BRPI1014846B1

BRPI1014846B1 - método e sistema de detecção por ressonância plasmônica na superfície

Info

Publication number: BRPI1014846B1
Application number: BRPI1014846-9A
Authority: BR
Inventors: Valsesia Andrea; Marabelli Franco; Rossi François; Colpo Pascal
Original assignee: The European Union Representada Pela European Commission
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2019-10-29
Also published as: WO2010146160A1; AU2010261777B2; US8508744B2; AU2010261777A1; CA2765972A1; BRPI1014846A8; EP2443438A1; EP2443438B1; CA2765972C; US20120120401A1; BRPI1014846A2; ES2543464T3; EP2264438A1; MX2012000052A

Abstract

método e sistema de detecção por ressonância plasmônica na superfície a invenção se refere a um método de detecção por ressonância plasmônica na superficie (spr) que compreende as seguintes etapas: apresentar um sensor spr compreendendo uma superfície do sensor de suporte spr e contatando uma amostra a ser analisada com a superficie do sensor. pelo menos uma condição de ressonância na superfície do sensor de suporte spr é monitorada pela iluminação da superficie do sensor com um feixe de luz de teste que aciona o spr e pela detecção do feixe de luz de teste refletido ou transmitido. adicionalmente, a superficie do sensor é iluminada com um feixe de luz de referência em condições selecionadas, de modo a não acionar o spr na superficie do sensor e detectar a intensidade do feixe de luz de referência refletido ou transmitido. pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste refletido ou transmitido é determinada, levando em conta a intensidade detectada do feixe de luz de referência refletido ou transmitido.

Description

Campo Técnico [0001] A presente invenção se refere, de um modo geral, a um método de detecção por ressonância plasmônica na superfície (SPR) e a um sistema de detecção SPR. A invenção se refere, mais particularmente, a um método de detecção SPR e a um sistema de detecção SPR adequado para uso, isto é, em testes químicos, bioquímicos, biológicos, biomédicos, farmacêuticos e físicos.

Fundamentos da Invenção [0002] Existem vários sensores conhecidos que utilizam o acionamento de substâncias plasmônicas na superfície, denominados Sensores (SPR) de Ressonância Plasmônica na Superfície, para detectar alterações de índice refrativo em uma amostra adjacente à superfície do sensor. Estes sensores SPR são utilizados, por exemplo, para quantificar concentrações de substâncias em pesquisas químicas, bioquímicas, biológicas, biomédicas ou farmacêuticas e em diagnósticos clínicos ou alimentares ou em medições ambientais (isto é, detecção de gás ou águas residuais), etc. Vários sensores SPR podem realizar inspeções rápidas, paralelas e massivas, o que toma estes sensores também convenientes para quantificar interações moleculares, em particular no estudo da afinidade e da cinética de reação em tempo real entre duas ou mais moléculas que interagem.

[0003] Os sensores SPR se baseiam em um fenômeno do SPR bem conhecido que envolve uma ou mais ondas eletromagnéticas fixas na superfície que se propagam na interface entre um material metálico (normalmente em ouro ou prata) e um material dielétrico. Cada onda eletromagnética fixa na superfície, que ocorre pela oscilação coletiva de

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2/29 elétrons livres na interface metal-dielétrica, se propaga em sua mais elevada intensidade e paralela a esta interface, decaindo de modo exponencialmente distante desta interface.

[0004] Convencionalmente, o sensor SPR compreende uma superfície no sensor que sustenta substâncias plasmônicas na superfície em que o SPR pode ser acionado opticamente. É bem sabido que a luz pode acionar a ressonância das substâncias plasmônicas na superfície na interface metaldielétrica, caso um componente de interface paralela da luz incidente e a onda eletromagnética fixa na superfície do SPR apresentem freqüências combinadas e comprimentos de onda combinados. Na condição da ressonância, a luz incidente é absorvida pela interface metal-dilétrica, para ser acoplada à onda eletromagnética fixa na superfície. Assim, é possível observar esta absorção ao detectar, por exemplo, a redução na intensidade da luz que é transmitida ou refletida pela interface metal-dielétrica. Visto que a condição de acoplamento entre a luz e as ondas plasmônicas na superfície é muito sensível às alterações do índice refrativo do meio dielétrico próximo à interface metal-dielétrica, os sensores SPR se beneficiam desta sensibilidade na condição de acoplamento da ressonância para detectar alterações no índice refrativo do meio dielétrico ao medir a diminuição da intensidade da luz refletida da interface metal-dielétrica, ao mesmo tempo em que esta última é iluminada pelo feixe de luz que aciona o SPR.

[0005] A aplicação do SPR se dá, particularmente, em sistemas biosensores capazes de detectar interações entre biomoléculas ou moléculas bioquímicas, por exemplo, interações entre antígenos e anticorpos, enzimas e substâncias fundamentais, endócrinas e receptoras, ácidos nucléicos e ácidos nucléicos, etc. Particularmente, vários sistemas biosensores SPR têm receptores ou ligantes fixos na superfície do seu sensor, para detectar alterações na condição de acoplamento de luz do SPR causadas pelas alterações do índice refrativo na superfície do sensor quando moléculas

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3/29 bioquímicas ou biomoléculas interagem (fixam-se) com estes receptores ou ligantes. Estes sistemas biosensores são adequados para medir, por exemplo, concentrações de biomoléculas ou moléculas bioquímicas em soluções, etc. [0006] Atualmente, existe uma variedade de equipamentos de laboratório que são baseados na detecção SPR. O pedido de patente norteamericano n.° 2009/021.727, por exemplo, descreve um método de detecção SPR e aparelho para detectar alterações de índice refrativo do meio dielétrico, em particular para detectar biomoléculas. De acordo com o método de detecção descrito neste documento, a luz polarizada, magnética e transversal é direcionada para a camada metálica e magnetizada, para acionar o SPR nesta camada metálica em que a luz é, pelo menos, parcialmente refletida pela camada magnética em direção ao sensor. O sensor detecta um aspecto da luz refletida e produz um sinal que é, em seguida, analisado para determinar o valor absoluto do índice refrativo, a magnitude e/ou indicação de ocorrência da alteração do índice refrativo do meio dielétrico adjacente à camada metálica.

[0007] Outro sistema biosensor SPR para detectar moléculas bioquímicas é conhecido em US2008/316.490. Este sistema compreende um sensor que apresenta uma película de detecção metálica disposto em um substrato de vidro em que a película de detecção metálica é coberto por uma estrutura de reticulação metálica. O material metálico utilizado para este sensor compreende ouro, prata ou cobre. São depositadas micelas na superfície do sensor formadas pela película de detecção e pela estrutura de reticulação, permitindo reagirem com as biomoléculas. Uma amostra líquida que contém biomoléculas é, em seguida, disposta nesta superfície, por onde biomoléculas de analitos reagem a estas micelas, induzindo, desta forma, a alteração do índice refrativo na superfície do sensor. Esta alteração do índice refrativo é detectada pela iluminação da superfície do sensor, para acionar o SPR nele e pela detecção da alteração da intensidade da luz refletida.

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4/29 [0008] ΕΡ 1729110 apresenta um biosensor ótico que tem nanopartículas de metal nobre. A luz é irradiada da fonte de luz sobre as nanopartículas de metal nobre por uma fibra ótica e a luz refletida é introduzida em uma ou mais unidades de detecção ótica por outra fibra ótica. A unidade de detecção ótica mede, separadamente, a intensidade da luz de entrada na banda principal, incluindo um comprimento de onda de absorção máxima, bem como em um par de bandas auxiliares que têm, respectivamente, comprimentos de onda maior e menor. As bandas auxiliares estão na proximidade espectral da banda principal e são utilizadas para avaliar o valor da mudança do comprimento de onda ressonante das nanopartículas de metal nobre devido à alteração do índice refrativo.

[0009] Os sistemas de detecção SPR supracitados são, no entanto, sujeitos à detecção múltipla e/ou a erros de medição das propriedades que são de interesse, como índices refrativos ou alterações de índices refrativos, etc.. Estes erros podem ser causados por efeitos externos, como variações de temperatura na superfície do sensor e/ou meio examinado, alterações ou flutuações na intensidade de luz medida e/ou na polarização medida do feixe de luz ao longo do seu trajeto ótico, instabilidades das fontes de luz, sinais de ruído que interferem no sinal detectado, choques mecânicos no sensor, etc. É interessante observar que estes efeitos estranhos podem causar alterações indesejadas na intensidade ou polarização do feixe de luz a ser detectado ou medido, os quais são referidos com freqüência como artefatos. [0010] Além disso, os sistemas de detecção SPR supracitados não são adaptados para detectar caso um artefato tenha ocorrido, nem para corrigir os artefatos.

Problema técnico [0011] Neste caso, faz-se necessário um método de detecção SPR ou sistema de detecção SPR que é capaz de detectar e/ou levar em conta a ocorrência dos artefatos para uma melhor confiabilidade.

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5/29 [0012] Isto é obtido com o método de detecção SPR, como reivindicado na reivindicação 1.

Descrição Geral da Invenção [0013] Para poder detectar a ocorrência dos artefatos durante a detecção SPR, a presente invenção propõe, além de monitorar a condição de ressonância plasmônica na superfície relacionada à amostra em investigação, monitorar a intensidade refletida ou transmitida da luz de referência que não aciona o SPR.

[0014] Na verdade, o monitoramento da intensidade de luz refletida ou transmitida em condições de não SPR pode ser utilizado, de forma vantajosa, para checar flutuações ou desvios que não são afetados pelo fenômeno de interesse, isto é, a mudança no SPR devido às variações do índice refrativo na superfície do sensor. Os presentes inventores têm, de fato, observado que as flutuações da luz de referência transmitida ou refletida são causadas por fenômenos estranhos, isto é, variações ou instabilidades de temperatura da fonte de luz.

[0015] De acordo com o presente método, a condição de ressonância é monitorada pela iluminação da superfície do sensor com, pelo menos, um feixe de luz de teste, para acionar o SPR, e a luz de teste refletida ou transmitida é detectada e, preferivelmente, medida. Como observado a seguir, para acionar o SPR na superfície do sensor, pelo menos um feixe de luz de teste deve ter uma ou mais freqüências que combinam com uma ou mais freqüências das ondas eletromagnéticas fixadas na superfície na superfície do sensor. Simultânea ou altemativamente, a superfície do sensor é iluminada por, pelo menos, um feixe de luz de referência em condições selecionadas, para não acionar a ressonância plasmônica da superfície na superfície do sensor, e a intensidade refletida ou transmitida é medida. De acordo com um aspecto importante da invenção, a intensidade detectada ou medida, refletida ou transmitida do feixe de luz de referência é levada em

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6/29 conta na determinação da propriedade da luz, isto é, a intensidade de, pelo menos, um feixe de luz de teste, como transmitida ou refletida pela superfície do sensor.

[0016] Levando em conta a intensidade medida da luz de referência refletida/transmitida durante a performance do SPR, é possível determinar a ocorrência de um artefato e, de modo até mais interessante, a correção sistemática dos valores medidos no teste. Naturalmente, o feixe de luz de referência detectado pode servir de base para filtrar ou corrigir o feixe de luz detectado/medido no teste.

[0017] Preferivelmente, o feixe de luz de referência cobre uma espectral cujos limites espectrais estão na posição espectral com, pelo menos, o dobro da distância do Comprimento Integral na Metade Máxima da Ressonância Plasmônica da Superfície do pico de Ressonância Plasmônica (mais aproximado) da Superfície (considerando o centro do pico). O feixe de luz de referência (respectivamente, a banda monitorada correspondente) tem, preferivelmente, uma largura espectral estreita, isto é, na ordem de 100 nm ou menos.

[0018] A presente invenção pode ser implementada com base em qualquer tipo de tecnologia de detecção SPR, isto é, sendo baseada na abordagem convencional de Kretschmann ou no uso mais recente de nanogrades metálicas e periódicas como camada de detecção na superfície, ou em outra configuração adequada da camada de detecção da superfície que sustenta SPR localizado ou deslocalizado, na medida em que a tecnologia selecionada permite monitorar a refletividade/transmitividade de um feixe de luz de referência que aciona um não SPR na superfície do sensor.

[0019] Pode ser observado que, pelas condições de ressonância serem essencialmente determinadas pelo modelo do sensor, a iluminação em condições de acionamento ou não acionamento do SPR é determinada pela seleção apropriada do ângulo incidente e comprimento de onda

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7/29 (respectivamente, do número de ondas). É suficiente variar, de forma apropriada, um dos ângulos de incidência e comprimento de onda para alterar a condição de iluminação que aciona a ressonância em uma iluminação que aciona a não ressonância. Entretanto, a variação pode ser aplicada aos dois casos.

[0020] O monitoramento do sinal de referência pode ser realizado em qualquer ocasião adequada. Idealmente, a medição da luz de referência é executada em relação a cada medição de teste de forma simultânea ou alternada. No último caso, a medição de teste e referência deve, preferivelmente, ser bem curta (cada uma na ordem de um ou alguns milissegundos separados por um período de alteração bem curto - também milissegundos).

[0021] Preferivelmente, o presente método envolve a medição de uma ou mais intensidades espectrais, isto é, intensidades que correspondem a frequências específicas, e/ou que determinam alterações em uma ou mais intensidades espectrais de, pelo menos, um feixe de luz de teste ou, de pelo menos, um feixe de luz de referência, como transmitidos ou refletidos pela superfície do sensor. Mais preferivelmente, o método envolve a determinação da alteração máxima das intensidades espectrais medidas, para detectar uma ocorrência de acionamento do SPR na superfície do sensor. Preferivelmente, o presente método propõe determinar a alteração máxima das intensidades espectrais medidas para determinar o valor indicativo da extensão da alteração na condição de acoplamento de luz do SPR na superfície do sensor.

[0022] A propriedade de luz medida de, pelo menos, um feixe de luz de teste pode ser uma intensidade medida, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou uma alteração medida na intensidade, em particular uma alteração medida em uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido de, pelo

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8/29 menos, um feixe de luz de teste. Pode ser observado que a alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido de, pelo menos, um feixe de luz de teste pode ser indicativa da alteração da intensidade média ponderada pela freqüência e/ou pelo tempo medido da alteração medida da intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido e vice-versa. Além disso, a propriedade de luz medida também pode ser indicativa da polarização de, pelo menos, um feixe de luz de teste, como transmitido ou refletido pela superfície do sensor.

[0023] Pode ser observado também que a intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido do feixe de luz de referência e/ou do feixe de luz de teste pode ser indicativa da uma intensidade média ponderada pelo tempo e/ou intensidade média ponderada pela frequência. A intensidade média ponderada pelo tempo monitorada ou medida é, preferivelmente, indicativa da intensidade média monitorada ou medida durante um ou mais intervalos de tempo, preferivelmente na gama de milissegundos. Entretanto, a intensidade média ponderada pela frequência monitorada ou medida do feixe de luz pode ser indicativa da intensidade espectral média, isto é, de um valor significativo das intensidades espectrais, que é pesada pelas frequências que compõem o espectro do feixe de luz. Em particular, quando um feixe de luz de referência ou de teste apresenta uma banda espectral contínua, a intensidade média ponderada pela frequência medida pode ser indicativa de uma integração, em particular de uma integração numérica, das intensidades medidas em relação ao espectro do feixe de luz.

[0024] A intensidade monitorada do feixe de luz de referência e/ou da intensidade medida do feixe de luz de teste pode ser indicativa de uma refletividade, refletância, transmitividade, transmissão, absorvência, etc., medida do feixe de luz correspondente.

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9/29 [0025] Em uma modalidade, o presente método propõe processar, em particular, filtrar a propriedade de luz medida de, pelo menos, um feixe de luz de teste ou da medição deste, utilizando um valor de deslocamento determinado e indicativo do desvio da intensidade monitorada do feixe de luz de referência, como transmitido ou refletido pela superfície do sensor, para excluir ou validar o valor medido no teste. Várias abordagens conhecidas estão disponíveis para a realização da filtragem. Uma possibilidade é excluir os valores medidos no teste quando o valor de deslocamento correspondente excede um predeterminado limiar. Altemativamente, é possível considerar que, caso o valor da intensidade medida no teste seja, pelo menos, três vezes o valor do ruído (isto é, o valor de intensidade da referência), o valor da intensidade medida no teste é considerado correto.

[0026] Em outra modalidade, o valor de deslocamento pode ser utilizado para corrigir a intensidade medida do feixe de luz refletido/transmitido no teste, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou uma alteração na intensidade medida, em particular uma alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de teste. Por exemplo, a intensidade medida de um feixe de luz de teste pode ser corrigida com a execução de cálculos, como combinações lineares, em particular subtrações, entre esta intensidade medida ou aquela intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido e o valor de deslocamento.

[0027] Como é sabido pelos conhecedores da técnica, em métodos clássicos do SPR, o modo de ressonância é somente deslocalizado e existe em relação a uma série de combinações apresentadas entre o ângulo de incidência e o comprimento de onda. Naturalmente, a iluminação da superfície do sensor com o feixe de luz de referência, em condições

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10/29 selecionadas para não acionar o SPR, pode ser realizada com a operação em um ângulo que não aciona o SPR, isto é, operando em uma distância angular com distância suficiente do ângulo de ressonância.

[0028] O SPR atual emprega nanogrades em que existem modos deslocalizados e modos localizados. Os modos deslocalizados se comportam da mesma forma que é descrita pelo caso acima, por meio da qual podem ser encontrados, em comprimento de onda fixo, alguns intervalos angulares em que o SPR não é acionado. Os modos localizados, no entanto, não apresentam dispersão, significando que eles existem em um comprimento de onda fixo em relação a todos os ângulos. Naturalmente, quando há operação com nanogrades baseadas em sensores SPR, deve-se, normalmente, alterar as condições de acionamento ou não acionamento do SPR ao variar o comprimento de onda. Do ponto de vista prático, isto é também muito mais fácil, visto que impede quaisquer deslocamentos dos feixes de luz.

[0029] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é proposto um sistema de detecção SPR, de acordo com a reivindicação 14, que é adequado para realizar o método de acordo com a reivindicação 14.

[0030] Preferivelmente, o fotossensor é adaptado para medir intensidade, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou alteração de intensidade, em particular uma alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de teste, como transmitido ou refletido pela superfície do sensor. Mais particularmente, o fotossensor pode ser adaptado para monitorar intensidade, preferivelmente uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de referência, como refletido ou transmitido pela superfície do sensor, e configurado para utilizar um valor de deslocamento que corrige a intensidade medida, a intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido ou alteração desta.

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11/29 [0031] Preferivelmente, a superfície do sensor compreende uma camada de detecção projetada como uma nanograde metálica e periódica, o metal sendo, por exemplo, em ouro, prata ou outros metais nobres utilizados na técnica. A superfície do sensor é, vantajosamente, sustentada em um substrato transparente capaz de transmitir os feixes de luz de teste e de referência, que permite a detecção no modo de reflexão. O substrato pode ser elaborado com vidro ou polímero transparente à luz.

[0032] Para aplicações de biodetecção, as partes enfocadas, que apresentam especificidade de fixação em relação a analitos visados, podem, normalmente, ser fixas na superfície do sensor. As partes enfocadas são, preferivelmente, organizadas como microarranjos e podem ser de diferentes tipos. As partes enfocadas podem ser fixas na superfície do sensor por uma camada de hidrogel apropriada, isto é, uma camada PEG.

[0033] Em uma modalidade preferida, o sistema de detecção compreende um sensor com uma superfície de sensor, nanograde periódica em ouro e microarranjos de partes enfocadas fixadas neste. O sistema é configurado para operar no modo de reflexão e compreende um detector CCD, bem como um LED para emitir o feixe de luz de referência e, pelo menos, um led, preferivelmente dois, para monitorar as respectivas posições de acoplamento de ressonância. Esta é uma modalidade particularmente vantajosa, que pode ser construída como um aparelho SPR de bolso, permitindo a medição em modo multiplexado de várias espécies bioquímicas com alta confiabilidade e precisão, sem riscos de erros de medição devido aos artefatos.

[0034] Estas e outras modalidades preferidas do presente método e sistema são descritas nas reivindicações pendentes.

Breve Descrição dos Desenhos

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12/29 [0035] Maiores detalhes e vantagens da presente invenção são descritos a partir da descrição detalhada a seguir de diversas, porém não limitadas, modalidades com referência aos desenhos em anexo nos quais:

[0036] Fig. 1 é um gráfico que mostra um conjunto de curvas determinadas por freqüência indicativas de intensidades de um feixe de luz de teste e de um feixe de luz de referência que são medidos em relação a diferentes valores do índice refrativo de um meio em contato com a superfície do sensor;

[0037] Fig. 2 é um gráfico que mostra um conjunto de valores de deslocamento indicativos de variações de intensidades monitoradas de um feixe de luz de referência que são obtidas em relação a diferentes valores do índice refrativo de um meio adjacente à superfície do sensor, de acordo com a presente invenção;

[0038] Fig. 3 é um gráfico que apresenta conjuntos de valores de média ponderada por frequência correta e não correta de intensidades medidas de um feixe de luz de teste que são obtidos em relação a diferentes valores do índice refrativo de um meio adjacente à superfície do sensor;

[0039] Fig. 4 é uma ilustração esquemática de um sistema de detecção SPR preferido;

[0040] Fig. 5 é uma vista perspectiva e esquemática da estrutura de um sensor preferido para uso em aplicações de biodetecção.

Descrição das Modalidades Preferidas [0041] A presente invenção apresenta um método seguro de detecção SPR que leva em conta a ocorrência de artefatos, isto é, eventos que são estranhos ao fenômeno em observação e que afetam a precisão das medições. [0042] Como é bem sabido, os métodos convencionais de análise SPR são baseados nas alterações da refletividade ótica de uma película em metal fina (normalmente em Ouro) quando contatada com uma amostra líquida (ou, possivelmente, gases) de interesse. Normalmente, o método envolve o

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13/29 acionamento de substâncias plasmônicas na superfície na interface de metal / amostra por meio do feixe de luz de teste e a detecção da luz refletida (ou transmitida), a intensidade da luz refletida dependendo do acoplamento do feixe de luz de teste incidente e para a propagação das ondas plasmônicas na superfície.

[0043] Na condição de ressonância, isto é, em que o acoplamento de ressonância é obtido entre a luz incidente no teste e as ondas plasmônicas na superfície, é observada forte atenuação na intensidade da luz refletida no teste. Esta condição de ressonância é muito sensível ao índice de refração da amostra e é, normalmente, rastreada com a variação das condições de iluminação. Em configurações normais de laboratório, a ressonância é monitorada seguida da variação da intensidade de luz versus comprimento de onda ou ângulo incidental. Em outras palavras, mais sistemas práticos SPR, a alteração da condição de ressonância é rastreada seguida da variação da intensidade refletida em um feixe de luz incidente e pontual gerado, por exemplo, por um LED com largura de banda estreita ou laser.

[0044] O presente método se baseia na técnica do SPR e propicia uma forma de levar em conta os artefatos que ocorrem durante as medições. Isto é obtido ao monitorar a refletância (transmissão) da superfície do sensor que sustenta o SPR em condições que não acionam a ressonância, para detectar o deslocamento ou alteração na intensidade refletida (resultante do feixe de luz de referência incidente) que não é devido ao acoplamento da ressonância entre o feixe de luz incidente e as ondas plasmônicas na superfície. Assim, o método inventivo utiliza uma propriedade ótica da superfície, que, propositalmente, não está relacionada à ressonância plasmônica sustentada pela superfície.

[0045] A detecção do artefato é aplicável a qualquer técnica de detecção SPR em que a intensidade de sinal refletida ou transmitida pode ser medida em condições de iluminação selecionadas para não acionar o SPR.

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14/29 [0046] A descrição a seguir do presente método e sistema com referência às Figuras é dirigida a uma modalidade preferida com uma estrutura de sensor preferida que tem uma superfície no sensor que sustenta SPR localizado ou deslocalizado e adaptado para biodetecção, bem como um sistema de detecção configurado para operação em modo de reflexão e em ângulo de incidência fixo.

[0047] O presente método, como aplicado ao biosensor, pode ser implementado da forma a seguir. Uma amostra a ser analisada é contatada com a superfície de um sensor adequado para sustentar o SPR. Uma modalidade preferida do sensor é descrita abaixo, em maiores detalhes, com referência às FIGs. 4 e 5; entretanto, pode ser observado que ela apresenta, preferencialmente, uma superfície de sensor que compreende um nanograde metálica e periódica de metal nobre (em ouro, neste caso) para sustentar o SPR localizado e deslocalizado. As propriedades geométricas e físicas desta nanograde determinam a resposta ótica do sensor.

[0048] Ao contatar a superfície do sensor com uma amostra a ser analisada, a superfície do sensor é iluminada por um feixe de luz de teste que tem frequência e ângulo de incidência conhecidos por ser capazes de acionar o SPR na superfície do sensor. Pode ser observado que o feixe de luz de teste que ilumina a superfície do sensor pode ser configurado de modo por si só conhecido, para apresentar uma polarização determinada. Para acionar o SPR, o feixe de luz de teste apresenta uma ou mais frequências que combinam com uma ou mais frequências permitidas das ondas eletromagnéticas fixas na superfície na superfície do sensor. Preferivelmente, o sensor é projetado para que as frequências permitidas do SPR correspondam, normahnente, ao espectro de luz visível/próximo do infravermelho. Visto que o feixe de luz de teste aciona o SPR, pelo menos parte do feixe de luz de teste é absorvida na superfície do sensor em que a extensão da absorção depende da frequência da luz incidente na superfície

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15/29 do sensor. A luz do feixe de luz de teste que não foi absorvida na superfície do sensor é refletida ou transmitida pela superfície do sensor.

[0049] Uma propriedade da luz do feixe de luz refletido no teste, preferivelmente sua intensidade, é detectada (medida) e o valor corrente da propriedade de luz medida é determinado, o qual é representativo do nível de acionamento das substâncias plasmônicas na superfície, permitindo avaliar o estado de ressonância da alteração da condição de ressonância estabelecida com relação aos dados calibrados ou previamente armazenados/adquiridos. Como é sabido, a condição de ressonância leva, normalmente, à diminuição da intensidade medida da luz refletida do feixe de luz de teste devido à absorção da luz na superfície do sensor, e a modificação no índice refrativo da amostra adjacente à superfície do sensor acarreta na alteração da condição de ressonância.

[0050] Durante a medição da intensidade refletida da luz de teste, a medição pode ser afetada por efeitos estranhos e espúrios, como temperatura ou flutuações da fonte de luz, variações na sensibilidade do detector ou modificações na configuração mecânica, que alteram a resposta geral do sistema de detecção. Os artefatos, desta forma, causam o desvio ou deslocamento da intensidade medida da luz de teste refletida em comparação ao valor medido que é obtido sem qualquer artefato, sendo erroneamente interpretados como alteração do índice refrativo.

[0051] Como observado a seguir, para poder checar a ocorrência do artefato e/ou corrigir o valor de intensidade determinado, é proposto iluminar a superfície do sensor com um feixe de luz de referência em condições que são selecionadas, para não acionar o SPR na superfície do sensor. Naturalmente, o feixe de luz de referência apresenta uma ou mais frequências que não combinam com a frequência permitida das ondas eletromagnéticas fixadas na superfície na superfície do sensor (o ângulo de incidência sendo fixado nesta variante). Em outras palavras, o feixe de luz de referência

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16/29 apresenta uma ou mais frequências que não estão na banda espectral, levando à condição de ressonância na superfície do sensor. O monitoramento da intensidade da luz de referência espetacularmente refletida (isto é, feixes refletidos que apresentam bandas/comprimentos de bandas espectrais que não acionam o SPR - em uma distância espectral apropriada da ressonância) por um período de tempo permite determinar a variação na intensidade da luz de referência refletida que não é devida ao SPR, indicando, desta forma, uma alteração no sistema do sensor que não é devida ao fenômeno em observação.

[0052] Como explicado em maiores detalhes abaixo, o feixe de luz de referência pode ser explorado simplesmente para detectar o deslocamento da medição devido ao artefato (neste caso, para fins de filtragem), porém isto pode ser levado em conta para corrigir os valores de intensidade refletidos na luz de teste, apresentado um tipo de correção de ruído.

[0053] Na verdade, a intensidade do feixe de luz de referência refletido ou transmitido pode ser monitorada, e o valor de deslocamento indicativo do desvio da intensidade monitorada, com relação aos dados de referência (medição anterior ou outros dados armazenados ou calibrados), é, desta forma, determinado. Como observado a seguir, neste caso, o desvio da intensidade monitorada em relação à intensidade previamente monitorada é indicativo da variação de tempo da intensidade de referência monitorada devido aos efeitos espúrios.

[0054] A propriedade medida da luz do feixe de luz de teste pode ser processada, utilizando o valor de deslocamento. Naturalmente, a intensidade medida do feixe de luz de teste refletido ou transmitido é corrigida, utilizando o valor de deslocamento, por exemplo, ao considerar a diferença entre a intensidade medida e o valor de deslocamento 32 indicativo da variação da intensidade monitorada do feixe de luz de referência. É observado que o artefato na intensidade medida do feixe de luz de teste, que

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17/29 é causada por um efeito externo também causador, de forma diferente, da variação da intensidade monitorada do feixe de luz de referência, pode ser corrigida ao subtrair o valor de deslocamento da intensidade medida do feixe de luz de teste. As intensidades medidas corrigidas do feixe de luz de teste podem ser também processadas, armazenadas ou exibidas.

[0055] Para fins de exemplificação e melhor compreensão do princípio de funcionamento do presente método, o método é descrito com respeito às Figs. 1 a 3, obtidas com o uso de um chip do sensor, que apresenta a superfície do sensor, compreendendo uma nanograde periódica em ouro. O sensor foi examinado em modo de reflexão por meio de um feixe branco colimado e emitido por uma fonte de luz de tungstênio em ângulo fixo. A luz refletida foi detectada por meio de um detector CCD de resolução de espectro (400-1050pm). Como é sabido pelo conhecedor da técnica, nesta configuração, os parâmetros de nanograde e o ângulo de incidência determinam, de forma inequívoca, a resposta ótica do sistema e, como consequência, a posição espectral das ressonâncias. Estes picos de ressonância resultam da alteração dos modos de ressonância localizados e deslocalizados.

[0056] Os espectros foram colhidos com o uso das seguintes amostras: a primeira amostra de Solução de Tampão Fosfato (PBS, índice refrativo n=l,334) e diversas amostras de PBS que contêm concentrações predeterminadas de Glicerol (correntemente, entre 0,1% e 25%), apresentando uma variação conhecida do índice refrativo na superfície do sensor. Ao examinar cada amostra, o gráfico da Fig. 1 foi traçado, e o eixo vertical que indica o chamado Sinal calculado como a proporção da intensidade refletida das amostras com concentrações variadas de glicerol durante a intensidade refletida da amostra PBS pura, ao mesmo tempo em que o eixo horizontal apresenta o comprimento de onda.

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18/29 [0057] Em relação ao exemplo com PBS, o sinal dever ser, idealmente, de 100%. Como pode ser visto na Fig. 1, nesta configuração, o Sinal é uma função do aumento da concentração de glicerol, sendo observados três picos de ressonância: pico positivo centrado em 760 nm, pico negativo centrado em 820 nm e pico positivo centrado de magnitude em 900 nm. Estes picos resultam da capacidade de ressonância localizada e deslocalizada do sensor. [0058] No lado direito do gráfico, as intensidades dos picos (suas áreas, respectivamente) aumentam com a concentração de glicereol. No lado esquerdo, a porção do espectro de 450 nm a 700 nm permanece substancialmente inalterada, porém, o que é mais importante, ela não revela qualquer condição de ressonância devido à configuração específica que foi selecionada (propriedades da grade, ângulo de trabalho e comprimento de onda).

[0059] Assim, a variação do índice refrativo induzida pelas amostras em contato com a superfície do sensor apresenta sinais mensuráveis que podem ser observados na região 750-1050 nm em que ocorre a ressonância. Por outro lado, na região 450-700 nm as intensidades refletidas e medidas não variam devido à ressonância e podem ser utilizadas para monitorar as flutuações devido aos efeitos estranhos, isto é, artefatos, tais como: variações de temperatura; instabilidades da fonte de luz; instabilidades do fluxo líquido na superfície do sensor; choques; etc.

[0060] Como consequência, o monitoramento contínuo ou regular desta região do espectro que não aciona o SPR pode ser utilizado para detectar a variação pontual ou instantânea do deslocamento do sinal, podendo também ser utilizado para corrigir o sinal medido da luz refletida na variação de ressonância, como explicado abaixo.

[0061] Embora o espectro mostrado na Fig. 2 seja obtido com iluminação de luz branca, como mencionado, é possível utilizar, de forma vantajosa, simplesmente dois LEDs para realizar a mesma análise: uma para

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19/29 acionar o SPR e obter um sinal significativo em tomo de 900 nm e outra para monitorar flutuações em tomo de 525 nm. Esta possibilidade é ilustrada na Fig. 2 com os retângulos etiquetados LED1 e LED2, respectivamente, cada LED cobrindo uma respectiva largura de banda do espectro. Assim, o LED emite o feixe de luz de teste incidente, ao mesmo tempo em que o LED 2 emite o feixe de luz de referência incidente.

[0062] Embora não utilizado neste caso, o LED 1’ constitui outra possibilidade em relação ao feixe de luz de teste. Na verdade, a condição de ressonância plasmônica na superfície também pode ser determinada, de forma vantajosa, ao monitorar a diferença entre o pico “positivo” medido (isto é, 900 nm) que aumenta, enquanto a condição de acoplamento de luz do SPR se altera na superfície do sensor, e o pico “negativo” observado (isto é, em 820 nm), que aumenta na direção oposta a do pico positivo observado, enquanto a condição de acoplamento de luz do SPR se altera na superfície do sensor. O monitoramento das diferenças entre estes picos mais baixos e mais altos permite melhorar a sensibilidade do método de detecção. Neste caso, é possível utilizar dois LEDs por condição de ressonância; no presente caso, dois LEDs para a ressonância deslocalizada e dois LEDs para a ressonância localizada.

[0063] É observado a seguir que a banda do LED 1 e a banda do LED podem ser separadas por uma frequência intermediária (MRF), podendo corresponder à frequência de ressonância máxima do SPR na superfície do sensor.

[0064] Além disso, ao utilizar fontes monocromáticas, é preferido empregar o CCD como detector ao invés do espectrômetro. O CCD integra toda a luz vinda da amostra dentro da largura de banda dos LEDs e, normalmente, integra e calcula a média do sinal em relação ao tempo. Outra vantagem principal de utilização do detector CCD é sua resolução espacial, para que o mapa da superfície seja obtido na detecção do sinal localmente

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20/29 dependente na superfície de sensor; podem ser realizados testes multiplexados com a superfície do sensor preparada de forma apropriada. [0065] Em relação à Fig. 2, os valores traçados são indicativos da variação das intensidades monitoradas do feixe de luz de referência, isto é, em iluminação com o LED 2, em relação às mesmas amostras como na Fig.

1. O eixo y, neste caso, indica, de forma corrente, os valores ponderados pela frequência da variação das intensidades dentro da banda espectral LED 2 que podem ser calculados como a área do espectro dentro da largura de banda do LED2 dividido pela largura de banda. O eixo x indica a variação do índice refrativo expresso em unidades do índice refrativo (RIU). Como pode ser visto, os valores y aumentam até as variações do índice refrativo de 0,01 RIU, diminuindo ligeiramente. Embora não houvesse aparentemente variação sensível nesta largura de banda na Fig. 1, neste caso é possível observar que a flutuação ocorreu. Isto é possível devido ao aquecimento do sistema e à subsequente estabilização do sistema, tomando claro que ela é independente da alteração do índice refrativo na superfície do sensor. A variação é consistente até 1% e, particularmente, em relação às alterações mais baixas do índice refrativo em que o sinal é pequeno.

[0066] Desta forma, como pode ser deduzido da Fig. 2, o monitoramento da intensidade refletida do feixe de luz de controle/referência, com comprimento de onda que não aciona o SPR, permite detectar a ocorrência de artefatos. Porém, na verdade, o monitoramento da luz de referência refletida também permite corrigir os valores obtidos na iluminação de luz de teste, melhorando a qualidade e a sensibilidade, bem como o limite de detecção do método, o que é explicado a seguir com referência à Fig. 3.

[0067] Fig. 3 apresenta duas séries de pontos, uma série (a) sendo conectada aos artefatos, utilizando o monitoramento do sinal de referência, e outra série (b) sendo não corrigida. Os pontos são valores de teste

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21/29 ponderados pela frequência das intensidades medidas do feixe de luz de teste que foram obtidos com a integração dos sinais medidos na largura de banda do LED 1. Entretanto, em relação à série de pontos corrigidos, o valor ponderado pela frequência correspondente, obtido com a integração da luz medida no LED 2 de referência, é subtraído do valor do teste ponderado pela freqüência inicialmente obtido. Ao fazê-lo, as flutuações devidas aos artefatos são levadas em conta, e medições errôneas podem ser evitadas.

[0068] Como pode ser visto, uma linha reta apresenta melhor ajustamento à série de pontos corrigidos (a) do que aquela de pontos não corrigidos (b). A correção é, particularmente, eficaz em relação às variações mais baixas do índice refrativo em que o sinal de ruído é mais baixo.

[0069] Como é compreendido pelos conhecedores da técnica, o ajuste linear corrigido pode ser utilizado de forma vantajosa como curva de calibração para determinar o índice refrativo da amostra.

[0070] Uma modalidade preferida do sistema de detecção SPR 50 adaptada para executar o presente método é ilustrada esquematicamente na Fig. 4. Este sistema de detecção SPR 50 é, particularmente, adaptado para aplicações em biosensores devido à estrutura do seu sensor 52 que compreende ligantes ou outras partes enfocadas fixadas na superfície de detecção 54. Dependendo das partes enfocadas, o biosensor pode ser projetado para analisar uma variedade de amostras, isto é, medir a concentração de moléculas químicas ou bioquímicas específicas em soluções como sangue, urina ou água, etc. O presente sistema de detecção 50 é compacto e pode ser facilmente instalado e transportado em relação a várias aplicações, isto é, para medir parâmetros médicos em um ponto de atendimento, detectar e quantificar a contaminação de sangue e água ou detectar explosivos, substâncias de contaminação ou tóxicas na atmosfera, etc.

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22/29 [0071] O biosensor 52 apresentar uma superfície de sensor que forma a camada de detecção e construída como uma nanograde periódica em ouro configurada para permitir a geração do SPR, em particular SPR localizado e deslocalizado. Como é sabido, o SPR localizado corresponde às ondas eletromagnéticas fixas na superfície que são confinadas para definir regiões na superfície do sensor, enquanto que o SPR deslocalizado corresponde às ondas eletromagnéticas fixas na superfície que não são confinadas a estas regiões definidas na superfície do sensor. A superfície do sensor 54 está localizada na parte superior do substrato transparente 56 que é capaz de transmitir luz, permitindo seu processamento em modo de reflexão pela parte posterior do sensor 58.

[0072] Vários métodos possíveis de fabricação, como o sensor 52, são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o substrato transparente 56 consiste em um vidro transparente ou polímero transparente, por exemplo, poliestireno transparente. A camada da superfície do sensor 54 é, preferivelmente, fabricada com o depósito de uma camada de ácido poliacrílico (ppAA) sobre um substrato de vidro 56 e uma camada subsequente de esferas de poliestireno (PS). As camadas de ppAA e PS são impressas com plasma 02 para formar uma estrutura de grade que compreende pilares regularmente espaçados de ppAA separados por uma distância sub-micrométrica. O ouro, em seguida, é depositado sobre os pilares para preencher as falhas entre os pilares vizinhos, e o restante da máscara de OS é removido, obtendo uma nanograde periódica em ouro. Outros materiais possíveis dos pilares dielétricos são o poliestireno ou polimetil-metacrilato, etc. Ao invés do substrato de vidro, é possível utilizar substrato polimérico, isto é, feito de PS ou PMMA, ou outro material transparente, que permite a impressão direta do substrato para formar os pilares.

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23/29 [0073] Como é compreendido a seguir, as propriedades geométricas e físicas da estrutura padronizada da superfície do sensor determinam as condições de ressonância plasmônica na superfície (acoplamento da ressonância) na superfície do sensor, em particular as frequências plasmônicas na superfície, e a freqüência de acionamento máximo do SPR, determinando o efeito ótico de acionamento do SPR na superfície do sensor. [0074] O sinal de referência 58 indica uma camada muito fina de material anticrustante, isto é, hidrogel anticrustante, nomeadamente polietilenoglicol. Como é sabido, o material anticrustante atua de forma antiaderente para impedir ou reduzir interações indesejadas, como a absorção não específica de moléculas químicas ou bioquímicas, etc. na superfície do sensor. Isto reduz sinais de ruído que podem ter sido causados pela interação ou fixação de moléculas químicas ou bioquímicas indesejadas na superfície do sensor.

[0075] Na parte superior desta camada anticrustante 58 existe um microarranjo 60 de partes enfocadas, isto é, ligantes ou moléculas fixas de forma organizada na camada anticrustante que fixa ou imobiliza biomoléculas específicas ou outros analitos de interesse na amostra líquida contatado com a superfície do sensor. Estas partes enfocadas podem compreender antígenos/anticorpos, enzimas, proteínas, oligonucleótidos, etc. As partes enfocadas podem ser facilmente fixas na camada anticrustante com micro pontos que permitem uma ampla variedade de configurações da matriz, variando o tamanho dos pontos e os tipos de partes enfocadas. Esta técnica de micro pontos é descrita, por exemplo, no artigo “Fabrication and characterization of protein arrays for stem cell patteming”, de Laura Ceriotti et al, publicado em Soft Matter, 2009, 5, 1-12.

[0076] Com referência mais geral à configuração ótica do sistema do SPR 50, ela compreende uma fonte do feixe de luz de teste 62 e uma fonte do feixe de luz de referência 64. A fonte do feixe de luz de teste 62 e a fonte

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24/29 do feixe de luz de referência 64 compreendem, preferivelmente, cada uma, um diodo de emissão de luz (LED) ou laser. A fonte do feixe de luz de teste 62 é configurada para emitir um feixe de luz de teste 62a que tem uma ou mais frequências correspondentes a uma ou mais frequências permitidas do SPR na superfície do sensor 10, para acionar a ressonância. Preferivelmente, a fonte do feixe de luz de teste 62 é configurada para emitir um feixe de luz de teste 62a em, pelo menos, uma banda de emissão espectral, cobrindo, pelo menos, uma banda espectral permitida do SPR na superfície do sensor 54, semelhante ao LED 1 da Fig. 1.

[0077] Por contraste, a fonte do feixe de luz de referência 64 é configurada para emitir um feixe de luz de referência 64a de uma ou mais frequências que não correspondem às frequências permitidas do SPR na superfície do sensor 54, para não acionar o SPR. Preferivelmente, a fonte do feixe de luz de referência 64 é configurada para emitir um feixe de luz de referência 64a em, pelo menos, uma banda de emissão espectral remota das frequências permitidas do SPR na superfície do sensor 54. Por exemplo, a fonte do feixe de luz de referência 64 pode ser configurada para emitir luz de referência que cobre uma banda espectral cujos limites espectrais estão na posição espectral com, pelo menos, o dobro da distância do Comprimento Integral na Metade Máxima (FWHM) da Ressonância Plasmônica da Superfície do pico de Ressonância Plasmônica da Superfície.

[0078] Quando há mais de um pico de SPR (isto é, caso haja picos localizados e deslocalizados), a distância entre o pico de ressonância e o feixe de referência é calculada em relação ao pico de SPR mais próximo. Além disso, é possível considerar selecionar o feixe de referência com uma distância de, pelo menos, 2 a 4 vezes mais próxima do pico do SPR.

[0079] Deve ser observado que, na operação da posição espectral do feixe de referência, é possível impedir o acionamento das ressonâncias plasmônicas na superfície.

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25/29 [0080] Convencionalmente, em testes do SPR, o princípio consiste em ser capaz de detectar pequenas alterações no índice refrativo. E, neste caso, isto significa detectar as alterações em relação ao índice refrativo do meio que contém as biomoléculas ou outros agentes a serem detectados.

[0081] Deve ser levado em conta, porém, que, como já explicado, a posição espectral das ressonâncias plasmônicas da superfície (localizadas e deslocalizadas) é unicamente determinada pela estrutura da nanograde e do índice de refração do meio que contém as biomoléculas ou outros agentes a serem detectados.

[0082] Quando ocorre o reconhecimento na superfície do sensor, o SPR se altera no espectro pela quantidade, que é compreendida entre o limite de detecção do sistema (alteração mínima do espectro detectável) e o FWHM de cada ressonância plasmônica na superfície.

[0083] Assim, a seleção de um feixe de referência que tem banda espectral remota do SPR e que tem, nomeadamente, sua extremidade de largura de banda mais próxima com, pelo menos, o dobro do FWHM do pico do SPR, impede o acionamento das substâncias plasmônicas na superfície do pico do SPR, então monitorada pelo feixe de teste.

[0084] Com referência mais específica a presente variante, que tem uma superfície no sensor do SPR de superfície nanoestruturada, é possível observar que a posição espectral da estrutura de ressonância, utilizada como sonda sensível, depende dos parâmetros estruturais da superfície nanoestruturada e, em particular, do tamanho e da forma dos pilares poliméricos. Na verdade, a ressonância corresponde ao modo de oscilação da carga que tem o campo elétrico máximo dentro da área de superfície do pilar e próximo a sua parte superior. Neste momento, isto é devido à forma peculiar do pilar truncado em cone e à borda fina e circular correspondente formada pelo ouro na parte superior.

[0085] O efeito desta conformação é duplo:

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26/29 [0086] - O campo elétrico está localizado e ampliado bem na parte superior do pilar, ou seja, onde é mais elevada a probabilidade de serem fixadas as moléculas do analito;

[0087] - A forma cônica e o índice refrativo do substrato, que permite este modo plasmônico, podem ser facilmente acoplados às oscilações plasmônicas em ouro na lateral do substrato, tomando a ampliação do campo particularmente eficaz quando acionado pela parte posterior.

[0088] Em uma distância espectral suficiente deste tipo de ressonância (o dobro do seu FWHM é um bom espaçamento), a alta sensibilidade relacionada à configuração peculiar deste campo é perdida pelas seguintes razões: a distribuição espacial no campo elétrico é alterada, apresentando seus valores máximos em diferente locais nas duas superfícies (frontal ou posterior), ou na parte interior do pilar (onde as moléculas do analito podem ser detectadas), ou não é permitida qualquer combinação dos modos pelos pilares, não sendo o acionamento do campo ampliado transmitido para a região sensível.

[0089] Naturalmente, na seleção de um feixe de referência localizado com o dobro do FWHM do pico do SPR em monitoramento, é possível observar as propriedades óticas na superfície do sensor, as quais não estão, propositalmente, relacionadas à ressonância plasmônica sustentada pela superfície.

[0090] Embora utilizado, neste caso, em razão do exame ser realizado em ângulo fixo de incidência, é possível variar o ângulo de incidência do feixe de referência para iluminar a amostra em condições de não acionamento do SPR.

[0091] Como pode ser visto na FIG. 4, o feixe da luz de teste 62a e o feixe da luz de referência são direcionados para a superfície do sensor 54 via configuração ótica que pode compreender, por exemplo, um acoplador ótico 66, um separador de feixe 68 e um sistema de lentes 70. O acoplador ótico

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27/29 é configurado para controlar a transmissão alternativa ou simultânea do feixe da luz de teste 62a e do feixe da luz de referência 64a em direção à superfície do sensor 54. O sistema de lentes 70 é utilizado para transmitir os feixes da luz de referência e da luz de teste 62a, 64a, para iluminar, de forma homogênea, a superfície do sensor 54. É observado que o feixe da luz de teste 62a e/ou o feixe da luz de referência 64a podem iluminar a superfície do sensor 10 em vários ângulos de incidência, porém, na presente configuração, o ângulo de incidência é fixo. Devido à configuração, os feixes da luz de referência e da luz de teste atingem a camada sensível com o mesmo ângulo de incidência fixo.

[0092] Como é observado na FIG. 4, os feixes da luz de referência e da luz de teste 62a, 64a são direcionados para a superfície do sensor 54 pelo substrato transparente 56, onde eles são refletidos na lateral da superfície do sensor 54 que faz interface com o substrato transparente 56. É observado que a luz refletida nesta lateral interna da superfície do sensor 52 não interfere ou se dispersa na amostra que está sobre o microarranjo. O reflexo interno, isto é, da parte posterior 58, é vantajoso no sentido de impedir interferência da transmissão de luz devido à amostra e à estrutura do microarranjo. Os feixes de luz refletidos na superfície do sensor são direcionados via separador de feixe 68 até um fotossensor 72. O fotossensor 72 é adaptado para medir a intensidade ou quantidade indicativa deste, como as intensidades espectrais, a absorvência, a refletância, a refletividade, etc. É observado que o fotossensor 72 é também adaptado para monitorar a intensidade do feixe da luz de teste 62a, em particular do valor ponderado pela frequência ou tempo deste, em uma ou duas dimensões, permitindo, desta forma, por exemplo, a detecção simultânea de várias alterações locais na condição de acoplamento de luz do SPR na superfície do sensor 54. Vantajosamente, o fotossensor 72 pode ser adaptado para propiciar uma imagem uni ou bidimensional da intensidade medida ou monitorada. É

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28/29 observado que a operação uni ou bidimensional do fotossensor 72 permite, por exemplo, a detecção simultânea de várias moléculas diferentes de interesse que interagem com a fixação ou se fixam na superfície do sensor 54. Este fotossensor de imagens uni ou bidimensional SPR 72 permite a análise elevada de eventos químicos ou bioquímicos na superfície do sensor 54, permitindo, também, a redução do custo médio por teste do sistema de detecção.

[0093] Em uma modalidade preferida, o fotossensor 72 compreende, preferivelmente, uma câmera de resolução de tempo e/ou espectro baseada em um dispositivo de carga acoplada (CCD) e uma estrutura de fotodiodo para medir a intensidade do feixe da luz de teste 62a e detectar alterações de intensidade do feixe da luz de referência refletido 64a. Preferivelmente, esta câmera é adaptada para solucionar um sinal medido em intervalos de curto espaço de tempo que, normalmente, estão na variação de milissegundos. Mais preferivelmente, esta câmera também pode emitir sinais indicativos de medições sucessivas de intensidades ponderadas pela frequência e/ou tempo do feixe da luz de teste 62a e/ou do feixe da luz de referência 64a. A câmera também pode ser adaptada para medir as intensidades espectrais do feixe da luz de teste refletido 62a e emitir um sinal indicativo da medição de uma intensidade espectral média, isto é, indicativa do valor significativo das intensidades espectrais medidas ou do sinal indicativo destas.

[0094] Os sinas que correspondem às intensidades monitoradas dos feixes da luz de referência e os sinais que correspondem às intensidades medidas do feixe da luz de teste são transmitidos para um processador 74. Vantajosamente, o processador 74 permite detectar a ocorrência do acionamento do SPR ao detectar a redução graduada na intensidade refletida e medida da luz de teste e, em particular, ao detectar uma diminuição no espectro da intensidade medida do feixe da luz de teste refletido 62a causado pela absorção da luz na superfície do sensor 542. É observado que a

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29/29 intensidade medida do feixe da luz de teste 62a também pode ser indicativa da intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido do feixe da luz de teste ou da alteração deste.

[0095] Além disso, o fotossensor 72 é adaptado para detectar a alteração na intensidade refletida e monitorada do feixe da luz de referência 64a, em particular a alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, alteração no monitoramento da intensidade espectral, alteração na absorvência monitorada, alteração na refletância ou refletividade monitorada, etc., do feixe da luz de referência 64a, como refletido pela superfície do sensor 52, para determinar a ocorrência de um artefato.

[0096] O processador 74 é configurado para processar, em particular filtrar as medições do fotossensor 72. Este processador 74 é, preferivelmente, programado para corrigir as intensidades medidas do feixe da luz de teste 62a, da forma descrita acima, e estimar a alteração no índice refrativo na superfície do sensor da forma descrita acima.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de detecção por Ressonância Plasmônica na Superfície (SPR) compreendendo as etapas abaixo:

apresentar um sensor SPR (52) que compreende uma superfície do sensor de suporte SPR (54);

contatar uma amostra a ser analisada com a superfície do sensor (54) e monitorar, pelo menos, uma condição de ressonância na superfície do sensor (54) de suporte SPR ao iluminar a superfície do sensor (54) com um feixe de luz de teste de acionamento do SPR (62a) e detectar o feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido;

determinar, pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido;

caracterizado por iluminar a superfície do sensor (54) com um feixe de luz de referência (64a) em condições selecionadas, de modo a não acionar o SPR na superfície do sensor (54) e detectar a intensidade do feixe de luz de referência (64a) refletido ou transmitido em que a determinação de, pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido leva em consideração a intensidade detectada do feixe de luz de referência (64a) refletido ou transmitido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido ser filtrado ou corrigido com base na intensidade detectada do feixe de luz de referência (64a) refletido ou transmitido.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo valor indicativo de deslocamento do desvio da intensidade detectada do feixe de luz de referência (64a) com respeito aos dados de referência serem determinados e pelo valor de deslocamento ser

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2/5 utilizado na determinação de, pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos dados de referência ser indicativos da intensidade previamente monitorada de, pelo menos, um feixe de luz de referência (64a) e pelo valor de deslocamento ser indicativo do desvio da intensidade monitorada com respeito à intensidade previamente monitorada.
5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo valor de deslocamento ser utilizado para concluir a ocorrência de um artefato da propriedade de luz medida e pela propriedade de luz medida ser examinada para fins de correção ou incorreção com base na ocorrência de um artefato.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 5, caracterizado pela propriedade de luz medida de, pelo menos, um feixe de luz de teste ter a intensidade medida, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou alteração da intensidade medida, em particular uma alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de teste.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 6, caracterizado pela utilização do valor de deslocamento, para corrigir a intensidade medida, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou alteração da intensidade medida, em particular uma alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo valor de deslocamento ser indicativo da amplitude de variação do feixe de luz de referência (64a) refletido ou transmitido e por, pelo menos, uma

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3/5 propriedade do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido no valor de intensidade obtido com o substrato do valor de deslocamento em relação ao valor da intensidade medida do do feixe de luz de teste (62a) refletido ou transmitido.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pela superfície do sensor (54) compreender uma nanograde periódica de material nobre.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelas partes enfocadas serem fixadas na superfície do sensor (54), que exibem especificidade vinculada aos analitos visados, as partes enfocadas sendo, preferivelmente, organizadas como microarranjos (60).
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo feixe de luz de teste (62a) e feixe de luz de referência (64a), cada um dos quais sendo produzido por uma respectiva fonte de luz monocromática (62, 64).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado por cada condição de ressonância ser monitorada com o uso de, pelo menos, dois feixes de luz de teste (62a) centrados nas respectivas posições espectrais de acionamento do SPR.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo feixe de luz de referência (64a) emitir luz de referência que cobre uma banda espectral cujos limites espectrais estão em uma posição central distante de, pelo menos, o dobro da Largura Integral na Metade Máxima da Ressonância Plasmônica da Superfície do Pico de Ressonância Plasmônica da Superfície.
14. Sistema de detecção por Ressonância Plasmônica na Superfície (SPR) (50) que compreende:

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4/5 sensor SPR (52) que compreende uma superfície do sensor de suporte SPR (54); pelo menos, uma fonte de luz de teste (62) que emite, pelo menos, um feixe de luz de teste (62a), para iluminar a superfície do sensor (54) em condições selecionadas, de modo a acionar o SPR na superfície do sensor (54), um fotosensor (72) para medir a propriedade de luz de, pelo menos, um feixe de luz de teste (62a) como transmitido ou refletido pela superfície do sensor (54), para monitorar a condição de ressonância na superfície do sensor (54), caracterizado por pelo menos, uma fonte de luz de referência (64) que emite, pelo menos, um feixe de luz de referência (64a) para iluminar a amostra em condições selecionadas, de modo a não acionar a ressonância plasmônica da superfície na superfície do sensor (54), em que o fotosensor (72) é também adaptado para monitorar a intensidade de, pelo menos, um feixe de luz de referência (64a) como transmitido ou refletido pela superfície do sensor (54), e meio processador (74) configurado para determinar, pelo menos, uma propriedade do feixe de luz de teste (62a) transmitido ou refletido, levando em conta a intensidade detectada do feixe de luz de referência (64a) transmitido ou refletido.
15. Sistema de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo feixe de luz de referência (64a) emitir luz de referência que cobre uma banda espectral cujos limites espectrais estão em uma posição espectral distante de, pelo menos, o dobro da Largura Integral na Metade Máxima da Ressonância Plasmônica da Superfície do Pico de Ressonância Plasmônica da Superfície.
16. Sistema de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fotosensor (72) ser adaptado para medir intensidade, em particular uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou alteração da intensidade, em particular uma alteração na

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5/5 intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, de, pelo menos, um feixe de luz de teste (62a) como transmitido ou refletido pela superfície do sensor (54).
17. Sistema de acordo com as reivindicações 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fotosensor (72) ser adaptado para monitorar intensidade, preferivelmente uma intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido de, pelo menos, um feixe de luz de referência (64a), como refletido ou transmitido pela superfície do sensor (54), e pelos meios processadores (74) serem configurados para utilizar o valor de desvio para corrigir a intensidade medida e a intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido, ou a alteração desta.
18. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 17, caracterizado pelo meio processador (74) ser conectado operacionalmente ao meio armazenagem para armazenar ou ler os dados de calibração em que o meio processador (74) é adaptado para estimar a alteração no índice refrativo na superfície do sensor (54) ao comparar os dados de calibração com a alteração na intensidade medida, em particular com uma alteração na intensidade média ponderada pela freqüência ou pelo tempo medido de, pelo menos, um feixe de luz de teste (62a).
19. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 14 a 18, caracterizado por, pelo menos, uma fonte do feixe de luz de teste (62) ser uma fonte de luz monocromática com emissão em uma ou mais freqüências, que combinam com uma ou mais freqüências do SPR na superfície do sensor (54), para acionar o SPR e por, pelo menos, uma fonte do feixe de luz de referência (64) ser uma fonte de luz monocromática configurada para emissão em uma ou mais freqüências, que não combinam com uma ou mais freqüências do SPR na superfície do sensor (54), de modo a não acionar o SPR.