes maintenus en boîte a contention. Les animaux ont rec,u une dose de produit dans un volume de O.S ml/kg par voie veineuse au temps zéro et leur température enregistrée pendant 5 heures en continu.
(a). Evaluation de la ~vroqénicité de P1 Deux lots de trois lapins ont été constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de P1 ;
. groupe II : 100 ~g/kg de P1.
Les différences de température enregistrees étaient :
. pour le groupe I : 0.15, 0.25; 0.25 (C), soit une moyenne de : 0.22 C + 0.06 ;
. pour le groupe II : 0.40, 0.15, 0.30 (-C), soit une moyenne de : 0.28-C + 0.12.
Cette expérience indique que P1 est totalement denue d'effet pyrogène chez le lapin et dans les conditions drastiques d'un enregistrement effectué
durant 5 heures.
(b). Evaluation de la P~roqénicite de MDP-GDP en ~resence de P1 La dose minimale pyrogene de MDP-GDP préalablement determinée, est égale a : 2 ~g/kg.
Il a été choisi une dose de 10 ~g/kg qui donne -approximativement une augmentation de température de l-C.
Deux lots de trois lapins ont eté constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de MDP-GDP ;
. groupe II : 10 ~g/kg de MDP-GDP ~ 10 ~g/kg de Pl. -Les differences de temperature enregistrees sont :
. pour le groupe I : 0.70, 0.50, 0.85 (-C), soit une moyenne de : 0.68-C + 0.18 ;
. pour le groupe II : 1.15, o.so, 0.65 (oC), . : - : . . :~: .~ :
, .
W092/01~7~ PCT/FR91/OOC45 ~ a ;~ i 32 soit une moyenne de : o.9o~C + 0.25.
Un test statistique de Student (unpaired two-tailed t test, p = 0.2866) indique que cette différence n'est pas significative et donc que P1 n'induit pas une synergie de l'effet pyrogène d'un autre produit comme le MDP-GDP.
Les compositions dispersees obtenues presentent des propriétés pharmacologiques qui sont de même nature que celles rapportees ci-dessus pour les dispersions de la composition MDP-GDP-P~. On fait encore retour dans l'exemple V sur des résultats pharmacologiques particulièrement intéressants qui mettent aussi en oeuvre des compositions dispersables à base de MDP(Thr)1-GDP et P1.
EXEMPLE II - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse à base de l~-acetyl-muramyl-~-threonyl-D-isoglutamine)-~,~-dipalmitoyl-~n -glycérol (M9P~hr)l-GDP) Cette dispersion en présence du composé Pl, est obtenue exactement dans les mêmes conditions que pour le MDP-GDP
EXEMPLE III - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse d'un a~alogue monophosphoryle du ~ipide A
2.1 mg du dérivé monophosphoryle du lipide A (MPL
produit par Ribi lmmunochem. Research, Inc.) est dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution A).
3,8 mg de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (~) sont reunies. On ajoute de 2 à 3 ml d'eau distillee et fait barboter un courant d'azote à partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à elimination complète du chloroforme.
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` : ` :: ' : . . :
WO92t01475 PCT1FR91/00595 2n87~3~
On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux a la concentration desirèe. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que précedemment. `:
Propriétés biologigue~ de la di~per~ion agueu~e de MPL
~monophosphoryl Lipid A, Ribi immunochem. Research, Inc.) ~vec le composé P1 Activité antibactérienne.
Le MPL est mis en solution selon la procédure recommandee par Ribi immunochem. Research, Inc.. A
partir d'une solution dans le mélange chloroforme :
methanol (4:l) de 20 mg de MPL, une solution mere contenant 4 mg/ml de MPL est ainsi preparée, puis par addition de sérum physiologique depourvu de calcium, solution à 2 mg/ml.
L'essai est réalisé comme decrit dans l'exemple l, paragraphe 3a.
Le compose P1 n'altere pas l'effet protecteur du MPL vis-à-vis d'une infection par ~.pneumoniae. `
' ` ~ ' , " ' ' ~, `'
Les essais de pyrogénicite ont éte réalises sur des lapins neozelandais de 3 a 4 kilogrammes maintenus en boîte a contention. Les animaux ont rec,u une dose de produit dans un volume de O.S ml/kg par voie veineuse au temps zéro et leur température enregistrée pendant 5 heures en continu.
(a). Evaluation de la ~vroqénicité de P1 Deux lots de trois lapins ont été constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de P1 ;
. groupe II : 100 ~g/kg de P1.
Les différences de température enregistrees étaient :
. pour le groupe I : 0.15, 0.25; 0.25 (C), soit une moyenne de : 0.22 C + 0.06 ;
. pour le groupe II : 0.40, 0.15, 0.30 (-C), soit une moyenne de : 0.28-C + 0.12.
Cette expérience indique que P1 est totalement denue d'effet pyrogène chez le lapin et dans les conditions drastiques d'un enregistrement effectué
durant 5 heures.
(b). Evaluation de la P~roqénicite de MDP-GDP en ~resence de P1 La dose minimale pyrogene de MDP-GDP préalablement determinée, est égale a : 2 ~g/kg.
Il a été choisi une dose de 10 ~g/kg qui donne -approximativement une augmentation de température de l-C.
Deux lots de trois lapins ont eté constitués :
. groupe I : 10 ~g/kg de MDP-GDP ;
. groupe II : 10 ~g/kg de MDP-GDP ~ 10 ~g/kg de Pl. -Les differences de temperature enregistrees sont :
. pour le groupe I : 0.70, 0.50, 0.85 (-C), soit une moyenne de : 0.68-C + 0.18 ;
. pour le groupe II : 1.15, o.so, 0.65 (oC), . : - : . . :~: .~ :
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W092/01~7~ PCT/FR91/OOC45 ~ a ;~ i 32 soit une moyenne de : o.9o~C + 0.25.
Un test statistique de Student (unpaired two-tailed t test, p = 0.2866) indique que cette différence n'est pas significative et donc que P1 n'induit pas une synergie de l'effet pyrogène d'un autre produit comme le MDP-GDP.
Les compositions dispersees obtenues presentent des propriétés pharmacologiques qui sont de même nature que celles rapportees ci-dessus pour les dispersions de la composition MDP-GDP-P~. On fait encore retour dans l'exemple V sur des résultats pharmacologiques particulièrement intéressants qui mettent aussi en oeuvre des compositions dispersables à base de MDP(Thr)1-GDP et P1.
EXEMPLE II - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse à base de l~-acetyl-muramyl-~-threonyl-D-isoglutamine)-~,~-dipalmitoyl-~n -glycérol (M9P~hr)l-GDP) Cette dispersion en présence du composé Pl, est obtenue exactement dans les mêmes conditions que pour le MDP-GDP
EXEMPLE III - Production d'une composition dispersable dans une solution aqueuse d'un a~alogue monophosphoryle du ~ipide A
2.1 mg du dérivé monophosphoryle du lipide A (MPL
produit par Ribi lmmunochem. Research, Inc.) est dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution A).
3,8 mg de P1 sont dissous dans l ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (~) sont reunies. On ajoute de 2 à 3 ml d'eau distillee et fait barboter un courant d'azote à partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'à elimination complète du chloroforme.
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WO92t01475 PCT1FR91/00595 2n87~3~
On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux a la concentration desirèe. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que précedemment. `:
Propriétés biologigue~ de la di~per~ion agueu~e de MPL
~monophosphoryl Lipid A, Ribi immunochem. Research, Inc.) ~vec le composé P1 Activité antibactérienne.
Le MPL est mis en solution selon la procédure recommandee par Ribi immunochem. Research, Inc.. A
partir d'une solution dans le mélange chloroforme :
methanol (4:l) de 20 mg de MPL, une solution mere contenant 4 mg/ml de MPL est ainsi preparée, puis par addition de sérum physiologique depourvu de calcium, solution à 2 mg/ml.
L'essai est réalisé comme decrit dans l'exemple l, paragraphe 3a.
Le compose P1 n'altere pas l'effet protecteur du MPL vis-à-vis d'une infection par ~.pneumoniae. `
' ` ~ ' , " ' ' ~, `'
5 PCT/FR91/00545 7 ~
~ ABLEA~ V
Effet protecteur du MPL (Ribi immunochem. Research Inc.) seul ou en presence du compose P1, vis-a-vis d'une infection par une forte dose (4 x l0 5) de K.pneumoniae, chez la souris Swiss.
TRAITBMBNT 8URVIVANT8/~OTAL
A~ JOUR + lS
-MPL 0,l mg 0/8 MPL l mg 4/8 MPL l0 mg 7/8 MPL/P10,l mg l/8 MPL/P1 l mg 4/8 MPL/P1 l0 mg 8/8 WO92tO1475 PCT/FR91/00595 ;~Q~753 ~
EXEMPLE I~ - Dispersion agueuse d'un analogue mono~accharidique du Lipide A, le MRL 953 (analogue monosaccharidigue ~onophosphoryle), de formule VI, avec le composé P1 0~
~HO~ OH
a) Production de la disPersion 10,65 mg de MRL 953 sont dissous dans O,5 ml de chloroforme (solution A). 16,91 mg de P1 sont dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont reunies. On ajoute 2 a 3 ml d'eau et fait barboter un courant d'azote a partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'a élimination complete du chloroforme. On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, tres légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la WO92/01475 PCT/FR9l/00~5 3 ~
concentration desiree. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que precédemment.
b) ProPrietes bioloqiaues de la disPersion aaueuse du MRL 953 avec le comPose P1 Activite antibactérienne (figures l(a) et l(b) L'effet protecteur contre une infection par K
pneumoniae a été évalué chez des souris Swiss femelles (âgees ~e 5 à 6 semaines). -Les souris ont reçu la veille de l'infection par voie intraveineuse :
- 0,2 ml de sérum physiologique, - LPS (lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis) en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique, - 0,2 ml de ~1) la dispersion aqueuse de P1 + MRL 953, contenant 30, lO, 3 et 1 ~g de MRL 953 ~2) la dispersion dans un solution de glucosée de ~RL 953, contenant 30, 10, 3, et 1 mg de MRL 953.
L'infection par ~.pneumoniae est réalisée par injection intra-veineuse d'une suspension de 0,2 ml d'une suspension de bactéries (contenant 4,5 x 103 bactéries). La mortalité est notée pendant les deux semaines qui suivent l'inoculation des bactéries.
La comparaison des figures l(a) et l(b) montre que l'effet protecteur du MRL 953 est comparable, quelle que soit ~a méthode de dispersion employée. Les figures l(a) et l~b) comprennent en effet des courbes representatives des variations des pourcentages de souris survivantes (% sur les axes des ordonnees) en fonction du temps (T en jours sur les axes des abscisses) lorsque les substances étudiées (LPS et MPL953) ont eté administrees aux doses indiquees à la droite des figures, sous forme dispersee dans :
- une solution glucosee (figure l(a) ) WO92/0147s PCT/FR91/00595 ~7~3~
- une solution du derivé d'oside P1 (figure l(b) ) Il résulte de l'examen des figures que l'effet protecteur des substances etudiees, plus particulierement du MRL9S3, vis-à-vis d'une infection par K.Pneumoniae chez la souris est du même ordre de grandeur dans les deux cas de figure. Il serait même plus efficace, lorsque le MLR953 est administré sous forme de dispersion, en association avec le dérive d'oside P~.
EXENP~E V - I~fluence des dispersions selon l~invention sur les propriétés biologigues d'un principe actif tiers L'association de certains muramylpeptides avec un dérivé d'oside peut de façon très interessante entraîner vis-à-vis d'un principe actif tiers ~
. soit un accroissement de l'activite biologique du principe actif tiers, . soit une diminution de la toxicité de ce principe actif tiers, . soit les deux à la fois.
Ainsi, par exemple, remarque-t-on :
. un accroissement important de l'activité
antivirale de l'interféron, lorsque ce dernier principe actif est administre postérieurement a l'administration de l'association du MDP(Thr)1-GDP et du compose P1 dans les conditions permettant la formation de leur dispersion aqueuse ;
. une diminution de la synergie toxique du- LPS
avec un muramylpeptide prés-ntant un certain effet pyrogène, par exemple le MDP-GDP du compose P1, dans des conditions correspondant à celles deja décrites dans les exemples precedents. En particulier des doses de LPS, léthales pour la souris lorsqu'ils lui sont administrés seuls, ne le sont plus lorsque ces mêmes - . .: , : .
.: ,, ' ' ' .. ,: - , . ~ ' ' ' 3 ~ 38 doses sont administrées en association avec le mélange de MDP-GDP et le composé P1.
En d'autres termes, l'invention concerne encore l'application des compositions selon l'invention à la modulation de proprietes biologiques de composes tiers, administrés de façon concomitante ou non.
Ces effets de modulation sont encore illustrés de façon non-limitative par les exemples dont les résultats sont rapportés ci-dessous.
~ l) - Influence de l~utilisatio~ du compo~é P1 sur les propriétés immunostimulantes des muramylpeptides lipophiles a) - Auqmentation de 1'activite antivirale de l'interféron par le MDP(Thr~1-GDP
Le modele expérimental est l'encéphalomyocardite de la souris. Les animaux sont des souris mâles (Swiss, 17 g). Elles reçoivent par la voie intraperitoneale soit une suspension aqueuse du seul MDP(Thr)1-GDP, soit une dispersion aqueuse de MDP(Thr)1-GDP et de compose Apres 24 heures, il leur est injecté le virus de l'encéphalomyocardite par voie intrapéritonéale à
raison de lO0 fois la DL 50. Une heure apres cette injection, certains animaux reçoivent par voie intrapéritonéale 25.000 U.I. d'interféron ~,~ de souris.
Le tableau VI présente les résultats obtenus. Il en résulte que l'utilisation du composé P1 ne diminue pas, mais au contraire augmente l'activite antivirale propre du MDP(Thr)1-GDP, et l'effet de potentialisation de l'activité antivirale de l'interféron par ce muramylpeptide lipophile.
1, .. . , .. . ,, . . , , . I ' ~ ., ", , :'~ ', .. ' - " , . ", ' ........ . .
. ~
w~75'~
T~BLEAU VI
.~ . .
Augmentation de l'activite antivirale de l'interféron ~,~ vis-a-vis d'une infection par le virus de .:-l'encéphalomyocardite, chez la souris .:
T~AITENENT i.p. INTERFERON ~,~ % DE S~RVIE
A J - l .
Témoin - %
P1 ~600 ~g) _ 0 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) ` - 20 %
1P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) - 35 %
_ + 30 %
P1 (600 ~g) + 30 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) + 46 %
¦P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g3 + 70 %
b) - Influence d'un Pré-traitement par les muramvlpePtides liPophiles sur la Production de TNF circulant consecutive a l'iniection de LPS
ou d'un analoque svnthetique de LiPide A
(Tableau VII~
Les souris Swiss reçoivent une injection intraveineuse de :
- 0,2 ml de serum physiologique, - - du MDP-GDP en suspension dans 0,2 ml de serum physiologique, - du MDP(Thr)1-GDP en suspension aqueuse, seul, ou en dispersion aqueuse, en presence du compose Pl, - du Murabutide en solution dans 0,2 ml de serum physiologique.
WO 92/01475 PCI`/FR91/00!;95 r~
L'injection intraveineuse qui précede est faite 6 heures avant l'injection de LPS (S. enteritidis) dans du sérum physiologique ou bien de MRL 953 dispersé dans du serum physiologique en presence de P1.
Les animaux sont saignés à l'aorte abdominale de 1,5 a 2 heures (temps optimum de réponse) après cette derniere injection. L'activite TNF est évaluee par le -test de cytotoxicite etant mesurée par le nombre de cellules viables. Une unité de TNF représente la concentration qui produit 50 % de cytotoxicité dans les conditions données.
Les suspensions aqueuses de MDP lipophiles stimulent la réponse TNF a la stimulation par le LPS ou par la dispersion aqueuse de MRL 953 en presence de P1.
Cet effet est légèrement accentué avec les dispersions aqueuses de ces MDP lipophiles en presence du compoSe P1~
WO92/~1475 PCT/FR91/00595 41 ~7~3i3 TAB~EA~ VIS ;~:
Influence d'un pre-traitement par un MDP lipophile sur la production de TNF sérique consécutive à l'injection de LPS ou d'un analogue synthétique du Lipide A
(MRL 953).
TRAITEMENT i.v. CHALLENGE ACTSVS~B TN~
H - 6 LPS l~g ( en U.I./ml) ~RL953/P1 300 ~g 1,5h2h aucun LPS 879 MDP-GDP 100 ~g LPS 2,947 MDP(Thr)t-GDP 100 ~g LPS 4,235 aucun LPS 900 - ~ -MDP(Thr)1-GDP 100 ~g LPS 3,311 ¦MDP(Thr)1-GDP 100 ~g ,~
I+ P1 LPS 7,347 aucun MRL953/P1 <10 ~10 MDP(Thr)l-GDP 100 mg MRL953tP11,089 488 ¦MDP(Thr)1-GDP 100 mg ¦+ P1 MRL953/P1 ~ 1,838 Murabutide 100 mg MRL953/P1 ~ 1,150 aucun MRL953/P1 76 Murabutide MRL953/P1 820 WO 92/01475 PCr/FRgl/00595 r~
c) - Diminution de la syner~ie toxioue du LPS et du MDP-GDP en Presence du compose P1 (TABLEAU ~III) Le MDP-GDP, ~is en suspension dans 0, 2 ml de serum physiologique, seul, ou dans une solution glucosee en presence d'acide pluronique (F 68, SERVA), OU encore en dispersion dans 0, 2 ml de serum physiologigue en présence du composé P1, est administrée par voie intraveineuse avec le LPS (S. enteritidis) à des souris Swiss adrénalectomisees.
La mortalité est notée en 3 jours, mais elle se produit le plus souvent en 24 à 48 heures.
Les suspensions de MDP-GDP dans le serum physiologique ou dans une solution glucosée d'acide pluronique augmente la toxicité du LPS in~ecte simultanement. La dispersion de MDP-GDP en presence de P1 diminue cet effet.
Cette diminution de l'effet toxique n'est ras due à un effet direct du compose Pt sur le LPS iont la toxicité demeure chez la souris normale en presence du -composé P1 (résultats non presentes). ~-On remarqiuera que l'interêt de ces résultats -réside dans le fait que l'association avec le dérive -~ -d'oside permet d'envisager l'utilisation in vivo d'un plus grand nombre de produits lipophiles, par exemple de muramylpeptides lipophiles qui, tels le MDP-GDP, peuvent présenter une certaine pyroginicité résiduelle, sans que l'on ait pour autant a craindre une synergie :
toxique importante, in vivo, de ces produits avec les LPS des organismes infectieux eventuellement presents chez l'hôte.
,; .. ' ' , ' :. ' , ,', 'i , .~ ~.
43 `~ '7 ~ ~ ~
TABLEA~ VIII
Reduction de la synergie toxique du LPS et du MDP-GDP
en presence de P1 .
VE~IC~LE MDP--GDP LPSMORTS/TOTAL
~lg) ~25 lg) sérum physiologique - + 0/18 ~ .
100 + 7/18 p<O, 02 300 + 17/18 p<O, 01 solution glucosée d ' acide pluronique (F68) - + 0/18 100 + 8/18 p<0, 01 300 + 17/18 p<0, 01 ~-dispersion aqueuse, en présence de P1 ~ + 0/18 100 + 0/18 300 + 6/18 p<O, 05 ~
300 - 0/18 : :
,: . . : . : ,
~ ABLEA~ V
Effet protecteur du MPL (Ribi immunochem. Research Inc.) seul ou en presence du compose P1, vis-a-vis d'une infection par une forte dose (4 x l0 5) de K.pneumoniae, chez la souris Swiss.
TRAITBMBNT 8URVIVANT8/~OTAL
A~ JOUR + lS
-MPL 0,l mg 0/8 MPL l mg 4/8 MPL l0 mg 7/8 MPL/P10,l mg l/8 MPL/P1 l mg 4/8 MPL/P1 l0 mg 8/8 WO92tO1475 PCT/FR91/00595 ;~Q~753 ~
EXEMPLE I~ - Dispersion agueuse d'un analogue mono~accharidique du Lipide A, le MRL 953 (analogue monosaccharidigue ~onophosphoryle), de formule VI, avec le composé P1 0~
~HO~ OH
a) Production de la disPersion 10,65 mg de MRL 953 sont dissous dans O,5 ml de chloroforme (solution A). 16,91 mg de P1 sont dissous dans 0,5 ml de chloroforme (solution B).
Les solutions chloroformiques (A) et (B) sont reunies. On ajoute 2 a 3 ml d'eau et fait barboter un courant d'azote a partir du fond du tube contenant les deux phases, jusqu'a élimination complete du chloroforme. On obtient une dispersion aqueuse homogène et stable, tres légèrement opalescente.
La dispersion aqueuse est lyophilisee et la poudre obtenue est reprise dans un solvant aqueux à la WO92/01475 PCT/FR9l/00~5 3 ~
concentration desiree. On obtient une dispersion de même aspect et qualité que precédemment.
b) ProPrietes bioloqiaues de la disPersion aaueuse du MRL 953 avec le comPose P1 Activite antibactérienne (figures l(a) et l(b) L'effet protecteur contre une infection par K
pneumoniae a été évalué chez des souris Swiss femelles (âgees ~e 5 à 6 semaines). -Les souris ont reçu la veille de l'infection par voie intraveineuse :
- 0,2 ml de sérum physiologique, - LPS (lipopolysaccharide de Salmonella enteritidis) en suspension dans 0,2 ml de sérum physiologique, - 0,2 ml de ~1) la dispersion aqueuse de P1 + MRL 953, contenant 30, lO, 3 et 1 ~g de MRL 953 ~2) la dispersion dans un solution de glucosée de ~RL 953, contenant 30, 10, 3, et 1 mg de MRL 953.
L'infection par ~.pneumoniae est réalisée par injection intra-veineuse d'une suspension de 0,2 ml d'une suspension de bactéries (contenant 4,5 x 103 bactéries). La mortalité est notée pendant les deux semaines qui suivent l'inoculation des bactéries.
La comparaison des figures l(a) et l(b) montre que l'effet protecteur du MRL 953 est comparable, quelle que soit ~a méthode de dispersion employée. Les figures l(a) et l~b) comprennent en effet des courbes representatives des variations des pourcentages de souris survivantes (% sur les axes des ordonnees) en fonction du temps (T en jours sur les axes des abscisses) lorsque les substances étudiées (LPS et MPL953) ont eté administrees aux doses indiquees à la droite des figures, sous forme dispersee dans :
- une solution glucosee (figure l(a) ) WO92/0147s PCT/FR91/00595 ~7~3~
- une solution du derivé d'oside P1 (figure l(b) ) Il résulte de l'examen des figures que l'effet protecteur des substances etudiees, plus particulierement du MRL9S3, vis-à-vis d'une infection par K.Pneumoniae chez la souris est du même ordre de grandeur dans les deux cas de figure. Il serait même plus efficace, lorsque le MLR953 est administré sous forme de dispersion, en association avec le dérive d'oside P~.
EXENP~E V - I~fluence des dispersions selon l~invention sur les propriétés biologigues d'un principe actif tiers L'association de certains muramylpeptides avec un dérivé d'oside peut de façon très interessante entraîner vis-à-vis d'un principe actif tiers ~
. soit un accroissement de l'activite biologique du principe actif tiers, . soit une diminution de la toxicité de ce principe actif tiers, . soit les deux à la fois.
Ainsi, par exemple, remarque-t-on :
. un accroissement important de l'activité
antivirale de l'interféron, lorsque ce dernier principe actif est administre postérieurement a l'administration de l'association du MDP(Thr)1-GDP et du compose P1 dans les conditions permettant la formation de leur dispersion aqueuse ;
. une diminution de la synergie toxique du- LPS
avec un muramylpeptide prés-ntant un certain effet pyrogène, par exemple le MDP-GDP du compose P1, dans des conditions correspondant à celles deja décrites dans les exemples precedents. En particulier des doses de LPS, léthales pour la souris lorsqu'ils lui sont administrés seuls, ne le sont plus lorsque ces mêmes - . .: , : .
.: ,, ' ' ' .. ,: - , . ~ ' ' ' 3 ~ 38 doses sont administrées en association avec le mélange de MDP-GDP et le composé P1.
En d'autres termes, l'invention concerne encore l'application des compositions selon l'invention à la modulation de proprietes biologiques de composes tiers, administrés de façon concomitante ou non.
Ces effets de modulation sont encore illustrés de façon non-limitative par les exemples dont les résultats sont rapportés ci-dessous.
~ l) - Influence de l~utilisatio~ du compo~é P1 sur les propriétés immunostimulantes des muramylpeptides lipophiles a) - Auqmentation de 1'activite antivirale de l'interféron par le MDP(Thr~1-GDP
Le modele expérimental est l'encéphalomyocardite de la souris. Les animaux sont des souris mâles (Swiss, 17 g). Elles reçoivent par la voie intraperitoneale soit une suspension aqueuse du seul MDP(Thr)1-GDP, soit une dispersion aqueuse de MDP(Thr)1-GDP et de compose Apres 24 heures, il leur est injecté le virus de l'encéphalomyocardite par voie intrapéritonéale à
raison de lO0 fois la DL 50. Une heure apres cette injection, certains animaux reçoivent par voie intrapéritonéale 25.000 U.I. d'interféron ~,~ de souris.
Le tableau VI présente les résultats obtenus. Il en résulte que l'utilisation du composé P1 ne diminue pas, mais au contraire augmente l'activite antivirale propre du MDP(Thr)1-GDP, et l'effet de potentialisation de l'activité antivirale de l'interféron par ce muramylpeptide lipophile.
1, .. . , .. . ,, . . , , . I ' ~ ., ", , :'~ ', .. ' - " , . ", ' ........ . .
. ~
w~75'~
T~BLEAU VI
.~ . .
Augmentation de l'activite antivirale de l'interféron ~,~ vis-a-vis d'une infection par le virus de .:-l'encéphalomyocardite, chez la souris .:
T~AITENENT i.p. INTERFERON ~,~ % DE S~RVIE
A J - l .
Témoin - %
P1 ~600 ~g) _ 0 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) ` - 20 %
1P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) - 35 %
_ + 30 %
P1 (600 ~g) + 30 %
MDP(Thr)1-GDP (600 ~g) + 46 %
¦P1 (600 ~g) +
¦MDP(Thr)1-GDP (600 ~g3 + 70 %
b) - Influence d'un Pré-traitement par les muramvlpePtides liPophiles sur la Production de TNF circulant consecutive a l'iniection de LPS
ou d'un analoque svnthetique de LiPide A
(Tableau VII~
Les souris Swiss reçoivent une injection intraveineuse de :
- 0,2 ml de serum physiologique, - - du MDP-GDP en suspension dans 0,2 ml de serum physiologique, - du MDP(Thr)1-GDP en suspension aqueuse, seul, ou en dispersion aqueuse, en presence du compose Pl, - du Murabutide en solution dans 0,2 ml de serum physiologique.
WO 92/01475 PCI`/FR91/00!;95 r~
L'injection intraveineuse qui précede est faite 6 heures avant l'injection de LPS (S. enteritidis) dans du sérum physiologique ou bien de MRL 953 dispersé dans du serum physiologique en presence de P1.
Les animaux sont saignés à l'aorte abdominale de 1,5 a 2 heures (temps optimum de réponse) après cette derniere injection. L'activite TNF est évaluee par le -test de cytotoxicite etant mesurée par le nombre de cellules viables. Une unité de TNF représente la concentration qui produit 50 % de cytotoxicité dans les conditions données.
Les suspensions aqueuses de MDP lipophiles stimulent la réponse TNF a la stimulation par le LPS ou par la dispersion aqueuse de MRL 953 en presence de P1.
Cet effet est légèrement accentué avec les dispersions aqueuses de ces MDP lipophiles en presence du compoSe P1~
WO92/~1475 PCT/FR91/00595 41 ~7~3i3 TAB~EA~ VIS ;~:
Influence d'un pre-traitement par un MDP lipophile sur la production de TNF sérique consécutive à l'injection de LPS ou d'un analogue synthétique du Lipide A
(MRL 953).
TRAITEMENT i.v. CHALLENGE ACTSVS~B TN~
H - 6 LPS l~g ( en U.I./ml) ~RL953/P1 300 ~g 1,5h2h aucun LPS 879 MDP-GDP 100 ~g LPS 2,947 MDP(Thr)t-GDP 100 ~g LPS 4,235 aucun LPS 900 - ~ -MDP(Thr)1-GDP 100 ~g LPS 3,311 ¦MDP(Thr)1-GDP 100 ~g ,~
I+ P1 LPS 7,347 aucun MRL953/P1 <10 ~10 MDP(Thr)l-GDP 100 mg MRL953tP11,089 488 ¦MDP(Thr)1-GDP 100 mg ¦+ P1 MRL953/P1 ~ 1,838 Murabutide 100 mg MRL953/P1 ~ 1,150 aucun MRL953/P1 76 Murabutide MRL953/P1 820 WO 92/01475 PCr/FRgl/00595 r~
c) - Diminution de la syner~ie toxioue du LPS et du MDP-GDP en Presence du compose P1 (TABLEAU ~III) Le MDP-GDP, ~is en suspension dans 0, 2 ml de serum physiologique, seul, ou dans une solution glucosee en presence d'acide pluronique (F 68, SERVA), OU encore en dispersion dans 0, 2 ml de serum physiologigue en présence du composé P1, est administrée par voie intraveineuse avec le LPS (S. enteritidis) à des souris Swiss adrénalectomisees.
La mortalité est notée en 3 jours, mais elle se produit le plus souvent en 24 à 48 heures.
Les suspensions de MDP-GDP dans le serum physiologique ou dans une solution glucosée d'acide pluronique augmente la toxicité du LPS in~ecte simultanement. La dispersion de MDP-GDP en presence de P1 diminue cet effet.
Cette diminution de l'effet toxique n'est ras due à un effet direct du compose Pt sur le LPS iont la toxicité demeure chez la souris normale en presence du -composé P1 (résultats non presentes). ~-On remarqiuera que l'interêt de ces résultats -réside dans le fait que l'association avec le dérive -~ -d'oside permet d'envisager l'utilisation in vivo d'un plus grand nombre de produits lipophiles, par exemple de muramylpeptides lipophiles qui, tels le MDP-GDP, peuvent présenter une certaine pyroginicité résiduelle, sans que l'on ait pour autant a craindre une synergie :
toxique importante, in vivo, de ces produits avec les LPS des organismes infectieux eventuellement presents chez l'hôte.
,; .. ' ' , ' :. ' , ,', 'i , .~ ~.
43 `~ '7 ~ ~ ~
TABLEA~ VIII
Reduction de la synergie toxique du LPS et du MDP-GDP
en presence de P1 .
VE~IC~LE MDP--GDP LPSMORTS/TOTAL
~lg) ~25 lg) sérum physiologique - + 0/18 ~ .
100 + 7/18 p<O, 02 300 + 17/18 p<O, 01 solution glucosée d ' acide pluronique (F68) - + 0/18 100 + 8/18 p<0, 01 300 + 17/18 p<0, 01 ~-dispersion aqueuse, en présence de P1 ~ + 0/18 100 + 0/18 300 + 6/18 p<O, 05 ~
300 - 0/18 : :
,: . . : . : ,
Claims (29)
1. Composition susceptible d'être solubilisée ou dispersée de façon homogène et stable dans une solution aqueuse pharmaceutiquement acceptable, caractérisée par l'association :
- d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarboné comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérivé osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au moins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce dérivé osidique étant en une proportion suffisante par rapport au principe actif lipophile pour promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
- d'une part, d'un principe actif lipophile de médicament ou "substance pharmacologiquement active", comprenant au moins un groupe hydrocarboné comportant lui-même au moins 3 atomes de carbone, et - d'autre part, d'un dérivé osidique solubilisateur, lui-même hydrosoluble, pharmaceutiquement acceptable, portant lui-même un groupe hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone et comprenant une ou plusieurs fonctions hydroxyle, dont au moins l'une est substituée par un groupe phosphate ou sulfate, ce dérivé osidique étant en une proportion suffisante par rapport au principe actif lipophile pour promouvoir la solubilisation ou la dispersion de l'ensemble de la composition dans une solution aqueuse.
2. Composition selon la revendication l, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active lipophile est une substance de type saccharide, peptide ou polypeptide, à caractère cyclique ou non, glycopeptides à caractère cyclique ou non, porteur d'au moins une chaîne hydrocarbonée comportant au moins trois atomes de carbone.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le groupe . hydrocarboné est constitué :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
4. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est un dérivé lipophile de muramyl-peptide.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composes répondant à la formule (II) suivante :
dans laquelle - R5 représente H ou CH3 ;
- R6 représente un groupe - NH2, -OH ou un groupe -OW1, W1 étant un groupe hydrocarboné comportant de 1 à 10 atomes de carbone ;
- X représente un résidu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, thréonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
- Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 étant un groupe hydrocarboné de 1 à 4 atomes de carbone, soit encore un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", étant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et z est toujours constitue par un groupement lipophile du type A ou du type B ;
- n1 et n2, identiques ou différents, représentent zéro ou 1, - A1 et B1 sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de 1 à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et 10.
dans laquelle - R5 représente H ou CH3 ;
- R6 représente un groupe - NH2, -OH ou un groupe -OW1, W1 étant un groupe hydrocarboné comportant de 1 à 10 atomes de carbone ;
- X représente un résidu aminoacyle du groupe comprenant alanyle, valyle, isoleucyle, norleucyle, leucyle, thréonyle, prolyle, glutaminyle, asparaginyle, méthionyle, tryptophanyle, phénylalanyle, tyrosyle, glycyle ;
- Y représente soit OH, soit NH2, ou un groupe -OW2, W2 étant un groupe hydrocarboné de 1 à 4 atomes de carbone, soit encore un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - Z représente soit H, soit un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", étant cependant entendu que l'un au moins des deux groupes Y et z est toujours constitue par un groupement lipophile du type A ou du type B ;
- n1 et n2, identiques ou différents, représentent zéro ou 1, - A1 et B1 sont soit des groupes respectivement identiques ou différents comprenant de 1 à 3 résidus aminoacyles, eux-mêmes identiques ou différents entre eux, ou encore un groupe -NH-(CH2)p-CO- avec des valeurs de p comprises entre 2 et 10.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composés de formule (II) dans laquelle :
- n1 et n2 représentent zéro, - R5 représente CH3, - R6 représente -OH, -NH2 ou avec x1 compris entre 1 et 6, avec une préférence pour X1=4, - X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y représente -O-CH2-CHO(R7)-CH2O(R8), Z représente H, et lorsque Z représente ?
-C-CHO(R7)-CH2O(R8), Y représente -OH, -NH2 ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée dans la revendication 6, et R7 et R8 étant des groupes palmitoyles.
- n1 et n2 représentent zéro, - R5 représente CH3, - R6 représente -OH, -NH2 ou avec x1 compris entre 1 et 6, avec une préférence pour X1=4, - X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y représente -O-CH2-CHO(R7)-CH2O(R8), Z représente H, et lorsque Z représente ?
-C-CHO(R7)-CH2O(R8), Y représente -OH, -NH2 ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée dans la revendication 6, et R7 et R8 étant des groupes palmitoyles.
7. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est choisie parmi les composés de formule (II) dans laquelle :
- n1 et n2 représentent zéro, - R5 représente CH3, - R6 représente -OH, ou -NH2 ou -On (CH2)x1H avec x1 compris entre 1 et 6, avec une préférence pour x1=4, - X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y représente -O-(CH2)x2H avec x2 = 8, Z
représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)x2H, avec x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée dans la revendication 6.
- n1 et n2 représentent zéro, - R5 représente CH3, - R6 représente -OH, ou -NH2 ou -On (CH2)x1H avec x1 compris entre 1 et 6, avec une préférence pour x1=4, - X est L ou D-alanyle, L-thréonyle, L-valyle, - lorsque Y représente -O-(CH2)x2H avec x2 = 8, Z
représente H, et lorsque Z représente -CO(CH2)x2H, avec x2 = 8, Y représente -OH, -NH2, ou un groupe -OW2, W2 ayant la signification indiquée dans la revendication 6.
8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est formée à partir de constituants d'origine bactérienne, entre autres des constituants de la paroi bactérienne : dérivés du tréhalose, notamment du type du TDM (produits de la classe des tréhalose dimycolates), lipolysaccharides (LPS), comportant d'une part des chaînes lipidiques et, d'autre part, au moins un groupe phosphate ou sulfate.
9. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est une fraction lipidique obtenue à partir de ces LPS, en particulier le "Lipide A", cette fraction comportant au moins un groupe phosphate ou sulfate.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est formée de dérivés ou analogues du lipide A, mono- ou di-saccharidiques, mono- ou diphosphorylés, porteurs de chaînes ramifiées ou encore de chaînes hydrocarbonées linéaires, pouvant être elles-mêmes substituées ou non, par des chaînes hydrocarbonées linéaires au moyen de liaisons ester, thioester, éther ou thioéther.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un lipide A monophosphorylé, notamment le MPL.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un analogue du lipide A répondant à la formule générale (IV), dans laquelle:
R4 et R'1 représentent H ou PO4, avec au moins R4 ou R'1 étant un groupe PO4 R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
R4 et R'1 représentent H ou PO4, avec au moins R4 ou R'1 étant un groupe PO4 R2, R3 et R'2, R'3 représentent CO-CH(OR)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant CO-(CH2)y-CH3 y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est constituée par un dérive monosaccharidique du lipide A répondant à la formule générale (V) :
dans laquelle :
R1 représente H ou PO3 R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant H ou OH ou encore CO-(CH2)y-CH3, y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12, R4 représente PO3 si R1 n'est pas PO3, OU H ou encore l'une des significations données à R2 et R3.
dans laquelle :
R1 représente H ou PO3 R2 et R3 représentent CO-CH(R)-(CH2)x-CH3, x étant compris entre 5 et 15, avec une préférence pour x = 10, et R étant H ou OH ou encore CO-(CH2)y-CH3, y étant compris entre 5 et 15 avec une préférence pour y = 10 ou 12, R4 représente PO3 si R1 n'est pas PO3, OU H ou encore l'une des significations données à R2 et R3.
14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que le dérivé monosaccharidique du lipide A est le compose de formule VI :
15. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active lipophile est une substance de type peptide cyclique, tel qu'une cyclosporine.
16. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que la substance pharmacologiquement active est une substance de type peptidique, tel que la gramicidine, ou une substance de type macrolide, telle que la leucensomycine, ou une substance de type pseudopeptidique, tel que la valinomycine, ou une vitamine liposoluble, notamment de type vitamine A, D, E, K,
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que le dérivé
osidique est représenté par la formule (I) suivante :
dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (C1) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2, R3, R'3, R4 ou R'4 représentant un résidu sulfate ou phosphate.
osidique est représenté par la formule (I) suivante :
dans laquelle :
- R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone, notamment un groupement lipophile "de type A" ou "de type B", - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (C1) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2, R3, R'3, R4 ou R'4 représentant un résidu sulfate ou phosphate.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le groupe R ou le groupe R' est constitué :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioéther, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioéther, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
19. Composition selon la revendication 17 ou la revendication 18, caractérisée en ce que le dérive osidique est choisi parmi les composés suivants :
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée dans la revendication 17 ou 18.
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée dans la revendication 17 ou 18.
20. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que le dérivé osidique est choisi parmi les composes suivants :
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-suyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glyceroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-.alpha.-.alpha.'-D-tréhalose.
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-suyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glyceroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-.alpha.-.alpha.'-D-tréhalose.
21. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B", (2) un dérivé osidique associé de façon non covalente à
la substance (1), ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B", (2) un dérivé osidique associé de façon non covalente à
la substance (1), ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
22. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 en combinaison avec l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B", (2) un dérivé osidique associe de façon non covalente à
la substance (1), ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
(1) une substance pharmacologiquement active, insolu-ble dans l'eau, cette substance étant substituée :
. soit par une groupement lipophile "de type A", . soit par une groupement lipophile "de type B", (2) un dérivé osidique associe de façon non covalente à
la substance (1), ce dérivé osidique étant lui-même substitué :
. soit par au moins un groupement lipophile "de type A" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type B", . soit par au moins un groupement lipophile "de type B" lorsque ladite substance pharmacologiquement active est substituée par un groupement lipophile "de type A", l'une au moins des fonctions hydroxyle du dérivé
osidique sus-mentionné étant substituée par un, ou plusieurs, groupe(s) phosphate ou sulfate.
23. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que le dérivé
d'oside et la substance pharmacologiquement active sont avantageusement dans un rapport pondéral de 0,25 à 4, notamment de 0,5 à 1,5.
d'oside et la substance pharmacologiquement active sont avantageusement dans un rapport pondéral de 0,25 à 4, notamment de 0,5 à 1,5.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce qu'elle est à
l'état anhydre, notamment sous forme de lyophilisat.
l'état anhydre, notamment sous forme de lyophilisat.
25. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, soit à l'état anhydre, soit à l'état dispersé dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable.
26. Dérivé d'oside répondant à la formule générale (I) suivante :
dans laquelle - R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone, - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (C1) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2. R3, R'3, R4 ou R'4 représentant un résidu sulfate ou phosphate, étant entendu que l'un au moins des groupes précédents est un groupe sulfate.
dans laquelle - R représente un groupement hydrocarboné comportant au moins 3 atomes de carbone, - R2 représente H, ou OH, ou un groupement acétamido, sulfate, sulfamido, phosphate, phosphamido, - R3 et R4, identiques ou différents, représentent soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un groupement sulfate ou phosphate, - R1 représente soit H, soit OH, ou OCH3, ou encore un résidu ose ou osamine dont le carbone anomérique en position 1 (C1) est engagé dans une liaison glycosidique, les positions C2, C3 et C4 étant respectivement substituées par des groupes R'2, R'3, et R'4 ayant respectivement les significations données ci-dessus pour R2, R3, et R4, et la position C6 par un groupe R' ayant la signification donnée ci-dessus pour R, l'un au moins des groupes R2, R'2. R3, R'3, R4 ou R'4 représentant un résidu sulfate ou phosphate, étant entendu que l'un au moins des groupes précédents est un groupe sulfate.
27. Dérivé d'oside selon la revendication 26, caractérisée en ce que le groupe R ou le groupe R' est constitué :
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioéther, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
. soit par au moins une structure hydrocarbonée linéaire de 3 à 20, notamment de 4 à 20 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une liaison éther, ester, thioether, thioester, ou amide, cette structure linéaire étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type A", . soit par au moins une structure hydrocarbonée ramifiée de 5 à 50, notamment de 10 à 50 atomes de carbone, comprenant le cas échéant, une ou plusieurs liaison(s) éther, ester, thioéther, thioester, ou amide, cette structure ramifiée étant désignée ci-après par groupement lipophile "de type B".
28. Dérive d'oside selon la revendication 26 ou la revendication 27, répondant à l'une des formules suivantes :
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée dans la revendication 26 ou la revendication 27.
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-OR-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl 4-sulfate-6-OR-2-desoxy-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-OR-glucopyrano-se, - 4-sulfate-6-OR-glucopyranose, - 6,6'-di-OR-4,4'-di-sulfate-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, R ayant la signification indiquée dans la revendication 26 ou la revendication 27.
29. Dérivé d'oside selon la revendication 26, répondant à l'une des formules suivantes:
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-.alpha.-.alpha.'-D-tréhalose.
- .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy -glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside-N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl) glycéroyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-octanoyl-2-désoxy-glucosamine, - N-acétyl-4-sulfate-6-(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-2-désoxy-D-glucosamine, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-octanoyl-glu-copyranoside, - .alpha. ou .beta.-méthyl-glycoside 4-sulfate-6-(2,3-dipalmi-toyl)-glycéroyl-D-glucopyranoside, - 4-sulfate-6-octanoyl-D-glucopyranose, - 4-sulfate-6(2,3-di-palmitoyl)-glycéroyl-glucopyranose - 4,4' di-sulfate-6,6' di-octanoyl-.alpha.,.alpha.'-D-tréhalose, - 4,4'di-sulfate-6,6'(2,3-dipalmitoyl)-glycéroyl-.alpha.-.alpha.'-D-tréhalose.
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