BRPI0920800A2 - vírus da herpes bovina-1, composição, método para produzir uma resposta imunológica em um hospedeiro, e, uso de vírus da herpes bovina-1. - Google Patents

Abstract

VÍRUS DO HERPES BOVINO-I VIVO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM UM HOSPEDEIRO, E, USO DE VÍRUS DO HERPES BOVINO-1 VIVO A descrição geralmente se refere ao tratamento ou prevenção de doença em gado. Mais particularmente, a invenção é dirigida à produção e uso de vírus do herpes bovino 1 (BFIV-I) modificado e seu uso em composições e vacinas que protegem gado de infecção por BHV-1 embora não suprimindo a resposta imunológica no hospedeiro. Em um exemplo, a invenção é dirigida ao uso de BHV-1 modificado, administrado com imunógenos adicionais, ou através de co-administração e/ou através de administração em vacinas de combinação, e o uso destas vacinas para a proteção de gado de doença. Em um exemplo, uso do BHV-1 modificado nas composições administradas facilita -uma resposta imune a ou contra os imunógenos adicionais.

Description

"VÍRUS DO HERPES BOVINO-I VIVO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO

PARA PRODUZIR UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM UM HOSPEDEIRO, E, USO DE VÍRUS DO HERPES BOVINO-I VIVO" Referência Cruzada para Pedidos Relacionados 5 Este pedido reivindica prioridade para pedido provisório de Patente Norte^nericana número 61/195.102, depositado em 3 de Outubro de 2008, que é incorporado neste lugar por referência. Fnndamentos Herpesvírus bovino 1 (BHV-I), é o agente causador de rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), e é um patógeno viral economicamente significativo de gado que pode causar infecção respiratória severa, conjuntivite, abortos, vulvovaginite, balanopostite, e infecção sistêmica em bezerros neonatos (Wyler et al. (1989) HERPESVIRUS DISEASES OF CATTLE, HORSES, AND PIGS 1-72 (Boston) In G. Witman (ed.) Kluwer Academic Publishers). A seqüência de nucleotídeos do genoma de BHV-I (136 kb) é conhecida. Ela geralmente contém 67 genes únicos e 2 genes, ambos duplicados, nas repetições invertidas. Em geral, os genes de BHV-I exibem homologia no nível de seqüências de aminoácidos com aqueles de outros alfa-herpesvíms (HSV-l, VZV, EHV-I) e são arranjados em ordem similar. BFIV-I é um membro do gênero Varicellovirus, parte da subfamília Alphaherpesvirinae (fainília herpesviridae). A subfamília inclui herpesvínis humano 3, vírus da pseudoraiva, e herpesvírus bovinos e eqüinos. Infecção por BHV-I também é um componente da infecção do trato respiratório superior referida como "febre do transporte" o'u complexo respiratório bovino (Tikoo et al. (1995) Adv. Virus Res. 45:191; publicação de Patente None-Alnericana no. 2004-0185056). BHV-I não é o único agente infeccioso associado com febre do transporte, mas ele inicia a desordem imunossuprimindo gado infeetado, o que geralmente resulta em infecções bacterianas secundárias e pneumonia. Susceptibilidade aumentada à infecção secundária se correlaciona com imunidade celular mediada deprimida depois de infecção por BHV-I (Carter et al. (1989) J. Virol. 63:1525; Griebel et al. (1990) J. Gen. Virol. 71:369; Griebel et al. (1987) Viral Immunol.1:287; Griebel et al. (1987) Viral Inimunol. 1:267). BHV-I geralmente estabelece '5 latência vitalícia em neurônios ganglionares do sistema nervoso periférico depois de replicação inicial em epitélio de mucosa e resulta em animais sendo contagiosos além de infecção aguda. Reativação de latência geralmente 0 resulta em excreção viral e transmissão a outros animais susceptíveis.

· Reativação geralmente ocorre depois de estresse natural ou induzido por 10 corticosteróide (Rock et al. (1992) J. Virol. 66:2484; Shefíy e Davies (1972) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140:974). Em um esforço para eontrolar infecções por BHV-I, vacinas convencionais de vírus morto e vírus vivo atenuado foram desenvolvidas. Vacinas comerciahnente disponíveis, vacinas de vírus vivo atenuado, por 15 exemplo, podem causar imunossupressão ou depressão imune, ou outras alterações do sistema imune do hospedeiro. Estas alterações podem ser atribuídas a proteínas codificadas por BHV-I que suprimem ou de outra maneira alteram o sistema imune do hospedeiro infectado. Esta imunossupressão pode resultar na incapacidade destas vacinas para prevenir . 20 estabelecimento de uma infecção latente por uma linhagem virulenta de " campo de BHV-I (veja, e.g., Gerber et al. (1978) Am. J. Vet. Res. 39:753; Jericho et al. (1983) Can. J. Com. Med. 47:133; Pastoret et al. (1980) Infect. " hnmun. 29:483).

& Uma tendência em vacinas atuais é vacinas co-administradas " 25 ou de coínbinação, que geralmente contêm antígenos de múltiplos agentes ou . organismos. Estas vacinas podem fomecer vacinação e proteção para múltiplos agentes e/ou doenças e pode ser dada em um único momento ou * administração. Em vacinas contendo BHV-I, BHV-I pode afetar ou alterar a " resposta imune do hospedeiro contra co-administrada. Em um exemplo, a resposta imune a antígenos co-administrados com BHV-I ou presentes em vacinas de combinação junto com BHV-I pode ser suprimida, diminuída, ou . de outra maneira alterada, em relação à resposta imune do hospedeiro àqueles antígenos quando administrados sem BHV-I. A resposta imune afetada ou "5 alterada pode reduzir a capacidade de antígenos vacinais co-administrados com BHV-I de estimular uma resposta imune protetora contra infecção e/ou doença causada pelos agentes infecciosos a partir dos quais os antígenos co- . administrados foram derivados. Vírus BHV-I atenuados anteriores e atuais " geralmente não se dirigem a imunossupressão por BHV-I e/ou respostas 10 imunes alteradas do hospedeiro contra antígenos co-administrados. Resumo Foi encontrado que víms BHV-I com modificações, e/ou expressão alterada, de certos genes de BHV-I podem aliviar, prevenir ou reverter alterações de respostas imunes do hospedeiro (e.g., imunossupressão) 15 atribuídas a BHV-I. Também foi encontrado que vírus BHV-I contendo as modificações e/ou alterações podem aliviar ou prevenir as alterações em resposta imune do hospedeiro a antígenos co-administrados ou antígenos administrados em combinação (e.g., resposta imune suprimida a antígenos · adicionais) se comparados com vírus BHV-I que não têm as modiíicações. . 20 Baseado nestes achados, as seguintes invenções são descritas.

U Em um exeinplo, composições e vacinas contendo um imunógeno de BHV-I onde pelo menos um gene do BFN-I foi modificado. b Em um exemplo, a vacina com o BIIV-I modificado é administrada com um · imunógeno não BHV-I ou através de co-administração ou eín uma vacina de ' 25 combinação. O BHV-I pode ser uma linhagem modificada de BHV-I vivo de . vacina. Em um exemplo, os genes modincados do BHV-I geralmente podem ser genes que codificam proteínas envolvidas na depressão da resposta k imunológica do hospedeiro durante infecção por BHV-I. As composições e

W 4 vacinas também podem incluir modificação de forma que a virulêneia do BHV-I tenha sido reduzida. Exemplos de genes modificados de BHV-I podem incluir . UL49.5 de BHV-I, UL41 de BHV-I, Us4 de BHV-I, e Cir de BHV-I "5 modificados. Os genes podem ser modificados por mutações pontuais únicas, em alguns casos com a única mutação sendo mutações por deleção. Mutações por deleção podem ser deleções completas ou deleções parciais dos genes. As

O modificações podem resultar em produção de nenhuma proteína a partir ' " daquele gene. As modificações podem resultar em produção de proteínas não 10 nativas ou não tipo selvagem a partir daquele gene. Em um exemplo, UL49.5 de BFN-I é modificado. Em um exemplo, UL41 de BHV-I é modificado. Em um exemplo, Us4 de BHV-I é modificado. Em um exemplo, Circ de BHV-I é modificado. Modificação em genes diferentes ou adicionais é contemplad.a. Vírus BHV-I contendo modificações de genes podem conter 15 uma modificação, duas modificações, três modificações ou quatro ou mais modificações. Estas modificações pode.m ser em adição a modificações que podem já existir, como em linhagens atenuadas de vacina, por exemplo. Em um exemplo, um vírus BHV-I pode conter dois genes modificados que são · UL49.5 e UL41. Em um exemplo, pelo menos um gene selecionado a partir . 20 do grupo de UL49.5 de BHV-I, UL41 de BHV-I, Us4 de BHV-I e Circ de " BFIV-I c pelo menos um gene selecionado a partir do grupo de LR-ORF 1 de BHV-I, LR-ORF 2 de BHV-I, e Us9 de BHV-I são modificados.

T Em qualquer dos exemplos descritos de eomposição e vacina, · um gene marcador pode estar incluído. Em certas formas de realização, os " 25 genes marcadores podem ser UL49.5 de BHV-I, UL41 de BHV-I, Us4 de . BHV-I, e/ou Circ de BHV-I. Certas composições e vacmas também podem incluir Us8 de BHV-I como o gene marcador. » Vacinas descritas também podem incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis. As composições e vacinas também podem

W incluir imunógenos adicionais (e.g., um imunógeno outro do que um imunógeno de BHV-I). Os imunógenos adicionais podem ser co- . administrados ou podem ser administrados em uma vacina em coquetel de combinação. Outras administrações são contempladas. Os imunógenos '5 adicionais podem ser imunógenos bacterianos, tal como imunÓgenos de Vibrio, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Fusobacterium . necrophorum, clostridiais, E. coli, Salmonella enterica, Mycoplasma bovis,

B e/ou Leptospirose, e/ou imunógenos virais tal como imunógenos de BVD I e " II, PI3 e BRSV. As composições e vacinas podem incluir adicionahnente 10 imunógenos parasíticos tal como imunógenos de Neospora caninum e/ou Trichomonas spp.. Métodos descritos incluem prevenção ou tratamento de uma infecção por BHV- I em um hospedeiro (geralmente uin bovino) administrando com uma dose terapêutica das composições ou vacinas 15 descritas (e.g., BHV-I contendo gene ou genes modificado(s) e pelo menos um imunÓgeno adicional). Geralmente, os métodos também incluem tratamento ou prevenção de infecção e/ou doença por patógenos a partir dos

Y quais o imunógeno adicional ou imunógenos é/São obtido(s). Em um -

B exemplo, administração das composições ou vacinas descritas facilita 20 respostas imunes em um hospedeiro a ou contra BHV-I e os imunógenos adicionais. Em um exemplo, administração das composições ou vacinas descritas facilita aliviar ou prevenir imunossupressão das respostas imunes do

N hospedeiro atribuídas a BHV-I que não contém os genes modificados. Em um · exemplo, administração das composições descritas facilita aliviar ou prevenir " 25 imunossupressão da resposta imune do hospedeiro a ou contra os imunÓgenos . adicionais atribuídos a BHV-I não modificado.

B Breve Descrição dos Desenhos Nos desenhos anexos, que são incorporadas em e constituem 4 uma parte do relatório, formas de realização de, ou relacionadas a,

% 6 composições, vacinas e métodos são ilustradas, que, junto com a descrição detalhada dada abaixo, servein para descrever os exemplos. Deve ser . percebido que as formas de realização ilustradas nas ilustrações são mostradas para o propósito de ilustração e não para limitação. Deve ser percebido que '5 alterações, modificações e desvios das formas de realização ilustradas nas ilustrações podem existir sem se afastar do espírito e escopo da invenção, conforme descrito abaixo. Figura 1 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:l) e de ' ' aminoácidos (SEQ ID NO:2) de UL49.5 de BHV-I da linhagem Cooper. 10 Figura 2 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:3) e de aminoácidos (SEQ ID NO:4) de UL41 de BHV-I da linhagem Cooper. Figura 3 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:5) e de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de Circ de BHV-I da linhagem Cooper. Figura 4 ilustra seqüêneias de DNA (SEQ ID NO:7) e de 15 aminoácidos (SEQ ID NO:8) de LR-ORF 1 de BHV-I da linhagem Cooper. Figura 5 ilustra seqüências dé DNA (SEQ ID NO:9) e de aminoácidos (SEQ ID NO:lO) de LR-ORF 2 de BHV-I da linhagem Cooper. Figura 6 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:ll) e de 0 - aminoácidos (SEQ ID NO:12) de Us4 de BHV-I da linhagem Cooper. Como 20 descrito no relatório, os nucleotídeos sublinhados indicam a região que foi ° deletada no gene Us4 da linhagem GL756 de BHV-I para. produzir o Us4 mutante usado em alguns estudos. Deleção dos nucleotídeos sublinhados k resulta em ausência dos aminoácidos subliiihados quando o gene é expresso. b Figura 7 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:13) e de ' 25 aminoácidos (SEQ ID NO:14) de Us9 de BHV-I da linhagem Cooper.

Y Figura 8 ilustra seqüências de DNA (SEQ ID NO:15) e de b aminoácidos (SEQ ID NO:16) de Us8 de BHV-I da linhagem Cooper. Figura 9 ilustra a seqüência de DNA (SEQ ID NO:23) de um ' gene UL49.5 mutante da linhagem GL756 de BHV-I. Os nucleotídeos sublinhados indicam seqüências adicionadas à seqüência de UL49.5 de GL756 tipo selvagem. Os nucleotídeos sublinhados adic.ionam dois códons de . parada de tradução em quadro de leitura à seqüência de codificação. Figura 10 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo de '5 efeito de BHV-I GL756 em expressão em superfície celular de moléculas de MHC classe I. Células MDBK, não infectadas (mock-infected) e infectadas com BHV-I GL756 foram coradas com anticorpo monoclonal PT85A,

W específico para moléculas de MHC classe I. Células de controle negativo " foram coradas com MM605, um anticorpo de controle isotípico não reativo.

L 10 Figura 11 ilustra dados exemplares de um estudo onde antígeno LKT foi adm.inistrado a bezerros sozinho (LKT) ou com BHV-I (GL756+LKT) em dia 0 e novamente em dia 21 (LKT administrado sozinho em dia 21). Bezerros de controle foram administrados com apenas BHV-I (GL756) em dia 0. Soros foram obtidos dos bezerros nos dias indicados e os 15 níveis de anticorpos específicos para LKT foram deteminados usando ELISA. Barras de erro indicam erro padrão da média (EPM) para as medidas. Os triângulos indicam momentos onde houve uma diferença significativa entre os

T níveis de anticoipos específicos para LKT em amostras de soro de animais · 0 GL756+LKT se comparados com animais LKT. 20 Figura 12 ilustra dados exemplares de um estudo onde " antígeno LKT foi administrado a bezerros soziiiho (LKT) ou com BHV-I (GL756+LKT) em dia 0 e novamente em dia 21 (LKT administrado sozinho b eni dia 21). Soros foram obtidos dos bezerros nos dias indicados e os níveis " de anticorpos IgGl e IgG2 específicos para LkT foram determinados usando " 25 ELISA. Os dados são expressos como proporções de IgGl versus IgG2.

- Barras de erro indicam EPM. Figura 13 ilustra dados exemplares de um estudo onde k' antigeno LKT foi administrado a bezerros sozinho (LKT) ou com BHV-I " (GL756+LKT) em dia 0 e novamente em dia 21 (LKT administrado sozinho k 8 em dia 21). Bezerros de controle foram administrados com apenas BHV-I (GL756) em dia 0. Sangue periférico foi obtido dos bezerros em dia 23.

. Células dentro das amostras de sangue foram colocadas em contato com antígeno LKT e, subseqüentemente, níveis de JL-2 nas amostras foram '5 determinados usando ELISA.

Figura 14 ilustra Construções de Deleção-Recombinação . (DRC) de BHV-I GL756A UL49.5 (A) e US4A (B) exemplares usadas para gerar modificações de deleção por recombinação homóloga. Também são " ilustradas seqüências de DNA exemplares de construções de recombinação 10 UL49.5 (SEQ ID NO:17) e Us4 (SEQ ID NO:18).

Figura 15 ilustra seqüências de DNA exemplares de eonstruções de recombinação BHV-I UL41 (SEQ ID NO:l9) e BHV-I LR- ORF 2 (SEQ ID NO:20).

Figura 16 ilustra produtos de reação em cadeia da polimerase 15 (PCR) exemplares de amplificação de nucleotídeos de BHV-I GL756AUL49.5 _EGFP clones Al e B8, e GL756 BHV-I de base, usando iniciadores flanqueadores para o sítio de deleção/recombinação.

W Figura 17 ilustra produtos de reação em cadeia da polimerase " (PCR) exemplares de amplificação de nucleotideos de BHV-I ¥ 20 GL756AUs4 EGFP clones 1 e 2, e GL756 BHV-I de 'base usando iniciadores " flanqueadores para o sítio de deleção/recombinação.

Figura 18 ilustra um Westem blot exemplar de BHV-I k GL756LJJJL49.5 clones Al, A5, B7 e B8 ou GL756 BHV-I de base, usando " anticorpo contra UL49.5. O Westem blot confirma deleção do gene alvo no ' 25 BHV-I modificado.

0 Figura 19 ilustra um Westem blot exemplar de BHV-I GL756L\UL49.5 clones Al, B8; GL756AUs4 clones 1, 2, ou GL756 BHV-I k d.e 'base usando anticorpo contra Us4. O Western blot confirma deleção do

V gene alvo no BHV-I modificado.

Figura 20 ilustra as mutações dentro dos genes UL49.5 (inserção de dois códons de parada) e UL41 (deleção completa) do genoma de m BHV-I GL756. Na parte superior da ilustração são mostradas as regiões únicas (Ul e Us) e repetidas (IR e TR) do genoma.

Na parte inferior da "5 ilustração é mostrado o gene UL49.5 dentro do hagmento J, e o gene UL41 dentro do hagmento I, do genoma.

Figura 21 ilustra as mutações dentro do gene Us4 (deleção 0 parcial e inserção) do genoma de BHV-I GL756. Na parte superior da

" ilustração são mostradas as regiões únicas (Ul e Us) e repetidas (IR e TR) do genoma.

Na parte inferior da ilustração é mostrado o gene US4 dentro do Fagmento K do genoma.

Figura 22 ilustra as mutações dentro do gene Circ (deleção completa) do genoma de BHV-I GL756. Na parte superior da ilustração são mostradas as regiões únicas (Ul e Us) e repetidas (IR e TR) do genoma.

Na parte inferior da ilustração é mostrado o gene Circ dentro do ífagmento N do genoma.

Figura 23 ilustra curvas de crescimento de vírus BHV-I em células MDBK.

Os vírus tiveram o GL756 de base.

GL756 (BHV-I WT), UL49.5 mutante de GL756 (BHV-1AUL49.5), clones de dois UL4L mutantes de GL756 (BHV-1AUL41:1606 e BHV-1AUL41:1607), clones de dois mutantes duplos UL41/UL49.5 (BHV4L\UL41/UL49.5:1614 e BHV- 1AUL41/UL49.5:1616), Circ mutante de GL756 (BHV-1ACKc:1697) e US4 mutantes (BHV-1AUs4gG:l698) foram testados.

Figura 24 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo de efeito de BHV-I GL756 e BFIV-I modificado em expressão em superficie celular de moléculas de MIIC classe I.

Células MDBK, não infectadas (mock- infected), infectadas com BHV-I GL756 ou GL756,AUL4.5 clones Al ou B8 foram coradas eom antic.orpo monoclonal PT85A, um anticorpo específico para moléculas de MHC classe I. Células de controle negativo foram coradas com MNI605, uin anticorpo de controle isotípico não reativo. Figura 25 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo do efeito de BHV-I GL576 e GL756AUL49.5-AUL41 em expressão em 5 superfície celular de moléculas de MHC classe I. Células MDBK não infectadas (mock-infected), infectadas com BHV-I GL756 ou GL756AUL49.5-AUL41 foram coradas com anticorpo monoclonal PT85A, um anticoípo específico para moléculas de MHC classe I. Células de controle negativo foram coradas com MM605, um anticorpo de controle isotípieo não reativo. Figura 26 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo do efeito de vários vírus BHV-I mutantes em expressão em superficie celular de moléculas de MHC classe I. Os dados são expressos como expressão percentual comparada com células não infectadas (mock-infected) (100°4).

Células MDBK foram infectadas com BHV-I GL576, GL756AUL49.5, GL756AUL41 ou GL756AUL49.5-AUL41 e foram coradas com um anticorpo reativo com moléculas de MHC classe I. Figura 27 ilustra dados exemplares de Westem blotting do efeito de vários vírus BHV-I mutantes em expressão de moléculas de MHC classe I (topo). Os blots foram escaneados e quantificados, e os dados são expressos como expressão percentual comparada com células não infectadas (mock-infected) (100°4, fúndo). Células MDBK foram infectadas com BHV-I GL576, GL756AUL49.5, GL756AUL41, GL756AUL49.5-AUL41, GL756ACHc ou GL756AUs4. Figura 28 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo do efeito de BFIV-I e vários vírus BHV-I mutantes em expressão em superficie celular de moléculas de MHC classe II. Os dados são expressos como expressão percentual comparada com células não infectadas (mock-infected) tratadas com IFN-y (100°4). Células MDBK foram infectadas com BHV-I

GL576 (WT clone 1584), GL756AUL49.5 (clone 1610), GL756AUL41 (clone 1606), GL756AUL41 (clone 1607), GL756AUL49.5-AUL41 (clone 1614), GL756AUL49.5-AUL41 (clone 1616), G1J756ACirc (clone 1697) ou GL756AUs4 (clone 1698), incubadas a 4°C por 30 mins, então a 37°C por 1 5 hora seguido por tratamento com IFN"y. Em 72 horas após infecção, as células foram coradas com anticoIpo monoclonal CAT82A, específico para MHC classe II. Células de controle negativo não foram coradas.

Figura 29 ilustra dados exemplares de citometria de fluxo do efeito de vários vírus BHV-I mutantes em expressão em superficie celular de moléculas de MIIC cIasse II. Os dados são expressos como restauração percentual de expressão de MHC classe II (i.e., níveis de MIIC classe II em células infectadas com GL576 recebeu valor de 0; restauração de MHC classe II aos níveis presentes eni células não infectadas (niock-infected) receberia valor de 100). Células MDBK tratadas com IFN-y foram infectadas com BHV-I GL576 (WT clone 1584), GL756AUL49.5 (clone 1610), GL756AUL41 (clone 1606), GL756AUL41 (elone 1607), GL756AUL49.5- AUL41 (clone 1614), GL756AUL49.5-AUL41 (clone 1616), GL756ACirc (clone 1697) ou GL756AUs4 (clone 1698) e foram coradas com um anticorpo reativo com moléculas de MHC classe II.

Figura 30 ilustra dados exemplares de um estudo onde antígeno LKT foi administrado a bezerros sozinho (LKT), com BHV-I GL756 (GL756+LKT), com GL756AUL49.5-AUL41 ou GL756AUs4 em dia 0 e novamente em dia 21 (LKT administrado sozinho em dia 21). Soros foram obtidos dos bezerros nos dias indicados e os níveis de anticorpos IgGl e IgG2 específicos para LKT foram detenninados usando ELISA. Os dados são expressos como proporções de IgGl versus IgG2. Barras de erro indicam EPM. Figura 31 ilustra dados exemplares de um estudo onde antígeno LKT foi administrado a bezerros com BHV-I GL756 (LKT+GL756),

GL756AUL49.5-AUL41 ou GL756AUs4 em dia 0 e novamente ein dia 21 (LKT administrado sozinho em dia 21). Sangue periférico foi obtido dos bezerros em dia 23. Células dentro das amostras de sangue forani colocadas em contato com antígeno LKT e, subseqüentemente, níveis de IL-2 nas 5 amostras foram determinados usando ELISA.

Descrição detalhada Víms BHV-I são conhecidos por causar imunossupressão de hospedeiros infectados.

Quando BHV-I é administrado a um hospedeiro como uma vacina, ele também pode supriniir ou deprimir a resposta imune a um imunógeno que pode ser administrado coin o BHV-I.

Este pedido descreve vírus BHV-I que imunossuprimem hospedeiros infectados em um menor grau do que víms BHV-I tipo selvagem nonnais.

Os víms BHV-I descritos aqui também podem aliviar a supressão ou depressão da resposta imune a um imunógeno que é administrado com BHV-I.

Eni alguns casos, não há nenhuma supressão da resposta imune a um imunógeno administrado com os vírus BHV-I inventivos comparada com uma resposta imune produzida quando aquele imunógeno é administrado sozinho (sem BHV-I). Em alguns casos, há uma acentuação da resposta imune a um imunógeno administrado com os vírus BHV-I inventivos comparada com uma resposta imune produzida quando aquele imunógeno é administrado sozinho.

Também são descritas composições contendo os vírus BHV-I inventivos e imunógenos adicionais.

Também são descritos métodos de usando os víms BHV-I inventivos, através de co-administração a um hospedeiro ou através de administração em uma vacina de combinação, para produzir uma resposta imune em um hospedeiro a BHV-I e um imunógeno adicional.

A prática da presente invenção irá empregar, a menos que de outra maneira indicado, virologia convencional, inicrobiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante dentro do verso da arte.

Estas técnicas são completamente explicadas na literatura.

Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações citados neste lugar, quer acima ou abaixo, são por. aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

A terminologia seguinte será usada em conformidade com as defmições apresentadas abaixo para descrever a presente invenção. 5 Definições "Composição de vacina" e "vacina" se referem a um agente usado para estimular uma resposta imunológica em um animal de forma que dano atual é aliviado, ou proteção contra dano fíituro é fomecida.

Uma "vacina co-administrada" é uma ' vacina dada . ou administrada aproximadamente ao mesmo"tempo, mas em uma dose separada.

Como usado neste lugar, aproximadamente ao mesmo tempo pode ser qualquer tempo entre administração da primeira dose e cineo dias após administração da primeira dose.

Uma "combinação" ou "vacina de coquetel" é uma vacina que estimula uma resposta imunológica a mais do que um patógeno que é fabricada com múltiplos imunógenos e administrada em uma dose única.

Uma "molécula de DNA dupla fita" se refere à forma polimérica de desoxirribonucleotídeos (adenina, guanina, timina ou citosina) em sua hélice dupla fita normal.

Este termo se refere apenas à estrutura primária e secundária da molécula, e não se limita a quaisquer fonnas terciárias particulares.

Assim, este termo inclui DNA dupla Ma encontrado, entre outros, em moléculas de DNA linear (e.g., hagmentos de restrição), vírus, plasmídeos, e cromossomos.

Ao discutir a estrutura de moléculas de DNA dupla fita particulares, seqüências podem ser descritas neste lugar de acordo com a convenção normal de dar apenas a seqüência na direção 5' a 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (i.e., a fita tendo a seqüência homóloga ao mRNA). Uma "seqüência de codificação" de DNA é uma seqüência de DNA que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriaclas.

Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon de início no término 5' (aniino) e um códon de término de tradução no término 3' (carboxi). Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a, seqüências procarióticas, cDNA de niRNA eucariótico, seqüências de DNA genômico de DNA 5 eucariótico (e.g., de mamífero), e seqüências de DNA sintético.

Um sinal de poliadenilação e seqüência de ténnino de transcrição normalmente estarão localizados 3' à seqüência de codificação.

Um polinucleotídeo é dito "codificar" um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos para aqueles versados na arte, ele pode ser transcrito e/ou traduzido para prodÜzir o niRNA para o polipeptídeo e/ou um fí:agmento deste.

A fita antisenso é o complemento de um tal ácido nucléico, e a seqüência de codificação pode ser deduzida a partir deste ponto. "Seqüências reguladoras" de DNA se refere coletivamente a seqüências de promotores, sítios de ligação ao ribossomo, sinais de poliadenilação, seqüências de témino de transcrição, domínios regulatórios à montante, acentuadores, e os semelhantes, que coletivamente sustentam a transcrição e tradução de uma seqüência de codifieação em uma célula hospedeira. "Ácido nucléico recombinante" é um ácido nucléico que não é naturahnente ocorrente, ou que é feito pela combinação artificial de dois segmentos de seqüência de outra inaneira separados.

Esta combinação artificial Heqüentemente é realizada ou por meio de síntese química, ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, e.g., por técnicas de engenharia genética.

Isto pode ser feito para substituir um códon por um códon redundante codificando o mesmo aminoácido ou um conservativo, enquanto tipicamente introduzindo ou removendo um sítio de reconhecimento de seqüência.

Altemativamente, isto é realizado para unir segmentos de ácidos nucléicos de fünções desejadas para gerar uma combinação desejada de fúnções.

Um polipeptídeo produzido como um produto de expressão de uma seqüência genética isolada e manipulada é um "polipeptídeo isolado", como usado neste lugar, mesmo se expresso em um tipo de célula homóloga. Formas ou moléculas feitas sinteticamente expressas por células heterólogas são inerentemente moléculas isoladas.

5 "Polipeptídeos recombinantes" se referem a polipeptídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante ou ácido nucléico recombinante; i.e., produzidos a partir de células transformadas por uma constmção de DNA exógeno codificando o polipeptídeo desejado. Uma "seqüência de promotor" ou "promotor" é uma região reguladora de DNA capaz de ligar RNA polimerase em uma cél'ula e iniciar transcrição de uma seqüência de codificação à jusante (direção 3'). Para propósitos de deftnir a presente invenção, a seqüência de promotor é Iigada no término 3' pelo códon de início de tradução (ATG) de uma seqüência de codificação e se prolonga à montante (direção 5') para inclui.r o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar e regular transcrição ' apropriadamente em níveis detectáveis acima de histórieo. Dentro da seqüência de promotor será encontrado um sítio de início de transcrição assim como domínios de ligação de proteínas responsáveis pela ligação de RNA polimerase. Promotores eucarióticos heqüentemente, mas não sempre, irão .. conter caixas "TATA" boxes e caixas "CAT". Promotores procarióticos podem conter seqüências Shine-Dalgamo em adição às seqüências consenso - lO e -35. "Operacionalmente ligado" se refere a uma justaposição de componentes caracterizado pelo fato de que os componentes assim descritos estão em uma relação perrnitindo que eles hmcionem em sua maneira almejada. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma seqüência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da seqüência de codificação.

Duas seqüências de DNA ou polipeptídeos são "substanciahnente homólogas" quando pelo menos cerca de 85%, a menos que especificamente determinado de outra maneira, (preferivelmente pelo menos cerca de 9Ô°/o, e niais preferivelmente pelo menos cerca de 95%) dos 5 nucleotídeos ou aminoácidos coineidem ao longo de um comprimento definido da molécula. Seqüências de DNA que são substanciahnente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southem, por exemplo, em condições estringentes, confome definido para " aquele sistema particular. Definir condições apropriad.as de hibridização está dentro do verso da arte. O termo "füncionalmente equivalente" pretende que a seqüência de aminoácidos da proteína codificada seja uma que irá produzir uma resposta biológica equivalente à resposta biológica do imunógeno ou proteína especificado, geralmente uma proteína nativa. Em alguns casos, esta resposta biológica será uma resposta imunológica. Em alguns casos, esta resposta biológica se refere à capacidade de uina proteína codificada de suprimir uma resposta imunológica em um hospedeiro. "Não fimcionalmente equivalente" se refere a uma resposta biológica que não é equivalente à resposta biológica mediada pela proteína nativa. Adicionalmente, uma seqüência de genes é füncionahnente equivalente a outra seqüência de genes se ela codifica um polipeptídeo idêntico ou um polipeptídeo que por si só é fúncionalmente equivalente. O termo "polipeptídeo" é usado em seu sentido mais amplo, i.e., qualquer polímero de aminoácidos (dipeptídeo ou maior) Iigados através de ligações peptídicas. Assim, o termo "polipeptídeo" inclui proteínas, oligopeptídeos, fragmentos de proteínas, análogos, muteínas, proteínas de fijsão e os semelhantes. Uma "glicoproteína" é uni polipeptídeo glicosilado.

Proteínas ou polipeptídeos "nativos" se referem a proteínas ou polipeptídeos com seqüências idênticas àquelas de proteínas BHV-I tipo selvagem e Èagmentos destas. Um gene "nativo" é um gene tendo uma seqüência de nucleotídeos idêntica a um gene ou Fagmento deste encontrado em BHV-I tipo selvagem. "Modificação" de um gene como usado neste lugar significa 5 mutação, substituição ou deleção de uma seqüência de nucleotídeos codificando um gene ou um &agmento deste para uma proteína BHV-I, que resulta em uma proteína de BHV-I não füncionahnente equivalente se comparada com proteína de BHV-I ancestral. Um gene que . foi completamente deletado ou foi parcialmente deletado também passou por modificação. Um gene que foi completamente deletado geralmente não codifica uma proteína. Um gene que foi parcialmente deletado pode codificar uma proteína modificada. Modificação de um gene também pode incluir uma inserção de uma ou mais seqüências em um gene. Modificação de um gene pode incluir combinações de tipos individuais de modificações ou mutações.

Em um exemplo, parte de um gene pode ser deletada e uma seqüência adicional pode ser inserida na localização da deleção original ou em outra localização dentro do gene. Seqüências de proteínas também podem ser modificadas.

Proteínas modificadas podem ser codificadas por genes modificados. Uma proteína modificada geralmente tem uma seqüência de aminoácidos diferente do que a proteína não modificada ou nativa. Em alguns casos, uma proteína modificada não terá a mesma fúnção que a proteína nativa. Neste caso a proteína modificada também pode ser uma proteína não fúncionalmente equivalente, se comparada com BHV-I ancestral. A proteína modific.ada pode ter mutações, substituições ou deleções de aminoácidos se comparada com BHV-I ancestral. Em certas formas de realização, um gene ou proteína será modificado se ele resulta em uma proteína que não é fíincionahnente equivalente a um gene ou proteína tipo selvagem. Técnicas para modificar genes e proteína, tal como construções de deleção gênica e cromossomos artificiais bacterianos (BACs) são bem conhecidas dentro da arte e não pretendidas para serem limitantes.

Qualquer método para modificar os genes ou seqüências de proteínas da presente invenção pode ser usado.

Por exemplo, qualquer técnica de modificação que resulta em uma proteína não 5 fúncionalmente equivalente pode ser usada.

Uma modificação gêniea também pode incluir alterações, não à seqüência de codificação de um gene, mas a uma seqüência regulatória que afeta o nível de expressão do gene.

Em um exemplo, uma modificação deste tipo pode resultar em regulação descendente de expressão de um gene.

Dentro do contexto desta invenção, os tipos de modificações que podem ser feitas em um gene específico podem depender, em parte, da fünção da proteína codificada.

Em um exemplo, a proteína codificada por um gene de BHV-I particular pode ser conhecida por suprimir resposta imunológica de um hospedeiro a um antígeno administrado com BHV-I.

Portanto, pode ser desejado deletar o gene de forma que nenhuma proteína seja expressa a partir do gene (e.g., deleção gênica completa). Entretanto, pode ser que ausente a proteína codificada pelo gene de BHV-I particular, o BHV-I seja muito virulento para ser usado como uma linhagem de vacina.

Uma maneira, mas não a única maneira, que isto pode ocorrer é se a proteína codificada pelo gene de BHV-I particular é um imunógeno forte que, em parte, estimula uma forte resposta imunológica no hospedeiro.

Ausência desta proteína do víms pode resultar em uma incapacidade do hospedeiro de montar uma resposta imunológica suficiente para manter o virus infectante sob controle.

Doença ou outros efeitos colaterais deletérios podem ocorrer no hospedeiro.

Uma solução potencial para este problema pode ser modificar o gene de BHV-I particular de forma que a proteína codificada ainda é imunogênica, mas é incapaz de supriniir resposta imunológica de um hospedeiro.

Desta maneira., o hospedeiro ainda pode ser capaz de montar uma resposta imunológica suficiente para inanter o vírus BHV-I infectante sob controle, mas a fúnção da proteína para suprimir uma resposta imunológica do hospedeiro é desativada.

Podem existir outros cenários onde nem todo tipo de modificação em um gene de BHV-I particular conhecida por suprimir o sistema imune do hospedeiro pode ser usada.

Alguém de verso na arte terá

5 conheeimento de métodos para identificar e solucionar este e problemas similares.

Como usado neste lugar, uma "proteína relacionada a MHC" é qualquer proteína diretamente envolvida na via de processamento de antígenos e apresentação através de uma molécula de MHC classe I ou MHC classe II.

Estas proteínas são bem conhecidas para aqueles versados na arte.

Assim, uma proteína relacionada a MHC pode ser não apenas uma molécula de MHC mas também, embora não limitado a, proteínas ativas no transporte de antígenos para apresentação de MHC classe I tal como proteínas transportadoras associadas ao processamento de antígenos (TAP) de um animal hospedeiro.

Um "gene marcador" se refere a um gene que pode ser usado para diferenciar animais infectados de animais vacinados.

Como usado neste lugar, genes marcadores diferem de genes tipo selvagem de uma maneira que pode ser medida usando um teste diagnóstico.

Uma vacina marcadora é uma vacina contendo pelo menos um gene marcador.

Em uma forma de realização da presente invenção, os genes marcadores serão ou BHV-I UL49.5, BHV-I UL41, BHV-I US4, ou BHV-I Circ.

Em outras formas de realização, o gene marcador pode ser BHV-I Us8. Genes marcadores em vacinas podem ser usados para uma vacina "DIVA" (DifferenüatMg Infected Hom Vaccinated

Animals) como é conhecido na arte.

Em um exemplo, um teste diagnóstico pode ser projetado e usado para diferenciar entre uma vacina de BHV-I administrada (vacina DIVA) e um BHV-I que naturalmente infectou o hospedeiro.

"Análogo mutante" de uma proteína ou gene de BHV-I como usado neste lugar signinca uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos ou um gene tendo uina seqüência de nucleotídeos qualquer que difere da seqüência de proteína ou gene de BHV-I tipo selvagem em uma ou mais

5 modincações.

Um "hospedeiro" se refere a um animal capaz de naturalmente adquirir infecção por BFN-I.

Assim, um hospedeiro é um para o qual pode ser desejável imunizar contra infecção por BHV-I, quer ou não o hospedeiro já esteja infectado ou latentemente infectado por BHV-I.

Geralmente o hospedeiro é um ungulado.

Um hospedeiro ungulado pode ser bovino, o que inclui gado de qualquer raça e qualquer idade.

Um hospedeiro bovino abrange bezerros assim como gado a.dulto, e é pretendido para incluir bois, touros, novilhos, vacas e bezerros.

Bovino ou gado também podem incluir animais bovinos prenhes e lactantes.

Aplicações veterinárias são claramente contempladas pela presente invenção.

Em algumas fomas de realização, as composições e vacinas da presente invenção não serão dadas a um hospedeiro que esteja prenhe, lactante, ou com cerca de três meses de idade.

Em certas fomias de realização, as composições e vacinas da presente invenção serão dadas a hospedeiros que estão com ou cerca de um mês de idade.

Em formas de realização ainda adicionais, as composições e vacinas da presente invenção serão dadas a animais prenhes.

Nestas forinas de realização, as composições e vacinas podem ser dadas para prevenir infecção fetal.

Em outras formas de realização, a composição e vacinas não serão dadas a um hospedeiro dentro de aproximadainente 30 dias de procriação.

Um "antígeno" se refere a uma molécula contendo um ou mais epítopos que irão estimular o sisteina imune de uin hospedeiro a fazer uma resposta secretória, humoral e/ou celular antígeno-específica.

O temo é usado permutavelniente com "imunógeno". O antígeno específico pode ser uma proteína, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um lipopeptídeo ou outras moléculas; ou ele pode ser uma combinação de qualquer destes.

Outras combinações são possíveis.

Particulannente, o antígeno específico pode incluir uma proteína ou fragmento de proteína natural, ou uma proteína ou fragmento de proteína ou peptídeo sintético; ele pode incluir glicoproteína,

5 glicopeptídeo, lipoproteína, lipopeptídeo, nucleoproteína, nucleopeptídeo; ele pode i.ncluir um conjugado peptídeo-peptídeo; ou ele pode incluir um produto de expressão de ácido nucléico recombinante.

Exemplos não limitantes de antígenos incluem, sem limitação, aqueles que são capazes de produzir uma resposta imune contra herpesvírus bovino viral, vírus respiratório bovino,

vírus da diarréia viral bovina, coronavírus bovino, e linhagens bacterianas comumente associada com "febre do transporte". O termo "quantidade efetiva de um imunógeno" define uma quantidade de imunógeno capaz de produzir uma resposta imune humoral, secretória, e/ou celular mediada demons'trável.

A quantidade apropriada de imunÓgeno a ser usada é dependente do iniunógeno específico e é bem conhecida na arte.

O tenno "epítopo" se refere ao sítio em um imunógeno ou hapteno ao qual uma molécula específica de anticoIpo se liga ou é reconhecida por células T.

O termo também é usado permutavelmente com

"determinante antigênico" ou "sítio de determinante antigênico." Uma "resposta imunológica" é o desenvolvimento no indivíduo de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo.

Nomalmente, uma tal resposta inclui, mas não é limitada a, um ou mais dos seguintes efeitos; a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares,

células T supressoras, e/ou células T citotóxicas e/ou células yõT, dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse.

Há muitos componentes que podem resultar nas respostas imunes conforme defínido por anticorpos, células B, células T e os semelhantes, como descrito na &ase anterior.

Mensuração destes componentes pode ser usada para interferir se ou não uma resposta humoral, celular, combinação de humoral e celular, ou outra existe ou é alterada. Por exemplo, uma resposta imune humoral ou celular, que pode assumir a forma de anticoípos específicos ou células T citotóxicas antígeno-específicas, 5 respectivamente, pode ser afetada uma variedade de componentes. Um componente pode ser a capacidade de um epítopo específico de ser "apresentado" a células T no contexto de moléculas de MHC classe I e/ou MHC classe II na superficie de células aprese.ntadoras de antígenos (APCs) ou outras células. Portanto, a presença ou níveis de moléculas de MHC classe I e/ou MHC cIasse II podem indicar a capacidade de um organismo de montar um tipo específico de resposta imune. Também, alterações nos níveis de moléculas de MHC classe I e/ou MHC classe II ao longo do tempo ou em diferentes situações podem permitir inferência em se um tipo específico de resposta imune existe ou pode existir.

Outro componente de uma resposta imunológica é a capacidade de um antígeno, que já foi apresentado ao sistema imune de um organismo e estimulou uma resposta imune primária, para estimular uma resposta imune secundária ou para "relembrar" a resposta imune primária.

Quando um antígeno é usado para relembrar "uma resposta imune, várias citocinas podem ser secretadas por células imunes envolvidas no processo. Em uma instância, mensuração de alterações em interleucina-2 (IL-2) pode ser usada para inferir se e em qual grau um imunógeno relembrou uma resposta imune primária. Memória de uma resposta imune pode ser proporcional à quantidade de IL-2.

Em relação a uma resposta imune humoral, uma característica de se esta resposta imune existe e pode ser protetora contra um patógeno, por exemplo, pode ser os níveis de anticorpos no soro que são específicos para um antígeno do patógeno. Em adição a níveis de anticoIpos, os isotipos específicos de anticorpos ou combinação de isotipos ou, para um dado isotipo de anticorpo, o subtipo ou subclasse específico, ou combinação ou proporção de subtipos ou subclasses específicos podem ser informativos. Em um exemplo, soro pode conter diferentes subtipos do isotipo IgG. O subtipo IgGl pode ser um anticorpo que é neutralizante para um antígeno específico (e, 5 portanto, concebido como protetor). O subtipo IgG2 pode ser um anticorpo que não é neutralizante para uin antígeno específico (e, portanto, não protetor ou menos protetor do que o subtipo IgGl). Neste exemplo, portanto, uma maior proporção de IgG1/lgG2 (para IgG específico para um dado antígeno) pode indicar o potencial para uma melhor resposta imunológica a um dado "10 antígeno do que uma proporção menor de IgGl/lgG2.

V Uma resposta imunológica, ou componentes de uma resposta imunológica, normalmente são medidos com imunoensaios. Um aumento em resposta imunolÓgica pode ser medido contra a resposta imunológica seguindo infecção com BHV-I tipo selvagem ou infecção com vacinas de 15 BHV-I comercialmente disponíveis. Depressão de uma resposta imunológica pode ser inedida se comparada com infecção com vacinas de BHV-I comercialmente disponíveis ou células não infectadas. Em algumas fonnas de realização, depressão de resposta imunológica será determinada avaliando expressão em superfície de célula de MHC classe I. Em outras formas de realização, depressão de resposta imunológica será determinada avaliando expressão citoplasmática de célula de MHC classe I, com ou sem expressão em superficie de célula. Em outras formas de realização, depressão de resposta imunológica será determinada avaliando expressão de MHC classe II. Em fonnas de realização adicionais, depressão de resposta imunológica será determinada avaliando citocinas e outros indicadores de resposta imune, tal como medindo imunossupressão de resposta de um hospedeiro a imunógenos co-administrados como um indicador. Métodos usados para medir resposta imunológica, e componentes de respostas imunológicas, são bem conhecidos na arte e não pretendidos para serem limitantes.

Os termos "polipeptídeo imunogênico" e "seqüência de aminoácidos imunogênica" se referem a um polipeptídeo ou seqüência de aminoácidos, respectivamente, que produzem anticorpos que neutralizam infectividade viral, e/ou mediam citotoxicidade celular dependente de 5 complemento de anticorpo ou anticorpo ou imunidade celular mediada para fomecer proteção de um hospedeiro imunizado.

Um "polipeptídeo imunogênico" como usado neste lugar inclui a seqüência de comprimento completo (ou comprimento quase completo) da proteína inserida ou um fragmento imunogênico desta.

Por "hagmento imunogênico" é pretendido um fragmento de um polipeptídeo o que inclui um ou mais epítopos e assim

. produz antieorpos que nelItra1izaIn infectividade viral, e/ou mediam citotoxicidade celular dependente de complemento de anticorpo ou anticorpo ou imunidade celular mediada para fomecer proteção de um hospedeiro imunizado.

Estes Eagmentos normalmente serão de pelo menos cerca de 5 aminoácidos de comprimento, e em certas fomas de realização pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos de eomprimento.

Não existe nenhum limite superior crítico para o comprimento do fragrnento, que pode compreender quase o comprimento completo da seqüência de proteína, ou mesmo uma proteína de füsão conipreendendo Hagnientos de dois ou mais antígenos de subunidades.

Os termos "tratamento" e "tratado" como usado neste lugar se referem à administração a um indivíduo de uma composição que ou previne infecção ou reinfecção (profilaxia), ou reduz ou elimina os sintomas de BHV- I (terapia) ou outras doenças associadas com imunógenos adicionais.

Como usado neste lugar, tratamento também ocorre se o ciclo latência-reativação de BHV-I é reduzido ou prevenido como medido por excreção viral seguindo reativação se comparado com reativação seguindo infecção de BHV-I tipo selvagem.

Por exemplo, um animal hospedeiro foi tratado se a quantidade de BHV-I excretado em fezes ou durante infecção primária ou durante latência é reduzida ou eliminada.

Um animal hospedeiro também foi tratado se o tempo de infecção latente é reduzido.

Sucesso deste tratamento pode ser medido por uma redução de excreção ocular ou excreção reduzida de vírus infeccioso na amígdala ou TG. 5 "Ciclo latência-reativação" se refere ao processo de estabelecimento de latência, manutenção de latência, e reativação de BHV- l.

Estabelecimento de latência inclui infecção aguda.

Manutenção de latência é ,. uma fase que dura pela vida do hospedeiro e pode ser operacionalmente

' definida como um período quando vírus infeccioso não é detectado por "10 procedimentos padrão de isolamento de vírus. "Reativação" e "reativação de

. latência" se referem ao processo de reativação viral seguindo administração exógena de corticosteróides ou níveis elevados de corticosteróides naturais como uma conseqüência de estresse.

Imunossupressão também pode estimular expressão gênica viral a causar reativação.

Mediante reativação, 15 expressão gênica viral abundante pode ser detectada em neurônios sensoriais, e vírus BHV-I infeccioso pode ser isolado de gânglios trigeminais, esHegaços ofíálmicos, e/ou eshegaços nasais.

Durante reativação, vírus é translocado de volta ao sítio inicial de infecção, a partir do qual ele pode se espalhar a outros hospedeiros susceptíveis.

A capacidade de reativar a partir de latência resulta em doença recorrente e transmissão de víms.

Um víms foi "atenuado" quando a linhagein do vírus tem patogenicidade e/ou virulência reduzida de forma que ele irá iniciar uma resposta imunológica sem produzir a doença específica.

Como usado neste lugar, uma vacina viva modincada (MLV) é uma vacina contendo vírus vivo que foi atenuado.

Em algumas formas de realização, as vacinas da invenção serão adicionalmente atenuadas.

Um virus adicionalmente atenuado exemplar é um que tem uma redução ou eliminação da febre, linfopenia, queda na produção de leite, queda no consumo alimentar, aborto em bezerras grávidas e viremia fatal em bezerros de menos do que 3 dias de idade se comparado com vacinação com uma vacina convencional de vírus vivo atenuado. Em certas formas de realização, vírus BHV-I será adicionalmente atenuado. Um "veículo farmaceuticamente aceitável" é formulado para ser compatível com sua via de administração pretendida e é pemutável neste 5 lugar com o termo "carreador veterinariamente aceitável" ou "veículo veterinariamente aceitável". Exemplos de vias de administração incluem parenteral, e.g., intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (e.g., inalação), transdérmica (tópica), transmucosal, retal, e outras administrações. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérinica, ou subcutânea íO podem 'incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal c.omo água . para injeção, solução salina, Óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como ácido etilenodiaminotetracético; tampões tal como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Uma preparação parenteral pode ser embutida em ainpôlas, seringas descartáveis ou hascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico.

Uma "modificação por deleção" ou "mutante de deleção" inclui seqüências de genes com deleção de pelo menos um nucleotídeo, geralmente no quadro de leitura aberta de uma proteína. Como alguém de verso na arte irá entender, em certos casos, u.ma mutação por deleção pode incluir uma mutação pontual. Em certas formas de realização, um mutante de deleção tem expressão protéica nocauteada ou eliminada da proteína codific.ada pela seqüência de nucleotídeos modincada. Em outras formas de realização, um mutante de deleção resulta em uma proteína, que embora expressa, não é fimcionalmente equivalente à proteína tipo selvagem. Em algumas formas de realização, mutantes de deleção estarão perdendo a seqüência de genes inteira.

Estes mutantes de deleção podem ser chamados de deleções completas.

Em outras formas de realização, os mutantes de deleção estarão perdendo menos do que 1°/,, I °/,-S°/,, 5°4-10°4, ou mais da seqüência gênica.

Estes mutantes de deleção podem ser chamados de deleções parciais. 5 Em certas fonnas de realização, a deleç"o será uma deleção pontual conforme definido por deleção de um único nucleotídeo.

Uma modificação por deleção ou mutante de deleção também podem incluir mais do que uma deleção de um único nucleotídeo.

Um "gene repórter" pode ser qualquer seqüência a expressão "10 da qual pode ser detectada ou medida, outra do que a seqüência de

- codificação a qual o promotor naturahnente é operacionahnente ligado.

Tipicamente, o gene repórter é heterólogo à eélula na qual atividade de promotor é medida.

Exemplos de genes repórteres incluem, sem limitação, genes que codificam proteína verde fluorescente (ou qualquer outro marcador fluorescente), cloranfenicol acetil transferase (cat), j3-glucuronidase (gus), ]3" Galactosidase (lacZ), luciferase, e os semelhantes.

Expressão de gene repórter pode ser medida por qualquer dos diversos métodos convencionais, e o método ótimo irá depender de fatores tais como a natureza e fünção do gene repórter.

Em geral, ensaios adequados de expressão de gene repÓrter incluem métodos tal como (i) ensaiar a fúnção de um produto do gene repórter (e.g., medir uma reação enzimática catalisada por um produto do gene repÓrter); (ii) medir o nível de proteína expressa a partir do gene repórter (e.g., por SDS- PAGE ou em um imunoensaio usando anticorpos (e.g., anticoípos policlonais ou monoclonais) que se ligam especinc.a1nente ao produto do gene repórter); e (iii) medir o nível de niRNA transcrito a partir do gene repórter.

Estão incluídos dentro da invenção ensaios que permitem triagem em larga escala de compostos de teste.

Em um exemplo, expressão de GFP ou EGFP pode ser detectada por visualização de Morescência verde em luz branca.

Vírus BHV-I modificados

Em temos gerais, em muitas formas de realização, a presente invenção envolve a modificação de genes de BHV-I de vírus BHV-I vivos modificados de vacina de foma a prevenir ou diininuir a imunossupressão do hospedeiro vista em infecção com vírus BHV-I tipo selvagem ou de vacina.

5 Em um exemplo, as modificações de BIIV-I resultam em um vírus que é menos capaz ou incapaz de diminuir ou suprimir uma resposta imunológica específica para ou contra um imunógeno que é administrado com BHV-I. Em um exemplo, as modincações de BHV-I resultam em vírus que, quando administrado com um imunógeno não BHV-I adicional, resulta em uma "10 resposta imunológica contra o imunógeno adicional que é mais robusta do que . a resposta imunológica que resulta quando o imunógeno adicional é administrado sozinho (sem BHV-I). Geralmente, o BHV-I usado na invenção é um vírus vivo. Este vírus pode ser ou não atenuado. Em certas formas de realização, vírus BHV-I 15 modificado morto pode ser usado. Esta invenção tainbém fomece um método de aliviar imunossupressão de resposta do hospede'ro a imunógenos adicionais ou co-administrados e/ou em uma vacina de combinação. A invenção também fomece um método de tratar um animal hospedeiro com as vacinas inventivas. A invenção inclui eomposições e vacinas compreendendo genes de BHV-I modificados cara.cterizados pelo fato de que os genes são modificados a fim de tratar depressão de resposta imunológica do hospedeiro diirante infecção por heípesvírus bovino e/ou para aliviar imunossupressão de resposta do hospedeiro a um imunógeno adicional ou co-administrado e/ou em uma vacina de combinação. Na maioria das formas de realização, vacinas para tratar tanto subtipos BHV-1.1 como BHV-1.2 estão abrangidas pela invenção. Métodos de usar as vacinas da presente invenção também são previstos. Muitos, mas certamente não todos, genes BHV-I ativos em suprimir o sistema imune têm homólogos celulares, permitindo que eles sejam fàcilmente reconhecidos.

Em certas formas de realização, a modificação será em genes que desempenham um papel em processamento e apresentação de imunógeno MHC.

MHC classe I são moléculas apresentadoras de antígenos . encontradas em todas as células nucleadas de vertebrados, ao passo que MHC

5 classe II são moléculas apresentadoras de antígenos encontrad.as essencialmente em macrófagos e linfócitos B.

Modificações podem ocorrer em genes envolvidos tanto com fúnções de MHC classe I como MHC classe II.

Em muitas formas de realização, genes de BHV-I modificados "10 serão genes que codificam proteínas que causam regulação descendente das

- proteínas relacionadas a MHC do hospedeiro e/ou evadem resposta imune do hospedeiro ao vírus por evasão do sistema imune do hospedeiro.

Exemplos destes tipos de genes incluem BHV-I UL49.5 [SEQ ID NO.:l], BHV-I UL41 [SEQ ID NO.:3], e BHV-I Circ [SEQ ID NO.:5]. Em ainda outras formas de realização, os genes modificados codificam proteínas que suprimem fünção imune através de regulação de complemento, ação em crescimento celular e/ou interferência em expressão de interferon.

Acredita-se que Us4 de BHV-I [SEQ ID NO.:ll] seja imunomodulador através de sua fünção como uma proteína de ligaçã.o à quimiocina.

O gene UL49.5 de BHV-I codifica uma protema homóloga à glicoproteína altamente conservada N (gN), encontrada em todos os herpesvírus conhecidos. gN desempenha um papel em regulação descendente de MHC classe I na superfície celular, permitindo assim que BHV-I evada apresentação de antígenos e ativação do sistema imune do hospedeiro.

Lipinska et al. (2006) J.

Virol. 80:5822, por aqui incoiporado por referência, descreve o gene UL49.5 de BHV-I em detalhe.

O gene UL41 de BHV-I codifica uma proteína homóloga a protema do tegumento que desliga hospedeiro ou "virion host shutoff" (vhs).

A proteína do tegumento que desliga hospedeiro parece desempenhar uni papel em irnunossupressão regulando de forma descendente a expressão de mRNA de MHC Classe I. Gopinath et al. (2002) Viral Immun. 15: 595, descreve modificação de UL41 de BFIV-I.

5 O gene Circ de BHV-I codifica uma proteína homóloga a proteína miristilada do tegumento. Proteína miristilada do tegumento de BHV-I parece regular de forma descendente expressão de MHC Classe II. Schwyzer et al. (2002) Vet. Microbiol. 86:165, descreve Circ. O gene US4 de BHV-I codifica uma proteína honióloga a "10 glicoproteína(g)G, uma proteína de ligação à quimiocina. Bryant et al. (2003) . EMBO J. 22:833, descreve Us4. O gene US9 de BHV-I codifica uma proteína provavelmente envolvida em transporte anterógrado de gânglios trigeminais a sítios nasais durante reativação de latência. Os genes LR-ORF 1 e 2 de BHV-I ou ORF's relacionados à latência estão iniplicados em desenvolvimento de infecção latente e persistência viral em gânglios trigeminais. O gene Us8 de BHV-I codifica uma proteína homóloga a g1icoproteína(g)E, uma proteína que segundo se acredita inibe resposta imune mediada por IgG. Modificações de todos os genes nomeados acima são contempladas pela invenção descrita. Em uma forma de realização, um vírus BHV-I modificado pode ter uma modincação em um único gene. Em outras formas de realização, um vírus BHV-I niodificado pode ter modificações em dois, três, quatro, ou mesmo mais genes separados. Em muitas formas de realização, modificação de genes ativos em apoptose estará em conjunção com modificação de genes ativos em processamento de MHC e nestas outras fonnas de realização, embora não limitante, a modificação pode estar em genes que suprimeni resposta imunológica através de ou indução ou supressão de apoptose ou morte celular programada. Como um exemplo não limitante, modificação pode ocorrer em UL49.5 e em LR-ORF 1 [SEQ ID NO.: 7]. Em ainda outras fomas de realização, modificação pode ocorrer em UL49.5, Us4, e em LR- 5 ORF 1 ou simplesmente em UL49.5 e Us4. Em ainda outra fonna de realização, modificação pode ocorrer em UL49.5 e UL41. É entendido que estas fonnas de realização são exemplares apenas e diferentes combinações de genes imunossupressores são contempladas pela invenção. Em certas formas de realização, composições serão escolhidas baseado na capacidade de genes "10 modificados de atuar sinergisticamente para estimular resposta iinune.

. Em certas formas de realização, composições e vacinas irão incluir pelo menos um UL49.5 de BHV-I, Us4 de BHV-I, UL41 de BHV-I, e/ou Circ de BHV-I modificado. Estes genes modificados gerahnente são reconhecidos por aliviar imunossupressão. Em algumas formas de realização, todos os quatro genes serão modificados. Ein outras fomias de realização, um, dois ou três genes serão modificados. Os genes podem ser modificados em qualquer combinação. Como um exemplo não limitante, em composições ou vacinas onde dois dos genes foram inodificados, estes genes podem ser UL49.5 de BHV-I e UL41 de BHV-I, UL49.5 e Us4, UL41 e Us4, assim como Circ de BFIV-I e UL49.5 de BHV-I. Em formas de realização que incluem modificações em genes ativos em aliviar imunossupressão, modificações em LR-ORF 1 e 2 de BHV-I [SEQ ID NO.: 9J e US9 de BHV-I [SEQ ID NO.: 13] também podem ocorrer. Inversamente, podem existir composições e vaeinas onde modificações ocorreram apenas em LR-ORF 1 e 2 BHV-I e/ou Us9 de BHV-I. É e.ntendido que modificação pode ocorrer tanto em LR-ORF 1 e 2 de BHV-I como US9 de BHV-I. Acredita-se que LR- ORF 1 e 2 de BHV-I e Us 9 de BHV-I sejam- ativos na prevenção/redução de latência e a excreção de BHV-I. Em ainda outras formas de realização, genes marcadores podem ser modificados ou em conjunção com as modiftcações dos genes ativos em imunossupressão e/ou dos genes ativos na prevenção/redução de latência e a excreção de BHV-I ou em conjunção com modificação tanto em genes de imunossupressão como de Iatência. O gene marcador pode ser Us8 de BHV-I [SEQ ID NO.: 15]. Em uma única forma de 5 realização, a vacina pode consistir de três modificações em genes envolvidos em imunossupressão, duas modificações em genes envolvidos em latência, e um gene marcador. As únicas limitações nas combinações de genes modificados são que os imunógenos resultantes devem ser compatíveis tanto no animal como na preparação de vacina. q .

"10 Métodos para a preparação e avaliação de genes e proteínas . modificados dentro da presente invenção são bem conhecidos na arte. Exemplos não limitantes de técnicas de modificação incluem modificação de seqüências de DNA de forma que haja (1) substituição de um ou mais aminoácidos por outro, por exemplo, substituição por um resíduo isostérico 15 tendo uma fünção diferente, e.g., substituir Asn por Asp; um resíduo tendo uma fünção idêntica, mas uma estrutura primária, secundária ou terciária diferente, e.g., Asp por Glu; quebradores de hélices tal como Pro; substituição de aminoácidos glicosilados por aminoácidos não glicosilados e os semelhantes ou vice versa; substituindo Cys por outro resíduo para deletar formação de pontes dissulfeto; e (2) adição ou deleção de um ou mais aminoácidos para produzir diferenças isostéricas, fúncionais ou estmturais nas proteínas. Alterações na estrutura primária incluein alterações de hidrofobicidade ou hidrofilicidade, alterações na estrutura secundária incluem alterações de enovelamento local e alterações na estrutura terciária incluem alterações na estrutura 3-D de uma proteína. Em muitas formas de realização, estas alterações na estmtura irão resultar em proteínas nocauteadas ou proteínas incapazes de fúncionar equivalentemente à proteína tipo selvagem. Em algumas formas de realização, os genes irão resultar em imunossupressão de vias não relacionadas a MHC e.g. Us4, UL41. Nestas outras formas de realização, embora não limitante, a modificação pode estar em genes que suprinieni a resposta imunológica através de ou indução ou supressão de apoptose ou morte celular prograrnada.

Por exemplo, quando apoptose ocorre em subconjuntos de leucócitos, incluindo células CD4+, o 5 sistema imune do hospedeiro é suprimido.

Genes ativos nesta ativação de apoptose incluem blCPO (Geiser et al. (2008) Microb.

Pathog. 44: 459). Em algumas formas de realização, modificações estarão em genes que codificam blCPO (Jones et al. (2006) Vet.

Microb. 113: 199). Em ainda outras formas de realização, modificações podem estar nos genes relacionados à latência tal "10 como LR-ORF 1 e 2 de BHV-I e Us49 de BHV-I.

Outras vias não

- relacionadas a MHC podem incluir modificação de genes tal como LR-ORF 1 de BFIV-I e Us9 de BHV-I.

Todas as formas de realização da presente invenção são previstos como possíveis em diferentes BIN-I ancestrais.

Por exemplo, o BHV-I ancestral pode ser a linhagem Cooper (tipo selvagem) ou inversamente pode ser uma linhagem tal como BHV-I GL756, encontrada em vacinas comercialmente disponíveis.

GL756 é um exemplo de um vírus BHV- l vivo modificado convencionalmente derivado.

Outros vírus BHV-I vivos modificados convencionahnente derivados são contemplados.

Estas linhagens exemplares não são pretendidas para serem limitantes e as fonnas de realização podem usar como base qualquer linhagem de BHV-I capaz de infectar um hospedeiro.

Nas vacinas da invenção, o BHV-I de base comumente será um vírus vivo ateriuado ou modificado.

Em certas formas de realização, o BHV-I de base será vírus morto.

Em certas formas de realização, a depressã.o de resposta imunológica do hospedeiro será medida contra resposta imunológica vista seguindo infecção com BHV-I tipo selvagem ou infecção com um imunógeno adicional.

Em formas de realização altemativas, a depressão de resposta imunológica do hospedeiro será medida contra infecção com BHV-I GL756 ou infecção com BHV-I linhagem Cooper.

Uma variedade de métodos de mensuração de resposta imunológica do hospedeiro, tal como ensaios imunoenzimáticos indiretos (ELISAs) ou mensuração de expressão de MFIC, são previstos e bem conhecidos por aqueles na arte. 5 Em certas formas de realização, as composições da invenção são colocadas em um vetor adequado para produzir o BHV-I contendo genes modificados in vivo.

Este vetor pode ser constru.ído em uma composição de vacina pela adição de um veículo famaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um adjuvante.

Tais formulações estão bem dentro do verso da "10 arte.

Vetores adequados podem incluir construções de cromossomos artificiais

. contendo os genes modificados.

Um exemplo de um cromossomo artincial é uni cromossomo artincial bacteriano (BAC), e.g., pBeloBAC1 1 ou pBAC108L; veja, e.g., Shizuya et al. (1992) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 89:8794; Wang et al. (1997) Biotechniques 23:992. Os componentes das construções de cromossomos artificiais podem ser reunidos usando métodos padrão.

Por exemplo, os genes de BHV-I modincados podem ser inseridos em um cromossomo artificial por co-transfecção de células com (i) uma construção contendo o cromossomo artificial, flanqueada por seqüências homólogas a regiões do genoma de BHV-I, e (ii) os genes de BHV-I, de forma que recombinação ocorre nas células, resultando em produção de um vírus recombinante incluindo o cromossomo artificial.

BHV-I recombinante pode ser isolado de células nas quais uma construção de cromossomo artificial e BHV-I forani co-transfectadas, levando à produção de um vírus recombinante por recombinação homóloga, e o BHV-I isolado pode ser manipulado para produzir os genes modificados de BHV-I, conforme desejado.

Métodos de clonagem direta, empregando sítios únicos no genoma de BHV-I e o cromossomo artificial, também podem ser usados para reunir os componentes do cromossomo artificial.

Para exemplos de cromossomos artificiais com genes exógenos inseridos, veja Publicação de Patente Norte-

Americana 2004-0 171569, neste lugar incotporada por referência. Nas formas de realização de vacinas da invenção, o vírus BHV-I recombinante, produzido mediante introdução da construção de cromossomo artificial em uma célula, não mata a célula. Instâncias específicas de incoiporação de genes 5 de BHV-I inodificados específicos em um vírus viável são descritas no exemplos 5 e 6 desta invenção. Formulações As composições imunogênicas e vacinas empregadas neste . lugar como contempladas pela presente invenção podem incluir um ou mais "10' carreadores veterinários aceitáveis. Tais carreadores veterinariamente . aceitáveis incluem qualquer solvente, meio de dispersão, agente de revestimento, adjuvante, estabilizante, diluente, agen.te antibacteriano, agente antifúngico, agente isotônico, agente de adsorção, agente de retardo e os semelhantes. Como usado neste lugar, carreadores veterinariamente aceitáveis 15 e veículos farmaceuticamente aceitáveis são usados permutavelmente. Diluentes podem incluir água, soro fisiológico, dextrose, etanol, glicerol, e os semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albuniina, entre outros. Um veículo farmaceuticamente aceitável, adequado para injeção parenteral, normalmente é não tóxico e não terapêutico. Exemplos de tais veículos são água, soro nsiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Veículos não aquosos, tal como Óleos fixos, Óleo de gergelim, oleato de etila, ou triglicerídeos também podem ser usados.

Veículos parenterais também podem assumir a forma de suspensões contendo agentes melhoradores de viscosidade, tal como carboximetikelulose sódica, sorbitol, ou dextrana. O veículo também pode conter quantidades mínimas de aditivos, tal como substâncias que aumentam isotonicidade e estabilidade química, tal como tampões e conservantes. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão tris, enquanto que exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico.

Formulações padrão serão ou líquidos injetáveis ou sólidos que podem ser absorvidos em um líquido adequado como uma suspensão ou solução para 5 injeção.

Assim, em uma formulação não líquida, o veículo pode compreender dextrose, albumina de soro humano, conservantes, etc., ao qual água estéril ou soro fisiológico podem ser adicionados antes de administração.

Qualquer material ou mistura de materiais solúvel ein água farmaceuticamente aceitável pode ser utilizado na invenç.ão.

O material "10 solúvel em água farmace'uticamente aceitável pode compreender um ou mais

. monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos ou carboidratos.

Exemplos incluem dextrose, manitol, fhitose, polifiutosano, polidextrose, dextrina, glicose, açúcar invertido, lactitol, lactose, isomalte, maltitol, maltose, maltodextrina, sorbitol, xilitol, sacarose, sucralose, manose, galactose, xilose, arabinose, fíutose, glucosamina, galactosamina, ramnose, 6-O-metil-D- galactose, 2-0-acetol-betajj-xilose, 2-acetamido-2-dioxi-beta-D-galactose-4- sulfato, N-acetilglicosamina, iduronato, manuronato, galacturonato de metila, galactose, arabinose, alfaj)-manopiranose e biopolímeros formados por ligação covalente entre uma ou mais unidades de monossacarídeo ou dissacarídeo.

Exemplos de carboidratos incluem alginato, amilose, eelulose, carragena, pectina.

Para conveniência, monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos e carboidratos podem ser coletivamente referidos como "açúcares". Outros materiais farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos na arte também podem ser utilizados.

Vários adjuvantes, um campo bem conhecido na arte, também podem ser empregados nas fonnulações de vacinas da presente invenção.

Adjuvantes podem incluir, mas não são limitados a: géis minera.is, e.g., hidróxido de alumínio; substâncias tensoativas tal como lisolecitina; glicosídeos, e.g., derivados de saponina tal como Quil A ou GPI-O1OO; polióis pluronic; poliânions; polímeros em bloco não iônicos, e.g., Pluronic® F-l27 (B.A.S.F., Estados Unidos da Aniérica); peptídeos; óleos minerais, e.g. Montanide ISA-50, carbopol, Amphigen®, Amphigen® Mark II (Hydronics, Estados Unidos da América), Alhydrogel® (BSA2; Accurate Scientific, 5 Westbury, NY), emulsões oleosas, e.g. uma emulsão de óleo mineral tal como BayolF/Arlacel A e água, ou uma emulsão de óleo vegetal, água e um emulsificante tal como lecitina; alume; citocinas bovinas; colesterol; e combinações de adjuvantes. Emulsões oleosas adicionais incluem uma emulsão de água em óleo, e uma emulsão de água em Óleo em água. Outros "10 adj uvantes ou agentes com propriedades de imunoestimulação ou . imunornodulação ou apresentação de antígenos, e produtos comerciais Impran"" (Boehringer Ingelheim Vetmedica, St. Joseph, MO), Emunade® (Schering-Plough Animal Health, Summit, NJ), MetaStim® (Fort Dodge An.imal Health, Overland Park, KS) e/ou Emulsigen® (MVP Laboratories, 15 Inc., Omaha, NE) também podem ser usados. Emulsigen D também pode ser usado. Na maioria das formas de realização, o tipo de adjuvante não é limitante contanto que ele não interfira em Beef Quality AssuranceTM. Quantidades e concentração de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelo artesão versado.

20 Adjuvantes podem ser usados de diferentes maneiras dependendo de como a vacina inventiva é administrada. Por exemplo, quando o BHV-I inventivo e um imunógeno não BHV-I adicional são co- administrados (e.g., BHV-I administrado em uma localização e o antígeno adicional administrado a outra localização do hospedeiro), o adjuvante pode 25 ser administrado com o imunógeno adicional, mas não com o BHV-I. Em outros exemplos, adjuvante pode ser admmistrado com o BHV-I, mas não com o imunógeno adicional. Tanto o BHV-I como imunógeno adicional podem ser administrados com adjuvante ou sem adjuvante (e.g., no caso onde BHV-I e imunógenos não BHV-I são administrados em um coquetel de combinação). Em alguns exemplos, BHV-I pode ser administrado com um adjuvante e imunógenos adicionais podem ser administrados com um adjuvante diferente.

Em algumas formas de realização, as vacinas da presente 5 invenção serão fomecidas em forma líquida.

Em outras fonnas de realização, as vacinas serão fomecidas como um pó seco.

Em formas de realização onde a vacina é fomecida como um pó seco, o usuário final da vacina pode reconstituir a vacina usando um diluente apropriado.

Diluentes são bem conhecidos na arte e podem incluir, mas não são limitados a, substâncias tal "10 como água estéril.

Em alguns casos, a vacina é preferivelmente usada dentro

- de um certo período de tempo, tal como 24 horas, uma vez que ela tenha sido reconstituída.

Administração e imunógenos adicionais Geralmente, as vacmas de BHV-I modificado serão 15 administradas com pelo menos um imunógeno adicional, ou através de co- administração e/ou através de administração de uma vacina de combinação.

Como usado neste lugar, um "imunógeno adicional" é um imunógeno outro do que um imunógeno BHV-I.

Além disso, ein certas formas de realização, um imunógeno adicional pode não compreender um gene exógeno inserido em um vetor de BHV-I.

Um imunógeno adicional pode estar em uma vacina co-administmda ou em uma vacina de combinação/coquetel, i.e. uma vacina com pelo menos dois tipos de imunógenos.

Estes imunógenos adicionais podem ser um único imunógeno de um ou mais patógenos particulares (bactérias, micoplasma, vírus, parasitas, etc.) ou podem incluir uma combinação de mais do que um imunógeno de um ou mais patógenos particulares.

As vacinas co-administradas e/ou de combinação podem ser preparações de células inteiras ou parc.iais e/ou preparações vivas modificadas e tais comumente são conhecidas por alguém de verso na arte.

Elas também podem incluir outras moléculas imunomoduladoras.

Exemplos não limitantes de patógenos e moléculas imunomoduladoras a partir dos quais imunógenos adicionais podem ser selecionados incluem, mas não são limitados a: vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV); I, II e III; Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV); Vírus da Parainfluenza 3 (PI3); Mannheimia haemolytica;

5 Histophilus somni (previamente Haemophilus somn.us) (H. somni); Rotavírus (BRV); Coronavírus (BCV); Mycoplasma bovis; Leptospirosis; Neospora caninum; Trichomonas spp.; Vibrio; antígenos clostridiais; Pasteurella multocida; Fusobacterium necrophorum; E. coli O157:H7; Salmonella enterica e citocinas imunomoduladoras tal como, por exemplo, interleucina- "10 1a (IL-I cl), interleucina-1j3 (IL-I |3), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-

- 4), fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), e interferons.

Confonne detenninado acima, em certas formas de realizaçã.o, imunógenos contra BVD estarão incluídos em vacinas co-ad'ministradas e/ou de combinação.

BVDV Tipos 1, 2 e 3 foram implicados em uma variedade de síndromes clínicas.

Estudos estabeleceram que o vírus causa doença respiratória primária severa; que infectou persistentemente gado são uma grande fonte de infecção para bezerros susceptíveis; e que BVD infecta reservatórios de células brancas, causando déficits profundos e abrangentes no sistema imune.

Além disso, aborto ou mumificação podem ocorrer quando gado prenhe se toma infectado especialmente durante o primeiro trimestre.

Doença das mucosas, outra manifestação fatal Eeqüente de diarréia viral bovina (BVD), resulta de infecção fetal precoce com um biotipo de BVD não citopático, desenvolvimento de imunotolerância ao vírus, nascimento de um bezerro infectado persistentemente, e subseqüente superinfecção com um biotipo de BVD citopático.

BVD Tipo 2, foi previamente reconhecido principalmente como um isolado de BVD hemorrágico principahnente em rebanhos leiteiros.

Em certas fomas de realização, imunógenos adicionais contra Mycoplasma bovis estarão incluídos em uma vacina co-administrada e/ou de combinação para prevenir a doença clínica e perdas associadas com infecções causadas por Mycoplasma bovis em gado de corte e leiteiro. Estas doenças 5 mcluem mastite contagiosa, pneumonia respiratória, infecções articulares (condições artríticas), ceratoconjuntivite, e infecções do ouvido médio. Pasteurella multocida, uma causa bacteriana de pneumonia em gado, é outra bactéria a partir da qual imunógenos adicionais podem estar incluídos em vacinas co-administradas e de combinação. "10 ImunÓgenos de Mannheimia haemo/ytica podem incluir - leucotoxina (LKT) ou antígenos associados a Proteína de Membrana Extema ' (OMP), ou outros antígenos. Iniunógenos bacterianos adicionais contra Leptospirose também são previstos em vacinas co-administradas e de combinação.

15 Leptospirose, causada por bactérias do gênero Leptospira, é uma infecção zoonótica economicamente importante de animais de fazenda. Leptospira borgpetersenii sorovar hardjo (L. hardjo) e L. interrogans sorovar pomona (L. pomona) são os dois sorovares mais comumente assoeiados com leptospirose bovina ao redor do mundo. Em muitos casos, imunógenos adicionais destes dois sorovares estarão incluídos na vacina co-administrada e/ou de combinação. Imunógenos adicionais de Leptospirose incluem aqueles de Leptospira cannicola, Leptospira grippojyphosa, e Leptospira icterohaemorrhagiae. Infecção leptospiral de gado pode resultar em febre aguda, agalactia, aborto, ou nascimento de bezerros infectados prematuros e hacos, e pode contribuir para falhas reprodutivas e baixas taxas de concepção. Outros imunógenos exógenos de patógenos bacterianos que podem ser usados em formas de realização da presente invenção vêm de Vibrio spp. e espécies clostridiais. Exemplos de imunógenos clostridiais incluem aqueles de Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium

%

41 noíyi, Clostridium sordel/ii, Clostridium perfingens Tipos C e D, e Clostridium haemolyticum.

Em formas de realização ainda adicionais, imunógenos adicionais contra Neospora caninum estarão incluídos em vacinas co- 5 administradas e/ou de combinação.

Neospora caninum é um protozoário formador de cisto que causa aborto em gado.

Em gado, aborto devido a infecção com N. caninum nomalmente ocorre no meio para o fmal da gestação, embora nem todos os fetos infectados sejam abortados.

Muitos bezerros infectados congenitamente nascem saudáveis e infectados "10 persistentemente, embora alguns bezerros infectados fiquem adoentados no

- nascimento e morram no período neonatal com lesões similares àquelas de bezerros abortados.

Trichomonas é ainda outro parasita para o qual imunógenos adicionais podem estar incluídos em vacinas co-administradas e/ou de combinação.

Ein certas formas de realização, vacinas contra BHV-I co- administradas e/ou de combinação podem incluir imunógenos adicionais escolbidos a partir de qualquer combinação de ou de cada um dos grupos de citocinas bacterianas, virais, parasíticas, e imunomoduladoras acima.

Em outras formas de realização, a vacina co-administrada e/ou de combinação pode incl"uir apenas uni imunógeno adicional de um dos grupos acima.

Em ainda outras formas de realização, é entendido que vacinas co-administradas e/ou de combinação podem incluir qualquer número de combinações múltiplas de imunógenos adicionais tirados dos gmpos acima.

Como uni '25 exemplo, uma vacina de combinação pode consistir de imunógenos de BFIV-I modificado, BVDV Tipo I e Tipo II, PI3, e BRSV.

Em uina forma de realização, será usada uma vacina de combinação contendo antígenos de BHV-I modificado, BVD I & II, L.

Pomona, Lepto hardjo-bovis, Vibrio, e Trichomonas.

Esta vacina pode ser particularmente útil em va.cas de corte de mais do que um ano de idade. Esta vacina exemplar pode ser usada em fèmeas prenhes para a prevenção de infecção fetal devido a BVD I & II, a prevenção de aborto por BHV-I, prevenção de morte embrionária precoce devido a Vibrio e L. hardio bovis, e prevenção de infecção por Trichomonas.

5 Em outra fonna de realização, uma vacina de combinação contendo antígenos contra BHV-I modificado, BVD I & II, L. Pomona, Lepto hardio-bovis, Vibrio, e Neospora é prevista. Esta vacina pode ser particularmente adequada para vacas leiteiras de mais do que um ano de idade. Em ainda outra forma de realização, ad.equada para bezerros de um a seis meses de idade, a vacina de "10 combinação pode conter ahtígenos de BHV-I modificado, BVD I & II, . BRSV, M haemolytica, H. somnus, Mycoplasma bovis, L. pomona, e Lepto hardio-bovis. Em algumas fonnas de realização, bezerros mais jovens do que um mês de idade, mas mais velhos do que um dia de idade serão vacinados.

Para bezerros entre as idades de seis a doze meses, uma vacina de combinação 15 exemplar pode conter antígenos contra BHV-I modificado, BVD I & II, M haemolytica, H somnus, Mvcoplasma bovis, L. pomona, e Lepto hardio- bovis. Vacinas co-administradas exemplares incluem aquelas com imunógenos adicionais para um ou mais dos antígenos clostridiais, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Pasteurella multocida, Fusobacterium necrophorum, E.coli O157:H7 e Salmonella enterica. Em certas formas de realização, a vacina co-administrada será uma contra apenas bacterina clostridial. Em outras fomas de realização, a vacina co- administrada será contra apenas bacterina de Histophilus somni, bacterina de Fusobacterium necrophorum, ou bacterina de Salmonella dublin- çyphimurium. Conforme é entendido por alguém de verso na arte, as únicas delimitações em vacinas co-administradas e/ou de combinação são que os componentes individuais possam ser co-administrados ou administrados como uma vacina de combinação para atingir o resultado desejado de combater imunossupressão causada por BFIV-I.

Em cada uma das vacinas contempladas pela presente invenção, também é entendido que qualquer dos componentes veterinários aceitáveis, incluindo, mas não limitado a, 5 adjuvantes, diluentes, solventes, etc., descritos neste lugar, também podem ser incoIporados na vacina co-administrada e/ou de combinação.

É entendido que em certas formas de realização, mesino que vacinas co-administradas e/ou de combinação possain não produzir a mesma imunogenicidade que vacinas individuais, a vacina. co-administrada ou de "10 combinação ainda pode ser preferida.

Em muitas instâncias, é vantajoso

. administrar uma vacina de combinação ao invés de administrar diversas vacinas diferen.tes, pois vacinas de combinação comumente reduz custos, tanto em termos de trabalho como materiais.

Além disso, vacinas de combinação ocupam menos espaço, tomando-as mais fáceis para transporte e 15 armazenamento.

Muitos protocolos para administrar as composições de vacina da presente invenção a animais hospedeiros estão dentro do verso da. arte, incluindo oral, intranasal, tópica, transdérmiea, e parenteral.

Em certas formas de realização, a via de administração é intranasalmente ou parenteralmente, particulamente intramuscularmente.

Em certas formas de realização, as formulações serão particulamente adaptadas para injeção intramuscular, pois injeção intravenosa pode não ser prática para aplicação em larga eseala a animais domésticos.

Contudo, outras vias de administração, tal como subcutaneamente ou intradermicamente são previstas, pois pode ser desfavorável administrar intramusculannente em hospedeiros designados para composição de alimentos.

Altemativamente, as vacinas podem ser dadas oralmente e as subunidades formuladas com um veículo oral famaceuticamente acei.tável.

Nestas formas de realização, as vacinas da presente invenção podem ser administradas oralmente para produzir imunidade de mucosa, assim como intramusculannente para imunidade sistêmica.

Para instilação intranasal, animais hospedeiros podem ser , inoculados com aproximadamente 102 a 108 TCID50 das respectivas

5 linhagens modificadas de vacinas vivas.

Para vacinação IM, a vacina pode ser injetada no flanco (massa do músculo caudal) ou no pescoço (músculo braquiocefálico) usando 102 a 108 TCID50 do vírus.

Para administração subcutânea, animais hospedeiros podem ser inoculados com , aproximadamente 102 a 108 TCID50 das respectivas linhagens modific.adas de "lO vacinas vivas.

E'm muitas formas de realiza.ção, vacinas irão incluir pelo

. menos 102,5 TcrD50 de vírus por dose.

Em certas fomias de realização, a vacinação pode conter um volume de dose de aproximadamente 2 ml a aproximadamente 5 ml.

As vias de vacinação fomecidas acima são exemplares apenas, e quaisquer meios adequados conhecidos na arte podem

15 ser usados na prática da presente invenção.

A concentração do(s) antígeno(s) na composição de vacina é selecionada de forma que uma dose efetiva seja apresentada no hospedeiro para produzir imunidade mediada por células ou anticoIpos aos epítopos neutralizantes de polipeptídeos.

Dentro de amplos limites, não se acredita que

20 a dosagem seja crítica.

Enibora opcional, em certas formas de realização, uma segunda imunização de reforço será administrada ao animal hospedeiro diversas semanas a diversos meses depois da imunização inicial.

Em formas de realização específicas, tal reforço pode ser administrado tão tarde quanto 25 um ano depois da imunização inicial.

Para garantir altos níveis constantes de proteção contra doença, pode ser de grande auxílio re-adininistrar uma imunização de reforço aos animais hospedeiros em uma base periódica.

Esta base periÓdica pode variar de mensalmente, a cada seis meses, a anuahnente, a múltiplos anos.

Em certas formas de realização, as composições não serão usadas em animais prenhes ou lactantes.

Em certas outras formas de realização, as composições não serão usadas em indivíduos que estão dentro de menos do que uma semana, uma semana, duas semanas, três semanas, ou quatro semanas de procriação.

Em ainda outras formas de

5 realização, a vacina não será usada em animais condenados ao abate dentro de 28 dias ou menos.

Sem pretensão de ser limitante, animais de corte podem ser comumente vacinados em marcação (ou pré-arrumação para pastagem de verão), momento de desmama, em.momento de Jiberação para uma ,instalação "10 de recria (pastagem de trigo de invemo), e na chegada em um curral de

- engorda.

Para vacas, desmama de outono ou monitoramento de gestação também são momentos comuns para vacinação.

Para gado leiteiro, um momento comum para vacinação é o momento de secagem.

As presentes composições e vacinas modificadas podem ser

15 usadas como marcadores.

Análise de amostras do animal hospedeiro pode ser usada para determinar se o animal hospedeiro está protegido pela vacina da invenção e não foi exposto a uma linhagem tipo selvagem de BFIV-I.

Em certas fonnas de realização, a invenção inclui um método para determinar a ausência ou presença e/ou concentração de anticoípos dirigidos contra genes de BHV-I e genes de BHV-I modiíicados em uma amostra empregando um imunoensaio, o imunoensaio caracterizado por usar imunógenos de BHV-I modificado reativos com anticoipos pa.ra BHV-I como um reagente no imunoensaio, através do qual é formado um complexo dos anticorpos para BHV-I e o imunógeno de BHV-I modificado, e determinar a ausência ou presença e/ou concentração de um tal complexo para deteminar se anticorpos dirigidos contra tal BHV-I modificado estão presentes em uma amostra e, se presentes, fomecer um meio de determinar sua concentração.

Por exemplo, os imunógenos modificados podem ser usados como reagentes substratos em imunoensaios para identificar anticoípos para estas proteínas BHV-I em uma amostra, e.g., sangue, de urn mimal hospedeiro como um meio de determinar se o animal hospedeiro está infectado com BHV-I e para determinar a concentração dos anticorpos na amostra. hnunógenos de BHV-I podem ser misturados com ou ligados a uma matriz (suporte) adequada ou carreador, tal 5 como uma partícula de látex, placa de microtitulação de plástico ou um material similar. Eles também podem ser conjugados com uma enzima, corante, radioisótopo ou material similar, dependendo de qual método imunológico é usado. Imunoensaios empregando imunógenos modificados de BHV-I dentro da presente invenção incluem, mas não são limitados a, "10 radioimunoensaio, imunoensaio de competição, imunoprecipitação, ensaio - imunoenzimático indireto, ensaio de imunofluorescência e os semelhantes. Em muitas formas de realização, detecção preferivelmente é conveniente, rápida, sensível e específica.

São descritos abaixo exemplos da presente invenção que são fomecidos apenas para propósitos ilustrativos. Os exemplos não são pretendidos para limitar o escopo da presente invenção de qualquer maneira, uma vez que numerosas formas de realização dentro do escopo das reivindicações estarão perceptíveis para aqueles de habitual verso na arte à luz da presente descrição. Aqueles de habitual verso na arte presumivelmente são familiares com (ou têm pronto acesso a) as referências citadas neste pedido, e as descrições destas são incorporadas por referência neste lugar.

Exemplos Os exemplos seguintes têm o propÓsito de ilustrar uma forma de realização e não devem ser interpretados conio uma limitação.

Exemplo 1. Infecção por BHV-I causou regulação descendente de moléculas de MHC classe I em células infectadas Para avaliar o efeito de infecção por BHV-I em expressão de MHC classe I na superfície de células infectadas, células de rim bovino MDBK (Madinjjarby bovine kidney) foram infectadas com linhagem GL756 de BHV-I em uma multiplicidade de infecção (moi) de 10, ou não infectadas (mock infected). Em 16-24 horas após infecção, as células foram marcadas com anticorpo monoclonal PT85A (VMRD, Inc.; Pullman, Washington, Estados Unidos da América), específico para moléculas de MHC classe I. 5 Células de controle negativo foram coradas com um anticorpo controle isotípico não reativo (NIM605; Dr.

Subramaniam Srikumaran; Washington State University). Os anticorpos primários foram ou marcados com Zenon® Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies, Carlsbad, Califómia, Estados Unidos da América) ou "10 anticoipos secundários marcados fluorescentemente foram usados.

As células

. foram então examinadas para imunofluorescência de superfície por citometria de fluxo.

Na Figura 10, os dados mostram que células infectadas com BHV-I expressaram moléculas de MHC classe I na superfície celular, mas os 15 níveis de expressão foram diminuídos ou regulados de fonna descendente se comparados com células não infectadas (mock infected). Portanto, BHV-I tipo selvagem diminuiu expressão de nioléculas de MHC classe I na superfície de células infectadas.

Exemplo 2. Administração de BHV-I causou uma resposta imune suprimida a uin imunógeno co-administrado adicional em bezerros Para avaliar o efeito de BFIV-I na resposta imune a um imunógeno não BHV-I co-a.dministrado a bezerros, o seguinte estudo foi realizado- Bezewos soro-negativos para BHV-I (cruzamento Herefordm4ngus ou Holandês-Leiteiro), de 3-6 meses de idade, foram usados.

Os bezerros também tiveram quantidades mínimas de títulos de LKT confonne medido por ELISA- Bezerros foram subcutaneamente administrados no pescoço ou eom LKT recombinante de Mannheima haemolytica apenas (100 µg em 2 ml contendo adjuvante Emulsigen D), BHV-I apenas (aproximadamente 1 05-5 linhagem GL756 de BHV-I em 2 ml) ou LKT e BHV-I (BHV-I e LKT co-

administrados no pescoço aproximadamente 5 cm distante) em dia 0. LKT foi administrada novamente em dia 21 aos grupos de bezerros de LKT apenas e BHV-I mais LKT.

Sangue foi extraído e soros coletados antes de administração (dia 0) e em dias 4, 10, 14, 21, 28 e 35. Anticorpos séricos 5 reativos com LKT foram medidos para cada momento usando ELISA.

Níveis de anticorpos nos vários momentos foram normalizados para os níveis para dia 4, que receberam valores de 1. Os resultados em Figura 11 mostraram que níveis de anticorpos específicos para LKT nos grupos de LKT apenas e BHV-I mais "10 LKT geralmente aumentaram durante o percurso de tempo do estudo e com

- pico em 28-35 dias.

Em todos os momentos, os níveis de anticorpos específicos para LKT presentes nos soros de bezerros administrados com LKT apenas forain maiores do que os níveis de anticorpos específicos para LKT presentes nos soros dos bezerros administrados com BHV-I mais LKT. 15 Diferenças significativas entre os grupos de LKT apenas e BHV-I mais LKT foram vistas em dias 10, 14, 21 e 28. Estes dados indicaram que o BFIV-I co- administrado suprimiu a resposta imune a um imunógeno co-administrado nos bezerros se comparado com bezerros que foram administrados com o imunógeno apenas.

Exemplo 3. Administração de BHV-I causou uma proporção suprimida de subtipos IgGl para IgG2 para IgG específica para uni imunógeno co- administrado em bezerros Para avaliar o efeito de BHV-I em subtipos de IgG para IgG reativa com um imunógeno não BHV-I co-administrado com BHV-I, as amostras de soro dos grupos administrados LKT apenas e BHV-I mais LKT no estudo descrito no exemplo 2 foram usadas.

Estas amostras de soro foram testadas para subtipos IgGl e IgG2 específicos para LKT usando placas de ELISA cobertas com LKT e anticoipos específicos de subtipo IgG.

k: Os resultados em Figura 12 mostraram que a proporção de IgGl/lgG2 específica para LKT para soros de bezerros administrados com LKT e BHV-I foi reduzida comparado com bezerros administrados com LKT apenas. Estes dados indicaram que BHV-I pode alterar (di1mnuir) a 5 proporção de subtipos IgG1/lgG2 para um imunógeno administrado junto com BHV-I. Exemplo 4. Administração de BHV-I causou uma resposta de memória a antígeno suprimida para um imunógeno co-administrado em bezerros Para exaniinar o efeito de BHV-I em memória ao antígeno u para um imunógeno não BHV-I eo-administrado com BHV-I (conforme " medido por produção de IL-2), sangue foi extraído dos bezerros usados no estudo descrito no exemplo 2 em dia 23. O sangue foi diluído e antígeno LKT foi adicionado às amostras. Níveis de IL-2 foram subseqüentemente medidos nas amostras usando ELISA. Os resultados em Figura 13 mostraram que produção de IL-2 em resposta a antígeno de memória foi suprimida em ainostras de bezerros administrados com BHV-I mais LKT, se comparado com bezerros administrados com LKT apenas. Estes dados indicaram que BHV-I pode suprimir uma resposta de memória a um imunógeno administrado com BHV-

1. Exemplo 5. Construção de mutantes de deleção de BHV-I usando construções de deleção-recombinação em células de mamíferos Mutantes de deleção de BHV-I GL756 para UL49.5, clones Al, A5, B7 e B8, foram gerados usando construções de deleção- recombinação (DRC) conforme mostrado em Figura 14A e em SEQ ID NO: 17 em Figura 14. Protema verde fluorescente melhorada (EGFP) foi inserida nas construções para possibilitar isolamento de vírus recombinantes. DRC foram transfectadas em células MDBK e as células foram subseqüentemente infectadas com BHV-I GL756. Sobrenadante de cultura de células infectadas

N foi diluído e emplacado em novas células MDBK. Placas virais exibindo fluorescência verde foram isoladas, purificadas em placa e identidade confinnada por uma triagem recombinante por reação em cadeia da polimerase (PCR). A triagem por PCR usou iniciadores flan.queando o sítio de 5 deleção/recoinbinação. Tamanho esperado de produto de PCR foi de 2072 pares de bases (bp) para os inutantes e 657 bp para o vírus tipo selvagem/parental. Figura 16 mostra o padrão esperado para os m"utantes Al cB8. Lisados de cultura de células infectadas foram usados para h 10 triar BHV-I GL756AUL49.5 Al e B8 por SDS- Eletroforese em gel de " poliacrilamida (PAGE) e Westem blot para confirmar d-eleção do gene visado. Tamanho esperado do produto protéico do gene UL49.5 é de aproximadamente 15 klja em vírus ancestral. Figura 18 mostra que os clones Al, A5, B7 e B8 não expressaram o produto protéico do gene UL 49.5. 15 Células não infectadas (mock infected) foram usadas como o controle. Mutantes de deleção de BHV-I GL756 para Us4, clones 1 e 2, foram gerados usando construções de deleção-recombinação (DRC) conforme mostrado em Figura 14B e em SEQ ID NO: 18 em Figura 14. EGFP foi inserida nas constmções para possibilitar isolamento de vírus recombinantes. DRC foram transfectadas em células MDBK e as células foram subseqüentemente infectadas com BHV-I GL756. Sobrenadante de cultura de células infectadas foi diluído e emplacado em novas células MDBK. Placas virais exibindo fluorescência verde foram isoladas, purincadas em placa e identidade confirinada por triagem por PCR. A triagem por PCR usou iniciadores flanqueando o sitio de deleção/recombinação. Tamanho esperado de produto de PCR foi 2072 bp para os mutantes e 1757 bp para o víms tipo selvagem/parental. Figura 17 mostra o padrão esperado para os mutantes l e

2.

Lisados de cultura de células infectadas foram usados para triar BHV-I GL75AUs4- 1 e 2 por SDS-PAGE e Westem blot para confirinar deleção do gene visado.

Tamanho esperado do produto protéico do gene US4 é de aproximadamente 40 klja em vírus ancestral.

Figura 19 mostra que os 5 clones 1 e 2 não expressaram o produto protéico do gene Us4. Células não infectadas (mock infected) foram usadas como o controle.

Exemplo 6. Construção de mutantes de deleção de BHV-I usando construções de cromossomos artificiais bacterianos em células de mamíferos Um procedimento usando construções de cromossomos ¶

artinciais bacterianos (BAC) foi usado para gerar mutantes de BFN-I usados " em alguns estudos.

O procedimento foi descrito em Tischer et al. (2006) BioTechniques 20:191. Em geral, o procedimento usa plasmídeos de transferência recombinantes que contêm a mutação desejada para ser colocada em BHV-I que é flanqueada por seqüências de BHV-I tipo selvagem.

Os plasmídeos de transferência recombinantes continham o gene codificando proteína verde fluorescente (GFP) e também uma origem de replicação bacteriana.

Os plasmídeos de transferência recombinantes foram transfectados em células MDBK e subseqüentemente infectados com BHV-I GL756. Sobrenadante de cultura de células infectadas foi diluído e emplacado em novas células MDBK.

Placas virais exibindo iluorescência verde foram isoladas, purificadas em placa e o DNA viral foi eletroporado em células de E. coli.

DNA dos clones transformados de E. co/i foi triado por digestões de restrição e Southem blotting para obter os mutantes desejados de BHV-I.

Seqüências indesejadas de GFP e origem de replicação bacteriana foram então removidas dos clones mutantes de BHV-I usando mutagênese "en passant", como descrito na referência Tischer et al.. Este método usa inserção catalisada por Red para criar "uma seqüência que é excisada, junto com as seqüências de GFP e origern bacteriana, em uma subseqiiente etapa catalisada por Red.

Os clones de BHV-I resultantes foram transfectadas em células MDBK e estoques de vírus inutantes infecciosos foram obtidos.

Cinco diferentes vírus BHV-I m'utantes ou modificados foram produzidos usando os procedimentos acima.

Todos os vírus BHV-I mutantes 5 foram feitos na liríhagem ancestral GL756. Um ví.ms BHV-I mutante continha uma modificação no gene UL49.5. A seqüência de DNA do UL49.5 mutante é mostrada como SEQ ID NO: 23 em Figura 9. Os nucleotídeos sublinhados na seqüência de DNA ilustrada em Figura 9 indicam nucleotídeos que foram inseridos na seqüência de Uji49.5 de GL756 tipo ^ selvagem.

Os nucleotídeos sublinhados adicionam dois códons de parada de

" tradução em quadro com a seqüência de codificação.

As proteínas traduzidas a partir deste gene são truncadas.

Outro vírus BHV-I mutante continha uma deleção completa da seqüência de codificação de UL41. Um terceiro víms BHV-I mutante continha ambas as mutações já descritas de UL49.5 e UL41. Portanto, este BHV-I particular continba modificações em dois genes, UL49.5 e UL41. Figura 20 ilustra as localizações das regiões de genes UL49.5 e UL41 dentro do genoma de BHV-I, assim como as modificações descritas acima.

Um quarto vírus BHV-I mutante continha uma deleção parcial da seqüência de codificação de Us4, mas também uma inserção de uina nova seqüência na localização da deleção.

As seqüências de DNA (SEQ ID NO: 11) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) do gene US4 da linhagem Cooper de BHV-I são ilustradas em Figura 6 e são as mesmas que do gene US4 da linhagem GL756. Os nucleotídeos sublinhados ilustrados na seqüência de

DNA de Figura 6 são os nucleotídeos que foram deletados no Us4 mutante de BHV-I.

Deleção destes nucleotídeos resultou ein deleção dos aminoácidos sublinhados na seqüência de aminoácidos de Figura 6. A deleção foi uma deleção em quadro de leitura.

Portanto, a seqüência de aminoácidos

A.

codificada por nucleotídeos após a deleção é a mesma que aquela codificada por nucleotídeos da seqüência de Us4 tipo selvagem. Em adição a estas deleções, o gene US4 mutante também tinha uma inserção de 24 nucleotídeos (GGATCTGGTAGTGGCTCCGGGAGC; 5 SEQ ID NO: 21) na região onde a deleção descrita acima foi localizada. Estes 24 nucleotídeos codificarain a seqüência de aminoácidos Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser (SEQ ID NO: 22). Pelo fato de a inserção ter sido uma deleção em quadro de leitura, a proteína codificada pelo gene Us4 lnodincado continha os aminoácidos Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser no lugar dos -, lO aminoácidos sublinhados mostrados em SEQ ID NO: 12 ilustrada em Figura " 6. Figura 21 ilustra a localização da região de gene US4 dentro do genoma de BHV-I, assim como a modificação. Um quinto vírus BHV-I mutante continha uma deleção completa da seqüência de codificação de Circ. Figura 22 ilustra a localização da região de gene Circ dentro do genoma de BHV-I, assim como a modificação. Exemplo 7. Crescimento de vírus BHV-I contendo modificações Para examinar o efeito de modificações dentro de genes de interesse em propriedades de crescimento do vírus BHV-I, células MDBK foram infectadas com os vírus descritos no exemplo 6, e título de vírus foi detenninado ern vários momentos posteriormente. Vírus examinados incluíram BHV-I com nenhuma das modificações descritas (GL756; BHV-I WT), com a modificação em UL49.5 (BHV-1AUL49.5), dois diferentes clones de BHV-I eom a modificação em UL41 (BHV-1AUL41:1606 e BHV- 1,AUL41:1607), dois diferentes clones de BHV-I com as modificações tanto em UL49.5 como UL41 (BHV-1AUL41/UL49.5:1614 e BHV- 1AUL41/UL49.5:1616), com a modificação em Circ (BHV-LACirc:1697), e com a modificação em Us4 (BHV-1AUs4gG:1698).

Os resultados em Figura 23 mostram que 'todos os vírus BHV- l testados com modificações tiveram cinética de crescimento similar ao BHV- l sem nenhuma modificação.

Estes dados indicaram que modificações nos genes testados não afetaram as propriedades de crescimento do vírus. 5 Exemplo 8. Restauração de expressão de MIIC classe I ern células infectadas por infecção com vírus BHV-I contendo modificações Para avaliar o efeito de vírus BHV-I contendo modificações em expressão de MHC classe I na superfície de células infectadas, células MDBK foram infectadas com os vírus BHV-I modificados descritos no m exemplo 5 (dados para estes experimentos niostrados em Figura 24) ou os

" vírus BHV-I modificados descritos no exemplo 6 (dados para estes experimentos mostrados em Figuras 25-31). Para os experimentos onde expressão de MHC classe I foi avaliada, como descrito neste exemplo, células MDBK foram infectadas pelos vírus ern um moi de 10, ou não foram infectadas (mock infected). Em 16-24 horas após infecção, as células foram marcadas com anticorpo monoelonal PT85A (VMRD, Inc.; Pullman, Washington, Estados Unidos da América), que é específico para moléculas de MHC classe I.

Células de controle negativo foram coradas com uin anticoípo de controle isotípico não reativo (MM605; Dr.

Subramaniam Srikumaran; Washington State Uni,versity). Os anticoIpos primários foram ou marcados com Zenon® Mouse [gG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen

Detection Technologies, Carlsbad, Califómia, Estados Unidos da América) ou anticorpos secundários marcados fluorescentemente foram usados.

As células foram então analisadas para fluorescência de superficie por citometria de fluxo.

Em Figura 24, os dados mostraram que células infectadas com BHV-IAUL49.5 Al ou B8 (como descrito no exemplo 5) tiveram expressão de MHC classe I parcialmente revertida ou restaurada na superficie celular se comparadas com célúlas infectadas com BHV-I não contendo modificação no gene UL49.5 (BHV-I GL756). Em Figura 25, os dados mostraram que células infectadas com BHV-1GL756AUL41-AUL49.5, contendo modificações tanto em UL49.5 e UL41 (como descrito no exemplo 6) tiveram expressão de MIIC classe I completamente revertida ou restaurada na 5 superfície celular se comparadas com células infectadas com BHV-I não contendo as modificações (BFIV-I GL756). Estes dados indicaram que os vírus BHV-I contendo estas modificações não causaram regulação descendente de expressão de molécula de MHC classe I, ou pelo menos não ) causaram regulação descendente de MHC classe I no grau em que vírus BI-N- lO 1 não modificados causaram regulação descendente de expressão de MHC classe I.

Em Figura 26, os dados mostraram que células infectadas com BHV-I GL756AUL49.5, contendo modificação em UL49.5 (como descrito no exemplo 6), e com BHV-I GL756AUL41, contendo modifícação em UL41 15 (eomo descrito no exemplo 6), tiveram expressão de MHC classe I parciahnente revertida ou restaurada na superfície de células infectadas se comparadas com célula,s infectadas com BHV-I GL756 que não continha modificações.

Os dados também mostraram que células infectadas com BHV- l GL756AUL49.5-AUL41, contendo modificações em UL49,5 e UL41, expressão de MHC classe I completainente revertida ou restaurada na superfície celular de células infectadas se comparadas com células infectadas com BHV-I GL756 que não continha as modificações.

Em adição a análise de citometria de fluxo de expressão em superfície de célula de MHC classe I, lisados foram preparados a partir de células infectadas como descrito acima e forain analisados por SDS-PAGE e Westem blotting usando anticorpo reativo com moléculas de MHC classe I.

Figura 27 (topo) mostra esta análise para células infectadas com vírus BHV-I não contendo modificação (GL756), vírus BHV-I contendo modificação em 1JL49.5 (GL756 AUL49.5), dois clones de vírus BHV-I contendo

* 'l · 56 modificação em UL41 (GL756 L\UL41), dois clones de vírus BHV-I contendo modificações tanto em UL49.5 como UL41 (GL756 LJUL49.5- AUL41), virus BHV-I contendo modificação em Circ (GL756 ACirc), e vírus BHV-I contendo modificação em Us4 (GL756 AUs4). Estes são os virus 5 BHV-I mutantes descritos no exemplo 6. Figura 27 (fúndo) mostra quantificação densitométrica dos Westem blots.

Os dados em Figura 27 mostrarain que, para vírus BHVJ contendo uma inodificação em uin único gene, BHV-I coin UL41 modificado teve o inaior efeito em restauração (inenor efeito em supressão) de expressão lO de MHC classe l se comparado com BHV-I não contendo uma modificação.

" Os dados também mostraram que BHV-I contendo modificações tanto em UL49.5 como UL4 1 restaurou completamente (não teve nenhum efeito em) expressão de MHC cIasse I se comparado com BHV-I não contendo uma modificação. Os dados mostraram que o BHV-I modificado, GL756 4 15 AUL49.5-AUL41, pode ter até expressão de MHC classe ] acentuada se e comparado com células não infectadas (mock infected).

Exemplo 9. Re&u]ação descendente de BHV-I de moléculas de MHC classe ]] em células infectadas e restauração de expressão de cIasse j] por vírus BHV-I contendo modifícações 20 Para avaiiar o efeito de víms BHV-I e vírus BHV 1 contendo modificações em expressào de moléculas de MHC classe IJ na superficie de células infectadas, células MDBK forain infectadas com os virus BHY-] modificados descritos no exemplo 6. Células foram infectadas com os vims em um moi de 0,1, ou não foram infectadas (mock infected), incubadas a 4°C 25 por 30 rnins, então a 37°C por l hora seguido por tratamento com IFN-y. Em 72 horas após infecção, as células forain marcadas com anticorpo monoclonai CAT82A, especifico para moléculas de MHC cIasse Il (VMRD). O anticorpo CAT82A foi ou marcado com Zenon® Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Jnvitrogen Detection Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados

0 " " 57 . Unidos da América) ou anticorpos secundários marcados fluore-scentemente foram usados. Células de controle negativo não foram coradas. As células foram então analisadas para fluorescência por citometria de fluxo.

Os dados em Figura 28 mostraram expressào relativa de MHC 5 classe ]] em células infectadas com virus se coinparadas com células nào infectadas (rnock infected) (células não infectadas (mock infected) indicadas coino 100°4 de expressão). Os dados em Figura 29 mostraram restauraçào percentual de expressão de MHC classe II em células pelos virus contendo inodificações se coinparadas com células infectadas com virus não contendo . 10 genes modificados (níveis de MHC classe IJ em células infectadas com BHV- ' 1 GL756 receberam valor de 0; céjulas não infectadas (mock infected) tiveram valor de 100). Os dados mostraram que BHV-I não modificado causa supressão de expressão de molécula de MHC classe II na superfície de células infectadas. Os dados tnostraram que virus BHV-I com modificação em . 15 UL49.4, e vírus BHV-J coin modificação em UL41, restauraram parcialmente m expressão de MHC classe lj (não supriiniram tào significativamente) se a comparados com BHV l não modificado ou tipo selvagem- Os dados ' mostrarain que virus BHV-I com modificações tanto em UL49.5 como UL41 suprimiram expressão de MHC classe ]] em células infectadas menos do que 20 virus c.ontendo as modificações simples (maior restauração de MHC classe JJ se comparado com BHV-I contendo modificações ein genes únicos).

Exelnp]o lO. Restauração e acentuação de proporçào de subtipos JgGl/IgG2 em bezerros para ]gG especifica para uin imunÓgeno co-administrado por virus BHV-I contendo modificações 25 Os dados apresentados no exemplo 3 e Figura 12 indicaram que BHV-I diminuiu a proporção de subtipos JgGl/lgG2 para IgG produzida em resposta a um imunógeno que é administrado com BHV-I, se comparada com a proporção de IgGl/jgG2 para IgG produzida em resposta a um imunógeno que foi administrado sozinho. Para avaliar o efeito de vírus BHV-

I contendo modificações na proporção de ]gGl/lgG2 para IgG reativa a um imunógeno administrado com o virus, bezerros BHV-I soro-negativos (cruzamento l-lereford-Angus ou Holandês-Leiteiro), de 3-6 meses de idade, foram usados.

Os bezerros tainbém tiveram quantidades minimas de titulos de 5 LKT conforme medido por ELISA.

Bezerros foram subcutaneamente administrados no pescoço ou coin LKT recombinante de Ma/?nhein7a hae/no/y/ica apenas (100 µg em 2 ml contendo adjuvante Emulsigen D), LKT e BHV-I GL756 (aproxiinadamente 10'·' linhagem GL756 de BHVJ em 2 ml), LKT e BHV-I contendo modificações tanto ein UL49.5 como UL41 lO (GL756 AUL49.5-AUL4I coino descrito no exeinplo 6), ou LKT e BHV-I ' contendo uma modificação ení Us4 (GL756 L\Us4 coino descrito no exemplo 6). BHV-I, ou BHV-I ínodificado, e LKT foram co-administrados aproximadamente 5 cni distante ein dia 0. LKT foi novan]ente administrada aos bezerros sozinha (sem virus) em dia 21. Sangue foi extraído e soros 15 coletados em dias 14, 21, 28 e 35. Anticorpos séricos ]gG] e lgG2 reativos com LKT foram inedidos para cada momento usando placas de ELJSA %k cobertas com LKT e anticorpos especificos de subtipo JgG.

Os resultados em Figura 30 mostraram que administração de BHV-Í tipo selvagem (GL756) junto com LKT diininuiu a proporção de

20 ]gG]/jgG2 específica para LKT se comparada com a proporção de JgGl/lgG2 especifica para LKT obtida depois de administração de LKT apenas (veja inomentos de dia 28 e 35). Estes resultados são os mesmos que aqueles discutidos no exemplo 3 e ilustrados em Figura 12. Os dados em Figura 30 tanibéin mostrarain que esta supressão de IgGl/jgG2 não foi observada

25 quando LKT foi administrada coin vírus BHV-I que tinhain modificações tanto em UL49.5 como UL4I, ou virus BHV-I que tinham modificações em Us4. Os dados mostraram que, em contraste com a supressão da proporção de lgG .l/lgG2 específica para LKT vista depois de administração de LKT com BHV-I tipo selvagem (se coinparada com LKT apenas), a proporção de t~ " * 59 & IgG l/lgG2 especifica para Lkl" vista depois de administração de LKT com qualquer dos dois vírus BHV-I modificados foi acentuada (maior do que a IgGl/lgG2 vista depois de administração de LKT apenas). Estes dados indicaram que os virus BHV-I modificados podem reverter a supressão da 5 proporção JgGl/lgG2 para anticorpos especificos para um iinunÓgeno co- administrado com BHV-I tipo selvagem. Estes dados também indicaram que os vírus BHV-I inodificados podem até acentuar a proporção JgGl/lgG2 para anticorpos específicos para um imunógeno co-adniinistrado, se comparada com a proporção JgGl/jgG2 para os anticorpos produzidos depois de * 10 administração do iinunÓgeno apenas (sem BHV-I tipo selvagem).

. Exemplo ll. Restauração de resposta de ]nemória ao antigeno para um imunóqeno co-administrado em bezerros por vírus BHV- 1 contendo modificações Os dados apresentados no exemplo 4 e Figura i4 indicaram 15 que BHV-I pode suprimir uma resposta de meniÓria a um iinunógeno co- I adininistrado com BHV-I tipo selvagem, se coinparada com a resposta de b memória ao imunógeno administrado sozinho. Para avaliar o efeito de virus BHV-I contendo modificações na resposta de memória a um imunógeno administrado com o virus, conforme medido por produção de IL-2, sangue foi 20 extraído dos bezerros usados no estudo descrito no exemplo 10 em dia 23. O sangue foi diluído e antígeno LKT foi adicionado às amostras. Níveis de JL-2 foram subseqüentemente inedidos nas amostras usando ELJSA. Os resultados ilustrados em Figura 3i inostraram que memÓria ao antígeno, conforme medido por produção de IL-2 a partir de células no 25 sangue, foi aumentada quando LKT foi administrada a bezerros com vírus BHV-I contendo inodificações tanto ein UL49.5 como UL41 (GL756AUL49.5-UL41 como descrito no exemplo 6) se comparado coin LKT administrada a bezerros com BHV-I que nào continham as modificações (GL756). Os dados l]1ostraraln que memória ao antígeno foi adicionalmente aumentada quando LKT foi administrada a bezenos com BHV-I contendo uma modificação em US4 (GL756AUs4 como descrito no exemplo 6). Embora composições, métodos exemplares, e assim por diante tenham sido ilustrados por descrição, não é a intenção dos requerentes 5 restringir ou de qualquer foma liniitar o escopo do pedido.

Naturahnente, não é possível descrever cada combinação concebível de componentes ou metodologias para propósitos de descrever as composições, métodos, e assim por diante descritos neste lugar.

Vantagens e modificações adicionais irão aparecer prontamente para aqueles versados na arte.

Portanto, a invenção não n

10 é limitada aos detalhes e exemplos específicos mostrados e descritos.

Assim, " este pedido tem a intenção de abarcar alterações, modificações, e variações que caem dentro do escopo do pedido.

Além disso, a descrição precedente não é pretendida para limitar o escopo da invenção.

De preferência, o escopo da invenção deve ser determinado pelas reivindicações anexas e seus 15 equivalentes.

Na medida em que o termo "ou" é empregado na descrição detalhada ou reivindicações (e.g., A ou B) é pretendido para significar "A ou B ou ambos". Quando os requerentes pretendem indicar "apenas A ou B mas não ambos" então o tenno "apenas A ou B mas não ambos" será empregado.

Assim, uso do termo "ou" neste lugar é o inclusivo, e não o exclusivo.

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES " 1. Vírus do herpes bovino-l vivo caracterizado pelo fato de que tem modificações do UL49.5 e pelo menos um gene adicional codificando proteína que" pode suprimir o sistema imune de um hospedeiro 5 mfectado, onde células infectadas com o BFIV-I que tem as modificações tendo pelo menos parcialmente restaurada expressão classe I MHC como comparada a células infectadas com um BHV-I que não tem as modificações.
2. 2. BHV-I vivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um gene adicional é UL41 ou Us4. 10
3. 3. BHV-I vivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que células infec.tadas com BHV-I que tem as modificações tendo parcialmente restaurada expressão classe II MHC como comparada a células infectadas com um BHV-I que não tem as modificações.
4. 4. BHV-I vivo de acord.o com a reivindicação 3, caracterizado 15 pelo fato de q'ue o pelo menos um gene adicional é UL41.
5. 5. BHV-I vivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o conhecimento do' BHV-I inclui linhagem Cooper ou linhagem GL756.
6. 6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: 20 a) um BHV-I vivo que tem modificações de UL49.5 e pelo menos uni gene adicional codificando proteína que pode afetar uma resposta imunológica de hospedeiro a um imunógeno; e b) um imunigene adicional, em que administração a seguir da composição a um 25 hospedeiro, uma razão de IgGl/lgG2 para IgG específico para o imunógeno adicional no hospedeiro é maior que a razão de IgG1/lgG2 para IgG específic.o ,para imunÓgeno adicional em um hospedeiro admisistrado uma composição de BHV-I vivo que não tem as modificações e o imunógeno adicional.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada " pelo fato de que o pelo menos um gene adicional é UL41 ou Us4.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada - pelo fato de que a administração seguinte da composição do BHV- 1 vivo que 5 tem as modificações e o imunógeno adicional ao hospedeiro, amostras de célula obtidas do sangue do hospedeiro e contactado eom o imunógeno adicional tem maiores níveis de interleucina-2 (IL-2) como comparado a níveis de IL-2 de amostras de células obtidas. do sangue do hospedeiro adininistrado a composição de BHV-I vivo que não tem as modificações e o 10 imunógeno adicional, e eontactar com o- imunógeno adicional.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene adieional é UL41.
10. lO. Composição de acordo eom a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o imunógeno adicional inclui uma bactéria, 15 viral ou imunógeno parasítico.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o imunógeno adicional inclui imunógeno do Vírus Da diarréia viral Bovina (BVDV) I, BVDV II, BVDV III, Vírus Sincitial Respiratório B'ovino (BRSV), Víms Parainfluenza 3 (PI3), Rotavírus 20 (BRV), Comavírus (BCV), Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Mycoplasma bovis, espécies de Leptospira, espécies de Vibrio, espécies de Clrostridia, Pasturella multocida, Fusobacterium necrophoruin, E. coli O 157:H7, Salmonella entérica, Neospora caninum ou espécies- de Trichomonas. 25
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o imunógeno adicional inclui LKT do Mannheimia haemolytica.
13. 13. Método para produzir uma resposta imunológica em um hospedeiro, caracterizado por compreender administrar ao hospedeiro:

    a) um imunógeno outro do que um antígeno do BHV-I - '(imunógeno que não é de BHV-I); e b) um BHV-I vivo que tem modificações de UL49.5 e pelo m menos um gene adicional codificando proteína que- pode afetar uma resposta 5 imunológica de hospedeiro a um imunógeno, em que a seguinte administração da composição da composição do hosped-eiro, a razão de IgGl para IgG2 no hospedeiro para IgG específico para o imunógeno não-BHV-l é maior que a razão de ÍgG1 para IgG2 para IgG especínco para o imunógeno de não-BHV-1em um- lO hospedeiro adrn.inistrado uma composição de i-munÓgeno de não-BHV-le BHV-I vivo que não tem as modificações.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o imunógeno de não-BHV-le o BHV-I vivo são co- administrados ou administrados ao hospedeiro em uma combinação de vacina. 15
15. 15. Método de acordo com a reivmdicação 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene adicional é UL41 ou Us4.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a seguinte adm.inistração da composição de não-imunógenos BHV-I e BHV-I vivo que tem as modificações para o hospedeiro, amostras 20 de célula obtidas do sangue do hospedeiro e contactado com o imunógeno de não-BHV-ltendo níveis mais altos de iterleucina-2 (IL-2) de amostras de células obtidas do sangue do hospedeiro administrado a composição do imunógeno de não-BHV-le BHV-I vivo que não tem as modificações, e contactados com o não-imunógen.o BHV-I. 25
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene adicional é UL41.
18. 18. BHV-I vivo caracterizado pelo fato de que tem modificações de UL49.5 e um de UL41 ou Us4, para uso elicitando uma resposta imunológica para BHV-I e imunógeno de não-BHV-lem um hospedeiro ungulado.
19. 19. BHV-I vivo de acordo com a reivindicação 18,
20. V caracterizado pelo fato de que as modificações de um de UL41 ou Us4 é uma modificação de UL41. 5 20. Uso de um vírus do herpes bovino 1 .(BHV-I) vivo que tem modificações de UL49.5 e UL41 ou Us4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição de vacina para elicitar uma resposta imunológica para BHV-I e um não&nunógeno BHV-I, pela co- administração do hnunógeno de BHV-I e nã.o-BHV-l ou pela administração IO de um coquetel de combinação de Imunógeno de BHV-I e não-BHV-l a um hospedeiro ungulado.
21. 21. BHV-I vivo, de acordo. com a reivindicação 20, earacterizado pelo fato de que a modificação de um de UL41 ou Us4 é uma modificação de UL41.

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