CA1341376C - Concentre de proteines coagulables par la thrombine, son procede d'obtention et son utilisation therapeutique - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un concentré de protéines coagulables par la thrombine, sa préparation et son utilisation thérapeutique. Ce concentré présente une teneur en fibrinogène supérieure à 70% et une quantité suffisante de Facteur XIII endogène. Il peut être solubilisé à température ambiante. Sa préparation fait intervenir au moins une étape de précipitation à froid l'éthanol dilué et utilise comme produit de départ le plasma total. Le concentré de l'invention permet notamment d'obtenir un fibrinogène injectable et une colle biologique de haute qualité.
Description
1 341 37 fi La présente invention porte sur un concentré de protéines coagulables par la thrombine, son procédé d'obtention à partir de plasma total et son utilisation à des fins théra-peutiques.
Ce type de concentré peut ëtre utilisé pour obtenir par redissolution un fibrinogëne injectable ou une colle bio-logique.
Ainsi qu'on le sait, les injections de fibrinogène permettent de traiter les états d'hypofibrinogëmie ou d'afi brinogé~nie constitutionnelle, avec ou sans hémorragies, et également les syndromes de défibrination aiguë avec hémorra-gies graves, en association avec le traitement étiologique, l'héparinothérapie ou les anti-fibrinolytiques.
Les colles biologiques, d'autre part, permettent d'apporter une aide efficace lors de certains épisodes clini-ques tels que les greffes de peau, les sutures nerveuses ou artérielles,'les cicatrisations rapides ou toute utilisation oû un effet hémostatique et/ou bactériostatique et/ou esthé-tique est recherché. En effet, le fibrinogène, constituant majeur d'un tel concentré, subit une dégradation enzymatique au contact avec la thrombine activée par des ions calcium.
Après élimination des fibrinopeptides A et B les monomères de fibrine polymérisent alors spontanément est génërent de la fibrine soluble. La prësence de Facteur XIII dans ce type de produit contribue â stabiliser la fibrine par des liaisons covalentes en la rendant insoluble, c''est-à-dire résistante aux solvants, par exemple l'urée. La fibrine ainsi stabilisée, en plus de son rôle coagulant, est plus résistante à la fibri-nolyse et à la traction mécanique.
Pour ces différentes utilisations thérapeutiques il est nécessaire de disposer d'un produit d'origine plasma-tique présentant une bonne solubilité et stable dans les conditions de son utilisation. En ce qui concerne les colles biologiques il est outre nécessaire qu'elles présentent, 1 3'~1 376
Ce type de concentré peut ëtre utilisé pour obtenir par redissolution un fibrinogëne injectable ou une colle bio-logique.
Ainsi qu'on le sait, les injections de fibrinogène permettent de traiter les états d'hypofibrinogëmie ou d'afi brinogé~nie constitutionnelle, avec ou sans hémorragies, et également les syndromes de défibrination aiguë avec hémorra-gies graves, en association avec le traitement étiologique, l'héparinothérapie ou les anti-fibrinolytiques.
Les colles biologiques, d'autre part, permettent d'apporter une aide efficace lors de certains épisodes clini-ques tels que les greffes de peau, les sutures nerveuses ou artérielles,'les cicatrisations rapides ou toute utilisation oû un effet hémostatique et/ou bactériostatique et/ou esthé-tique est recherché. En effet, le fibrinogène, constituant majeur d'un tel concentré, subit une dégradation enzymatique au contact avec la thrombine activée par des ions calcium.
Après élimination des fibrinopeptides A et B les monomères de fibrine polymérisent alors spontanément est génërent de la fibrine soluble. La prësence de Facteur XIII dans ce type de produit contribue â stabiliser la fibrine par des liaisons covalentes en la rendant insoluble, c''est-à-dire résistante aux solvants, par exemple l'urée. La fibrine ainsi stabilisée, en plus de son rôle coagulant, est plus résistante à la fibri-nolyse et à la traction mécanique.
Pour ces différentes utilisations thérapeutiques il est nécessaire de disposer d'un produit d'origine plasma-tique présentant une bonne solubilité et stable dans les conditions de son utilisation. En ce qui concerne les colles biologiques il est outre nécessaire qu'elles présentent, 1 3'~1 376
2 après mise en contact avec la thrombine calcique, un haut pouvoir adhésif et une grande élasticité.
L'obtention de telles caractéristiques est directe-ment liée à la nature du produit, et donc à son mode de pu-s rification à partir du plasma. Il est donc utile de disposer d'une technique de préparation facilement mise en oeuvre à
l'échelle industrielle mais qui soit aussi suffisamment douce pour ne pas altérer les qualités biochimiques du produit pour l'utilisation recherchée par les cliniciens.
On connait déjà, notamment d'après les brevets français N°s 2 448 900 et 2 448 901, des colles renfermant du fibrinogène et du Facteur XIII. Ces produits sont obtenus à partir de cryoprécipité de plasma par traitement avec une solution tampon contenant un inhibiteur-activateur du plasmi-nogène ou inhibiteur de la plasmine, qui se retrouve présent dans la colle â l'état lyophilisé.
Ces produits présentent des caractéristiques inté-ressantes. Toutéfois, ces produits sont obtenus selon des méthodes de production du fibrinogêne assez complexes qui nécessitent, pour avoir un mélange final satisfaisant, l'ad-jonction exogène d'autres protéïnes plasmatiques comme le Facteur XIII. De plus, il faut adjoindre en cours de produc-tion des inhibiteurs, tels des inhibiteurs de protéases, d'origine animale comme l'aprotinine bovine.
Par ailleurs les concentrés de protéines connus, en particulier ceux utilisés à titre de colles, ne se solubilisent pas en milieu aqueux à température ambiante et peuvent même étre difficiles à solubiliser â 37°C, obligeant à ajouter dans le flacon de lyophilisation du produit un barreau aimanté et à disposer d'un agitateur magnétique pour accélérer la remise en solution.
I1 serait donc tout à fait bénéfique de disposer d'une méthode simple de production de colle biologique permet-tant d'obtenir,sans apport exogêne de protéines,un mélange protéinique répondant aux qualités souhaitées pour un tel produit. En particulier, pour l'utilisation en tant que colle, le concentré obtenu devrait posséder un contenu satisfaisant ~ 341 37 6
L'obtention de telles caractéristiques est directe-ment liée à la nature du produit, et donc à son mode de pu-s rification à partir du plasma. Il est donc utile de disposer d'une technique de préparation facilement mise en oeuvre à
l'échelle industrielle mais qui soit aussi suffisamment douce pour ne pas altérer les qualités biochimiques du produit pour l'utilisation recherchée par les cliniciens.
On connait déjà, notamment d'après les brevets français N°s 2 448 900 et 2 448 901, des colles renfermant du fibrinogène et du Facteur XIII. Ces produits sont obtenus à partir de cryoprécipité de plasma par traitement avec une solution tampon contenant un inhibiteur-activateur du plasmi-nogène ou inhibiteur de la plasmine, qui se retrouve présent dans la colle â l'état lyophilisé.
Ces produits présentent des caractéristiques inté-ressantes. Toutéfois, ces produits sont obtenus selon des méthodes de production du fibrinogêne assez complexes qui nécessitent, pour avoir un mélange final satisfaisant, l'ad-jonction exogène d'autres protéïnes plasmatiques comme le Facteur XIII. De plus, il faut adjoindre en cours de produc-tion des inhibiteurs, tels des inhibiteurs de protéases, d'origine animale comme l'aprotinine bovine.
Par ailleurs les concentrés de protéines connus, en particulier ceux utilisés à titre de colles, ne se solubilisent pas en milieu aqueux à température ambiante et peuvent même étre difficiles à solubiliser â 37°C, obligeant à ajouter dans le flacon de lyophilisation du produit un barreau aimanté et à disposer d'un agitateur magnétique pour accélérer la remise en solution.
I1 serait donc tout à fait bénéfique de disposer d'une méthode simple de production de colle biologique permet-tant d'obtenir,sans apport exogêne de protéines,un mélange protéinique répondant aux qualités souhaitées pour un tel produit. En particulier, pour l'utilisation en tant que colle, le concentré obtenu devrait posséder un contenu satisfaisant ~ 341 37 6
3 de fibrinogéne, de Facteur XIII et de fibronectine.
Le procëdé en question doit aussi s'adapter aisément à des modifications visant à l'introduction d'une étape d'inactivation virale. Le produit en résultant devrait se solubiliser en moins de 10 minutes à la température d'utilisation (généralement 18 à 20°C),,sans nécessité d'un outillage particulier. I1 faudrait aussi que le produit soit stable plusieurs heures pour en faciliter l'utilisation et en garantir l'efficacité clinique.
La Demanderesse a ainsi mis au point un procëdé
simple qui permet de préparer un concentré de protéines coagulables par la thrombine contenant, par le simple fait du fractionnement mis en oeuvre, plus de 70~ de fibrinogéne coagulable par rapport à l'ensemble des protéines présentes, et une quantité satisfaisante de Facteur XIII endogène, par une technique utilisant une fraction plasmatique disponible dans tous les centres de fractionnement.
L'invention concerne un procëdé de préparation d'un concentré de protéines d'origine plasmatique coagulables par la thrombine, comprenant essentiellement du fibrinogène et du Facteur XIII, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) une précipitation d.u plasma total non cryoprêcipité par une solution aqueuse d'êthanol à 10%, â
Le procëdé en question doit aussi s'adapter aisément à des modifications visant à l'introduction d'une étape d'inactivation virale. Le produit en résultant devrait se solubiliser en moins de 10 minutes à la température d'utilisation (généralement 18 à 20°C),,sans nécessité d'un outillage particulier. I1 faudrait aussi que le produit soit stable plusieurs heures pour en faciliter l'utilisation et en garantir l'efficacité clinique.
La Demanderesse a ainsi mis au point un procëdé
simple qui permet de préparer un concentré de protéines coagulables par la thrombine contenant, par le simple fait du fractionnement mis en oeuvre, plus de 70~ de fibrinogéne coagulable par rapport à l'ensemble des protéines présentes, et une quantité satisfaisante de Facteur XIII endogène, par une technique utilisant une fraction plasmatique disponible dans tous les centres de fractionnement.
L'invention concerne un procëdé de préparation d'un concentré de protéines d'origine plasmatique coagulables par la thrombine, comprenant essentiellement du fibrinogène et du Facteur XIII, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) une précipitation d.u plasma total non cryoprêcipité par une solution aqueuse d'êthanol à 10%, â
4°C et à pH 7,2, pendant 12 à 24 heures pour former un premier précipité;
b) l'éliminatïon du surnageant et un lavage du premier précipité par de 1°ëthanol à 10% â 4°C;
c) une remise en solution du premier précipité
dans une solution tampon TRIS/citrate en présence de lysine à une concentration correspondant à une teneur, dans le produit final, de 0,1 â 0,2 grammes par gramme de protéines;
~.r 3a d) uï~ traitement d'inactivation virale suivant une méthode classique par solvant-détergent;
e) une seconde prêcipitation par de l'éthanol à
10% pour former un second précipité; et f) l'élimination du surnageant et une remise en solution du second précipité en présence de lysine, comme à
l'étape c), une diafiltration, une mise en flacons de la solution de l'étape précédente et une lyophilisation.
L'invention concerne également un concentré de protéines caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,70 â 0,75 g de fibrinogène, de 100 â 250 UI
de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
L'invention concerne donc un concentré de protéines coagulables par la thrombine, notamment obtenu par précipitation et traitement à l'éthanol de plasma humain ou animal, qui contient avantageusement plus de 70~ en poids de fibrinogène coagulable par rapport aux protéines totales et du Facteur XIII endogène. Ce concentré, contrairement â
ceux actuellement connus, se solubilise en milieu aqueux à
température ambiante et ceci rapidement, c'est-à-dire de préférence en mains de 10 mn, pour une teneur en protéines pouvant atteindre 150 g/1. Par ailleurs il peut rester stable après reconstitution pendant au moin:~ 24 h, lorsqu'il est conservé à une température comprise par exemple entre 4 et 37~C.
Ce concentré contient avantageusement, par gramme de ~ 341 37 fi protéines, au moins 0,10 UT de Facteur XIII endogène.
I1 contient en outre une quantité équilibrée de fibronectine, en particulier comprise entre 0,03 et 0,10 g/gramme de protéines.
L'invention concerne également un fibrinogène injectable, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un concentré tel que défini précédemment.
Pour une utilïsation en tant que fibrinogène injectable on formule et conditionne le concentré de façon à obtenir après reconstitution par resolubilïsation une teneur totale en protéines de l'ordre de 17 â 20 g/1.
L'invention concerne également une colle biologique, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'un concentré tel que défini précëdemment:. Pour une utilisation à titre de colle biologique cette teneur sera de préférence comprise entre 100 et 120 g/1 environ.
L'invention concerne en outre un procédé pour la préparation d'un concentré tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de précipitation à froid de plasma total par de l'éthanol dilué.
Avantageusement, le plasma total est précipité par de l'éthanol â l0%, à un pH de 7,2, à une température de 4°C et pendant une durée d'au moins 24 heures.
Le concentré selon l'invention peut être obtenu par une procédé comportant une ëtape de précipitation à
l'éthanol dilué â un pH voisin de la neutralité et â basse température, d'un plasma total non soumis à la cryoprécipitation.
On ajuste les conditions de mise en oeuvre du procédé
de façon à obtenir un précipité peu dénaturé, évitant ainsi les dégradations que subiraient les protéines si l'étape de ~ 3~~ 3~s précipitation se déroulait dans les conditions industrielles classiques de traitement du plasma. Ainsi, en dehors des
b) l'éliminatïon du surnageant et un lavage du premier précipité par de 1°ëthanol à 10% â 4°C;
c) une remise en solution du premier précipité
dans une solution tampon TRIS/citrate en présence de lysine à une concentration correspondant à une teneur, dans le produit final, de 0,1 â 0,2 grammes par gramme de protéines;
~.r 3a d) uï~ traitement d'inactivation virale suivant une méthode classique par solvant-détergent;
e) une seconde prêcipitation par de l'éthanol à
10% pour former un second précipité; et f) l'élimination du surnageant et une remise en solution du second précipité en présence de lysine, comme à
l'étape c), une diafiltration, une mise en flacons de la solution de l'étape précédente et une lyophilisation.
L'invention concerne également un concentré de protéines caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,70 â 0,75 g de fibrinogène, de 100 â 250 UI
de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
L'invention concerne donc un concentré de protéines coagulables par la thrombine, notamment obtenu par précipitation et traitement à l'éthanol de plasma humain ou animal, qui contient avantageusement plus de 70~ en poids de fibrinogène coagulable par rapport aux protéines totales et du Facteur XIII endogène. Ce concentré, contrairement â
ceux actuellement connus, se solubilise en milieu aqueux à
température ambiante et ceci rapidement, c'est-à-dire de préférence en mains de 10 mn, pour une teneur en protéines pouvant atteindre 150 g/1. Par ailleurs il peut rester stable après reconstitution pendant au moin:~ 24 h, lorsqu'il est conservé à une température comprise par exemple entre 4 et 37~C.
Ce concentré contient avantageusement, par gramme de ~ 341 37 fi protéines, au moins 0,10 UT de Facteur XIII endogène.
I1 contient en outre une quantité équilibrée de fibronectine, en particulier comprise entre 0,03 et 0,10 g/gramme de protéines.
L'invention concerne également un fibrinogène injectable, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un concentré tel que défini précédemment.
Pour une utilïsation en tant que fibrinogène injectable on formule et conditionne le concentré de façon à obtenir après reconstitution par resolubilïsation une teneur totale en protéines de l'ordre de 17 â 20 g/1.
L'invention concerne également une colle biologique, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir d'un concentré tel que défini précëdemment:. Pour une utilisation à titre de colle biologique cette teneur sera de préférence comprise entre 100 et 120 g/1 environ.
L'invention concerne en outre un procédé pour la préparation d'un concentré tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de précipitation à froid de plasma total par de l'éthanol dilué.
Avantageusement, le plasma total est précipité par de l'éthanol â l0%, à un pH de 7,2, à une température de 4°C et pendant une durée d'au moins 24 heures.
Le concentré selon l'invention peut être obtenu par une procédé comportant une ëtape de précipitation à
l'éthanol dilué â un pH voisin de la neutralité et â basse température, d'un plasma total non soumis à la cryoprécipitation.
On ajuste les conditions de mise en oeuvre du procédé
de façon à obtenir un précipité peu dénaturé, évitant ainsi les dégradations que subiraient les protéines si l'étape de ~ 3~~ 3~s précipitation se déroulait dans les conditions industrielles classiques de traitement du plasma. Ainsi, en dehors des
5 précautions prises, notamment au niveau de la concentration en éthanol et de la température, on traite de préfërence le plasma dans des récipielnts de petite taille (par exemple 10 litres) munis de barreaux aimantés. Le plasma est donc mis au contact avec de l'éthanol à faible concentration, par exemple de 8 â 12%, pendant une durée pouvant atteindre plusieurs jours et en tout état de cause supérieure à 24 heures. Le surnageant est alors décanté et est disponible pour la préparation d'autres dérivés.
Le précipité obtenu aprës centrifugation est lavé à
l'éthanol, toujours â basse température, c'est-à-dire entre 0 et 6°C et à un degré alcoolique de 8 à 12%, de préférence 10%, et l'ensemble est centrifugé.
Le précipité est alors remis en solution dans un tampon Tris/citrate, éventuellement concentré, filtré et de préférence lyophilisé avant traitement ultérieur.
Éventuellement, il peut être traité directement, c'est-â-dire à l'état non lyophilisë.
Le traitement ultérieur réalisé pour obtenir un concentré de protéines selon l'invention peut être mis en oeuvre selon deux variantes d'exécution.
Selon une première variante on remet le lyophilisat ou la pâte fraiche correspondante en solution eau ou tampon Tris/citrate contenant avantageusement de la lysine et on traite la solution par de l'éthanol dilué à chaud.
Selon cette variante le lyophiiisat de fibrinogène, ou la pâte fraîche correspondante, est donc remis en solution à un taux de protéines de l'ordre de 50 g/1 et soumis à un traitement â l'éthanol à 8 à 12%,, à une A
Le précipité obtenu aprës centrifugation est lavé à
l'éthanol, toujours â basse température, c'est-à-dire entre 0 et 6°C et à un degré alcoolique de 8 à 12%, de préférence 10%, et l'ensemble est centrifugé.
Le précipité est alors remis en solution dans un tampon Tris/citrate, éventuellement concentré, filtré et de préférence lyophilisé avant traitement ultérieur.
Éventuellement, il peut être traité directement, c'est-â-dire à l'état non lyophilisë.
Le traitement ultérieur réalisé pour obtenir un concentré de protéines selon l'invention peut être mis en oeuvre selon deux variantes d'exécution.
Selon une première variante on remet le lyophilisat ou la pâte fraiche correspondante en solution eau ou tampon Tris/citrate contenant avantageusement de la lysine et on traite la solution par de l'éthanol dilué à chaud.
Selon cette variante le lyophiiisat de fibrinogène, ou la pâte fraîche correspondante, est donc remis en solution à un taux de protéines de l'ordre de 50 g/1 et soumis à un traitement â l'éthanol à 8 à 12%,, à une A
6 température comprise entre 30 et 40°C, préférentiellement à
35°C et pour une durée de l'ordre d'une heure et demie.
Cette étape, réalisée de préférence en présence de lysine, contribue à 1a bonne remise en solution de la colle biologique lyophilisée, tout en apportant une sécurité
accrue vis-à-vis de l'inactivation d'éventuels virus pathogènes, dont le virus du SIDA.
La quantité de lysine utilisée permet d'avoir par exemple une concentration de l'ordre de 0,1 ~ 0,2 g/gramme de protéines dans le produit prêt à l'emploi.
L'éthanol est éliminë par ultra-ou diafiltration contre un tampon contenant préférentiellement une quantité
de lysine correspondant à la quantité souhaitée dans le produit prêt à l'emploi mais avantageusement dépourvu de citrate de façon à ce que la concentration de ce composé
dans le produit final soit la plus faible possible, étant donné son action apparemment néfaste dans les phënomènes de coagulation. On utilise par exemple un tampon Tris/NaCl/lysine.
Le produit est alors filtrê stérilement, réparti dans son flacon d'utilisation et lyophilisé.
L'invention concerne également un concentré de protéines coagulables par la thrombine obtenu par le procédé
défini précédemment, caractérisé en ce qu'il contient 70 à
75~ de fibrinogëne et, par gramme de protéines, 0,10 é
0,25 UI de Facteur XIïI endogéne et 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
Selon la deuxième variante d'exécution on soumet le lyophilisat, ou la pâte fraîche correspondante, après remise en solution, à une étape d'inactivation virale, par exemple à un traitement par solvant et détergent. Les résidus de ce 1 3~1 376 6a traitement sont alors éliminés de préférence par une étape de précipitation à froid par de l'éthanol dilué. De préférence, la précipitation est réalïsée avec le l'éthanol é 10%, à une température de 4°C et pendant une durée d'environ 12 heures.
Selon cette variante le lyophilisat de fibrinogëne, ou la pâte fraîche correspondante, est donc remis en solution à un taux de protéines de l'ordre de 20 g/1. I1 est alors soumis ~ un traitement d'inactivation virale par exemple à un traitement au solvant et détergent selon le brevet européen no. EP-0 131 740.
Cette étape, réalisée avantageusement à une température supérieure â 24°C et pour une durée supérieure à 6 h, apporte une sécurité accrue vis-â-vis de l'inactivation d'éventuels virus pathogènes, dont le virus du SIDA et les virus des hépatîtes. Elle est préférentiellement mise en oeuvre en présence de lysine du produit prêt à l'emploi de l'ordre de 0,1 à~ 0,2 g/gramme de protéines.
L'élimination des agents d'inactivation virale conjointement à l'augmentation de la puretë du concentré
protéique est assurée par précipitation des protéines à
basse température par l'éthanol â 8 à 12~. Aprës centrifugation, on élimine en effet dans le surnageant les agents d'inactivation virale et des protéines contaminantes comme l'albumine. Si nëcessaire, le précipité peut être mis en contact de nouveau avec la solution éthanolique afin d'assurer une meilleure élimination des agents d'inactivation virale.
Le précipité est remis en solution dans une solution tampon Tris-citrate-lysine puis ultrafiltré et diafiltré, 6b avant filtration stërilisante et répartition.
L'ultrafiltration vise à éliminer l'éthanol de même que le citrate mais permet de maintenir en teneur constante en lysine de 0,1 à 0,2 g par gramme de protêines.
L'invention concerne également un concentré de protéines coagulables par la thrombine et obtenu par un procédé tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu'il contient 90 à 95% de fibrinogëne et, par gramme de protéines, 0,15 à 0,30 UI de Facteur XIII endogène et 0,03 à 0,06 g de fibronectine endogène.
L'invention concerne en outre du fibrinogêne injectable ou une colle biologïque, caractérisé en ce qu'il est obtenu â partir d'un des concentrés définis précëdemment.
Lorsque le concentré selon l'invent.ion sert pour une colle biologique, la reconstitution de la colle avant emploi s'effectue par une solution aqueuse d'aprotinine à
10000 UIK/ml, la solution résultante étant. mélangée à de la thrombine calcique à 50o UI/ml.
Le produit s'utilise soit sous forme liquide dispensée par un système de double aiguille (colle biologique reconstituée d'une part, et thrombine calcique d'autre part) soït sous forme sèche (utilisation en poudre) ou par un système de vaporisation.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limïter la portée.
A - PREPTIO~ Dij CONçENTRE PROTIDIQUE
Le plasma utilisé est obtenu par centrifugation de sang et congelé â -35°C dans les 6 heures suivant le prélèvement. Pour la préparation du concentré il est A
1 3~1 376 6c 'A
décongelé à 37°C. On le soumet ensuite à une précipitation ,...~,
35°C et pour une durée de l'ordre d'une heure et demie.
Cette étape, réalisée de préférence en présence de lysine, contribue à 1a bonne remise en solution de la colle biologique lyophilisée, tout en apportant une sécurité
accrue vis-à-vis de l'inactivation d'éventuels virus pathogènes, dont le virus du SIDA.
La quantité de lysine utilisée permet d'avoir par exemple une concentration de l'ordre de 0,1 ~ 0,2 g/gramme de protéines dans le produit prêt à l'emploi.
L'éthanol est éliminë par ultra-ou diafiltration contre un tampon contenant préférentiellement une quantité
de lysine correspondant à la quantité souhaitée dans le produit prêt à l'emploi mais avantageusement dépourvu de citrate de façon à ce que la concentration de ce composé
dans le produit final soit la plus faible possible, étant donné son action apparemment néfaste dans les phënomènes de coagulation. On utilise par exemple un tampon Tris/NaCl/lysine.
Le produit est alors filtrê stérilement, réparti dans son flacon d'utilisation et lyophilisé.
L'invention concerne également un concentré de protéines coagulables par la thrombine obtenu par le procédé
défini précédemment, caractérisé en ce qu'il contient 70 à
75~ de fibrinogëne et, par gramme de protéines, 0,10 é
0,25 UI de Facteur XIïI endogéne et 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
Selon la deuxième variante d'exécution on soumet le lyophilisat, ou la pâte fraîche correspondante, après remise en solution, à une étape d'inactivation virale, par exemple à un traitement par solvant et détergent. Les résidus de ce 1 3~1 376 6a traitement sont alors éliminés de préférence par une étape de précipitation à froid par de l'éthanol dilué. De préférence, la précipitation est réalïsée avec le l'éthanol é 10%, à une température de 4°C et pendant une durée d'environ 12 heures.
Selon cette variante le lyophilisat de fibrinogëne, ou la pâte fraîche correspondante, est donc remis en solution à un taux de protéines de l'ordre de 20 g/1. I1 est alors soumis ~ un traitement d'inactivation virale par exemple à un traitement au solvant et détergent selon le brevet européen no. EP-0 131 740.
Cette étape, réalisée avantageusement à une température supérieure â 24°C et pour une durée supérieure à 6 h, apporte une sécurité accrue vis-â-vis de l'inactivation d'éventuels virus pathogènes, dont le virus du SIDA et les virus des hépatîtes. Elle est préférentiellement mise en oeuvre en présence de lysine du produit prêt à l'emploi de l'ordre de 0,1 à~ 0,2 g/gramme de protéines.
L'élimination des agents d'inactivation virale conjointement à l'augmentation de la puretë du concentré
protéique est assurée par précipitation des protéines à
basse température par l'éthanol â 8 à 12~. Aprës centrifugation, on élimine en effet dans le surnageant les agents d'inactivation virale et des protéines contaminantes comme l'albumine. Si nëcessaire, le précipité peut être mis en contact de nouveau avec la solution éthanolique afin d'assurer une meilleure élimination des agents d'inactivation virale.
Le précipité est remis en solution dans une solution tampon Tris-citrate-lysine puis ultrafiltré et diafiltré, 6b avant filtration stërilisante et répartition.
L'ultrafiltration vise à éliminer l'éthanol de même que le citrate mais permet de maintenir en teneur constante en lysine de 0,1 à 0,2 g par gramme de protêines.
L'invention concerne également un concentré de protéines coagulables par la thrombine et obtenu par un procédé tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu'il contient 90 à 95% de fibrinogëne et, par gramme de protéines, 0,15 à 0,30 UI de Facteur XIII endogène et 0,03 à 0,06 g de fibronectine endogène.
L'invention concerne en outre du fibrinogêne injectable ou une colle biologïque, caractérisé en ce qu'il est obtenu â partir d'un des concentrés définis précëdemment.
Lorsque le concentré selon l'invent.ion sert pour une colle biologique, la reconstitution de la colle avant emploi s'effectue par une solution aqueuse d'aprotinine à
10000 UIK/ml, la solution résultante étant. mélangée à de la thrombine calcique à 50o UI/ml.
Le produit s'utilise soit sous forme liquide dispensée par un système de double aiguille (colle biologique reconstituée d'une part, et thrombine calcique d'autre part) soït sous forme sèche (utilisation en poudre) ou par un système de vaporisation.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limïter la portée.
A - PREPTIO~ Dij CONçENTRE PROTIDIQUE
Le plasma utilisé est obtenu par centrifugation de sang et congelé â -35°C dans les 6 heures suivant le prélèvement. Pour la préparation du concentré il est A
1 3~1 376 6c 'A
décongelé à 37°C. On le soumet ensuite à une précipitation ,...~,
7 9 341 376 à 10 %, à pH 7,2, à un taux de protéines de 52 g/1, à une température de 4°C. Le mélange est agité durant 30 minutes puis laissé à décanter pour une durée minimale de 24 heures à 4°C.
Le surnageant éthanolique est éliminé par centri-fugation et le précipité, riche en particulier en fibrinogène et en Facteur XIII, est récupêré. Celui-ci e;st soumis à un lavage poussé à l'aide d'une solution â 10 % d'éthanol pré-refroidi à +4°C puis de nouveau centrifugé.
Le précipitê est alors remis en solution par une solution tampon Tris/citrate, puis concentré à 15-20 g/1 de protéines, filtré et éventuellement lyophilisé.
Le produit résultant est remis en suspension à
50 g/1 de protéines par une solution de lysine correspondant à une teneur en lysine du produit final de 0,1 â 0,2 g/gramme de protéines, puis subit une deuxième traitement à l'éthanol à 10 % pour une heure et demie à 35°C.
Après diafiltration pour éliminer le citrate et l'éthanol et amener le taux de protéines à la valeur adéquate, par exemple 35 g/1, le concentré est filtré" réparti stérile-ment et lyophilisé dans le flacon final pour une remise en solution en 0,5, 1, 2 ou 5 ml, par exemple, lors de l'utilisa-tion.
B) ANALYSE BIOCHIMIQUE DU CONCENTRE DE PROTEINES
La compositïon en protéines du produit est la suivante (expriméepar gramme de protéines) ., Fibrinogène 0,70-0,75 g (f.ibrïnogène coagulable) Facteur XIII endogène 0,10-0,25 UI
Fibronectine 0,05 - 0,20 g Exemple 2 A) PREPARATION DU CONCENTRE PROTEIQUE
Le plasma utilisé est obtenu par centrifugation de sang et congelé à -35°C dans les 6 heures suivant le Prélèvement. Pour la préparation du concentré, il est décongelé
à 37°C. On le soumet ensuite â une précipitar.ion à l'éthanol â 10 %, à pH 7,2, à un taux de protéines de 52 g/1, à une 1 341 37fi s température de 4°C. Le mélange est agité durant 30 minutes puis laissé à décanter pour une durée minimale de 24 heures à 4°C.
Le surnageant éthanolique est éliminé par centri fugation et le précipité, riche en particulier en fibrinogène et en Facteur XIII, est récupéré. Celui-ci est soumis à un lavage poussé à l'aide d'une solution à 10 ~ô d'éthanol pré-refroidi à +4°C puis de nouveau centrifugé.
Le précipité est alors remis en solution par une solution tampon Tris/citrate, puis concentré à 15-20 g/1 de protéines, filtré et éventuellement lyophilisé.
Le produit résultant est remis en suspension à
environ 20 g/1 de protéines par une solution de lysine correspondant à
une teneur en lysine du produit final de 0,1 à 0,2 g/gramme de protéines, puis est soumis à un traitement par solvant et détergent â 0, 3 %
de TNBP et 1 % de Tween 80 pendant une durée supérieure à
6 h et à une température supérieure à 24°C.
La solution est alors soumise â une précipitation alcoo-lique à l'aide d'éthanol à 10 %, à 4°C, et laissée à décanter pour environ 12 h.
Aprês centrifugation et élimination du surnageant (qui peut renfermer des agents d'inactivation virale), le précipité est récupéré puis remis en solution par un tampon Tris/citrate renfer-mant de la lysine en quantité correspondant à 0,1-0,2 g de lysine par gramme de protéines.
Après diafiltration pour ajuster la force ionique, éliminer le citrate et l'éthanol (maïs en conservant la lysine) et amener la teneur en protéines à une valeur adéquate, par exemple de g/1 environ, le concentré est filtré, réparti stérilement et lyophilisé dans le flacon final pour une remise en solution 30 en 0,5, 1, 2 ou 5 ml, par exemple, lors de l'utilisation.
B) ANALYSE BIOCHIMIQUE DU CONCENTRE PROTEIQUE
La composition en protéines du produit est la suivante (exprimée par gramme de protéines) Fibrinogène 0,90-0,95 g (fibrinogène coagulable) 35 Facteur XIII endogène 0,15-0,30 UI
Fibronectine 0,03-0,06 g La figure unique annexée représente les résultats d'analyse par électrophorèse sur acétate de cellulose obtenus respectivement pour ce concentré (courbe 1a), et des concen-trés du commerce utilisés en tant que colles biologiques ( courbes 1b à 1d).
La pureté en constituants de la zone Y (fibrinogène) largement supérieure du produit selon l'invE~ntion apparaît manifestement sur ces courbes.
Ainsi que mentionné plus haut,le concentré
selon l'invention présente d'excellentes caractéristiques de solubilisation et de stabilitë.
En effet son temps de remise en solutïon est inférieur à 10 minutes, voire 5 minutes, tant à 20°C qu'à
37°C, sans appareillage particulier, par simple mouvement de rotation manuelle.
Par ailleurs on n'observe pas de déstabilisation du.produit reconstitué et conservé à 4°C, 20°C ou 37°C
pendant 24 h.
En ce qui concerne une colle biologique selon l'invention on constate qu'elle présente d'excellentes carac-téristiques d'utïlisation pour cette indication. En effet son pouvoir adhésif est supérieur à i00 g/cm2 exprimé par test sur l'animal de collage de lambeaux de peau, valeur supérieure à celles obtenues sur d'autres colles préparées à partir de cryoprécipité. Ce pouvoir adhésif, se maintient à 90 % de sa valeur aprës reconstitution de la colle biologique et conservation 24 heures à 4°C ou â 20°C. Par ailleurs on ne constate pas d'exsudation lors du mélange du concentré
protéique avec la thrombine calcique.
Les essais cliniques réalisés ont démontré la grande adaptabilité de cette colle aux contraintes de l'utili-sation , besoin de remise en solution rapide, stabilité aux températures~des blocs opératoires, possibilité d'attente d'utilisation.
Les indications d'une colle selon l'invention découlent de ses propriétés ; son pouvoir adhésif et hémosta-tique en font un adjuvant précieux des interventions chirurgi-cales au cours desquelles elle assure un gain de temps opératoire. En outre son pouvoir bactériostatique renforce et accélère la cicatrisation des plaies et des sutures.
Ses indications s'appliquent ainsi à des domaines très variés de la chirurgie .
- Chirurgie plastique et microchirurgie . greffe cutanée des brûlures, collages et lambeaux, lifting, blépharoplastie.
- Neurochirugie . plastie et suture de dure-mère, hémostase d'exérèse tumorale, hémostase de sinus veineux.
- Chirurgie cardia-vasculaire . étanchéité des sutures dies 10 prothèses vasculaires, dissection aortique, anévrismes.
- Chirurgie générale et abdominale . collage de déchirures viscérales (splénique, réna~le,~hépatique...), ou de biopsie hépatique, anastomoses digestives, fistules, hémostase des cavitésupératoires .
- Chirurgie osseuse . collage de corticale, suture du tendon, encollage de foyer ostéomyélitique.
- Stomatologie . hëmostase de foyer d'extractions dentaires chez les malades à haut risque hémorragique (hémophiles).
- Oto-Rhino-Laryngologie . réparation de plaie tympanique, amygdalectomie.
En ce qui concerne un fibrinogène injectable selon l'invention on constate qu'il présente également d'excel-lentes caractéristiques d'utilisation et que sa composition équilibrée en font un agent thérapeutique précieux pour le traitement des états d'hypo- ou d'afibrinogénémie et du syndrome de défibrination aiguë.
Pour le traitement des déficits constitutionnels, la dose usuelle est de 1 â 4 g suivant le poids du malade, en tenant compte que la demi-vie du fïbrinogëne est de trois à quatre jours et le taux plasmatique nécessaire pour avoir une hémostase suffisante est de l'ordre de 1g/litre.
Dans les états de défibrination aiguë les doses varient de 2 à 10 g suivant les circonstances.
Les produits thérapeutiques selon l'invention peuvent être préparés à partir de plasma humain ou animal et trouvent ainsi leur intérêt aussi bien en médecine humaine que vétérinaire.
Le surnageant éthanolique est éliminé par centri-fugation et le précipité, riche en particulier en fibrinogène et en Facteur XIII, est récupêré. Celui-ci e;st soumis à un lavage poussé à l'aide d'une solution â 10 % d'éthanol pré-refroidi à +4°C puis de nouveau centrifugé.
Le précipitê est alors remis en solution par une solution tampon Tris/citrate, puis concentré à 15-20 g/1 de protéines, filtré et éventuellement lyophilisé.
Le produit résultant est remis en suspension à
50 g/1 de protéines par une solution de lysine correspondant à une teneur en lysine du produit final de 0,1 â 0,2 g/gramme de protéines, puis subit une deuxième traitement à l'éthanol à 10 % pour une heure et demie à 35°C.
Après diafiltration pour éliminer le citrate et l'éthanol et amener le taux de protéines à la valeur adéquate, par exemple 35 g/1, le concentré est filtré" réparti stérile-ment et lyophilisé dans le flacon final pour une remise en solution en 0,5, 1, 2 ou 5 ml, par exemple, lors de l'utilisa-tion.
B) ANALYSE BIOCHIMIQUE DU CONCENTRE DE PROTEINES
La compositïon en protéines du produit est la suivante (expriméepar gramme de protéines) ., Fibrinogène 0,70-0,75 g (f.ibrïnogène coagulable) Facteur XIII endogène 0,10-0,25 UI
Fibronectine 0,05 - 0,20 g Exemple 2 A) PREPARATION DU CONCENTRE PROTEIQUE
Le plasma utilisé est obtenu par centrifugation de sang et congelé à -35°C dans les 6 heures suivant le Prélèvement. Pour la préparation du concentré, il est décongelé
à 37°C. On le soumet ensuite â une précipitar.ion à l'éthanol â 10 %, à pH 7,2, à un taux de protéines de 52 g/1, à une 1 341 37fi s température de 4°C. Le mélange est agité durant 30 minutes puis laissé à décanter pour une durée minimale de 24 heures à 4°C.
Le surnageant éthanolique est éliminé par centri fugation et le précipité, riche en particulier en fibrinogène et en Facteur XIII, est récupéré. Celui-ci est soumis à un lavage poussé à l'aide d'une solution à 10 ~ô d'éthanol pré-refroidi à +4°C puis de nouveau centrifugé.
Le précipité est alors remis en solution par une solution tampon Tris/citrate, puis concentré à 15-20 g/1 de protéines, filtré et éventuellement lyophilisé.
Le produit résultant est remis en suspension à
environ 20 g/1 de protéines par une solution de lysine correspondant à
une teneur en lysine du produit final de 0,1 à 0,2 g/gramme de protéines, puis est soumis à un traitement par solvant et détergent â 0, 3 %
de TNBP et 1 % de Tween 80 pendant une durée supérieure à
6 h et à une température supérieure à 24°C.
La solution est alors soumise â une précipitation alcoo-lique à l'aide d'éthanol à 10 %, à 4°C, et laissée à décanter pour environ 12 h.
Aprês centrifugation et élimination du surnageant (qui peut renfermer des agents d'inactivation virale), le précipité est récupéré puis remis en solution par un tampon Tris/citrate renfer-mant de la lysine en quantité correspondant à 0,1-0,2 g de lysine par gramme de protéines.
Après diafiltration pour ajuster la force ionique, éliminer le citrate et l'éthanol (maïs en conservant la lysine) et amener la teneur en protéines à une valeur adéquate, par exemple de g/1 environ, le concentré est filtré, réparti stérilement et lyophilisé dans le flacon final pour une remise en solution 30 en 0,5, 1, 2 ou 5 ml, par exemple, lors de l'utilisation.
B) ANALYSE BIOCHIMIQUE DU CONCENTRE PROTEIQUE
La composition en protéines du produit est la suivante (exprimée par gramme de protéines) Fibrinogène 0,90-0,95 g (fibrinogène coagulable) 35 Facteur XIII endogène 0,15-0,30 UI
Fibronectine 0,03-0,06 g La figure unique annexée représente les résultats d'analyse par électrophorèse sur acétate de cellulose obtenus respectivement pour ce concentré (courbe 1a), et des concen-trés du commerce utilisés en tant que colles biologiques ( courbes 1b à 1d).
La pureté en constituants de la zone Y (fibrinogène) largement supérieure du produit selon l'invE~ntion apparaît manifestement sur ces courbes.
Ainsi que mentionné plus haut,le concentré
selon l'invention présente d'excellentes caractéristiques de solubilisation et de stabilitë.
En effet son temps de remise en solutïon est inférieur à 10 minutes, voire 5 minutes, tant à 20°C qu'à
37°C, sans appareillage particulier, par simple mouvement de rotation manuelle.
Par ailleurs on n'observe pas de déstabilisation du.produit reconstitué et conservé à 4°C, 20°C ou 37°C
pendant 24 h.
En ce qui concerne une colle biologique selon l'invention on constate qu'elle présente d'excellentes carac-téristiques d'utïlisation pour cette indication. En effet son pouvoir adhésif est supérieur à i00 g/cm2 exprimé par test sur l'animal de collage de lambeaux de peau, valeur supérieure à celles obtenues sur d'autres colles préparées à partir de cryoprécipité. Ce pouvoir adhésif, se maintient à 90 % de sa valeur aprës reconstitution de la colle biologique et conservation 24 heures à 4°C ou â 20°C. Par ailleurs on ne constate pas d'exsudation lors du mélange du concentré
protéique avec la thrombine calcique.
Les essais cliniques réalisés ont démontré la grande adaptabilité de cette colle aux contraintes de l'utili-sation , besoin de remise en solution rapide, stabilité aux températures~des blocs opératoires, possibilité d'attente d'utilisation.
Les indications d'une colle selon l'invention découlent de ses propriétés ; son pouvoir adhésif et hémosta-tique en font un adjuvant précieux des interventions chirurgi-cales au cours desquelles elle assure un gain de temps opératoire. En outre son pouvoir bactériostatique renforce et accélère la cicatrisation des plaies et des sutures.
Ses indications s'appliquent ainsi à des domaines très variés de la chirurgie .
- Chirurgie plastique et microchirurgie . greffe cutanée des brûlures, collages et lambeaux, lifting, blépharoplastie.
- Neurochirugie . plastie et suture de dure-mère, hémostase d'exérèse tumorale, hémostase de sinus veineux.
- Chirurgie cardia-vasculaire . étanchéité des sutures dies 10 prothèses vasculaires, dissection aortique, anévrismes.
- Chirurgie générale et abdominale . collage de déchirures viscérales (splénique, réna~le,~hépatique...), ou de biopsie hépatique, anastomoses digestives, fistules, hémostase des cavitésupératoires .
- Chirurgie osseuse . collage de corticale, suture du tendon, encollage de foyer ostéomyélitique.
- Stomatologie . hëmostase de foyer d'extractions dentaires chez les malades à haut risque hémorragique (hémophiles).
- Oto-Rhino-Laryngologie . réparation de plaie tympanique, amygdalectomie.
En ce qui concerne un fibrinogène injectable selon l'invention on constate qu'il présente également d'excel-lentes caractéristiques d'utilisation et que sa composition équilibrée en font un agent thérapeutique précieux pour le traitement des états d'hypo- ou d'afibrinogénémie et du syndrome de défibrination aiguë.
Pour le traitement des déficits constitutionnels, la dose usuelle est de 1 â 4 g suivant le poids du malade, en tenant compte que la demi-vie du fïbrinogëne est de trois à quatre jours et le taux plasmatique nécessaire pour avoir une hémostase suffisante est de l'ordre de 1g/litre.
Dans les états de défibrination aiguë les doses varient de 2 à 10 g suivant les circonstances.
Les produits thérapeutiques selon l'invention peuvent être préparés à partir de plasma humain ou animal et trouvent ainsi leur intérêt aussi bien en médecine humaine que vétérinaire.
Claims (8)
1. Procédé de préparation d'un concentré de protéines d'origine plasmatique coagulables par la thrombine, comprenant essentiellement du fibrinogène et du Facteur XIII, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
a) une précipitation du plasma total non cryoprécipité par une solution aqueuse d'éthanol à 10%, à
4°C et à pH 7,2, pendant 12 à 24 heures pour former un premier précipité;
b) l'élimination du surnageant et un lavage du premier précipité par de l'éthanol à 10% à 4°C;
c) une remise en solution du premier précipité
dans une solution tampon TRIS/citrate en présence de lysine à une concentration correspondant â une teneur, dans le produit final, de 0,1 à 0,2 grammes par gramme de protéines;
d) un traitement d'inactivation virale suivant une méthode classique par solvant-détergent;
e) une seconde précipitation par de l'éthanol â
10% pour former un second précipité; et f) l'élimination du surnageant et une remise en solution du second précipité en présence de lysine, comme à
l'étape c), une diafiltration, une mise en flacons de la solution de l'étape précédente et une lyophilisation.
a) une précipitation du plasma total non cryoprécipité par une solution aqueuse d'éthanol à 10%, à
4°C et à pH 7,2, pendant 12 à 24 heures pour former un premier précipité;
b) l'élimination du surnageant et un lavage du premier précipité par de l'éthanol à 10% à 4°C;
c) une remise en solution du premier précipité
dans une solution tampon TRIS/citrate en présence de lysine à une concentration correspondant â une teneur, dans le produit final, de 0,1 à 0,2 grammes par gramme de protéines;
d) un traitement d'inactivation virale suivant une méthode classique par solvant-détergent;
e) une seconde précipitation par de l'éthanol â
10% pour former un second précipité; et f) l'élimination du surnageant et une remise en solution du second précipité en présence de lysine, comme à
l'étape c), une diafiltration, une mise en flacons de la solution de l'étape précédente et une lyophilisation.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape e) est effectuée à une température comprise entre 30 et 40°C pendant une durée de 90 minutes.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape e) est effectuée à une température de 4°C pendant une durée de 12 heures.
4. Concentré de protéines obtenu par le procédé
selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,70 à 0,75 g de fibrinogène, de 100 à 250 UI de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,70 à 0,75 g de fibrinogène, de 100 à 250 UI de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
5. Concentré de protéines obtenu par le procédé
selon les revendications 1 ou 3, caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,90 à 0,95 g de fibrinogène, de 100 à 250 UI de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
selon les revendications 1 ou 3, caractérisé en ce qu'il contient, par gramme de protéines, de 0,90 à 0,95 g de fibrinogène, de 100 à 250 UI de Facteur XIII endogène et de 0,05 à 0,10 g de fibronectine.
6. Concentré de protéines selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il se solubilise en milieu aqueux à température ambiante, jusqu'à une teneur en protéines de l'ordre de 150 g/l.
7. Concentré de protéines selon la revendication 4 ou 6, caractérisé en ce que sa teneur en protéines est ajustée entre 100 et 120 g/l pour le rendre utilisable comme colle biologique, par addition de thrombine calcique à 500 UI/ml.
8. Concentré de protéines selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que sa teneur en protéines est ajustée entre 17 et 20 g/l pour le rendre utilisable comme fibrinogène injectable, à usage thérapeutique.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| FR8710798 | 1987-07-30 | ||
| FR8710798A FR2618784B1 (fr) | 1987-07-30 | 1987-07-30 | Concentre de proteines coagulables par la thrombine, son procede d'obtention et son utilisation a titre de colle biologique |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| US6197325B1 (en) | 1990-11-27 | 2001-03-06 | The American National Red Cross | Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use |
| US6054122A (en) | 1990-11-27 | 2000-04-25 | The American National Red Cross | Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use |
| DE4202667C1 (fr) | 1992-01-29 | 1993-05-13 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg, De | |
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| US5395923A (en) * | 1993-02-23 | 1995-03-07 | Haemacure-Biotech, Inc. | Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by "salting-out" |
| EP0835667B1 (fr) | 1996-03-15 | 2005-11-09 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Dispositif de pulverisation pour l'application d'un adhesif tissulaire |
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