BRPI1004299B1 - composição inibidora da atividade da proteína mrp1, método de inibição da atividade da proteína mrp1, método de tratamento de desordens proliferativas e método de tratamento de tumores - Google Patents

Abstract

composição inibidora da atividade da proteína mrp1, método de inibição da atividade da proteína mrp1, método de tratamento de desordens proliferativas e método de tratamento de tumores. esta invenção pertence à área farmoquímica e refere-se a uma composição inibidora da atividade da proteína mrp1 contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos isolados ou não isolados, que pode ser empregada de forma sozinha ou associada aos quimioterápicos pertencentes ao estado da técnica; essa invenção também se refere ao método de inibição da atividade de proteínas mrp1, ao método de tratamento e/ou prevenção de desordens proliferativas tais como tumores resistentes a múltiplas drogas (mdr).

Description

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos não isolados ou isolados, com capacidade de inibir a proteína associada à resistência a múltiplas drogas, a qual é expressa em diversas linhagens tumorais e diferentes tipos de microorganismos. São descritos ainda métodos para o tratamento de tumores e para o tratamento de desordens proliferativas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A expressão do fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) é um dos principais empecilhos no sucesso da quimioterapia do câncer. A observação de que cerca de 50% dos pacientes que inicialmente respondem a quimioterapia recidivam e morrem por metástases generalizadas, tem sido atribuída ao desenvolvimento do fenótipo MDR. Clinicamente, a MDR é definida pela resistência cruzada a diversos quimioterápicos não relacionados, que divergem entre si quanto à estrutura, modo de ação e alvo celular. Portanto, a maioria dos medicamentos disponíveis é ineficaz contra tumores que expressam esse fenótipo. Além do câncer a expressão do fenótipo MDR também pode ser responsável pela resistência ao tratamento em outras doenças como infecções bacterianas, fúngicas e parasitárias (T.cruzi, leishmania, malária, etc).

Embora a MDR possa ser mediado por vários mecanismos, um dos mais estudados é o resultante da superexpressão de glicoproteínas pertencentes à superfamília ABC de transportadores como as glicoproteínas P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1 e BCRP/ABCG2. Estas proteínas funcionam como bombas de extrusão, diminuindo a concentração intracelular do quimioterápico e impedindo que ele atinja sua concentração letal.

Drogas empregadas no tratamento de diferentes tipos de neoplasias como o etoposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina e topotecan interagem com

2/19 as proteínas P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1 e BCRP/ABCG2 que as transportam para o meio extracelular impedindo desse modo, que as drogas atuem sobre seu alvo intracelular. Portanto a inibição da atividade dessas proteínas pode ser útil no tratamento de doenças cuja resistência é mediada pela expressão do fenótipo MDR.

A busca de inibidores das proteínas MDR, iniciada após a descoberta da P-gp/ABCB1 em 1976, continua sendo de grande interesse para a indústria farmacêutica. Entretanto, além da maioria dos inibidores serem ativos contra a P-gp/ABCB1, eles também são capazes de interagir com outras proteínas ABC. Assim, numa revisão publicada recentemente (Sharon, 2008) foi mostrado que a P-gp/ABCB1 pode ser inibida por uma série de compostos tais como verapamil, ciclosporina A, tamoxifem, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar e ontogen. A MRP1/ABCC1 pode ser inibida pelo biricodar e ο MK571 enquanto elacridar, pantoprazol, tariquidar, biricodar, gefitinibe, imatinibe e quercetina inibem a BCRP/ABCG2.

No estado da técnica é amplamente conhecida a utilização de compostos e abordagens visando inibir o fenótipo MDR. O pedido de patente W02008093331, por exemplo, descreve anticorpos conjugados capazes de inibir a ação de proteínas da família ABC, revertendo assim, a resistência a múltiplas drogas.

O documento W02008105872 descreve uma composição farmacêutica contendo um xanteno e um quimioterápico pertencente ao estado da técnica voltada para o tratamento de tumores MDR.

O pedido de patente WO01036477 reivindica um método de inibição dos transportadores ABC por peptídeos análogos aos domínios peptídicos transmembrana das proteínas do sistema ABC, descrevendo peptídeos análogos às proteínas P-gp, MRP1, MRP2 e outras.

As patentes US6376514, US7135483 e US7476680, pertencentes à mesma família de patentes, descrevem compostos químicos contendo 6 heterocíclos substituídos capazes de inibir as proteínas P-gp e MRP1.

A empresa Ely Lilly Company é detentora de uma série de documentos de patentes relativos a compostos tricíclicos capazes de inibir a ação da glicoproteína MRP1, revertendo assim o fenótipo MDR. Dentre estes documentos de patente citamos os pedidos internacionais W00200624,

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WO0196346, CZ20003689, CZ20003688, WO9951228 e WO9951227, os dois últimos possuem pedidos de patente brasileiros correspondentes, a saber, o PI9910112-2 e PI9909497-5 respectivamente.

Por último citamos o documento de patente US20020016293 que descreve o uso do flavopiridol capaz de inibir proteínas das famílias ABCC1, ABCB1, ABCB2, além de outras proteínas indutoras do fenótipo MDR.

Na literatura científica, Rocha et al (Bioorg. Med. Chem. 15:7355, 2007) trabalhando com diversos triterpenos isolados da planta Cecropia lyratiloba, mostrou que esses compostos apresentavam toxidez semelhante para linhagens leucêmicas sensível e resistente a múltiplas drogas.

Fernandes e Gattass (J. Med. Chem. 52: 1214, 2009) trabalhando na elucidação dos mecanismos de transporte das proteínas da família MRP1/ABCC1 demonstraram que esta proteína é capaz de transportar moléculas com tamanhos entre 170 a 216 Angstrons de TPSA (área da superfície polar topológica) sendo, entretanto incapaz de transportar moléculas com valores de TPSA reduzidos. Os dados utilizados foram obtidos de trabalhos realizados com quimioterápicos usuais e moléculas pertencentes ao estado da técnica como a glutationa s-transferase (GST) e outras.

No entanto, até hoje, nenhum composto inibidor específico para os transportadores ABC foi aprovado para uso clínico. As características mais procuradas nos inibidores de proteínas MDR são a capacidade de reverter a resistência aos quimioterápicos comumente em uso na clínica e a alta especificidade para as células tumorais que expressam a proteína MDR. Diferentemente da P-gp, para a qual já foram identificados numerosos inibidores, apenas um pequeno número de compostos mostrou especificidade para a MRP1 e destes, apenas o VX-710 (biricodar) ainda está em testes clínicos (Sharon, 2009). A ausência de inibidores específicos para a MRP1 também é um empecilho na caracterização do mecanismo de transporte de drogas por essa proteína e, consequentemente, no desenvolvimento de drogas capazes de reverter esse transporte. A presente invenção visa solucionar estes problemas pertencentes ao estado da técnica.

SUMÁRIO DA INVEÇÃO

O primeiro objeto desta invenção trata de uma composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, que compreende uma quantidade

4/19 farmaceuticamente eficaz de um ou mais compostos inibidores da atividade da MRP1 e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

O segundo objeto da presente invenção trata da composição antitumoral contendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de compostos inibidores da proteína MRP1 em associação a um composto antiproliferativo e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis voltado para o tratamento de desordenes proliferativo em um animal mamífero.

A presente invenção também se refere ao método de inibição da atividade da proteína MRP1 da família MRP/ABCC, baseado na administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de composto inibidor da MRP1 em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa.

É ainda um objeto da invenção um método de tratamento de desordens proliferativas baseado na administração de uma composição inibidora da MRP1 em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa.

O último objeto da invenção refere-se ao método de tratamento de tumores baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora da MRP1 e um composto antiproliferativo em um animal mamífero.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Efeito de diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de rhodamina 123 pela Lucena 1. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).

Figura 2. Efeito de 50pg/ml de verapamil (VP), MK571 ou de 25pg/ml de ácido euscáfico (EA), tormentico (AT), 2acetiltormentico (2AT), 3acetiltormentico (3AT), isoarjunólico (ISO), partição (PT) e extrato (EXT 1:500) sobre o acúmulo de rhodamina 123 pela Lucena 1. Resultados expressos como razão do acumulo na presença do tratamento em relação ao controle.

Figura 3: Comparação do efeito do 3AT e verapamil sobre diferentes linhagens celulares. 3A - Efeito do 3AT sobre o acúmulo de rhodamina sobre a linhagem celular lucena 1. FIGURA 3B. Efeito do 3AT sobre o acúmulo de rhodamina 123 sobre a linhagem celular K562/DOX. Foram empregados 25pg/ml do 3AT em comparação com o 50 pg/ml de verapamil.

Figura 4. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 e diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela linhagem celular

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B16/F10. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).

Figura 5. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 com o efeito de 25pg/mL 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela linhagem celular GBV. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).

Figura 6. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 e diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela A549.

Figura 7: Efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1/ABCC1 na linhagem B16F10. Células foram plaqueadas e tratadas com meio (controle) ou 12.5pg/mL de 3AT por 48h. A fluorescência intracelular foi medida por citometria de fluxo.

Figura 8: Comparação entre o efeito de 50pg/ml de MK571 e 25pg/ml de cada um dos seguintes triterpenos: ácido euscáfico (EA), tormentico (AT), 2acetiltormentico (2AT), 3-acetiltormentico (3AT), isoajurnólico (ISO), partição (PT) e extrato (EXT 1:500) sobre o acúmulo de CFDA pela B16F10.

Figura 9: Percentual de viabilidade celular em um experimento com o triterpeno 3-acetil tormentico (3AT) sobre linfócitos normais estimulados com PHA 5pg/ML. Dados demonstrando % de células vivas.

Figura 10: Inibição da viabilidade celular em células HL60.

Figura 11: Inibição da viabilidade celular em células A549.

Figura 12: Inibição da viabilidade celular em células GBV.

Figura 13: Inibição da viabilidade celular em células B16/F10. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Somente para fins desta invenção teceremos algumas definições com o intuito de auxiliar a definição mais objetiva dos objetos descritos. Inicialmente, o termo “inibir” ou “inibição” são empregados com o significado de impedir, aliviar ou atenuar a ação, restringir ou abrandar especificamente a ação extrusora de uma proteína causadora da resistência a múltiplas drogas em células proliferativas.

Desordem proliferativa pode ser qualquer distúrbio ou disfunção relacionada à multiplicação indesejada de células no organismo de um animal mamífero, incluindo o ser humano, podendo ser relacionada à multiplicação

6/19 indesejada de células de parasitas uni- ou pluricelulares, bem como à proliferação indesejada de células tumorais.

Preferencialmente, para esta invenção, o termo desordem proliferativa refere-se à proliferação indesejada de células tumorais em tecidos, glândulas e/ou órgãos de mamíferos, pertencentes ao grupo compreendido de: sistema nervoso, pele, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestino delgado, intestino grosso, sangue, cérebro. Mais preferencialmente ainda, o termo desordem proliferativa significa a proliferação indesejada de células tumorais no pulmão, rim, bexiga, fígado, pâncreas, estômago, ovário, testículo, sangue, cérebro, pele, ossos e mama.

A composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais compostos inibidores da atividade da MRP1 e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, sendo o dito composto inibidor da MRP1 um ou mais triterpenos isolados ou não isolados, pertencente ao estado da técnica. O triterpeno empregado é um inibidor específico da uma proteína da família MRP1/ABCC1, mais especificamente da MRP1.

Os triterpenos não isolados que podem ser encontrado na dita composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 referem-se a uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um extrato alcoólico da planta Cecropia lyratiloba rico em triterpenos não isolados inibidores da atividade da MRP1. O referido extrato alcoólico encontra-se, neste objeto, associado a adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis formando a dita composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC, sendo a atividade inibidora, mais especificamente observada em proteínas MRP1.

A composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 pode ainda compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2-AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

O efeito inibidor da composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, doravante chamada somente de composição, sobre a proteína

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MRP1 foi confirmado em ensaios onde foram utilizadas linhagens leucêmicas que expressam a proteína P-gp/ABCB1 (Lucena 1 e K562/DOX), linhagens que expressam a MRP1 como a B16F10 e a GBV, além de a linhagem celular A549 que expressa diferentes membros da família MRP/ABCC, mais precisamente, esta linhagem expressa as proteínas MRP1 a MRP5.

A análise do efeito da composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 sobre a expressão das proteínas MDR foi feita por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos para as proteínas P-gp e MRP1. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade da composição em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP (CFDA).

A medição do acúmulo de Rho 123 em células de Lucena 1 e K562/DOX mostrou que o tratamento destas células com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, causava aumento de aproximadamente 5 vezes no acúmulo de Rho 123 citoplasmática, enquanto que o tratamento com a composição ou o extrato causava apenas um pequeno efeito, inferior a 2 vezes, no acúmulo citoplasmático do substrato, indicando que essa composição não tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.

Em experimento realizado com a linhagem celular B16F10, que expressa MRP1, foi demonstrado que o tratamento com a composição induz ao aumento do acúmulo do substrato transportado (CF) ainda maior que o obtido com o tratamento com ο MK571 (inibidor comercial da MRP1), demonstrando um efeito inibidor da composição sobre essa proteína. Resultados semelhantes foram obtidos com a linhagem de glioblastoma multiforme (GBV), um tumor de sistema nervoso central grau IV.

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial da família MRP, resulta em um grande aumento no acúmulo do substrato (CF) em aproximadamente 12 vezes, o tratamento com a composição, objeto desta invenção, só induz um pequeno aumento de acúmulo do substrato sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presentes na A549.

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Como mostrado na tabela 1 o efeito da composição sobre a atividade da proteína MRP1 é ainda maior do que o efeito inibidor da MK571. Portanto, além de não ter efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1, a composição utilizada é um potente inibidor da MRP1.

Os triterpenos, preferencialmente, empregados na composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 desta invenção, pertencem ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos; uma mistura destes triterpenos, ou ao extrato alcoólico de Cecropia lyratiloba. Mais preferencialmente ainda, para esta invenção o composto inibidor da MRP1 é o 3AT e/ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do 3AT.

A quantidade farmaceuticamente eficaz do composto inibidor da MRP1 é aquela quantidade compreendida entre 1 a 1000 μg/ml, preferencialmente entre 10 a 500 μg/ml do composto inibidor da MRP1 desta invenção.

A tabela 1 mostra comparativamente o efeito cumulativo da carboxifluoresceína pela célula após o tratamento de culturas celulares com triterpenos inibidores da MRP1 ou MK571.

Tabela 1: Efeito do triterpeno no acúmulo do substrato para MRP1.

Carregamento	R*
CF	1
CF + MK571 (50 μΜ)	10.45 ± 1.67
CF + triterpeno (11,8 μΜ)	5.56 ± 1.16
CF + triterpeno (23,51 μΜ)	11.35 ± 1.31
CF + triterpeno (47,02μΜ)	20.86 ±3.39

R*: Razão entre o acúmulo de substrato (CF) em células incubadas com meio e em células incubadas com o triterpeno ou o inibidor MK571.

Avaliação da expressão da MRP1 demonstrou que o triterpeno empregado não interfere nos níveis de expressão das proteínas MRP.

Os adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser quaisquer adjuvantes farmacêuticos conhecidos pelos versados nas artes farmacêuticas, como por exemplo: conservantes, flavorizantes, tamponantes, umectantes, solventes, corantes, acidulantes, alcalinizantes, adsorventes, edulcorantes e outros. Os adjuvantes preferencialmente empregados nesta

9/19 invenção são aqueles voltados para obtenção de formas farmacêuticas líquidas, sólidas ou semi-sólidas.

Preferencialmente, a forma farmacêutica desta invenção é liquida ou sólida, podendo ser encontrada na forma de soluções, dispersões, emulsões, suspensões, loções, alcoolatos, alcoolaturas, colutórios, elixires, clisteres, poções, tinturas, ampolas, aeorossóis, comprimidos, cápsulas, drágeas, hóstias, efervescentes, óvulos, implantações, papéis, pérolas, pílulas, pós e supositórios, nanopartículas, mas não limitadas a estas preparações.

A composição inibidora da atividade das proteínas MRP/ABCC desta invenção além de possuir a capacidade de inibir a proteína MRP1, também é capaz de induzir a apoptose de células que expressam essa proteína, provavelmente por ser capaz de ativar a cascata de caspases, que é uma importante via apoptótica.

É ainda um objeto desta invenção, uma composição antitumoral contendo entre 3 a 400pg/ml de compostos inibidores da proteína MRP1 associada a um composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Esta composição antitumoral possibilita a ação sinérgica dos compostos inibidores da proteína MRP1 com o dito composto antiproliferativo, permitindo que sejam aplicadas concentrações menores tanto deste objeto da invenção, como do composto antiproliferativo a ele associado. O sinergismo ocorre, pois, a composição inibidora desta invenção possui a capacidade de sensibilizar tumores que expressam à proteína MRP favorecendo a otimização da absorção dos compostos ativos administradas conjuntamente à dita composição inibidora.

Os compostos inibidores da proteína MRP1 que podem ser empregados neste objeto são triterpenos isolados e não isolados capazes de inibir a ação inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1.

Estes compostos inibidores da MRP1 não isolados que são empregados neste objeto são: o extrato alcoólico da planta Cecropia lyratiloba rico em triterpenos não isolados inibidores da atividade da MRP1 e/ou um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2-AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

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Os compostos antiproliferativos ao quai este objeto se refere são quimioterápicos pertencentes ao domínio público pertencem ao grupo compreendido de: cisplatina, topotecam, irinotecam, vinblastina, vincristina, daunorubicina, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, etoposideo, teniposidio, mitoxantrona, bisantreno, metotrexato, flavopiridol, verapamil, tamoxifen, imatinib, quercetina e gefitinib.

A comprovação do sinergismo ocorrido entre os compostos inibidores da MRP1 e o composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica, pode ser verificada pela tabela 2 que expressa os dados obtidos nos testes realizados utilizando a linhagem B16F10 que é resistente a baixas concentrações de doxorubicina (DOX).

Tabela 2: Tratamento empregando-se a composição inibidora da proteína MRP (composição) sensibiliza a linhagem celular B16F10 ao quimioterápico Doxorubicina ou Co-tratamento de B16F10 com Doxorubicina.

TRATAMENTO	SUB-G1	G1	S	G2
Controle	1,6% ±0,83	59,8% ± 0,28	11,4% ±0,3	16,8% ±0,82
Composição 6,25μg/ml	1,3% ±0,28	59,4% ± 4,24	11,1% ±0,14	17% ±0,35
Composição 12,5pg/ml	1,2% ±0,17	56,5% ± 3,89	11,6% ± 0,85	17,1% ± 1,43
DOX 0,1 μΜ	1,8% ±0,64	54,6% ± 4,81	7,6% ± 0,85	22,3% ± 3,25
Composição 6,25pg/ml + DOX 0,1 μΜ	1,6% ± 0,47	44,1% ±2,69	6,2% ± 0,71	31,9% ±4,03
Composição 12^ig/ml + DOX 0,1 μΜ	1,8% ±0,57	30,4% ± 1,84	5,5% ± 0,42	39,8% ± 3,39

*Células de B16F10 foram co-tratadas com concentrações subletais de 3AT e doxorubicina por 48 horas e a percentagem de células em cada fase do clico celular foi avaliada por citometria de fluxo. Sub-G1 (apoptose), G1 (fase G1), S (fase S), G2M (passagem G2 para M)

Durante o co-tratamento das células B16F10 com doxorubicina e o primeiro objeto desta invenção, foi verificado, utilizando-se um citômetro de fluxo, a indução da parada do ciclo celular desta linhagem na fase de controle G2/M. Esse efeito citostático demonstra que, ao inibir a MRP, o primeiro objeto desta invenção sensibiliza uma linhagem resistente a drogas anti-neoplásicas.

Preferencialmente, esta composição antitumoral emprega entre 3 a 25C^g/ml dos compostos inibidores da proteína MRP1 associada a um composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica. Ainda

11/19 preferencialmente, o composto antiproiiferativo deste objeto da invenção é um quimioterápico empregado no tratamento de neoplasias hematológicas (leucemias, linfomas, mielomas etc), do sistema nervoso, pele, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestinos delgado e grosso, de tecido mole (sarcomas), carcinoma e outros tumores sólidos.

Esta invenção se refere ainda ao método de inibição da atividade de proteínas MRP1, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição inibidora da proteína MRP1, em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa indesejada. O dito método de inibição de proteínas da família MRP1/ABCC1 atua especificamente na inibição da MRP1, objetivando, dessa forma, a diminuição desta proteína que é superexpressa durante o processo de proliferação incontrolada de células tumorais. A composição inibidora empregada no presente método pode conter entre 1 a 1000 pg/ml de um triterpeno isolado ou não isolado capaz de inibir as proteínas MRP1.

Preferencialmente, a composição inibidora deve conter preferencialmente entre 10 a 500 pg/ml de um ou mais triterpenos isolados compreendido dentre o grupo consistido de: o ácido 3-beta acetil tormêntico (3TA); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Ainda preferencialmente, a composição inibidora pode ser consistida d uma concentração compreendida entre 10 a 500 pg/ml de um extrato alcoólico de C. lyratiloba rico em triterpenos não isolados. Mais preferencialmente ainda, a composição utilizada pelo método de inibição da MRP contém entre 10 a 500 pg/ml de um triterpeno isolado, seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Tal método de inibição é mais efetivo e apresenta menos efeitos adversos que os usuais métodos empregados na inibição da MRP1.

Este método para inibir a atividade de proteínas MRP1 não impede a entrada do composto inibidor, bem como, de outros compostos químicos no interior das células. Os efeitos alcançados por este método são primeiramente impedir que tanto o composto inibidor, como os demais compostos químicos que foram absorvidos pela célula sejam expulsos da célula.

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O método de tratamento de desordens proliferativas baseado na administração de uma composição inibidora das proteínas da família MRP1/ABCC1 em um animal mamífero portador de uma desordem resultante da proliferação indesejada de células é também um objeto desta invenção.

Desordem proliferativa pode ser qualquer tipo de neoplasias localizadas em tecidos, glândulas e/ou órgãos de mamíferos, tais como sistema hematopoiético (leucemias, linfomas mielomas, etc), tecidos moles (sarcomas), sistema nervoso, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestinos delgado e grosso, sangue. Mais preferivelmente ainda, o termo desordem proliferativa significa a proliferação indesejada de células tumorigênicas no pulmão, rim, bexiga, fígado, pele, pâncreas, estômago, ovário, testículo, sangue, cérebro, ossos e mama.

Este método baseia-se na administração, a um animal mamífero, de uma composição inibidora da MRP1 capaz de induzir apoptose e de sensibilizar células que expressam o fenótipo MDR mediado pela superexpressão da proteína MRP1/ABCC1 aos quimioterápicos pertencentes ao estado da técnica.

A composição inibidora deste método deve conter entre 1 a 1000 pg/ml de um triterpeno isolado ou não isolado capaz de inibir as proteínas MRP1. Preferencialmente, a composição inibidora deve conter preferencialmente entre 10 a 500 pg/ml de um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: ácido 3-beta acetil tormêntico (3TA); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico (AT); ácido euscáfico (AE); e ácido isoajurnólico (ISO) um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

Opcionalmente, de forma preferencial, a composição inibidora, utilizada pelo método de tratamento de desordenes proliferativa descrito, é consistida pelo extrato alcoólico de C. lyratiloba rico em triterpenos não isolados. Tal método de tratamento e/ou prevenção possui a capacidade induzir a morte ou de sensibilizar células que expressam o fenótipo MDR mediado pela expressão da proteína MRP1/ABCC1 ao quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Tal método de inibição é mais efetivo e apresenta menos efeitos adversos que os usuais métodos de inibição da MRP, especialmente, a MRP1.

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Este método é bastante efetivo e específico, pois, o triterpeno contido na composição inibidora apresenta elevada especificidade para as proteínas da família MRP/ABCC, especialmente, a MRP1/ABCC1.

É ainda um objeto desta invenção o método de tratamento de tumores resistentes a múltiplas drogas (MDR), baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora de proteínas da família MRP1/ABCC1 em associação a um quimioterápico pertencente ao estado da técnica a um animal mamífero portador de um tumor resistente a múltiplas drogas.

Esse método possibilita o tratamento de tumores MDR devido a capacidade do triterpeno, contido na composição inibidora, de sensibilizar um tumor que expressa MRP associado a um quimioterápico ao qual ele é resistente. Tal capacidade foi comprovada em testes realizados, onde a linhagem celular B16F10 foi co-tratada com uma composição contendo um triterpeno e um quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Esse cotratamento foi capaz de induzir o fim da proliferação celular indesejada em células tumorais, devido à parada do ciclo celular das células tratadas na fase G2/M do ciclo. Esse efeito citostático, ou seja, a interrupção do ciclo celular é clinicamente interessante, pois impede o crescimento do tumor. Além disso, em alguns casos, esse efeito pode possibilitar dentre outras coisas, a remoção cirúrgica do tumor.

O método de tratamento de neoplasias MDR com a composição inibidora de proteínas MDR, por sensibilizar as células resistentes ao efeito do quimioterápico, possibilita ainda a prevenção do desenvolvimento do fenótipo de resistência, caso venha a ser administrado a um mamífero portador de uma neoplasia, desde o inicio do tratamento quimioterápico que o mesmo vier a ser submetido. Desta forma, a administração conjunta da composição inibidora e do quimioterápico atuará no combate tanto das células do tumoral sensíveis ao dito agente quimioterápico, como sobre as células já resistentes a múltiplas drogas existentes no tumor.

Este método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora contendo preferencialmente entre 3 a 40(Xg/ml de um ou mais triterpenos, não isolados

14/19 ou isolados, em conjunto com uma quantidade reduzida de um quimioterápico usualmente empregado no tratamento de neoplasias malignas.

Finalmente, esta invenção refere-se a um método de tratamento de tumores baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora de proteínas da família MRP1/ABCC1 em associação a um quimioterápico pertencente ao estado da técnica a um animal mamífero portador de um tumor resistente a múltiplas drogas.

Os quimioterápicos pertencentes ao domínio público que podem ser empregados conjuntamente com a composição inibidora desta invenção os compostos pertencentes ao grupo compreendido de: cisplatina, topotecam, irinotecam, vinblastina, vincristina, daunorubicina, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, etoposideo, teniposidio, mitoxantrona, bisantreno, metotrexato, flavopiridol, verapamil, tamoxifenr, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar, ontogen, elacrida, imatinib, quecertina e gefitinib.

Para este objeto da invenção, vemos que a composição inibidora das proteínas MRP1/ABCC1 deve ser empregada conjuntamente com um quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Quando utilizada em conjunto com um quimioterápico pertencente ao estado da técnica, a dita composição inibidora atuará de forma sinérgica ao dito quimioterápico permitindo que sejam aplicadas concentrações menores tanto deste objeto da invenção, como do quimioterápico a ele associado sem que ocorra a redução da eficácia terapêutica, quando em comparação com o tratamento antitumoral tanto da composição inibidora desta invenção como do quimioterápico empregado.

Os exemplos fornecidos têm a mera função de ilustrar as concretizações realizadas pelos inventores, não devendo ser empregados na delimitação de seus direitos.

Exemplos 1: Investigação da ação do triterpeno 3AT:

A atividade anti-MDR do composto 3p-acetil tormêntico (3AT) foi investigada utilizando as linhagens leucêmicas Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) e K562/DOX (Tang et al., 2004) que expressam P-gp/ABCB1, o melamona murino B16F10 e o neuroblastoma humano GBV, que expressam MRP1/ABCC1 e a linhagem de câncer de pulmão humano, A549, que expressa diferentes proteínas da família MRP (MRP1-5). Ο 3AT induz a apoptose das

15/19 linhagens de maneira dose-dependente. O efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1 foi feito por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para a proteína. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade do composto em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP1 (CFDA). Medida de acúmulo de Rho 123 em células expressando P-gp, Lucena 1 e K562/DOX (fig. 1 e fig.3) mostrou que o tratamento com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, induzia um grande aumento no acúmulo desse composto enquanto o tratamento com o triterpeno ou o extrato causava apenas um pequeno efeito no acúmulo do substrato indicando que nem o triterpeno nem o extrato tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.

Experimento realizado com a linhagem celular B16F10 demonstrou que o tratamento com o triterpeno induz o aumento do acúmulo do substrato (CFDA) superior ao obtido com tratamento com MK571, um inibidor comercial específico de MRP, indicando que o triterpeno inibe a atividade da MRP1 (figura 4). De fato, como mostrado na tabela 1 à inibição da MRP1 obtida com 47.00 μΜ de 3AT é aproximadamente duas vezes a observada com 50 μΜ de MK571 indicando este triterpeno é um inibidor da MRP1/ABCC1 mais potente que ο MK571. Portanto, apesar dos dois inibidores, 3AT e MK571 apresentarem um efeito pequeno sobre a atividade da P-gp/ABCB1, o triterpeno utilizado deve ser considerado um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Experimento realizado com a GBV, outra linhagem que expressa MRP1/ABCC1, também mostrou efeito inibitório do 3AT sobre essa proteína (figura 5).

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial específico da MRP, aumenta significativamente o acúmulo do substrato (CFDA), o tratamento com o triterpeno só induz um pequeno aumento de acúmulo desse substrato, sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presente na A549 (fig. 5).

A atividade anti-MDR do composto 3p-acetil tormêntico (3AT) foi investigada utilizando as linhagens leucêmicas Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) e K562/DOX (Tang et al., 2004) que expressam P-gp/ABCB1, o

16/19 melamona murino B16F10 e o glioblastoma multiforme humano GBV, que expressam MRP1/ABCC1 e a linhagem de câncer de pulmão humano, A549, que expressa diferentes proteínas da família MRP (MRP1-5). Ο 3AT induz a apoptose das linhagens de maneira dose-dependente. O efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1 foi feito por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para a proteína. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade do composto em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP1 ( CFDA). Medida de acúmulo de Rho 123 em células expressando P-gp, Lucena 1 e K562/DOX (fig.1 e fig.3) mostrou que o tratamento com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, induzia um grande aumento no acúmulo desse composto enquanto o tratamento com o triterpeno ou o extrato causava apenas um pequeno efeito no acúmulo do substrato indicando que nem o triterpeno nem o extrato tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.

Experimento realizado com a linhagem celular B16/F10 demonstrou que o tratamento com o triterpeno induz o aumento do acúmulo do substrato (CFDA) superior ao obtido com tratamento com MK571, um inibidor comercial específico de MRP, indicando que o triterpeno inibe a atividade da MRP1 (figura 4). De fato, como mostrado na tabela 1 a inibição da MRP1 obtida com 25 μΜ de 3AT é aproximadamente duas vezes a observada com 50 μΜ de MK571 indicando este triterpeno é um inibidor da MRP1/ABCC1 mais potente que ο MK571. Portanto, apesar dos dois inibidores, 3AT e MK571 apresentarem um efeito pequeno sobre a atividade da P-gp/ABCB1, o triterpeno utilizado deve ser considerado um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Experimento realizado com a GBV, outra linhagem que expressa MRP1/ABCC1, também mostrou efeito inibitório do 3AT sobre essa proteína (figura 5).

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa às diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial específico da MRP, aumenta significativamente o acúmulo do substrato (CFDA), o tratamento com o triterpeno só induz um pequeno aumento de acúmulo desse substrato, sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presente na A549 (fig. 6).

17/19

Tabela 1: Efeito do triterpeno no acúmulo do substrato para MRP1:

Carregamento	R*
CF	1
CF + MK571 25,7pg/mL	10.45 ± 1.67
CF + 3AT 6,25 pg/mL	5.56 ± 1.16
CF + 3AT 12,5 pg/mL	11.35 ± 1.31
CF + 3AT 25 pg/mL	20.86 ± 3.39

R*: Razão entre o acúmulo de substrato (CF) em células incubadas com meio e em células incubadas com o triterpeno ou o inibidor MK571

Avaliação da expressão da MRP1/ABCC1 em células B16F10 demonstrou que ο 3AT não interfere nos níveis desta proteína (Figura 7) Exemplo 2: Efeito do co-tratamento de 3AT com Doxorubicina ao quimioterápico:

O efeito inibitório do 3AT sobre a MRP1 também foi avaliado por sua capacidade em sensibilizar um tumor que expressa essa proteína a um quimioterápico ao qual o tumor é resistente. Utilizando a linhagem B16F10, que é resistente a baixas concentrações de doxorubicina, observamos que o cotratamento com 3AT e doxorubicina induz uma parada do ciclo celular em G2/M nesta linhagem (tabela 2). Esse efeito citostático demonstra que, ao inibir a MRP1/ABCC1, ο 3AT sensibiliza uma linhagem resistente a drogas antineoplásicas.

Tabela 2: Co-tratamento com 3AT sensibiliza a de B16F10 ao quimioterápico Doxorubicina ou Co-tratamento de B16F10 com 3AT e Doxorubicina

TRATAMENTO	SUB-G1	G1	S	G2
Controle	1,6% ±0,83	59,8% ± 0,28	11,4% ± 0,3	16,8% ±0,82
3AT 6,25pg/ml	1,3% ±0,28	59,4% ± 4,24	11,1% ± 0,14	17% ±0,35
3AT 12,5pg/ml	1,2% ±0,17	56,5% ± 3,89	11,6% ±0,85	17,1% ± 1,43
DOX 0,1 μΜ	1,8% ±0,64	54,6% ± 4,81	7,6% ± 0,85	22,3% ± 3,25
3AT 6,25pg/ml + DOX 0,1 μΜ	1,6% ± 0,47	44,1% ±2,69	6,2% ± 0,71	31,9% ±4,03
3AT 12^g/ml + DOX 0,1 μΜ	1,8% ± 0,57	30,4% ± 1,84	5,5% ± 0,42	39,8% ± 3,39

Células de B16F10 foram co-tratadas com concentrações subletais de 3AT e doxorubicina por 48 horas e a percentagem de células em cada fase do cilco celular foi

18/19 avaliada por citometria de fluxo. Sub-G1 (apoptose), G1 (fase G1), S (fase S), G2M (passagem G2 para M)

Os dados obtidos mostram que ο 3AT não tem efeito sobre a Pgp/ABCB1, mas é um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Portanto, além de seu possível uso como quimioterápico no tratamento de tumores MDR (que expressam P-gp/ABCB1 e MRP1/ABCC1) ο 3AT também pode ser usado como co-adjuvante no tratamento de neoplasias resistentes que expressam MRP1/ABCC1, assim como outras doenças que expressem este fenótipo de resistência, ou como uma ferramenta para o estudo do mecanismo de transporte mediado pela MRP1/ABCC1.

A tabela 2 apresenta dados relativos ao efeito do 3AT e/ou Doxorubicina sobre as fases do ciclo celular da linhagem de melanoma B16F10 (que expressa MRP1/ABCC1), com o objetivo de avaliar se ο 3AT poderia atuar como co-adjuvante na atividade citotóxica da doxorubicina, um quimioterápico substrato para a MRP1/ABCC1.

As células (1x10⁴ / poço) foram plaqueadas e, após 24h, incubadas com diferentes concentrações de 3AT (6.25 e 12.5 pg/mL) e/ou DOX (0.1 μΜ) por 48h. Após esse tempo, as células foram incubadas com o tampão HFS (contendo 50 pg/ml de PI) por 1h a 4°C. As porcentagens de células no pico sub-G1 e em cada fase do ciclo celular (G1, S e G2) foram quantificadas por citometria de fluxo (10.000 eventos; canal FL-2A). Os resultados expressam a média ± DP de dois experimentos diferentes realizados em triplicatas.

Exemplo 3: Inibição da viabilidade celular pela composição inibidora da atividade das proteínas MRP.

Exemplo 3.1: Células sanguíneas.

Células sanguíneas (linfócitos) foram plaqueados e incubados com PHA por 24 horas, após esse tempo, ocorreu a incubação com diferentes concentrações da composição inibidora das proteínas MRP, contendo o triterpeno isolado 3AT por mais 48 horas. Ao final desse período é acrescentada uma pequena concentração do MTT. Segui-se a incubação por 4 horas e leitura da cor em um leitor de ELISA.

Os resultados estão demonstrados na tabela 3 e figura 9 na forma de % de INIBIÇÃO da viabilidade (mostra % de células NÃO viáveis).

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	% viabilidade
3AT25	85,3
3AT 37,5	88,8
3AT 42,5	57,7
3 AT 50	64,9

Tabela 3: Percentual de linfócitos estimulados com PHA vivos após o tratamento com diferentes concentrações do triterpeno 3AT isolado.

Exemplo 3.2: Células de pulmão, melanoma, leucemia mielóide aguda e glioma.

As células das seguintes linhagens (A549, B16, HL-60 E GBV) foram plaqueadas em placas de múltiplos poços (10⁴ cels/poço), após 24 horas diferentes concentrações do composto foram adicionadas e incubadas por 48 10 horas. Ao final desse período, o MTT foi acrescentado em pequena concentração, sendo incubado por 4 horas. A leitura da cor em um leitor de Elisa. Os resultados estão demonstrados na nas figuras 10 a 13, forma de % de INIBIÇÃO da viabilidade (mostra % de células NÃO viáveis).

Claims (6)

1. Composição farmacêutica inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 caracterizada por ter como ativos os triterpenos isolados pertencentes ao grupo formado pelo ácido 3-beta-acetil tormêntico em formulações contendo os excipientes dimetilsulfóxido (DMSO), cloreto de sódio, cloreto de potássio, fosfato dissódico, fosfato sódico e/ou água destilada associado a 6,25pg/ml_; 12,5pg/ml_ e 25pg/ml_ do triterpeno ácido 3-beta-acetil-tormênico com o composto antiproliferativo doxorubicina em concentrações farmaceuticamente aceitáveis para administração em mamíferos portadores de tumor.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por se empregar um conjunto de triterpenos isolados pertencente ao grupo consistido de ácido 3-beta-acetil tormêntico como triterpeno inibidor da proteína MRP1/ABCC1, dissolvido e diluído em solução contendo dimetilsulfóxido (DMSO) e os sais cloreto de sódio, cloreto de potássio, fosfato dissódico, fosfato sódico e/ou água destilada.

3. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizada pelo agente inibidor da MRP1 ser o extrato alcoólico da planta Cecropia lyratiloba rico em triterpenos não isolados, em formulações contendo os excipientes dimetilsulfóxido (DMSO), cloreto de sódio, cloreto de potássio, fosfato dissódico, fosfato sódico e/ou água destilada.

4. Composiçãofarmacêutica de acordo com as reivindicações 1 a 3 caracterizada por apresentar as concentrações de 6,25pg/ml_; 12,5pg/ml_; 25pg/ml_, 37,5pg/ml_, 50pg/ml_ e 100pg/ml_ do triterpeno inibidor da proteína MRP1/ABCC1

Petição 870190070004, de 23/07/2019, pág. 7/8

2/2

5. Uso da composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizada por preparar uma formulação ativa de concentração do triterpeno inibidor da proteína compreendida entre 1 a 100pg/Kg de peso corporal para tratamento de um animal portador de tumor.

6. Composição farmacêutica caracterizada por associar 6.25pg/ml_; 12.5pg/ml_ e 25pg/ml_ do triterpeno ácido 3-beta-acetil- tormêntico com o composto antiproliferativo doxorubicina em concentrações farmaceuticamente aceitáveis para administração em mamíferos portadores de tumor.