BRPI9915832B1 - "variante de uma cutinase de cepa dsm 1800 de humicola insolens precursora, sequência de dna, vetor, célula hospedeira microbiana transformada, processos para produzir uma variante, para hidrólise enzimática de um oligômero cíclico de poli(etileno tereftalato), para tingir pano ou fio de poliéster, para melhorar o acabamento funcional de um fio ou pano contendo pet, e, composilão detergente". - Google Patents

Abstract

"variante de uma cutinase fúngica precursora, seqüência de dna, vetor, célula hospedeira transformada, processos para produzir a variante, para construir uma variante de cutinase, para hidrólise enzimática de um oligômero cíclico de poli(etileno tereftalato), para tingir pano ou fio de poliéster, para detectar a atividade de cutinase em uma amostra, e para melhorar o acabamento funcional de um fio ou pano contendo pet, e, composição detergente". as variantes de cutinases fúngicas melhoraram a termoestabilidade. as variantes compreendem a substituição de um ou mais resíduos amino-ácidos próximos do n-terminal da seqüência de aminoácidos ou da estrutura tridimensional da cutinase.

Description

"VARIANTE DE UMA CUTINASE DE CEPA DSM 1800 DE HUMICOLA INSOLENS PRECURSORA, SEQUÊNCIA DE DNA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSFORMADA, PROCESSOS PARA PRODUZIR UMA VARIANTE, PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE UM OLIGÔMERO CÍCLICO DE POLI(ETILENO TEREFT AL ATO), PARA TINGIR PANO OU FIO DE POLIÉSTER, PARA MELHORAR O ACABAMENTO FUNCIONAL DE UM FIO OU PANO CONTENDO PET, E, COMPOSIÇÃO DETERGENTE".

CAMPO DA INVENÇÃO

As cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar a cutinase do substrato. As cutinases são conhecidas de vários fungos (P.E. Kolattukudy em “Lipases”, Ed. B. Borgstrõm e H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504). A seqüência de aminoácidos e a estrutura de cristal de uma cutinase de Fusarium solani pisi foram descritas (S. Longhi e outros, Journal of Molecular Biology, 268(4), 779-799 (1997)). A seqüência de aminoácidos de uma cutinase de Humicola insolens também foi publicada (US 5.827.719).

Diversas variantes da cutinase de Fusarium solani pisi foram publicadas: WO 94/14963; WO 94/14964; Appl. Environm. Microbiol. 64, 2794-2799, 1998; Proteins: Structure, Funcion and Genetics 26, 442-458, 1996; J. of Computational Chemistry 17, 1783-1803, 1996; Protein Engineering 6, 157-165, 1993; Proteins: Structure, Funcion and Genetics 33, 253-264, 1998; J. of Biotechnology 66, 11-26, 1998; Biochemistry 35, 398-410, 1996.

As cutinases fúngicas podem ser usadas na hidrólise enzimática dos oligômeros cíclicos de pol(etileno tereftalato), p. ex., no acabamento de fio ou pano de fibras de poli(etileno tereftalato) (WO 97/27237). Entretanto, é desejável melhorar a termoestabilidade das cutinases fúngicas conhecidas, para permitir uma mais alta temperatura de processamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram certas variantes de cutinases fúngicas tendo melhorada termoestabilidade.

Portanto, a invenção fornece uma variante de uma cutinase fungica precursora, compreendendo substituição de um ou mais resíduos aminoácidos, que é localizada a) dentro de 17 Ã do local do aminoácido N-terminal (como calculado pelos resíduos aminoácidos em uma estrutura de cristal), e/ou b) dentro de 20 posições do aminoácido N-terminal. A invenção também fornece uma seqüência de DNA codificando a variante, um vetor de expressão compreendendo a seqüência de DNA, uma célula hospedeira transformada abrigando a seqüência de DNA ou o vetor de expressão, um processo de produzir a variante, processos de utilizar a variante e uma composição detergente compreendendo a variante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 fornece as coordenadas para e estrutura 3D da cutinase de H. insolens. A Fig. 2 é um modelo de computador mostrando as estruturas tridimensionais das cutinases de F. solani pisi (esquerda) e H. insolens (direita). Diferentes cores foram usadas para identificar o aminoácido N-terminal e zonas de 12 Â e 17 Á de diâmetro em tomo deste.

As Figs. 3-6 ilustram a hidrólise de c3ET. Detalhes são dados nos Exemplos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Cutinase Fungica A cutinase precursora é uma cutinase fungica, tal como uma cutinase fungica fílamentosa, p. ex., nativa de uma cepa de Humicola ou Fusarium, especificamente H. insolens ou F. solani pisi, mais especificamente cepa H insolens DSM 1800. A sequência de aminoácidos da cutinase da cepa H. insolens DSM 1800 e a seqüêncía de DNA codificando-a são mostradas como SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:l da US 5.827.719. O sistema numérico usado aqui para a cutinase H. insolens é baseado no peptídeo maduro, como mostrado em dita SEQ ID NO:2. A sequência de aminoácidos da cutinase de F. solani pisi é mostrada como o peptídeo maduro na Fig. ID de WO 94/14964. O sistema numérico usado aqui para a cutinase F. solani pisi é aquele usado em WO 94/14964; ele inclui a pró-seqüência mostrada na Fig. ID; assim, a cutinase madura fica nas posições 16-214. A cutinase precursora pode ter uma seqüência de aminoácidos que é de pelo menos 50% (particularmente pelo menos 70% ou pelo menos 80%) homóloga à cutinase da cepa H. insolens DSM 1800. A cutinase precursora pode particularmente ser uma que possa ser alinhada com a cutinase da cepa H. insolens DSM 1800.

Nomenclatura para aminoácidos e alterações A especificação e reivindicações referem-se aos aminoácidos por seus códigos de uma letra. Um aminoácido particular de uma seqüência é identificado por seu código de uma-letra e sua posição, p. ex., Q1 indica Gin (glutamina na posição 1, isto é, no N-terminal. A nomenclatura usada aqui para definir substituições é basicamente como descrita em WO 92/05249. Assim, R51P indica substituição de R (Arg) na posição 51 dom P (Pró).

Homologia e alinhamento Para fins da presente invenção, o grau de homologia pode ser adequadamente determinado de acordo com o processo descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45, com os seguintes ajustes para comparação da sequência de polipeptídeo: penalidade de criação GAP de 3,0 e penalidade de extensão GAP de 0, l. A determinação pode ser realizada por meio de um programa de computador conhecido, tal como GAP provido no pacote de programa GCG (Programa Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Duas dadas sequências podem ser alinhadas de acordo com o processo descrito em Needleman (supra) usando-se os mesmos parâmetros. Isto pode ser realizado por meio do programa GAP (supra).

Estrutura tridimensional da cutinase A estrutura da cutinase de H. insolens foi resolvida de acordo com o princípio para os processos cristalográficos de raios-X, conforme apresentado, por exemplo, em X-Ray Structure Determination, Stout, G.K. e Jensen, L.H., John Wiley & Sons, Inc., NY, 1989. As coordenadas estruturais para a estrutura de cristal resolvida na resolução de 2,2 Â usando-se o processo de substituição isomorfo são dadas na Fig. 1 em formato PDB padrão (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, CT), A estrutura da cutinase de F. solani pisi é descrita em Martinez e outros (1992) Nature 356, 615-618. As estruturas 3D das cutinases de F. solani pisi e H. insolens são comparadas com um modelo de computador na Fig. 2.

Deve ser citado que as estruturas tridimensionais totais das cutinases fungicas são muito similares e foram mostradas por cristalografia de raios-X serem altamente homólogas. As similaridades entre as cutinases de F. solani pisi e H. insolens são claramente evidentes pelo modelo de computador da Fig. 2. Portanto, modificações do tipo indicado para uma cutinase fungíca também será funcional para outras cutinases fungicas.

Substituição próximo do N-terminal A variante da invenção tem uma ou mais substituições amino ácidas nas vizinhanças do N-terminal. A substituição está dentro de uma distância de 17 Â (p. ex., dentro de 12 Â) e/ou dentro de 20 posições (p. ex., dentro de 15 posições) do N-terminal. A distância do N-terminal é para ser calculada entre o átomo Ca dos aminoácidos e é calculada por um aminoácido de uma estrutura de cristal (isto é, visível na estrutura de raios-X).

Na cutinase da cepa de H. insolens DSM 1800, os dois aminoácidos N-terminal (Q1 e L2, isto é, Gin e Leu nas posições 1 e 2) não são visíveis na estrutura de raios-X, de modo que a distância é para ser calculada^o aminoácido G3. Os aminoácidos dentro de 17 Â incluem as posições 3-12, 18, 20-60, 62-64, 82, 85-86, 100-108, 110-111, 130-132, 174, 176-182, 184-185, 188 e 192. Aqueles dentro de 12 Á incluem as posições 3-8, 22-27, 30-47, 53-59, 102, 177 e 180-181.

Na cutinase de F. solani pisi, o aminoácido N-terminal G17 é visível na estrutura de raios-X. Os aminoácidos dentro de 17 Λ incluem as posições 17-26, 34-75, 77-7¾ 10 L 115. 117-119, 147, 191-197, 199-200 e 203. Aqueles dentro de 12 À incluem as posições (j 7-22, 38, 40, 45-58,(6¾ 65 e'70-72.) As variantes da invenção têm melhorada termoestabilidade em comparação com a enzima precursora. A termoestabilidade pode ser determinada pela temperatura de desnaturação por DSC (calorimetria de varredura diferencial), p. ex., como descrito em um exemplo, p. ex., em pH 8,5 com uma taxa de varredura de 90 k/h. As variantes podem tr uma temperatura de desnaturação que é de pelo menos 5 °C mais alta do que a da enzima precursora. O número total de substituições nas regiões acima é tipicamente de 1-10, p. ex., 1-5 substituições nas regiões acima. Além disso, a variante de cutinase da invenção pode opcionalmente incluir outras modificações da enzima precursora, tipicamente 10 ou menos, p. ex., 5 ou menos alterações (substituições, deleções ou inserções) fora das regiões acima. Assim, a sequência de aminoácidos total da variante é tipicamente 1-20, p. ex., 1-10 alterações em comparação com a cutinase precursora. Superfície acessível a solvente Um ou mais das substituições podem ser feitas em um resíduo aminoácido, isto é, um resíduo aminoácido tendo uma superfície acessível a solvente. Isto pode ser calculado pelo programa “dssp” (versão outubro de 1988) descrito em W. Kabsch and C. Sander, Biopolymers, 22 (1983) págs. 2577-2637.

Na cutinase da cepa H. insolens DSM 1800, os seguintes aminoácidos situam-se dentro de 17 A de G3 no N-terminal e têm uma superfície acessível a solvente maior do que 0: 3-12, 18, 26-33, 36-38, 40-45, 47-56, 59-60, 62-64, 82, 85-86, 104-105, 174, 176-179, 181-182, 192. Substituições específicas A substituição próxima do N-terminal pode especificamente ser uma que aumenta a carga elétrica, isto é, uma substituição de um urte anterior negativamente carregado com um aminoácido neutro ou positivamente carregado ou substituição de um aminoácido neutro com um aminoácido positivamente carregado. Assim, um resíduo aminoácido negativo em uma posição correspondendo à posição E6, E10, E30, E47, D63, E82 e/ou E179 na cutinase da cepa Humicola insolens DSM 1800 pode ser substituído por um aminoácido neutro ou positivo, p. ex., R, K, Y, H, Q ou N. Algumas substituições específicas são aquelas correspondendo a E6Q/N, E10Q/N, E47K/R ou E179Q/N. Além disso, um resíduo aminoácido neutro em uma posição correspondendo a N7, SI 1, N44 ou N52 da cutinase de H. insolens pode ser substituído por um aminoácido positivo (R, K ou H).

Outro exemplo de uma substituição próxima do N-terminal é uma substituição com um pro resíduo, p. ex., uma substituição correspondendo a A14P ou R51P da cutinase da cepa de Humicola insolens DSM 1800.

Variantes Específicas Os seguintes são alguns exemplos de variantes de cutinase de H. insolens. As variantes correspondentes podem ser produzidas com base em outras cutinases precursoras.

R51P

E6N/Q+1138I

A14P+E47K

E47K

E179N/Q

E6N/Q+E47K+R51P A14P+E47K+E179N/0 E47K+E179N/Q E47K+D63N E6N/Q+E1ON/Q+A14p+E47K+R51P+E179N/Q E6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q Q1P+L2V+S11 C+Nl 5T+F24Y+L46I+E47K Uso de variante de cutinase A variante de cutinase da invenção pode ser usada, p. ex., para a hidrólise enzimática de oligômeros cíclicos de poli(etileno tereftalato), tais como tri(etileno tereftalato) cíclico, abreviado como c3ET.

Em particular, esta pode ser usada para remover tais oligômeros cíclicos de poliéster contendo tecido ou fio pelo tratamento do tecido ou fio com a variante de cutinase, opcionalmente seguido por enxágüe do tecido ou fio com uma solução aquosa tendo um pH na faixa de cerca de pH 7 a cerca de pH 11. O tratamento do poliéster é convenientemente realizado acima da temperatura de transição vítrea de c3ET (cerca de 55 °C) e abaixo da temperatura de transição vítrea do poliéster (cerca de 70 °C).

Assim, o tratamento pode adequadamente ser realizado a 50-80 °C, p. ex, a 60-75 °C. O processo pode ser realizado em analogia com WO 97/27237. A variante de cutinase pode ser usada para tratar têxtil contendo poliéster, p. ex., PET (polímero de etilenoglicol e ácido tereftálico), P3GT (polímero de 1,3-propanodiol e ácido tereftálico) ou uma mistura de poliéster/algodão. O tratamento pode fornecer benefícios ao têxtil de poliéster, tal como melhorado uso e conforto, aumenta permeabilidade à água, reduzido comportamento antiestático, melhorado manuseio e maciez, mudadas características de redeposição e/ou clarificação de cor. A variante de cutinase pode ser usada para melhorar o acabamento funcional de um fio ou tecido contendo PET por um tratamento com uma variante de cutinase, seguido por um tratamento com um agente de acabamento, tal como um amaciante, uma resina anti-prega, um agente antiestático, um agente anti-sujeira ou agentes para dar efeitos livres de rugas, dobra permanente e resistência ao fogo. O tratamento com a variante de cutinase pode aumentar o número de grupos funcionais na superfície e isto pode ser usado para ligar o acabamento funcional. Exemplos de agentes de acabamento são descritos em “SENSHOKU SIAGEKAKO BENRAN”, publicado em 15-10-1998 por Nihon Seni Sentaa KK. A variante de cutinase da invenção é também útil em detergentes, onde ela pode ser incorporada para melhorar a remoção de sujeira gordurenta, como descrito na WO 94/03578 e WO 94/14964. A adição da variante de cutinase a detergente de lavagem de roupas pode reduzir o mal odor da roupa que é acumulada durante diversos ciclos de lavagem/uso. A variante de cutinase pode também ser usada para degradação e reciclagem de poliéster, tal como policaprolactona (PCL), poli-etilenoglicol-tereftalato (PET), ácido poliático, polibutilenossuccinato e polí(hidroxibutírico ácido)-co-(hidroxivalérico ácido), p. ex., película e garrafas, p. ex., como descrito na JP-A 5-344897. A variante de cutinase pode também ser usada para outras aplicações conhecidas de lipases e cutinases, por exemplo, na indústria de cozimento (p. ex., como descrito em WO 94/04035 e EP 585988), na i indústria de produção de papel (p. ex., para remoção de piche, vide EP 344700) e nas indústrias de couro, lã e afins (p. ex., para desengorduramento de couro de animais, pele ou lã de carneiro) e para outras aplicações envolvendo desengorduramento. Pode ser usada em forma imobilizada na indústria de gordura e óleo, como um catalisador de síntese orgânica (p. ex., ► reações de esterifícação, transesterificação ou hidrólise de éster). fingimento de poliéster A invenção fornece um processo para tingir tecido ou fio de poliéster. Neste processo, o tecido ou fio é primeiro tratado com uma cutinase, p. ex., 12-48 horas a 50-70 °C ou 65-70 °C, pH 7-10, seguido por ' tingimento com corante, p. ex., um corante reativo, um corante disperso ou um corante catiônica. O corante reativo pode ser um que reaja com grupos OH ou COOH, p. ex., tendo a estrutura Cromóforo-NHPh-S02CH2CH20S03Na. O tingimento pode ser conduzido a 40-80 °C, p. ex., por 20-60 minutos. 1 A cutinase pode ser uma cutinase termoestável, tendo uma temperatura de desnaturação térmica, Ta, em pH 8,5 que é pelo menos 5o mais elevada do que a cutinase precursora, p. ex., 7-10 mais elevada, p. ex., um valor de 65 °C ou mais elevado. A medição pode ser feita por DSC, como descrito em um Exemplo desta especificação.

Tensoativo No tratamento de tecido ou fio, um agente umectante convencional e/ou um agente dispersante podem ser usados para melhorar o contato com a enzima. O agente umectante pode ser um tensoativo nâo-iônico, p. ex., um álcool graxo etoxilado. Um agente umectante muito útil é um éster de ácido graxo etoxilado e propoxilado, tal como Berol 087 (produto da Akzo Nobel, Suécia). O agente dispersante pode adequadamente ser selecionado de tensoativos não-iônico, aniômco, catiônico, anfolítico ou zuiteriônico. Mais especi ficamente, o agente dispersante pode ser selecionado de carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulosc, alquil aril sulfonatos, sulfatos de álcool graxo de cadeia longa (alquil sulfatos primários e secundários), olefinas sulfonadas, monoglicerídeos sulfatados, éteres sulfatados, sulfossuccinatos, metil éteres sulfonados, sulfonatos de alcano, ésteres de fosfato, isotionatos de alquila, acil-sarcosídeos, alquiltauridas, fluorotensoativos, álcool graxo e condensados de alquilfenol, condensados de ácido graxo, condensados de óxido de etileno com uma amina, condensados de óxido de etileno com uma amida, ésteres de sacarose, ésteres de sorbitano, alquiloamidas, óxidos de aminas graxas, monoaminas etoxiladas, diaminas etoxiladas, etoxiíato de álcool e suas misturas. Um agente dispersante muito útil é um etoxiíato de álcool, tal como Berol 08 (produto da Akzo Nobel, Suécia).

Processos nara preparar variantes de cutinase A variante de cutinase da invenção pode ser preparada por processos conhecidos na arte, p. ex., como descrito em WO 94/14963 ou WO 94/14964 (Unilever). O seguinte descreve processos para a clonagem de seqüências de DNA codificando cutinase, seguido por processos para gerar mutações em sítios específicos dentro da seqüência codificando-cutinase. Clonagem de uma sequência de DNA codificando uma cutinase A seqüência de DNA codificando uma cutinase precursora pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo produzindo a cutinase em questão, empregando-se vários processos conhecidos na arte. Primeiro, um DNA genômico e/ou uma biblioteca de cDNA deve ser construída usando-se DNA cromossomal ou RNA mensageiro do organismo que produz a cutinase a ser estudada. Em seguida, se a seqüência de aminoácidos da cutinase for conhecida, sondas de oligonucleotídeos rotuladas podem ser sintetizadas e usadas para identificar clones codificando cutinase de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Altemativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada, contendo as sequências homólogas para outro gene de cutinase conhecido, podería ser usada como uma sonda para identificar clones codificando cutinase, empregando-se condições de hibridização e lavagem de mais baixa severidade.

Ainda outro processo para identificar os clones codificando cutinase envolvería inserir fragmentos de DNA genômico dentro de um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformar bactérias negativas de cutinase com a biblioteca de DNA genômico resultante e, em seguida, revestindo-se as bactérias transformadas sobre ágar contendo um substrato para cutinase (i.e. maltose), desse modo permitindo que os clones expressando a cutinase sejam identificados.

Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por processos padrão estabelecidos, p. ex., o processo de fosforoamidita descrito por S.L. Beaucage e M.H. Caruthers (1981), Tetrahedron Letters 22, pág. 1859-1869, ou o processo descrito por Matthes e outros (1984), EMBO J. 3, pág. 801-805. No processo de fosforoamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, p. ex., em um sintetizador de DNA automático, purificados, recozidos, ligados e clonados em vetores apropriados.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem genômica e sintética mista, origem sintética e de cDNA mista ou origem genômica e cDNA mista, preparada ligando-se fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (como apropriado, os fragmentos correspondendo a várias partes da inteira seqüência de DNA), de acordo com técnicas padrão. A seqüência de DNA pode também ser preparada por reação de cadeia de polimerase (PCR) usando-se imprimadores específicos, por exemplo, como descrito em US 4.683.204 ou R.K. Saiki e outros (1988), Science 239, 1988, págs. 487-491.

Mutagênese dirigida ao sítio Uma vez uma seqüência de DNA codificando uma cutinase tenha sido isolada e sítios desejáveis para mutação identificados, mutações podem ser introduzidas usando-se oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm seqüências de nucleotídeos flanqueando os sítios de mutação desejados. Em um processo específico, um intervalo de DNA de filamento único, a seqüência codificando-cutinase, é criado em um vetor contendo o gene de cutinase. Em seguida o nucleotídeo sintético, contendo a mutação desejada, é recozido em um porção homóloga do DNA de filamento único. O intervalo restante é então enchido com polimerase de DNA I (fragmento de Klenow) e o constructo é ligado usando-se ligase T4. Um exemplo especifico deste processo é descrito em Morinaga e outros (1984), Biotechnology 2, págs. 646-639. A US 4.760.025 descreve a introdução de oligonucleotídeos codificando múltiplas mutações pela realização de alterações menores do cassete. Entretanto, uma variedade mesmo maior de mutações pode ser introduzida a qualquer tempo pelo processo de Morinaga, porque uma multidão de oligonucleotídeos, de vários comprimentos, pode ser introduzida.

Outro processo para introduzir mutações dentro de seqüências de DNA codificando cutinase é descrito em Nelson e Long (1989), Analytical Biochemistry 180, p. 147-151. Ele envolve a geração de 3-etapas de um fragmento PCR contendo a desejada mutação introduzida utilizando-se um filamento de DNA quimicamente sintetizado como um dos imprimadores das reações PCR. Do fragmento PCR-gerado, um fragmento de DNA contendo a mutação pode ser isolado por divagem com endonucleases de restrição e reinserido dentro de um plasmídeo de expressão.

Expressão de variantes de cutinase De acordo com a invenção, uma sequência de DNA codificando a variante produzida por processos descritos acima ou por quaisquer processos alternativos conhecidos na arte, pode ser expressa, em forma de enzima, usando-se um vetor de expressão que tipicamente inclua seqüências de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de início de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

Vetor de expressão O vetor de expressão recombinante contendo a sequência de DNA codificando uma variante de cutinase da invenção pode ser qualquer vetor que possa, convenientemente, ser submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor com ffeqüência dependerá da célula hospedeira dentro da qual é para ser introduzido. O vetor pode ser um que, quando introduzido dentro de uma célula hospedeira, seja integrado dentro do genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) dentro do(s) qual(ais) foi integrado. Exemplos de vetores de expressão adequados incluem pMT83 8.

Promotor No vetor, a seqüência de DNA deve ser operavelmente conectada a uma seqüência de promotor adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que apresente atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivada de genes codificando proteínas homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição da seqüência de DNA codificando uma variante de cutinase da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do opéron lac de E.coli, os promotores dagA do gene de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene da α-amilase (amyL) do Bacillus licheniformis, os promotores do gene de amilase maltogênica (amyM) do Bacillus síearothermophilus os promotores da α-amilase (amyQ) do Bacillus amyloliquefaciens, os promotores dos genes xylA e xylB do Bacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fungíco, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando A amilase TAKA de A. oryzae, o promotor TPI (triose fosfato isomerase) de S. cerevisiae (Alber e outros (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, págs. 419-434, aspartica proteinase de Rhizomucor miehei, α-amilase neutra de A. niger, a-amilase estável em ácido de A. niger, glucoamílase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans.

Vetor de expressão O vetor de expressão da invenção pode também compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariotos, seqüências de poliadenilação operavelmente conectadas a seqüência de DNA codificando a variante de α-amilase da invenção. Seqüências de trminação e poliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes do promotor. O vetor pode ainda compreender uma seqüência de DNA possibilitando o vetor replicar-se na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACY177, pUBl 10, pE194, pAMBl e pIJ702. O vetor pode também compreender um marcador selecionável, p. ex., um gene cujo produto complementa um defeito da célula hospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confira resistência a antibiótico, tal como ampicilina, canamicina, cloramfenicol ou resistência a tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB, niaD e sC, um marcador dando origem a resistência a higromicina, ou a seleção pode ser realizada por cotransformação, p. ex., como descrito em WO 91/17243.

Os procedimentos usados para ligar o constructo de DNA da invenção codificando uma variante de cutinase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inseri-los dentro de vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos das pessoas hábeis na arte (cf., por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor, 1989). Células Hospedeiras A célula da invenção, compreendendo um constructo de DNA ou um vetor de expressão da invenção como definidos acima, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de cutinase da invenção. A célula pode ser transformada com o constructo de DNA da invenção codificando a variante, convenientemente integrando o constructo de DNA (em uma ou mais cópias) dentro do cromossomo hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem quando a seqüência de DNA for mais provável ser estavelmente mantida na célula. A integração dos constructos de DNA dentro do cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com processos convencionais, p. ex., por recombinação homóloga ou heteróloga.

Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão como descrito acima com relação aos diferente tipos de células hospedeiras. A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior, tal como um mamífero ou um inseto, porém é preferivelmente uma célula microbiana, p. ex., uma célula bacteriana ou fungica (incluindo levedura).

Exemplos de bactérias adequadas são bactérias Gram positivas, tais como Bacillus subtilis, Bacülus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefadens, Bacillus coagulans, BAcillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Síreptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas, tais como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser realizada por transformação de protoplasto ou utilizando-se células competentes em uma maneira por si conhecida. O organismo de levedura pode favoravelmente ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, p. ex., Saccharomyces cerevisiae. A célula hospedeira pode também ser um fungo filamentoso, p. ex., uma cepa pertencente a uma espécie de Aspergillus, muitíssimo preferivelmente Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou uma cepa de Fusarium, tal como uma cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (no estado perfeito chamada Gribberella zeae, anteriormente Sphaeria zeae, sinônimo de Gibberrella roseum e Gibberella roseum f. sp. cerealis), ou Fusarium sulphureum (no estado perfeito chamada Gibberella puricaris, sinônimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bacíridioides, Fusarium sambucium, Fusarium roseum e Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinônimo de Fusarium crokkwellnse), ou Fusarium venenatum.

Em uma versão preferida da invenção, a célula hospedeira é uma cepa deficiente de protease ou sem protease.

Esta pode, por exemplo, ser a cepa deficiente de protease Aspergillus oryzae JaL 125, tendo o gene de protease alcalina chamado “alp” delatado. Esta cepa é descrita em WO 97/35956 (Novo Nordisk).

As células fungicas filamentosas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplasto e transformação dos protoplastos seguido por regeneração da parede celular de urna maneira por si conhecida. O uso de Aspergillus como um microorganismo hospedeiro é descrito na EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), cujos conteúdos são por este meio incorporados por referência.

Produção de variante de cutinase nor cultivo de transformante A invenção refere-se, entre outros, a um processo de produzir uma variante de cutinase da invenção, processo este compreendendo cultivar uma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção da variante e recuperação da variante das células e/ou meio de cultura. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula hospedeira em questão e obter expressão da variante de cutinase da invenção. Meios adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (p. ex., como descrito nos catálogos da American Type Culture Collection). A variante de cutinase secretada pelas células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separação das células do meio por centrifugação ou filtragem e precipitando-se componentes proteicos do meio por intermédio de um sal tal como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos tais como cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade ou similares.

Exnressão de variante em plantas A presente invenção também refere-se a uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta que tenha sido transformada com uma sequência de DNA codificando a variante da invenção, de modo a expressar e produzir esta enzima em quantidades recuperáveis. A enzima pode ser recuperada da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo a enzima recombinante pode ser usada como tal. A planta transgênica pode ser dicotiledônea ou monocotiledônea, abreviadamente uma dicot ou monocot. Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), grama de forragem tal como festuca, lolium, grama moderada, tal como Agrostis, e cereais, p. ex., trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterrama, ervilha, feijão e soja, e crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza oleaginosa e o organismo modelo estreitamente afim Arabidopsis thaliana.

Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos. No presente contexto, também tecidos de plantas específicos, tais como cloroplasto, apoplasto, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são considerados serem uma parte de planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer seja a origem do tecido, é considerada ser uma parte de planta.

Também incluídos dentro do escopo da invenção são a progênie de tais plantas, partes de planta e células de planta. A planta ou célula de planta transgênica expressando a variante da invenção pode ser construída de acordo com processos conhecidos na arte. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando-se um ou mais constructos de expressão codificando a enzima da invenção dentro do genoma hospedeiro da planta e propagando-se a resultante parte modificada ou célula de planta dentro de uma planta transgênica ou célula de planta.

Convenientemente, o constructo de expressão é um constructo de DNA que compreende um gene codificando a enzima da invenção em associação operável com seqüências reguladoras apropriadas, requeridas para expressão do gene na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, o constructo de expressão pode compreender um marcador selecionável, útil para identificar células hospedeiras dentro das quais o constructo de expressão tenha sido integrado, e as seqüências de DNA necessárias para introdução do constructo dentro da planta em questão (o último depende do processo de introdução do DNA a ser usado). A escolha das seqüências reguladoras, tais como seqüências de promotor e terminador e, opcionalmente, seqüências de sinal ou seqüências de transito, é determinada, por ex., com base em quando, onde e como a enzima é desejada ser expressa. Por exemplo, a expressão do gene codificando a enzima da invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser desenvolvente, específica de estágio ou tecido e o produto genético pode ser alvejado para um tecido específico ou parte de planta, tal como sementes ou folhas. As seqüências reguladoras são, p. ex., descritas por Tague e outros, Plant, Phys., 86, 506, 1988.

Para expressão constitutiva o promotor 35S-CaMV pode ser usado (Franck e outros, 1980. Cell 21: 285-294). Promotores específicos de órgão podem, p. ex., ser um promotor de tecidos de armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata e frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de bacia metabólica, tais como meristemas (Ito e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente, tal como o promotor da glutelina, prolamina, globulina ou albumina do arroz (Wu e outros, Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8, págs. 885-889 (1998)), um promotor Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido da Vicia faba descrita por Conrad U. e outros, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6, págs. 708-711 (1998), um promotor de uma proteína corporal de óleo de semente (Chen e outros, Plant and cell physiology vol. 39, No. 9, págs. 935-941 (1998), o promotor napA de proteína de armazenagem de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na arte, p. ex., como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha, tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka e outros, Plant Physiology Vol. 102, No. 3, págs. 991-1000 (1993), o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra, A. e Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1, págs. 85-93 (1994), ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya e outros, Molecular e General Genetics Vol. 248, No. 6, págs. 668-674 (1995) ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu e outros, Plant Molecular Biology, Vol. 22, No. 4, págs. 573-588 (1993).

Um elemento intensificador de promotor pode ser usado para obter-se expressão mais elevada da enzima da planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotor pode ser um intron que seja deslocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificando a enzima. Por exemplo, Xufe outros, op cit descrevem o uso do primeiro intron do gene da actina do arroz 1 para aumentar a expressão. O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na arte. O constructo de DNA é incorporado dentro do genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, micro injeção, bombardeio de partículas, transformação biolística e eletroporação (Gasser e outros, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto e outros, Nature, 338d, 274, 1989).

Presentemente, a transferência do gene mediado por Agrobacterium tumefaciens é o processo de escolha para gerar dicots transgênicas (para revisão Hooykas & Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38); entretanto, ele pode também ser usado para transformar monocots, embora outros processos de transformação sejam geralmente preferidos para estas plantas. Presentemente, o processo de escolha para gerar monocots transgênicas é bombardeio de partículas (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas, revestidas com o DNA transformante) dos calli embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr. Opin. Biotechnolo. 5: 158-162; Vasil e outros, 1992. Bio/Technology 10: 667-674). Um processo alternativo para transformação de monocots é baseado na transformação do protoplasto como descrito por Omirulleh S e outros, Plant Molecular Biology, Vol. 21, No. 3, págs. 415-428 (1993).

Em seguida à transformação, os transformantes tendo incorporado o constructo de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras, de acordo com processos bem conhecidos na arte. MATERIAIS E PROCESSOS Plasmídeos PJSOQ26 Este é um plasmídeo de expressão de S. cerevisiae, descrito em WO 97/07205 e em J.S. Okkels (1996) “A URA-3-promoter deletion em um pYES vector increases the expression levei da fungai lipase in Saccharomyces cerevisiae". Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences, vol. 782 of the Annals of the New York Academy of Sciences). pFuku83 Este é uma levedura e vetor de lançadeira de E. coli para expressão da cutinase de H. insolens sob o controle de um promotor TPI, construído de pJSO026.

Substrato BETEB O bis(2-hidroxietil)éster dibenzoato do ácido tereftálico é aqui abreviado como BETEB (benzoil-etileno-tereftálico-eteleno-benzoado). Ele foi preparado do bis(2-hidroxietil) éster do ácido tereftálico e ácido benzóico. Atividade da lipase (LUt Um substrato para lipase é preparado emulsificando-se tributirina (tributirato de glicerin), usando-se goma arábica como emulsifícante. A hidrólise da tributirina a 30 °C em pH 7 é seguida em um experimento de titulação de pH-estat. Uma unidade de atividade de lipase (1 LU) iguala a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μπιοί de ácido butírico/min nas condições padrão.

Calorimetria de varredura diferencial Soluções amostra e de referência são cuidadosamente desgaseificadas imediatamente antes à carga das amostras dentro do calorímetro (referência: tampão sem enzima). As soluções amostra e de referência (aprox. 0,5 ml) são termicamente preequilibradas por 20 minutos a 5 °C. A varredura DSC é realizada de 5 C a 95 C em uma taxa de varredura de aproximadamente 90 k/h. As temperaturas de desnaturação são determinadas em uma precisão de aproximadamente í 1 C. Um VP-DSC da Microcal Inc. é adequado para os experimentos.

Processos Condições PCR

Etapa 1: 94 °C, 120 seg Etapa 2: 94 °C, 60 seg Etapa 3: 50 °C, 60 seg Etapa 4: 72 °C, 150 seg Vai para a etapa 2, 35 ciclos Etapa 5: 72 °C, 480 seg Etapa 6: 4 °C, para sempre EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de variantes de cutinase Uma seqüência de DNA codificando cutinase de H. insolens foi obtida como descrito na US 5.827.719 (Novo Nordisk) e foi constatada ter a seqüência de DNA como mostrada na SEQ ID NO: 1 ali.

Variantes foram preparadas por mutagênese aleatória localizada e seleção de clones positivos por incubação a 60 °C por 1 dia em placas BETEB. As placas BETEB continham 200 ml/1 de tampão de glicina 500 mM (pH 8,5), 1,25 g/1 de BETEB (dissolvido em etanol quente) e 20 g/1 de ágar.

Três variantes positivas foram isoladas e sua seqüência de aminoácidos foi determinada. Elas foram constatadas terem as seguintes modificações, em comparação com a cutinase de H. insolens precursora: A14P + E47K

E47K

E179Q

Exemplo 2: Mutação direcionada ao sítio Uma variante da cutinase de H. insolens, tendo as substituições E6Q+ E47K+ R51P foi preparada como segue: Um par de imprimadores PCR foram projetados de modo a introduzir substituições amino ácidas, fazendo uso dos sítios de enzima de restrição existentes nas proximidades, como segue (um asterisco indica uma mutação introduzida): Imprimador superior: E6Q F cgg cag ctg gga gcc ate c*ag aac Pvu II

Imprimador inferior: E47K,R51P cgc cct gga tcc aga tgt tcg* gga tgt ggg act t*aa ggc BamHI A PCR foi realizada usando-se estes imprimadores e pFukuNL83 como um modelo sob a condição PCR descrita acima. O fragmento PCR obtido foi purificado por Clontech Spincolumn e digerido com Pvu II e BamU I. O fragmento resultante foi gel-purificado e ligado a pFuKuNL83, que tinha sido digerido com os mesmos sítios de enzima de restrição.

Exemplo 3: Termoestabilidae das variantes de cutinase Variantes A termoestabilidae foi testada como descrito abaixo para a cutinase de H. insolens e as seguintes suas variantes: A14P+ E47K

E47K

E179Q E6Q+ E47K+ R51F) V 7 A14P+ E47K+ ET79Q E6Q+ A14P+ E47K+ R51p+ E179q E6Q+ E10Q+ A14P+ E47K+ R51P+ E179Q Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) A termoestabilidade das variantes de cutinase foi investigada por meio de DSC em pH 4,5 (tampão de acetato 50 mM) e pH 8,5 (tampão de glicil-glicina 50 mM). A temperatura de desnaturação térmica, Td, foi tirada como o topo do pico de desnaturação (pico endotérmico maior) em termogramas (Cp vs. T) obtido após aquecimento das soluções de enzima em uma taxa de aquecimento programada constante. A cutinase precursora foi constatada ter td de 63 °C em pH 8,5. Seis das variantes acima foram constatadas terem Td de 70-73 °C, isto é, uma melhora de 7-10 °C. A cutinase precursora foi constatada ter uma Td de 61 °C em pH 4,5. Cinco das,variantes acima foram constatadas terem Td de 64-66 °C, isto é, uma melhoria de 3-5 °C.

Hidrólise de BETEB A termoestabilidade da cutinase de H. insolens e de duas das variantes acima foi medida por hidrólise de BETEB em temperatura elevada. Para cada cutinase, a seguinte mistura foi incubada por 17 horas em várias temperaturas na faixa de 55-70 °C. 0,1 ml de tampão glicil-glicina 0,5 M (pH 8,5) 0,1 ml de 0,5% BETEB dissolvido em etanol 0,1 ml de solução de enzima (aproximadamente 25 LU/ml) 0,7 ml de água Milli Q O grau de hidrólise foi medido após a incubação. Os resultados são mostrados na tabela abaixo.

Estes resultados claramente mostram que as variantes têm melhorada termoestabilidade em comparação com a cutinase precursora. Hidrólise de BETEB A termoestabilidade da cutinase de H. insolens e de três das variantes acima foi medida por hidrólise de BETEB a 60 °C por 2 horas. A hidrólise foi realizada nas condições acima, exceto que a temperatura foi fixada a 60 °C e a dosagem de cutinase foi variada. Os resultados abaixo são mostrados na tabela abaixo. _______________________________________________ Os resultados mostram uma hidrólise muito mais rápida a 60 °C com as variantes do que com a cutinase precursora.

Exemplo 5: Hidrólise de c3ET A cutinase de H. insolens e cinco das variantes acima foram testadas na hidrólise de c3ET em temperatura elevada. Para cada cutinase, a seguinte mistura foi incubada por 2 horas em várias temperaturas. 0,115 mg c3ET (0,1 ml de c3ET 2 mM dissolvido em HF1P foram colocados no vaso de reação. Solvente foi removido sob vácuo, então secado a 70 °C durante a noite. 0,1 ml de tampão de glicil-glicina 0,5 M (pH 8,5) 0,1 ml de solução de enzima (aproximadamente 600 LU/ml) 0,8 ml de água Milli Q

Após a incubação, 2 ml de l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) foram adicionados a cada mistura de reação, em seguida a proporção de hidrólise foi medida por HPLC. Os resultados mostrados na Fig 3 claramente indicam que as variantes têm melhorada termoestabilidade em comparação com a cutinase precursora.

Exemplo 5: Hidrólise de c3ET no fío A termoestabilidade da cutinase de H. insolens e de cinco das variantes acima foi testada usando-se fio de poliéster contendo c3ET como subproduto. A seguinte mistura de substrato foi preincubada a 60 ou 65 °C: 0,1 g fio de poliéster 0,2 ml tampão de glicil-glicina 0,5M (pH 8,5) 1,7 ml Água Milli Q

Após a preincubação, 0,1 ml de solução de enzima (aproximadamente 1000 LU/ml) foi adicionado a cada vaso de reação e incubado por 17 horas. Em seguida 2 ml de HFIP foram adicionados e deixados por 30 minutos para extrair e hidrolisar c3ET sedimentando-se sobre a superfície do fío de poliéster; em seguida a proporção de hidrólise foi medida. Os resultados são mostrados na Fig. 4. Vê-se que as variantes são mais eficazes do que a cutinase precursora para hidrolisar c3ET no fío de poliéster. Uma variante fornece proporção de hidrólise mais elevada a 65 °C do que a 60 °C.

Exemplo 6: Tratamento de fio com variante de cutinase Os cursos de tempo da hidrólise C3ET no fio de poliéster em diferente temperatura ou dosagem foram examinados. O curso de tempo em diferentes temperaturas é mostrado na Fig. 5. É visto que a temperatura ótima é 65 °C. A 70 °C há cerca de metade da atividade abandonada. O curso de tempo com dosagem de enzima aumentada é mostrado na Fig. 6. As curvas na dosagem 275 e 550 LU/ml são vistas serem iguais, indicando que a proporção de hidrólise alcançou o platô entre a dosagem de 100 a 275 LU/ml. Presumivelmente 200LU/ml é bastante.

Exemplo 7: Tingimento de noliéster com corante reativo Os seguintes panos de poliéster foram tratados: pano tecido; ca. 2 x 2 cm, 34 mg pano entrelaçado: ca. 1,5 x 1,5 cm, 50 mg Cada pano foi embebido em 0,9 ml de tampão de GlyGly (glicil-glicina) 50 mM (pH 8,5) e 0,1 ml de solução de uma variante da cutinase de H. insolens (1100 LU/ml) e incubado a 65 ou 70 °C. Após um dia, outro 0,1 ml de solução de enzima foi adicionado, a incubação foi continuada por mais dois dias, os panos foram então retirados e enxaguados em água. Um experimento comparativo foi feito com a cutinase precursora e um peça foi tratado da mesma maneira sem enzima.

Os panos foram agitados em uma mistura de 9g 120 g Na2S04 e 60 g Na2C03 em 3 litros de água deionizada a 60 °C por 30 min e em seguida enxaguados com água quente corrente. O corante reativo foi Celmazol Brilliant Blue B (produto da Mitsui Chemical Co., Japão), que tem a estrutura Cromóforo-NHPh-SCbClUCFEOSChNa.

Em todos os quatro experimentos (tecido e entrelaçado, 65 e 70 °C) os panos foram uniformemente tingidos.

Exemplo 8: Solubilizacão de fragmentos de poliéster de têxtil entrelaçado Uma amostra de 1 x 1 de têxtil de poliéster entrelaçado (PET, polímero de etilenoglicol e ácido tereftálico) foi incubada por 1 hora em 1 ml de tampão em pH 10, 60 °C com 0,01 mg de uma variante de cutinase de H. insolens. A mistura de reação foi separada e a liberação do ácido tereftálico foi verificada medindo-se OD a 250 nm (expresso como OD25o/mg PET). Experimentos comparativos foram feitos sem enzima ou com a cutinase precursora. Resultados:______________________________________________ Os resultados mostram que a variante é eficaz em solubilizar o poliéster.

Em outro experimento, a variante de cutinase foi testada por 2 horas a 65 °C com e sem a adição de um tensoativo não-iônico (etoxilato de álcool, nome do produto Softanol 50), empregando-se várias quantidades da variante de 0,5 a 200 LU/ml. Os resultados mostraram mais solubilização na presença de tensoativo não-iônico.

Exemplo 9: Hidrólise de policaprolactona e película de poliéster Cerca de 0,1 g de policaprolactona ou película de poliéster foram colocados em tubos. Eles foram embebidos em 5 ml de tampão GlyGly 50 mM (pH 8,5) com ou seu uma variante de cutinase de H. insolens (450 LU). Eles foram incubados a 70 °C por 5 horas. Após a reação observamos uma fina camada de hidrolisato sobre a superfície dos tubos com enzima, tanto com policaprolactona como com película de poliéster. Por outro lado, nenhuma mudança foi observada nos controles sem enzima. No caso de policaprolactona houve 10% de perda de peso. Não vimos mudança de peso do poliéster.

Exemplo 10: hidrólise de cPET O desempenho de uma variante de cutinase foi comprado com o da enzima precursora (cutinase de H. insolens). Os testes foram feitos como segue: Um pedaço de pano manchado com oligômero de pano-PET (preto) (aproximadamente 4 cm x 13 cm) é submetido ao tratamento enzimático em agitação relativamente baixa em um aparelho chamado mini-tergitômetro. O pano-PET é fixado sobre um suporte cilíndrico e perfurado (raio ca. 2 cm, altura ca. 6 cm), que gira em tomo de seu eixo geométrico e com o lado manchado de olígômero do pano PET faceando o exterior do cilindro. O pano é imerso em um béquer de vidro de 150 ml, contendo 100 ml da solução de tratamento em uma determinada temperatura (aqui 65 °C). Após um determinado tempo de tratamento (aqui 90 minutos) o pedaço de PET é removido do banho e enxaguado em água deionizada e secado ao ar.

Após condicionamento os pedaços de pano são visualmente classificados (com respeito à remoção da mancha de oligômero) no lado tendo a mancha de oligômero. A classificação sendo como segue: -2: Amostra significativamente pior do que a peça bruta (nenhuma enzima) -1: Amostra ligeiramente pior do que a peça bruta (nenhuma enzima) 0: Amostra não pode ser distinguida da peça bruta 1: Amostra ligeiramente melhorada vs peça bruta 2: Amostra significativamente melhorada em relação a peça bruta Além disso, os pedaços de pano são lidos espectofotometricamente (aparelho: Hunterlab Reflectometer) para quantificar a intensidade de cor (valor-K/S a 600 nm). A tabela abaixo resume as condições de teste para uma prova comparando o desempenho das enzimas sob condições similares: Temperatura: 65 °C

Tampão/pH: tampão glicina 50 mM, pH 10,3 Tempo de tratamento (min) 90 Dosagem da Enzima (LU/g) 30.000 Os resultados da prova são resumidos abaixo ______ Por este conjunto de experimentos parece, assim, que a enzima precursora não fornece ou fornece somente efeito muito limitado nas dadas condições de teste (provavelmente porque a temperatura é demasiado alta para a enzima reter atividade), enquanto a variante de cutinase provê uma remoção substancial da mancha de oligômero do pano-PET.

Exemplo 11: hidrólise de cPET O perfil de pH e temperatura de uma variante de cutinase de H insolens foi testado em um experimento de fingimento disperso modelo. As provas foram realizadas como segue: Um pedaço de pano de pano-PET (preto) manchado de oligômero é submetido às condições de uma seqüência de fingimento disperso típico em um Wemer Mathis Labomat. Em resumo do processo, o pedaço de pano é adicionado a uma solução de tampão, aquecido a 130 °C, esfriado à temperatura de tratamento. Enzima ou tampão é adicionado e então mantido na temperatura desejada por 30 minutos. A solução é esfriada à temperatura ambiente e a turbidez do licor de lavagem é medida. A redução da turbidez é uma medida direta da atividade da cutinase, correspondendo aos oligômeros cPET hidrolisados.

Descrição detalhada do experimento: A um pedaço de pano PET preto (apr. 4 cm x 13 cm) são adicionados 140 ml de tampão Britton-Robinson 100 mM, contendo 0,2 g/1 de Lutensol ATI 1 (BASF) e carregado no Labomat (32 rotações por minuto). O Labomat é aquecido a 130 °C em um gradiente de 9 °C/minuto e mantido por 10 minutos.

Os béqueres são esfriados à temperatura de execução (de acordo com a tabela abaixo) em um gradiente de 9 °C/minuto e mantidos por 1 minuto. 10 ml de solução de enzima (100 LU/ml da variante) ou solução de tampão (0 LU/ml) empH apropriado são injetados nos béqueres. O Labomat é reaquecido à temperatura em um gradiente de 2 °C/min, e mantido por 30 minutos.

Os pedaços de pano são removidos e o licor de lavagem é esfriado à temperatura ambiente. A turbidez dos licores de lavagem é medida.

Avaliação: A turbidez é medida em Hach 18900 Ratio Turbidimeter (padronizado com Padrões de Turbidez de 1,8, 18 e 180 NTU). O desempenho da enzima é calculado em relação a uma peça bruta como a diferença entre a turbidez do licor bruto (sem enzima) e a turbidez do licor tratado com enzima. O desempenho relativo (redução de turbidez) da variante de cutinase é calculado e os resultados são mostrados na seguinte tabela. Quando um número negativo é obtido, então o resultado é dado como “negativo”. Um número negativo é suposto como sendo um artefato, causado pela variação do arranjo.

Os resultados mostram que a variante de cutinase é ativa em uma larga faixa de pH e temperatura, com remoção ótima de oligômero no atual arranjo em tomo de pH 9 e 85 °C.

Exemplo 12: hidrólise de cPET O efeito do tempo de tratamento foi investigado para uma variante de cutinase de H. insolens em um experimento de tingimento disperso modelo. As provas foram realizadas como segue: Um pedaço de pano manchado de oligômero, de pano-PET (preto), é submetido às condições de uma seqüência de tingimento dispersa típica em um Wemer Mathis Labomat. Em resumo do processo, o pedaço de pano é adicionado a uma solução de tampão, aquecido a 130 °C, esfriado à temperatura de tratamento. A enzima ou tampão (Britton-Robinson 100 mM, pH 9) é adicionado e então mantido a 75 °C por 0-40 minutos. A solução é esfriada à temperatura ambiente e a turbidez do licor de lavagem é medida. A redução de turbidez é uma medida direta da atividade de cutinase, correspondendo aos oligômeros cPET hidrolisados.

Descrição detalhada do exnerimento Um pedaço de pano PET preto (ap. 4 cm x 13 cm) é adicionado a 140 ml de tampão Britton-Robinson 100 mM contendo 0,2 g/1 Lutensol ATI 1 (BASF) e carregado no Labomat (32 rotações por minuto). O Labomat é aquecido a 130 °C em um gradiente de 9 °C/min e a temperatura é mantida por 10 minutos.

Os béqueres são esfriados a 75 °C em um gradiente de 9 °C/min e mantido por 1 minuto. 10 ml de solução de enzima (100 LU/ml de variante) ou tampão Britton-Robinson 100 mM, pH 9,0 (0 LU/ml), são injetados dentro dos béqueres. O Labomat é reaquecido a 75 °C em um gradiente de 2 °C/min, e mantido durante o número apropriado de minutos (0-40 minutos, vide tabela abaixo).

Os pedaços de pano são removidos e o licor de lavagem é esfriado à temperatura ambiente. A turbidez dos licores de lavagem é medida.

Avaliação: A turbidez é medida em Hach 18900 Ratio Turbidimeter (padronizado com Padrões de Turbidez de 1,8, 18 e 180 NTU). O desempenho da enzima é calculado em relação a uma peça bruta no tempo igual a zero: A turbidez do licor bruto no tempo zero (sem enzima) subtraiu a turbidez do licor tratado com enzima (em um determinado tempo). O desempenho relativo (redução de turbidez) da variante de cutinase foi calculado e os resultados são mostrados na seguinte tabela.

Os resultados mostram que o efeito da enzima é aumentado durante o tempo. Na atual dose de enzima e concentração de oligômero, parece nivelar-se acima de ap. 20 minutos.

Exemplo 13: Modificação de fibra O efeito sobre as características de umedecimento de um pano de poliéster tingido disperso foi investigado tratando-se o pano com uma variante de cutinase de H. insolens antes do tingimento. O experimento, portanto, consistiu de duas fases, a atual modificação de fibra e o procedimento de tingimento disperso.

Fase 1 - Modificação da Fibra: Equipamento: Atlas Launder-O-meter LP2 Pano: poliéster 100% limpado entrelaçado da Testfabrics pH: tampão de fosfato de potássio 50 mM, pH 7 Abrasivos: 5 grandes bolas de aço Vol. Béquer: 120 ml Tratamento: 2 horas 65 °C em seguida elevada até 90 °C e mantida por 1 hora Prep. pedaço de pano: Corte 3* 1,5 g pedaço de pano, 3 por béquer = 4,5 g Enxágüe: Enxágue em água deionizada.

Fase 2 - Tingimento - corante disperso: Solução de tingimento: Adicionar junto com água deionizada para produzir relação de licor 1:20-0,4% Dianix Red (DyStar) SE-CB (owf) pH 4,5 - 5 Procedimento de Tingimento: 1. Um pedaço de pano por tratamento da modificação de fibra é usado para o tingimento (1,5 g/pedaço de pano é usado para o cálculo da relação de licor). 2. Preparar o banho de tingimento de acordo com a receita acima. Adicionar a solução de corante fria nos béqueres de Labomat e aquecer a 55 °C em um gradiente de 3,5 °C/minuto. Manter durante 5 minutos uma vez a temperatura tenha sido alcançada. 3. Adicionar o pano ao béquer. 4. Elevar a temperatura a 130 °C em um gradiente de 1,5 °C/minuto. Tingir por 30 minutos. 5. Esfriar a 70 °C em um gradiente de 5 °C/min. Banho de gota, porém coletar e enxaguar o pano quente (60 °C) por 10 minutos. Seguir o enxágüe quente com um enxágüe de transbordamento à temperatura ambiente até toda a sangria ter parado. 6. Deixar secar ao ar durante a noite.

Testes/Análise Processo de Teste AATCC 61 - Fixação da cor na lavagem Exaustão Percentual do Banho de Lavagem - Espectrofotômetro K/S e L* - Reflectômero Teste de Gotejamento AATCC TM-79 Resultados: Os resultados da modificação da fibra são mostrados na seguinte tabela.

Os resultados mostram que o tratamento do poliéster com a variante aumenta o umedecimento substancialmente. Não são notados efeitos adversos sobre a tingibilidade com o corante disperso no atual arranjo. Exemplo 14: Redução do mal odor em têxteis suios com suor humano/sebo neío uso de uma variante de cutinase em lavagem de roupa O desempenho da cutinase, com respeito à redução do mal odor, pode ser testada em uma prova de lavagem de um ciclo, realizada em um Terg-O-tometer.

Condições experimentais: Licor de lavagem: 1000 ml por béquer Pedaços de pano: 100 % poliéster (entrelaçado, previamente limpado por extração Soxhlet). 24 pedaços de pano (3,3 x 3,5 cm) por béquer.

Sujeira: Suor axilar masculino humano e sebo aplicado por esfregamento das axilas após exercício.

Detergente: 5 g/1 de um detergente colorido padrão. Nenhum ajuste de pH.

Dureza da água: 3,2 mM Ca2_7Mg2+ (em uma relação de 5:1) Temperatura de lavagem: 30 °C

Tempo de lavagem: 30 min Enxágüe: 15 minutos em água de bica corrente.

Avaliação: Após lavagem, os pedaços de pano úmido são colocados em copos de 200 ml coloridos, fechado. Um painel sensorial treinado (9-11 juizes) avaliam o odor cheirando o espaço aéreo sobre as amostras úmidas e avalia a intensidade total do odor. A intensidade de odor é anotada colocando-se uma marca em uma escala de linha não-estruturada medindo 15 cm, com âncoras de palavra em cada extremidade (‘nada” no início da escala e ‘muito forte’ no final). Todas as avaliações são realizadas duas vezes. Os pedaços de pano são avaliados no dia 1, 2 e 3 após a lavagem (os pedaços de pano são mantidos dentro dos vidros todas as vezes).

Claims (13)

1. Variante de uma cutina.se de cepa DSM 1800 de Humicoía insolens precursora com sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, caracterizada pelo fato de: a) ter 1-20 alterações na sequência de aminoácidos da precursora; b) ter substituições que correspondam a uma das seguintes no peptfdeo maduro da SEQ ID NO: 2: (i) AI4P+E47K, <ii) E47K, (iii) EI79N/Q, <iv) E6N/Q+E47K+R51P, (v) A14P+E47K+E179N/Q, (vi) E6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q, ou (vii) E6N/Q+EIÜN/Q+A14P+E47K+R51 P+E 179N/Q; e c) ser mais terinoestável do que a cutinase precursora.

2. Sequência de DNA, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de DNA de SEQ ID NO: 1 mutada para codificar a variante de cutinase, tendo mutações correspondendo a uma das seguintes: (i) para a variante A14P+E47K, o códon de DNA “gcc” que codifica para Ala (A) na posição 14 no peptfdeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons dc DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag" que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptfdeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); (ii) para a variante E47K, o códon de DNA bigag'’ que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptfdeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); (iii) para a variante E179N/Q, o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 179 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); (iv) para a variante E6N/Q + E47K + R51P, o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 6 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); e o códon de DNA “cgg” que codifica para Arg (R) na posição 51 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); (v) para a variante A14P + E47K + E179N/Q, o códon de DNA “gcc” que codifica para Ala (A) na posição 14 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 179 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); (vi) para a variante E6N/Q+A14P+E47K+R51P+E179N/Q, o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 6 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); e o códon de DNA ”gcc” que codifica para Ala (A) na posição 14 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); e o códon de DNA “cgg” que codifica para Arg (R) na posição 51 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 179 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); (vii) para a variante E6N/Q+E1ON/Q+A14P+E47 K+R51P+E179N/Q, o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 6 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 10 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q); e o códon DNA “gcc” que codifica para Ala (A) na posição 14 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 47 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aaa” ou “aag” que codificam para Lys (K); e o códon de DNA “cgg” que codifica para Arg (R) na posição 51 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “cct”, “ccc”, “cca” ou “ccg” que codificam para Pro (P); e o códon de DNA “gag” que codifica para Glu (E) na posição 179 no peptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é mutado para os códons de DNA “aat” ou “aac” que codificam para Asn (N); ou para os códons de DNA “caa” ou “cag” que codificam para Gin (Q).

3. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de DNA como definida na reivindicação 2.

4. Célula hospedeira microbiana transformada, caracterizada pelo fato de abrigar a sequência de DNA como definida na reivindicação 2.

5. Processo para produzir a variante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 4, de modo a expressar e, preferivelmente, secretar a variante, e b) recuperar a variante.

6. Processo para hidrólise enzimática de um oligômero cíclico de poli(etileno tereftalato), caracterizado pelo fato de compreender tratar o oligômero cíclico com a variante de cutinase fúngica como definida na reivindicação 1.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o oligômero cíclico ser tri(etileno tereftalato) cíclico.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o tratamento ser realizado a 60-80°C.

9. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o oligômero cíclico estar presente nas fibras de um pano ou fio contendo poliéster.

10. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente enxaguar subsequentemente o pano ou fio.

11. Processo para tingir pano ou fio de poliéster, caracterizado pelo fato de compreender: a) tratar o pano ou fio com a variante como definida em na reivindicação 1, e b) tingir o pano tratado com um corante reativo ou um corante disperso.

12. Processo para melhorar o acabamento funcional de um fio ou pano contendo PET, caracterizado pelo fato de compreender a) tratar o fio ou pano com a variante como definida na reivindicação 1, e b) subsequentemente tratar o fio ou pano com um agente de acabamento selecionado do grupo consistindo de amaciantes, resinas anti-rugas, agentes anti-estáticos, agentes anti-sujeira.

13. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender um tensoativo e a variante como definida na reivindicação 1.