Procédé de stabilisation de phases lameLlaires lipidiques hydra-tées, par exemple de liposomes, composition de phases lamellaires lipidiques hydratees, par exemple des liposomes, stabilisées par un emploi d'un support stabilisant a base d'atelocollagène et de 05 glycosaminoglycannes, et utilisation en pharmacie ou en cosmétolo-gie.
La presente invention concerne essent;ellement un procédé
de stabilisation de phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple de liposomes, une composition et phases lamellaires lipi-diques hydratées, par exemple des liposomes stabilisés par un emploi d'un support stabilisant a base d'atélocollagene et de glycosaminoglycannes ét l'utilisation en pharmacie ou ~cosmétologie On conna;t depuis BANGHAM les phases lamellaires lipi-diques hydratées dont une forme particuliere est constituée par des liposomes (voir BA~GHAM et al. Journal of Molecular Biology, 13 : 238 ; 253 (196~) ou encore BANGHAM et al. Chem. Phys. Lipids.
1 : 255 (1~67)). De nombreux autres articles sur les liposomes ont eté publiés (voir PAPAHADJOPOULOS, ~iochim. ~iophys~ Acta, 135 (1967), pages 624-~3~ ou WEISSMANN dans Journal of Lipids ~esearch, volume 9~ (1968), pages 310 à 318).
On sait que les liposomes, qui sont des capsules phospho-lipidiques, prennent de plus en plus d'importance en cosmetique et en pharmacie car iLs permettent le transport de substances actives vers les cellules par lesquelles ils sont absorbes. En effet, et ceci est connu depuis BANGHAM, la nature phospholipidique de leur membrane, ~tant très proche de celle des cellules, entraîne une fusion entre les deux enveloppes.
Malheureusement, les liposomes ont une faible stabilite, de sorte que leur ~éveloppement s'en trouve grandement freine, ce qui constitue un probleme majeur. Dans bien des cas, ces reservoirs constituant les liposomes, se désintegrent avant d'entrer en contact avec les cellules visees. De plus, leur integration dans un produit fini provoque relativement souvent une destruction des réservoirs. En particulier, en cosmétique, la réalisation d'une émulsion contenant des liposomes est extremement deLicate, la phase ~
grasse entraînant une ouverture de la membrane phospholipidique.
Aussi, de nombreux travaux sont consacrés a la stabilisation des liposomes par des substances qui doivent en outre être biocompa-tibles.
05 ûn a déjà proposé diverses solutions pour stabiliser les liposomes, notamment l'utilisation d'une forme gel, dans un hydro-colloide (C.A., volume 97, 1982, 188 156k en référence a un article paru dans J. Pharm. Pharmacol, 1982, 34, (7, 473-4) ; voir aussi le document WO 85/û364û, dans lequel on décrit un grand nombre de substances pouvant être utilisées comme gélifiant, notamment les carbohydra~es comme les celluloses, des gommes notamment lecarra-ghénane, le xanthane, le collagène, le polyacrylamide, des poly-siloxanes, des polymères d'aminoacides tels que de l'albumine gélifiée, la gélatine (page 13, lignes 20 à 35)).
L'utilisation de gel présente de nombreux inconvénients.
Tout d'abord, il complique sérieusement la préparation des compo-sitions, notamment des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques.
En effet, en raison des propriétés physiques des gels, et notamment de leur caractère non coulable, l'utilisation de gel pose de 2û sérieux problèmes de maniabilité. Enfin, en ce qui concerne plus particulièrement l'utilisation de collagène comme gel support, le collagène pr~sente une certaine antigénicité bien que celle-ci soit faible. Egalement, pour le cas du collagène, on utilise habituel-lement du collagène acido-soluble. Etant donné que la composition doit avoir un pH voisin de la neutralité pour la stabilité des liposomes ainsi que pour être proche du pH physiologique, dans le cas de l'emploi en cosm~tique, dans ces conditions de pH, le collagène acido-soluble précipite, et l'inclusion de liposomes devient impossible. On peut empêcher ce phénomène par des conditions de préparation très compliquées et coûteuses non applicables à l'échelle industrielle, incluant des conditions de température basse voisine de 4C. Ceci ne permet pas d'-envisager une fabrication industrielle à un faible coGt.
La présente invention a donc pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes à l'aide d'un support stabili-sant qui se présente sous forme d'une solution suffisa~ment fluide pour éliminer tous les inconvénients inhérents à l'emploi de 05 supports stabilisants sous forme de gel.
La pr~sente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser les phases ~amellaires lipidiques hydratées, notamment les liposomes, par l'emploi d'un support sta-bilisant suffisamment fluide qui ne présente aucun caractèred'antigénicité et qui, au surplus, ne nécessite que la mise en oeuvre d'un procédé extrêmement simple, applicable industriellement dans des conditions opératoires simples, pouvant être variées relativement largement, permettant donc une reproductibilité prati-quement parfaite.
La présente invention a encore pour but de résoudre lenouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solu-tion permettant de stabiliser des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes, par l'emploi d'un support stabilisant compatible avec la formation d'émulsions.
Tous ces problèmes techniques sont résolus pour la pre-mière fois par la présente invention d'une manière satis~aisante, utilisable industriellement.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un procédé de stabilisation de phase lamellaire lipidique hydratée, par exemple des liposomes, comprenant l'intrùduction de ladite phase lamellaire lipidique hydratée dans un support stabi-lisant, caractérisé en ce qu'on prépare ledit support stabilisant de la manière suivante :
a) ùn prépare séparément une solution d'atélocollagène, et une solution de glycosaminoglycannes ; puis b) on mélange ladite solution d'atélocollagène avec la solution de glycosaminoglycannes. ;~
Selon une première variante de réalisation du procédé
selon l'invention, ùn réalise le mélange en introduisant la solu-tion de glycosaminoglycannes dans la solution d'atélocollayène. :
Selon un mode de réalisation particulier, la solution deglycosaminoglycannes est préparée par mise en solution du glycos-aminoglycanne dans une solution aqueuse basique dont le pH est 05 réglé de sorte qu'après mélange avec la solution d'atélocollagène, le pH du mélange constituant le support stabilisant reste légère-ment basique tout en étant proche de la neutralité. De préférence, ce pH final est voisin de 8.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, cette solution aqueuse basique est une solution aqueuse de soude.
Selon une autre caractéristique avantageuse, la concen-tration en glycosaminoglycanne dans la solution de glycosaminogly-cannes de 0,5 à 4 %, encore mieux, de û,5 à 2 %, et encore de préférence est voisine de 1 %.
Selon une autre caractéristique du procédé de l'inven-tion, la solution d'atélocollagène est une solution aqueuse d'atélocollagène ayant de préférence une concentration comprise entre 0,5 et 2 % en poids, et encore de préférence voisine de 1 %~
Cette solution d'atélocollagène peut être obtenue selon l'invention par dissolution de fibres d'atélocollagène dans une solution aqueuse légèrement acide.
Selon un mode de réalisation particulier, ces fibres d'atelocollagène sont mises en solution dans de l'acide acétique 0,1 M.
Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé
selon l'invention, l'atélocollagène est obtenu par digestion enzy-matique de collagène.
Selon une autre caractéristique particulière du procédé
selon l'invention, les phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, sont introduites dans la solution de support stabilisant selon l'invention, selon des ~olumes sensiblement égaux.
Selon un exemple de réalisation particulier, la propor-- tion des phases lamellaires lipidiques, par exemple des liposomes, représente environ 1 % de la composition finale.
:
Selon un deuxième aspect, la présente invention fournit aussi une composition contenant des phases lamellaires lipidiques hydratées, par exemple des liposomes, stabilisées par la présence 05 d'un support stabilisant, caractérisée en ce que le support stabi-lisant est sous forme d'une solution contenant un mélange d'atélo-collagène et de glycosaminoglycannes.
Selon une variante de réalisation particulière, les glycosaminoglycannes utilisés sont choisis parmi les glycosamino-glycannes de structure, notamment l'acide hyaluronique, le chondro;tine-4 sulfate, le chondroitine-6 sulfate, le dermatane sulfate, l'héparane sulfate, le kératane sulfate ; ou les glycosaminoglycannes de sécrétion, en particulier l'héparine et ses dérivés ainsi que les muco;tines sulfate.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, celle-ci concerne les solutions d'atélocollagène et de glycosaminoglycannes de départ pour la préparation de la solution de mélange dont les caractéristiques ont été précédemment énoncées dans le procédé.
La proportion relative de glycosaminoglycannes vis-à-vis de l'atélocollagène est de préférence de 18 à 25 Y0 en poids de glycosaminoglycanne par rapport à l'atélocollagène.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, la solution de support stabilisant est à un pH légère-ment basique tout en étant voisin de la neutralité, de préférence de l'ordre de 8.
Selon une autre caractéristique de la composition selon l'invention, cette composition est obtenue en mélangeant des volumes sensiblement égaux de solutions de phases lamellaires lipi-diques hydratées, par e~emple des liposomes, et de solutions de support stabilisant.
Une utilisation préférée des compositions selon l'inven~
tion concerne une utilisation en pharmacie ou en cosmétologie, sous forme de compositions pharmaceutiques ou cosmétiques. Pour ce faire, on peut utiliser la composition telle quelle ou bien lui :.,: ::
::
adjoindre divers composants ou excipients appropriés bien connus de l'homme de l'art, sans aucun probleme particulier, sous réserve de vérifier que cette adjonction ne modifie pas la stabilité des phases lamellaires lipidiques hydratées, notamment des liposomes.
05Grâce a l'invention, on obtient de maniere totalement inattendue une diminution de l'antigénicite du support stabilisant.
On obtient en outre une amélioration marquée de la protection de l'un des composants du support stabilisant, a savoir l'atélocoLlagène vis-a-vis des collagenases entraînant un prolonge-10ment "in vivo" de l'effet retard de l'atélocollagène.
Ce support stabilisant presente une propriet~ hydratante accrue, une action plus marquée de régénération du derme et de l'epiderme par accroissement du developpement cellulaire.
Un autre avantage particulierement inattendu et d'une 15importance capitale pour une exploitation industrielle reside dans Le fait que l'atelocollagène utilise sous forme de solution selon la présente invention est melange de façon extrêmement simple avec les glyrosaminoglycannes, en aboutissant a;nsi à une simplification du procedé de stabilisation et donc au procédé de fabrication des 20compositions, que celles-ci soient à usage thérapeutique ou cos-metique. Ce support est compatible avec la formation d'émulsions.
En outre, l'emploi d'un support stabilisant sous forme de solution permet d'obtenir un caractere coulable très avantageux, comme cela est aisement compréhensible a l'homme du métier.
25On conçoit ainsi que l'invention apporte des ameliora-tions remarquables, déterminantes vis-à-vis de la technique anterieure.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'inven-tion appara;tront egalement clairement à la lumiere de la 30description explicative qui va suivre faite en reference a plusieurs exemples de realisation de composition selon l'invention, mettant en oeuvre le procédé selon l'invention précédemment decrit.
.~
ExempLe 1 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation des grosses vesicules multilamellaires (M.L.V.) 05 La lecithine de soja est mise en solution chloroformique puis deposee sous forme d'un film mince sur les parois d'un ballon de verre par évaporation du solvant sous vide. De l'eau a la tempé-rature de 80C est alors versee dans le ballon et maintenu a cette temperature pendant 10 minutes sous agitation Vortex. La quantité
d'eau utilisée est telle que le mélange final renferme 1 % de lécithine. L'ensemble est alors laisse au repos à temperature ambiante jusqu'a obtenir le refroidissement complet. La solution contient alors 1 Y0 de phospholipide sous forme de liposomes MLV.
Si l'on veut encapsuler une substance hydrosoluble, celle-ci sera dissoute dans l'eau ajoutee au cours de la prépara-tion. Dans le cas d'un produit lipophi(e a introduire dans la membrane, celui-ci devra être incorpore dans la phase chloro-formique renfermant le phospholipide.
b) Préparation du collagene déréticule ou atélocollagene La peau de veau fraîchement abattu est soumise a épila-tion chimique dans un bain contenant 3 % de sulfure de sodium et 4 % de chaux, la proportion etant de 100 g de peau pour 200 cm3 de solution. Le derme est alors isole du reste de la peau par une operation de refendage grâce a une scie tournante à ruban.
Le tissu obtenu est broy~ et extrudé a travers une grille ~;
comportant des trous de 4 mm. Le broyat est alors mis en contact pendant 3 semaines avec un lait de chaux saturé a raison de 1 kg pour 4 l de solution. La peau ainsi traitee est séparee du surna-geant par une centrifugation en continue sous une accélération de 2000 g a l'aide d'une décanteuse tournant à 4000 tr/min. Le culot est ensuite soumis à deux lavages a l'eau courante dans une cuve inox sous agitation lente à raison de 1 kg pour 4 l de bain. Le broyat est alors soumis à deux traitements du tampon phosphate pH 7,~ (21,7 g/l de Na2HP04 et 0,7~ g/l de KH2P04) dans les mêmes conditions que pour le lavage a l'eau. Le culot est alors lavé par ~:, ~: .
deux bains d'eau désionisée et sterile. Le broyat obtenu est place dans une solution d'acide acétique (0,5 g/l, pH 3,4~ a raison de 1 kg pour 20 l de bain. Après 5 minutes d'agitation, Le surnageant est separé du cuLot par décantation en continu selon la technique 05 precedente. Le collagene est alors précipité par le surnageant par addition de chlorure de sodium sec dans une proportion de 10 %
environ par rapport au bain. Aprés decantation par gravité, les fibres obtenues sont dialysees contre de l'eau désionisée et sterile a l'aide de membranes de dialyse, de preférence formees par des boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6000 et 8000 daltons. Après avoir verifié par le nitrate d'argent que les fibres dialysees ne contenaient plus de chlorure de sodium, celles-ci sont mises en solution dans un bain renfermant 6 g/l d'acide acétique de facon a obtenir une concentration finale de 1 %
en protéine. L'ensemble est agite sous agitation lente pendant 24 heures.
c) Préparation du chondroïtine-4 sulfate Des cloisons nasales de veau debarrassées des tissus musculaires et adipeux sont hachées et broyees par extrusion à
travers une grille comportant des trous de 4 mm ; le broyat est place pendant 24 heures à une temperature de 6C dans un tampon de chlorure de potassium (11,8 g/l de KCl, 78,8 mg/l de cystéine, ETDA
180 mg/l) renfermant 1 % de papaïne "MERCK". La proportion etant de 130 9 de broyat pour 1 l de tampon.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu à l'aide d'une decanteuse tournant a 4000 tr/min. Au surna-geant sont alors ajoutes 40 g/l d'acide trichloracétique. Le precipite est eliminé par centrifugation en continue selon la technique précédente. Le surnageant est neutralise à l'aide de soude en pastille. Le mélange est alors dialyse contre de l'eau désionisée et stérile a l'aide de boyaux dont le seuil de coupure est compris entre 6 et 8000 daltons. La solution dialysee est lyophilisee. Le chondroïtine-4 sulfate est obtenu à l'état sec.
r d) Préparation du méLange ateLocoLLagène-chondro;tine-4 sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution a une concen-trat;on de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutee sous agitation Lente a La soLution d'aterocoLlagene 05 contenant 1 % de proteine et dans La proportion de 250 ml pour 1 de solution colLagenique. La quantité de soude est teLLe que Le pH
final est de 8.
e) Préparation de la composition de liposome-atérocoLLagene-chondro;tine-4 suLfate La soLution aqueuse de liposome a 2 % de lécithine de soja est introduite sous agitation lente dans le melange atélo-colLagène chondro;tine-4 sulfate, les volumes de soLution colla-gén;que étant égaux, Le compLexe finaL renferme 1 % de Lécithine.
Exe~ple 2 Preparation d'une composition de liposome dans un support atélo-collagène-glycosaminoglycanne a) Preparation de liposome SUV (petites vesicules unilamellaires) La lecithine d'oeuf est dissoute dans l'éthanoL a une concentration de 30 mmoL/L. La solution alcoolique est aLors ajoutée à une solution de chLorure de potassium 0,15 M. Des vesi-cules unilamellaires se forment alors. La suspension est ensuite dialysee pour éliminer l'alcool résiduel et peut être concentree jusqu'a 2 % par ultrafiLtration.
b) Préparation du collagene déreticule ou atelocollagene Le broyat de peau de veau est obtenu de la même façon que dans l'exemple precédent. Le broyat est alors soumis à deux traite~
ments au tampon phosphate pH 7,8 t21,7 h/L de Na2HP04 et 0,79 g/L
de KH2P04). La concentration en broyat est de 1 kg pour 1 l de bain. Après chaque traitement, le residu est récupéré par centri-gation en continu grace à une décanteuse tournant a 4000 tr/min et donnant une acceleration de 2000 g. Après lavage au tampon phosphate, le broyat est lavé par deux bains d'eau désionisée et stérile dans les mêmes conditions que précedemment.
Le broyat est alors place a raison de 200 gtL dans une solution d'acide chlorhydrique 0,01 N contenant 7,5 % de pepsine par rapport au collagène. L'ensemble est laissé au repos pendant 24 heures à température ambiante. Au bout de ce laps de temps, une quantité complémentaire de pepsine de 7,5 ~ par rapport au collagène est ajoutée au bain et l'ensemble est laissé au repos 05 dans les mê~es conditions que précédemment.
Le surnageant est séparé du culot par centrifugation en continu selon la technique précédente. Dans le surnageant est versé
du chlorure de sodium de façon à obtenir une concentration de lû %.
Par une centrifugation en continu, les fibres sont isolées et placées dans des tubes de dialyse Visking (r~f. 30/32). Après éli-mination totale du chlorure de sodium, les fibres sont mises en solution dans l'acide acétique û,1 M de façon à obtenir une concen-tration de 1 % de collagène.
c) Pr~paration du dermatane sulfate La peau de porc débarrassée de manière classique par refente de la couche cornée et des tissus sous-cutanés est hachée et broyée par extrusion à travers une grille comportant des trous de 4 mm~
Le broyat est ensuite lavé par un mélange chloroforme-méthanol (proportion en volume 2/1). Après évaporation du solvant sous vide, le résidu sec est traité comme le broyat des cloisons nasales dans l'exemple 1, le dermatane sulfate est obtenu à l'état sec.
d) Préparation du mélange atélocollagène-dermatane sulfate Le mucopolysaccharide est mis en solution à une concen-tration de 1 % dans un bain renfermant de la soude. Cette solution est ajoutée sous agition lente à la solution d'atélocollagène contenant 1 % de protéina dans la proportion de 3ûû ml pour 1 l de solution collagénique. La quantité de soude est telle que le pH
final est de 8.
e) Préparation du complexe liposome-atélocollagène-dermatane sulfate La solution aqueuse de liposome à 2 % de lécithine d'oeuf et introduite sous agitation lente dans le mélange atélocollagène-dermatane sulfate. Les volumes des solutions collagénique et lipo-somique étant égaux, le complexe final renferme 1 % de lécithine.
Exemple 3 Essai de contrôle de stabilité des liposomes dans leur support de .. . .
l'invention atélocollagène-glycosaminoglycanne 05 Le contrôle de la présence de la qualité des liposomes est effectue par microscopie électronique. Pour cela, les prépara-tions préparées conformément aux exemples 1 et 2, contenant 1 % de lécithine sont diluées 10 fois. Une goutte de cette dilution est placée sur une grille de microscopie électronique revêtue d'un film lû adéquat, par exemple un film de FormavarR. Immédiatement après, sur la même grille est ajoutée une goutte de solution d'acide phospho-tungstique à 2 % en poids préparée extemporanément et neutralisée à
pH 7. L'ensemble est séché à l'air et examiné par microscopie à
transmission.
Le contrôle à microscopie électronique montre que les liposomes restent bien formés et qu'ils peuvent etre remis en contact avec l'eau sans difficulté. Le passage par la lyophilisation permet d'une part une conservation illimitée du complexe et, d'autre part la préparation de pâtes très concentrées en liposome et en atélocollagène pouvant être injectées dans l'organisme SOU5 un volume réduit.
ûn v~rifie la stabilité des liposomes dans les composi~
tions selon l'invention en soumettant ces compositions à une con-trainte ultrasonique.
Pour cela, on peut agiter la composition avec un homogé-néiseur type "Ultra-Turax" tournant à 22000 tr/min pendant des temps de 1,3 et 5 minutes.
ûn a effectué une comparaison en soumettant une solution aqueuse des mêmes liposomes aux mêmes conditions.
La microscopie électronique des compositions ainsi traitées, à savoir les compositions selon l'invention obtenues aux exemples 1 et 2 et la composition comparative formée par une solu-tion aqueuse des mêmes liposomes, fait ressortir que dans la solution aqueuse les liposomes se désagrègent progressivement donnant naissance a des membranes désorganisées. Au contraire, dans :
12 l 330650 les supports stabilisants selon l'invention, les vésicules de liposome restent bien formées, meme au bout de 5 minutes de trai-tement.
L'invention permet donc de stabiliser les liposomes tout 05 en conservant les avantages inhérents 3 l'emploi d'une solution d'une grande fluidité, comme précédemment énoncé
Exemple 4 Composition pharmaceutique ou cosmétique On peut utiliser une composition obtenue aux exemples et 2 comme composition pharmaceutique ou cosmétique. Naturellement, dans ce cas, il est habituellement nécessaire d'encapsuler dans les liposomes un principe actif, soit dans la membrane du liposome, soit à l'intérieur du liposome en fonction du caractere hydrophobe ou hydrophile de la substance active, selon la procédure qui est d'ailleurs mentionnée à l'exemple 1 à la fin du paragraphe a) et qui est bien connue à l'homme du métier.
On peut également ajouter divers excipients ou d'autres composants actifs comme cela est souhaité, à condition qu'ils ne détruisent pas l'effet de stabilisation du support selon l'inven-tion, comme cela est bien compréhensible .
,. . . /
~` ~
Exemple de composition sous forme émulsionnée Cette composition présente à l'état brute la formula-tion suivante, les pourcentages étant exprimés en poids:
% en poids Poplyoxypropylène 15 (POP) - Alcool stéarylique 4 St~aroyle-2-lactylate de sodium 4 Ester d'acide gras polyoxy ethyléné 3 Stéarate de glycérol 3 Dioctonate de propylène glycol 2 Parabenzoate de m~thyle 0,3 Propylène glycol 2 Allantoine 0,2 Carboner 940 ~ 0,2 Triéthanolamine 0,5 "Complexe" de liposomes dans le support Stabilisant atélocollagene-glycosaminoglycanne selon l'invention .................................... 30 Eau purifiée 50,8 100 %
La préparation de cette composition sous forme émulsionnée est réalisée de la manière suivante.
Tout d'abord, on prépare une émulsion dans l'eau purifiée de tous les composants autres que le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocollagène~
glycosaminoglycanne, selon l'invention, de manière classique.
Une fois que cette émulsion est formée, on ajoute le "complexe" de liposomes dans le support stabilisant atélocol- ;
lagène-glycosaminoglycanne selon l'invention, tel que préparé -~:
selon l'exemple 1 ou 2, sous agitation qui est maintenue pendant ..
une heure, la température devant ~tre maintenue inf~rieure à
30C.
On obtient ainsi une composition sous forme émulsionnée dans laquelle les liposomes sont stables.
~.~.d.~
:':' : ' . .. : ,' . ". . :.' .. . , . : : ' . : ' ,! ' ' .'. " ' ' ' ' ' : ' :
14 l 330650 Cette stabilité a été contrôlée par microscopie électronique, ce qui constitue un résultat remarquable de l'invention.
Naturellement, la présente in~ention comprend tous les 05 moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs diverses combinaisons. Par exemple, il est bien clair que le terme "glycosaminoglycanne" ne doit pas être inter-prété strictement et qu'il inclut de manière équi~alPnte les muco-polysaccharides étant donné que les glycosaminoglycannes sont des polymères constitués d'unités disaccharidiques disposées de façon linéaire formées en général d'un acide uronique et d'une hexos-amine. Ainsi, les mucopolysaccharides sont inclus dans la défini-tion des glycosaminoglycannes.
De même, l'atélocollagène doit être entendu comme étant du collagène débarrassé de ses télopeptides, ce qui constitue un collagène déréticulé bien précis pour 1'homme de 1'art.
Il est à observer enfin que la combinaison selon l'in~en-tion de glycosaminoglycannes avec de l'atélocollagène permet de préparer un support stabilisant sous forme de solution à un pH
voisin de la neutralité sans qu'une précipitation de l'atélocolla-gène ne puisse se produire. En outre, le support selon l'invention permet de préparer sans problème des émulsions ; ce qui constitue un des a~antages techniques déterminants de l'in~ention, De plus, les glycosaminoglycannes suppriment pratiquement totalement l'antigénicité résiduelle de l'atélocollagène.
Il est à noter encore que la composition complète obtenue selon l'in~ention peut être lyophilisée, ce qui constitue un ' a~antage 1ndustriel déterminant.
o~ 1,330,650 Process for stabilization of hydrolytic lipid lamella phases tees, for example liposomes, composition of lamellar phases hydrated lipids, for example liposomes, stabilized by a use of a stabilizing support based on atelocollagen and 05 glycosaminoglycans, and use in pharmacy or cosmetolo-gie.
The present invention relates essentially to a method for stabilizing hydrated lipidic lamellar phases, by example of liposomes, a composition and lamellar phases lipi-hydrated disks, for example liposomes stabilized by a use of a stabilizing support based on atelocollagen and glycosaminoglycans and use in pharmacy or ~ cosmetology We know; from BANGHAM the lamellar phases lipi-hydrated disks, a particular form of which consists of liposomes (see BA ~ GHAM et al. Journal of Molecular Biology, 13: 238; 253 (196 ~) or also BANGHAM et al. Chem. Phys. Lipids.
1: 255 (1 ~ 67)). Many other articles on liposomes have been published (see PAPAHADJOPOULOS, ~ iochim. ~ iophys ~ Acta, 135 (1967), pages 624- ~ 3 ~ or WEISSMANN in Journal of Lipids ~ esearch, volume 9 ~ (1968), pages 310 to 318).
We know that liposomes, which are phospho- capsules lipids, are becoming more and more important in cosmetics and in pharmacies because they allow the transport of active substances towards the cells by which they are absorbed. Indeed, and this has been known since BANGHAM, the phospholipid nature of their membrane, ~ being very close to that of cells, causes a fusion between the two envelopes.
Unfortunately, liposomes have low stability, so that their ~ development is greatly hampered, this which is a major problem. In many cases, these tanks constituting the liposomes, disintegrate before entering contact with target cells. In addition, their integration into a relatively finished product relatively often destroys tanks. In particular, in cosmetics, the realization of a emulsion containing liposomes is extremely delicate, the phase ~
1,330,650 fatty resulting in an opening of the phospholipid membrane.
Also, many works are devoted to the stabilization of liposomes by substances which must also be biocompa-tibles.
05 ûn has already proposed various solutions to stabilize liposomes, including the use of a gel form, in a hydro-colloide (CA, volume 97, 1982, 188 156k with reference to an article published in J. Pharm. Pharmacol, 1982, 34, (7, 473-4); see also the document WO 85 / û364û, in which a large number of substances which can be used as a gelling agent, in particular carbohydra ~ es like celluloses, gums including lecarra-ghenane, xanthan, collagen, polyacrylamide, poly-siloxanes, amino acid polymers such as albumin gelatin, gelatin (page 13, lines 20 to 35)).
The use of gel has many disadvantages.
First, it seriously complicates the preparation of ingredients.
sitions, in particular pharmaceutical or cosmetic compositions.
Indeed, due to the physical properties of the gels, and in particular of their non-flowable nature, the use of gel poses 2. serious handling problems. Finally, regarding more particularly the use of collagen as a support gel, collagen has a certain antigenicity although this is low. Also, in the case of collagen, we usually use-also acid-soluble collagen. Since the composition must have a pH close to neutral for the stability of liposomes as well as to be close to physiological pH, in the case of use in cosmetics, under these pH conditions, the acid-soluble collagen precipitates, and the inclusion of liposomes becomes impossible. This phenomenon can be prevented by very complicated and expensive preparation conditions not applicable on an industrial scale, including conditions of low temperature close to 4C. This does not allow to consider industrial manufacturing at a low cost.
The present invention therefore aims to solve the new technical problem consisting in providing a solution tion to stabilize the lipid lamellar phases hydrated, in particular liposomes using a stabilized support health which is in the form of a sufficiently fluid solution to eliminate all the disadvantages inherent in the use of 05 stabilizing supports in gel form.
The present invention still aims to resolve the new technical problem consisting in providing a solution tion to stabilize the lipid ~ amellar phases hydrated, in particular liposomes, by the use of a static support sufficiently fluid bilisant which has no antigenicity character and which, moreover, requires only the work of an extremely simple process, industrially applicable under simple operating conditions, which can be varied relatively widely, thus allowing practicable reproducibility just perfect.
Another object of the present invention is to solve the new technical problem consisting in providing a solution tion to stabilize lipid lamellar phases hydrated, in particular liposomes, by the use of a support stabilizer compatible with the formation of emulsions.
All these technical problems are solved for the first time.
first time by the present invention in a satisfactory manner, industrially usable.
Thus, according to a first aspect, the present invention provides a method for stabilizing the lipid lamellar phase hydrated, e.g. liposomes, including the introduction of said hydrated lipid lamellar phase in a stable support reading, characterized in that said stabilizing support is prepared as follows :
a) a solution of atelocollagen is prepared separately, and a glycosaminoglycans solution; then b) mixing said atelocollagen solution with the solution of glycosaminoglycans. ; ~
According to a first alternative embodiment of the method according to the invention, the mixture is produced by introducing the solution.
tion of glycosaminoglycans in the atelocollayene solution. :
According to a particular embodiment, the glycosaminoglycans solution is prepared by dissolving the glycos-aminoglycan in a basic aqueous solution with a pH
05 adjusted so that after mixing with the atelocollagen solution, the pH of the mixture constituting the stabilizing support remains slight-basic while being close to neutrality. Preferably, this final pH is close to 8.
According to a particularly advantageous characteristic, this basic aqueous solution is an aqueous sodium hydroxide solution.
According to another advantageous characteristic, the concentration tration into glycosaminoglycan in the glycosaminogly solution rods from 0.5 to 4%, even better, from û, 5 to 2%, and still from preference is close to 1%.
According to another characteristic of the process of the invention tion, the atelocollagen solution is an aqueous solution atelocollagen preferably having a concentration included between 0.5 and 2% by weight, and more preferably close to 1% ~
This atelocollagen solution can be obtained according to the invention by dissolving atelocollagen fibers in a slightly acidic aqueous solution.
According to a particular embodiment, these fibers of atelocollagen are dissolved in acetic acid 0.1 M.
According to another particular embodiment of the method according to the invention, atelocollagen is obtained by digestion enzy-collagen material.
According to another particular characteristic of the process according to the invention, the hydrated lipid lamellar phases, by example of liposomes, are introduced into the support solution stabilizer according to the invention, according to ~ olumes substantially equal.
According to a particular embodiment, the proportion - tion of the lipid lamellar phases, for example liposomes, represents approximately 1% of the final composition.
:
According to a second aspect, the present invention provides also a composition containing lipid lamellar phases hydrated, for example liposomes, stabilized by the presence 05 of a stabilizing support, characterized in that the stabilizing support reading is in the form of a solution containing a mixture of atelo-collagen and glycosaminoglycans.
According to a particular variant embodiment, the glycosaminoglycans used are chosen from glycosamino-structural glycans, especially hyaluronic acid, chondro; tine-4 sulfate, chondroitin-6 sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate; where the secretory glycosaminoglycans, especially heparin and its derivatives as well as the sulphate mucotines.
According to another characteristic of the composition according to the invention, this relates to solutions of atelocollagen and starting glycosaminoglycans for the preparation of the solution mixture whose characteristics have been previously stated in the process.
The relative proportion of glycosaminoglycans vis-à-vis of the atelocollagen is preferably from 18 to 25 Y0 by weight of glycosaminoglycan compared to atelocollagen.
According to another characteristic of the composition according to the invention, the stabilizing support solution is at a light pH-basic while being close to neutrality, preferably around 8.
According to another characteristic of the composition according to the invention, this composition is obtained by mixing substantially equal volumes of lipi- lamellar phase solutions hydrated disks, such as liposomes, and solutions of stabilizing support.
A preferred use of the compositions according to the invention ~
tion relates to use in pharmacy or cosmetology, under form of pharmaceutical or cosmetic compositions. For this you can use the composition as it is or you can :.,: ::
::
1,330,650 add various well known suitable components or excipients skilled in the art, without any particular problem, subject to verify that this addition does not modify the stability of hydrated lipid lamellar phases, in particular liposomes.
05 Thanks to the invention, unexpected a decrease in the antigenicity of the stabilizing support.
There is also a marked improvement in the protection of one of the components of the stabilizing support, namely atelocoLlagen against collagenases causing a prolongation-10ment "in vivo" of the delayed effect of atelocollagen.
This stabilizing support has a hydrating property increased, a more marked action of regeneration of the dermis and the epidermis by increasing cell development.
Another particularly unexpected benefit and a 15important importance for an industrial exploitation resides in The fact that atelocollagen uses in the form of a solution according to the present invention is mixed in an extremely simple manner with glyrosaminoglycans, leading to a; nsi in a simplification the stabilization process and therefore the manufacturing process 20 compositions, whether for therapeutic or cos-metic. This support is compatible with the formation of emulsions.
In addition, the use of a stabilizing support in the form of solution makes it possible to obtain a very advantageous flowable character, as is easily understood by those skilled in the art.
25It is thus understandable that the invention brings improvements remarkable, decisive vis-à-vis the technique previous.
Other aims, characteristics and advantages of the invention tion will also appear clearly in the light of the 30 explanatory description which follows made with reference to several examples of the composition according to the invention, implementing the method according to the invention described above.
. ~
1,330,650 Preparation of a liposome composition in an atelo-collagen-glycosaminoglycan a) Preparation of large multilamellar vesicles (MLV) 05 Soy lecithin is put in chloroform solution then deposited in the form of a thin film on the walls of a balloon of glass by evaporation of the solvent under vacuum. Water at temperature stripped of 80C is then poured into the flask and maintained at this temperature for 10 minutes with Vortex stirring. The amount of water used is such that the final mixture contains 1% of lecithin. The whole is then left to stand at temperature ambient until complete cooling. The solution then contains 1 Y0 of phospholipid in the form of MLV liposomes.
If we want to encapsulate a water-soluble substance, this will be dissolved in the water added during the preparation tion. In the case of a lipophi product (including introducing into the membrane, this must be incorporated in the chloro-form containing the phospholipid.
b) Preparation of the collet dereticule or atelocollagen The freshly slaughtered calf skin is subjected to epila-chemical tion in a bath containing 3% sodium sulfide and 4% lime, the proportion being 100 g of skin per 200 cm3 of solution. The dermis is then isolated from the rest of the skin by a slitting operation using a rotating band saw.
The fabric obtained is ground ~ and extruded through a grid ~;
with 4 mm holes. The ground material is then brought into contact for 3 weeks with saturated lime milk at a rate of 1 kg for 4 l of solution. The skin thus treated is separated from the surna-giant by continuous centrifugation under an acceleration of 2000 g using a decanter rotating at 4000 rpm. The nerve is then subjected to two washes with running water in a tank stainless steel with slow stirring at a rate of 1 kg for 4 l of bath. The ground material is then subjected to two treatments of the phosphate buffer pH 7, ~ (21.7 g / l Na2HP04 and 0.7 ~ g / l KH2P04) in the same conditions only for washing with water. The base is then washed by ~ :, ~:.
two baths of deionized and sterile water. The ground material obtained is placed in a solution of acetic acid (0.5 g / l, pH 3.4 ~ at the rate of 1 kg for 20 l of bath. After 5 minutes of agitation, the supernatant is separated from the tank by continuous decantation according to the technique 05 previous. The collagen is then precipitated by the supernatant by addition of dry sodium chloride in a proportion of 10%
about compared to the bath. After gravity settling, the fibers obtained are dialyzed against deionized water and sterile using dialysis membranes, preferably formed by hoses whose cutoff threshold is between 6000 and 8000 daltons. After verifying with silver nitrate that the dialyzed fibers no longer contained sodium chloride, these are dissolved in a bath containing 6 g / l acetic acid so as to obtain a final concentration of 1%
in protein. The whole is stirred with slow stirring for 24 hours.
c) Preparation of chondroitin-4 sulfate Calf nasal septum riddled with tissue muscle and fat are minced and ground by extrusion to through a grid with 4 mm holes; the ground material is place for 24 hours at a temperature of 6C in a buffer of potassium chloride (11.8 g / l KCl, 78.8 mg / l cysteine, ETDA
180 mg / l) containing 1% papain "MERCK". The proportion being 130 9 of ground material for 1 l of buffer.
The supernatant is separated from the pellet by centrifugation in continuous using a decanter rotating at 4000 rpm. Au surna-giant are then added 40 g / l of trichloroacetic acid. The precipitate is removed by continuous centrifugation according to the previous technique. The supernatant is neutralized using soda in tablet. The mixture is then dialyzed against water deionized and sterile using hoses with cutoff threshold is between 6 and 8000 daltons. The dialysis solution is lyophilized. Chondroitin-4 sulfate is obtained in the dry state.
r 1,330,650 d) Preparation of the ateLocoLLagene-chondro mixture; tine-4 sulfate The mucopolysaccharide is dissolved in a concentration 1% trat; one in a bath containing soda. This solution is added with slow stirring to the solution of aterocoLlagene 05 containing 1% protein and in the proportion of 250 ml for 1 colLagenic solution. The amount of soda is as good as the pH
final is 8.
e) Preparation of the composition of liposome-atérocoLLagene-chondro; tine-4 suLfate The aqueous liposome solution has 2% lecithin soybean is introduced with slow stirring into the atelo- mixture collagen chondro; tine-4 sulfate, the volumes of colla-gen; that being equal, the final complex contains 1% lecithin.
Exe ~ ple 2 Preparation of a liposome composition in an atelo-collagen-glycosaminoglycan a) Preparation of SUV liposome (small unilamellar vesicles) Egg lecithin is dissolved in ethanol at a concentration of 30 mmoL / L. The alcoholic solution is then added to a 0.15 M potassium chloride solution.
unilamellar cules then form. The suspension is then dialysis to remove residual alcohol and can be concentrated up to 2% by ultrafiltration.
b) Preparation of the collagen derivative or atelocollagen The ground calf skin is obtained in the same way as in the previous example. The ground material is then subjected to two milking ~
Phosphate buffer pH 7.8 t21.7 h / L Na2HP04 and 0.79 g / L
of KH2P04). The ground material concentration is 1 kg per 1 l of bath. After each treatment, the residue is collected by centri-continuous gation thanks to a decanter rotating at 4000 rpm and giving an acceleration of 2000 g. After washing with a tampon phosphate, the ground material is washed by two baths of deionized water and sterile under the same conditions as before.
The ground material is then placed at a rate of 200 gtL in a 0.01 N hydrochloric acid solution containing 7.5% pepsin 1,330,650 compared to collagen. The whole is left to stand for 24 hours at room temperature. At the end of this time, a additional amount of pepsin of 7.5 ~ compared to collagen is added to the bath and the whole is left to stand 05 under the same conditions as above.
The supernatant is separated from the pellet by centrifugation in continuous according to the previous technique. In the supernatant is poured sodium chloride so as to obtain a concentration of 10%.
By continuous centrifugation, the fibers are isolated and placed in Visking dialysis tubes (r ~ f. 30/32). After eli-total mining of sodium chloride, the fibers are put in solution in acetic acid û, 1 M so as to obtain a concentration tration of 1% collagen.
c) Preparation of dermatan sulfate The pigskin removed in a conventional manner by splitting of the stratum corneum and subcutaneous tissue is chopped and milled by extrusion through a grid having holes 4 mm ~
The ground material is then washed with a chloroform mixture methanol (proportion by volume 2/1). After evaporation of the solvent under vacuum, the dry residue is treated like the shredded bulkheads nasal in Example 1, dermatan sulfate is obtained in the state dry.
d) Preparation of the atelocollagen-dermatan sulfate mixture The mucopolysaccharide is dissolved in a concentration 1% tration in a bath containing soda. This solution is added with slow stirring to the atelocollagen solution containing 1% protein in the proportion of 3ûû ml per 1 l of collagen solution. The amount of soda is such that the pH
final is 8.
e) Preparation of the liposome-atelocollagen-dermatan complex sulfate 2% aqueous liposome solution of egg lecithin and introduced with slow stirring into the atelocollagen mixture-dermatan sulfate. The volumes of collagen and lipo- solutions Somic being equal, the final complex contains 1% of lecithin.
Example 3 Stability control test of the liposomes in their support ... .
the atelocollagen-glycosaminoglycan invention 05 Checking the presence of the quality of liposomes is performed by electron microscopy. For this, the preparations tions prepared in accordance with Examples 1 and 2, containing 1% of lecithin are diluted 10 times. A drop of this dilution is placed on an electron microscope grid coated with a film lû adequate, for example a film of FormavarR. Immediately after, on the same grid is added a drop of phospho- acid solution tungstic at 2% by weight prepared extemporaneously and neutralized at pH 7. The whole is air dried and examined by microscopy at transmission.
The electron microscopy control shows that the liposomes remain well formed and they can be put back in contact with water without difficulty. Passing through the lyophilization allows on the one hand an unlimited conservation of complex and, on the other hand the preparation of highly concentrated pasta liposome and atelocollagen which can be injected into the body SOU5 a reduced volume.
ûn v ~ rify the stability of liposomes in composi ~
according to the invention by subjecting these compositions to a ultrasonic strap.
To do this, the composition can be agitated with a homogeneous nebulizer type "Ultra-Turax" rotating at 22000 rpm for time of 1.3 and 5 minutes.
ûn performed a comparison by submitting a solution aqueous of the same liposomes under the same conditions.
Electron microscopy of the compositions as well treated, namely the compositions according to the invention obtained with Examples 1 and 2 and the comparative composition formed by a solution tion of the same liposomes, highlights that in the aqueous solution the liposomes gradually disintegrate giving rise to disorganized membranes. On the contrary, in :
12 l 330 650 the stabilizing supports according to the invention, the vesicles of liposomes remain well formed, even after 5 minutes of treatment seriously.
The invention therefore makes it possible to stabilize the liposomes while 05 retaining the inherent advantages 3 the use of a solution very fluid, as previously stated Example 4 Pharmaceutical or cosmetic composition A composition obtained in the examples can be used and 2 as a pharmaceutical or cosmetic composition. Naturally, in this case, it is usually necessary to encapsulate in the liposomes an active ingredient, either in the liposome membrane, either inside the liposome depending on the hydrophobic character or hydrophilic of the active substance, depending on the procedure which is moreover mentioned in Example 1 at the end of paragraph a) and which is well known to those skilled in the art.
You can also add various excipients or others active components as desired, provided they do not not destroy the stabilizing effect of the support according to the invention tion, as is understandable .
,. . . /
~ `~
1,330,650 Example of composition in emulsified form This composition presents in the raw state the formula-following tion, the percentages being expressed by weight:
% in weight Poplyoxypropylene 15 (POP) - Stearyl alcohol 4 St ~ sodium aroyl-2-lactylate 4 Polyethylenated fatty acid ester 3 Glycerol stearate 3 Propylene glycol dioctonate 2 Parabenzoate of methyl ~ 0.3 Propylene glycol 2 Allantoin 0.2 Carboner 940 ~ 0.2 Triethanolamine 0.5 "Complex" of liposomes in the support Atelocollagen-glycosaminoglycan stabilizer according to the invention .................................... 30 Purified water 50.8 100%
The preparation of this composition in emulsified form is performed as follows.
First, we prepare an emulsion in water purified of all components other than the "complex" of liposomes in the stabilizing support atelocollagen ~
glycosaminoglycan, according to the invention, in a conventional manner.
Once this emulsion is formed, add the "complex" of liposomes in the stabilizing support atelocol-;
lagene-glycosaminoglycan according to the invention, as prepared - ~:
according to example 1 or 2, with stirring which is maintained for ..
one hour, the temperature should be kept below ~
30C.
A composition is thus obtained in emulsified form in which the liposomes are stable.
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14 l 330 650 This stability was checked by microscopy electronic, which is a remarkable result of the invention.
Naturally, the present in ~ ention includes all 05 means constituting technical equivalents of the means described as well as their various combinations. For example, it is good clear that the term "glycosaminoglycan" should not be inter-strictly loaned and includes equi ~ alPnte muco-polysaccharides since glycosaminoglycans are polymers made up of disaccharide units arranged so linear generally formed of a uronic acid and a hexos-amine. Thus, mucopolysaccharides are included in the definition.
tion of glycosaminoglycans.
Likewise, atelocollagen should be understood as being collagen stripped of its telopeptides, which is a very precise de-crosslinked collagen for those skilled in the art.
Finally, it should be observed that the combination according to in ~ en-tion of glycosaminoglycans with atelocollagen allows prepare a stabilizing support in the form of a solution at a pH
close to neutrality without a rush of atélocolla-gene cannot occur. In addition, the support according to the invention makes it easy to prepare emulsions; what constitutes one of the decisive technical advantages of in ~ ention, In addition, glycosaminoglycans virtually suppress completely the residual antigenicity of atelocollagen.
It should also be noted that the complete composition obtained according to in ~ ention can be freeze-dried, which constitutes a decisive industrial age.
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