BRPI0919707B1 - Cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificadora de ácido graxo dessaturases de hemiselmis spp., produto comercial e método de produção de uma composição alimentar ou de ração - Google Patents

Abstract

UTILIZAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DESSATURASES DE HEMISELMIS SPP. A presente invenção refere-se a métodos e composições relativas a enzimas dessaturases que modulam o número e posição de ligações duplas nos ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFA's). Em particular, a invenção relaciona-se a métodos e composições para melhorar perfis de ácido graxo ômega 3 em produtos e partes vegetais usando enzimas dessaturases exógenas e codificação de ácidos nucleicos de tais enzimas. Em modalidades particulares, as enzimas dessaturases exógenas utilizadas são delta 5 dessaturases de Hemiselmis spp. Também são fornecidas composições de óleo de soja melhoradas tendo EPA derivado a partir de plantas carregando os genes de interesse.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica a prioridade sobre o Pedido Provisório de Patente U.S. No. 61/105.316, depositado em 14 de outubro de 2008, que é incorporado neste pedido por referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] A Listagem de Sequência, que é uma parte da presente descrição, inclui um arquivo legível em computador de 36 KB intitulado "MONS219WO_ST25.txt" compreendendo sequências nucleotídicas e/ou de aminoácidos da presente invenção submetida através de EFS- web. A matéria objeto da Listagem de Sequência é incorporada neste pedido por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção

[0003] A presente invenção refere-se, geralmente, a enzimas dessaturases que modulam o número e a posição de ligações duplas nos ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFA'S). Especialmente, a invenção relaciona-se à alteração de perfis de ácido graxo usando enzimas delta 5 dessaturases e ácidos nucleicos que codificam tais enzimas dessaturases.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[0004] Os produtos primários da biossíntese de ácido graxo na maioria dos organismos são compostos de 16 e 18 carbonos. A proporção relativa de comprimentos de cadeia e grau de insaturação destes ácidos graxos varia largamente entre espécies. Mamíferos, por exemplo, produzem principalmente ácidos graxos saturados e monoinsaturados, enquanto plantas superiores produzem ácidos graxos com uma, duas ou três ligações duplas, as últimas duas compreendendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFA's).

[0005] Duas famílias principais de PUFAs são ácidos graxos omega 3 (também representados como ácidos graxos "n-3"), exemplificado pelo ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5, n-3) e ácidos graxos ômega 6 (também representados como ácidos graxos "n-6"), exemplificado pelo ácido araquidônico (ARA, 20:4, n-6). PUFAs são componentes importantes da membrana plasmática do tecido celular e adiposo, onde podem ser encontrados em tais formas como fosfolipídeos e como triglicerídeos, respectivamente. PUFAs são necessários para desenvolvimento apropriado em mamíferos, particularmente no desenvolvimento do cérebro infantil, e para formação e reparo de tecido. Ácido araquidônico é o precursor principal da síntese de eicosanoides, que incluem leucotrienos, prostaglandina e tromboxanos, e que também desempenham um papel significante no processo de inflamação.

[0006] Várias desordens respondem ao tratamento com ácidos graxos. Foi mostrado que o suplemento com PUFAs reduz a taxa de reestenose após angioplastia. Evidência indica que PUFAs podem estar envolvidos no metabolismo de cálcio, sugerindo que PUFAs possam ser úteis no tratamento ou prevenção de osteoporose e de pedras do trato renal ou urinário. A maior parte das evidências de benefícios à saúde aplica-se a gorduras de cadeia longa ômega 3, ácido eicosapentaenoico e ácido docosaexaenoico (DHA, 22:6, n-3) que são encontrados em peixe e óleo de peixe.

[0007] PUFAs, tais como ácido linoleico (LA, 18:2, Δ9, 12) e ácido α-linolênico (ALA, 18:3, Δ9, 12, 15), são considerados como ácidos graxos essenciais na dieta porque os mamíferos não têm a capacidade de sintetizar estes ácidos. LA é produzido do ácido oleico (OA, 18:1, Δ9) por uma Δ12-dessaturase enquanto ALA é produzido de LA por uma Δ15- dessaturase. Entretanto, quando ingeridos, mamíferos têm a capacidade de metabolizar LA e ALA para formar as famílias n-6 e n-3 de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFA). Em mamíferos, a formação de LC-PUFA é limitada por taxa pela etapa de dessaturação Δ6, que converte LA em GLA e ALA em SDA. Foi mostrado que muitas condições fisiológicas e patológicas reduzem esta etapa metabólica ainda mais, e consequentemente, a produção de LC-PUFA. Para superar a etapa limitante de taxa e aumentar os níveis teciduais de EPA, pode-se consumir grandes quantidades de ALA. Alternativamente, desviando à Δ6-dessaturação através do suplemento dietético com EPA ou DHA pode aliviar efetivamente muitas doenças patológicas associadas com baixos níveis de PUFA. Entretanto, como apresentado em mais detalhes abaixo, fontes atualmente disponíveis de PUFA não são desejáveis.

[0008] PUFAs de cadeia longa principais de importância incluem DHA e EPA, que são principalmente encontrados em tipos diferentes de óleo de peixe, e ARA, encontrado em fungos filamentosos, tais como Mortierella. Para DHA, diversas fontes existem para a produção comercial incluindo uma variedade de organismos marítimos, óleos obtidos de peixe marítimo de água fria, e frações de gema de ovo. Entretanto, há várias desvantagens associadas com a produção comercial de PUFAs de fontes naturais. Fontes naturais de PUFAs tendem a ter composições de óleo altamente heterogêneas. Os óleos obtidos destas fontes, por isso, podem requerer que a purificação extensa para separar um ou mais PUFAs desejados ou produzir um óleo que é enriquecido em um ou mais PUFAs.

[0009] Outras limitações naturais favorecem uma nova abordagem para produção de PUFAs. Condições meteorológicas e doença podem causar flutuação em rendimentos tanto de peixe como de outras fontes marítimas. Fermentação em larga escala de organismos, tais como Mortierella, é onerosa. Tecidos animais naturais contêm quantidades baixas de ARA e são difíceis de processar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] Um aspecto da corrente invenção fornece ácidos nucleicos isolados que codificam um polipeptídeo capaz de dessaturação de uma molécula de ácido graxo no carbono 5. Estes ácidos nucleicos podem ser usados para transformar células ou modificar a composição de ácido graxo de uma planta ou óleo produzido por uma planta. Certas modalidades da corrente invenção fornecem sequências polinucleotídicas isoladas de Hemiselmis spp. tendo uma atividade de dessaturase única. Em certas modalidades adicionais da invenção, os polinucleotídeos codificam um polipeptídeo tendo identidade de sequência de pelo menos 75% à sequência polipeptídica da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, incluindo pelo menos aproximadamente identidade de 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98% e 99% a estas sequências. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, como estas sequências estão relacionadas, um dado polipeptídeo pode compartilhar simultaneamente 75% ou maior identidade de sequência a mais de uma destas sequências polipeptídicas. Em certas modalidades, uma Hemiselmis spp. dessaturase da invenção é ainda definida como uma ômega 3 Δ5 dessaturase (isto é, um dessaturase com uma preferência de substrato ômega 3).

[00011] Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 5, compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindoem: (a) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; (b) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3; (c) um polinucleotídeo hibridizando a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3, ou um complemento da mesma, sob condições de SSC 5X, formamida 50% e 42°C; (d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos identidade de sequência de 75%, 85%, 95%, 98% ou 99% a uma sequência polipeptídica da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; e e) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos um dos motivos de AsnSerTyrArgGluAlaHisArgProIleSerIle (NSYREAHRPISI) (SEQ ID NO: 20); HisValTrpThrMetAlaValSerGluSerLeuThr (HVWTMAVSESLT) (SEQ ID NO: 21); LeuAlaIleProPheAlaLeuSerHisAsnPhe (LAIPFALSHNF) (SEQ ID NO:22); ou GlnProAlaValArgGluValCysLysLysHisGlyValAsnTyrVal (QPAVREVCKKHGVNYV) (SEQ ID NO: 23). Em outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo isolado compreendendo as sequências polipeptídicas da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 ou um fragmento das mesmas que tem atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 5.

[00012] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um construto de DNA compreendendo o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 5, compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo consistindoem : (a) um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; (b) um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3; (c) um polinucleotídeo hibridizando a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3, ou um complemento da mesma, sob condições de SSC 5X, formamida 50% e 42°C; e (d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos identidade de sequência de 75%, 85%, 95%, 98% ou 99% a uma sequência polipeptídica da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. Em uma modalidade adicional, o construto de DNA compreende ainda um promotor heterólogo operacionalmente ligado ao polinucleotídeo isolado descrito acima. Em outras modalidades, o promotor é funcional em uma célula procariótica ou em uma célula eucariótica. Em certas modalidades, a célula eucariótica na qual o promotor é funcional é uma célula vegetal. Em uma modalidade adicional, o promotor é um promotor potencializado por semente. Exemplos de promotores potencializados por semente incluem, mas não são limitados ao promotor USP88, o promotor 7Sα, o promotor 7Sα', o promotor Arcelina-5, o promotor napina e o promotor oleosina. Ainda em outra modalidade, o construto de DNA compreende ainda pelo menos uma sequência polinucleotídica adicional que codifica uma ácido graxo elongase.

[00013] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira transformada de um construto de DNA compreendendo o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 5 fornecido pela invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula vegetal, animal, fúngica ou bacteriana. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira da invenção fornece uma célula hospedeira que exibe biossíntese de ácido graxo alterada em relação a uma célula do mesmo genótipo que a célula hospedeira mas sem construto de DNA. Por exemplo, uma célula hospedeira transformada da invenção pode compreender um nível elevado de EPA em relação ao conteúdo de AA, tal como aproximadamente 2 ou aproximadamente 3 vezes mais EPA do que AA. Ainda em outro aspecto, a célula hospedeira herdou o construto de DNA de um progenitor da célula.

[00014] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma planta e sua progênie compreendendo células hospedeiras transformadas com um construto de DNA da invenção. Tal planta pode ser definida como compreendendo metabolismo de ácido graxo alterado em relação a uma planta do mesmo genótipo sem o construto de DNA. Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica ou parte da mesma compreendendo uma ômega-3 Δ5 dessaturase (isto é, um dessaturase com uma preferência de substrato ômega 3). Ainda em outro aspecto, tal planta pode compreender ainda pelo menos uma sequência polinucleotídica adicional que codifica uma ácido graxo elongase. Em uma modalidade, a planta é selecionada a partir do grupo consistindo em canola, Brassica campestris, oilseed rape, rapeseed, soja, crambe, mostarda, mamona, amendoim, sésamo, algodão, linhaça, cártamo, palmeira de óleo, linho, girassol, milho, arroz, cevada, painço, centeio, trigo, aveia, alfafa e sorgo. A invenção também fornece a semente da planta da invenção, tal como uma semente tendo um conteúdo de ácido graxo alterado em relação à semente que não compreende um construto de DNA da invenção. Por exemplo, uma semente da invenção pode compreender um nível elevado de EPA em relação ao conteúdo de AA, tal como aproximadamente 2 ou aproximadamente 3 vezes mais EPA do que AA.

[00015] Ainda em um aspecto adicional, é fornecido uma célula transformada, planta transgênica ou parte da mesma que compreende uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma Δ5 dessaturase da invenção operacionalmente ligada a um promotor heterólogo e pelo menos uma molécula de polinucleotídeo adicional que codifica uma enzima ácido graxo elongase ou dessaturase. Em certas modalidades, uma ácido graxo elongase ou dessaturase adicional pode ser uma Δ6 dessaturase, uma Δ6 elongase (por exemplo, Δ6 elongase de M. alpina), uma Δ18 elongase, uma Δ15 dessaturase, uma Δ9 elongase, uma Δ8 dessaturase, uma Δ17 dessaturase (por exemplo, Δ17 dessaturase de Saprolegnia diclina), uma Δ4 dessaturase e/ou uma C20 elongase. Por exemplo, Δ15 dessaturases podem ser Δ15 dessaturase de Aspergillus nidulans, Δ12/Δ15 dessaturase de Fusarium moniliforme, Δ15 dessaturase de Arabidopsis thaliana ou Δ15 dessaturase de M. alpina. Em certas modalidades, uma Δ6 dessaturase pode ser uma ômega 6 Δ6 dessaturase específica (por exemplo, Δ6 dessaturase de T. suecica, ou Δ6 dessaturase de M. alpina) ou uma ômega 3 Δ6 dessaturase específica (por exemplo, Δ6 dessaturase de Primula juliae). Alguns exemplos de Δ9 elongases incluem, mas não são limitados a, Δ9 elongase de Euglena gracilis e Δ9 elongase de Isochrysis galbana. Em algumas modalidades, uma Δ8 dessaturase podem ser uma Δ8 dessaturase de Tetruepretia pomquetensis ou Δ8 dessaturase de Euglena gracilis. Ainda em uma modalidade adicional, a ácido graxo elongase ou dessaturase adicional é operacionalmente ligada a um promotor potencializado por semente.

[00016] Ainda em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para aumento de EPA em uma célula hospedeira ou planta. Em uma modalidade, um método para aumentar o conteúdo de EPA compreende a expressão na célula hospedeira ou planta de uma Δ5 dessaturase de acordo com a invenção e uma Δ6 dessaturase (por exemplo, uma ômega 3 Δ6 dessaturase específica). Em modalidades adicionais, um método para aumento do conteúdo de EPA envolve ainda a expressão de uma Δ15 dessaturase em uma célula hospedeira ou planta. Em outra modalidade, um método para aumento do conteúdo de EPA em uma planta compreende a expressão na célula hospedeira ou planta de uma Δ5 dessaturase de acordo com a invenção, uma Δ9 elongase, uma Δ8 dessaturase e uma Δ15 dessaturase ou uma Δ17 dessaturase.

[00017] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método de produção de um produto comercial, tal como um alimento ou ração, compreendendo as etapas de (a) obtenção da planta transgênica da invenção; e (b) produção do produto comercial do tecido, semente, fruta e/ou óleo daquela planta transgênica. Por exemplo, o produto comercial pode ser uma composição alimentar ou de ração, tal como óleo, ensilagem, farelo, grão, amido, farinha ou proteína. A composição alimentar ou de ração é definida como compreendendo uma sequência polinucleotídica detectável ou polipeptídica detectável fornecida pela invenção. Adicionalmente, a invenção fornece composições de ração animal e de alimento humanas compreendendo EPA, ARA ou DHA (vide figura 4).

[00018] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método de aumentar o valor nutritivo de um produto comestível para consumo humano ou animal, compreendendo adição de plantas ou partes de plantas transformadas, ou derivados das mesmas fornecidos pela invenção para o produto comestível. Em certas modalidades, o produto é alimento humano e/ou animal. O produto comestível também pode ser ração animal e/ou um suplemento alimentício.

[00019] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método de fabricação de alimento ou ração, compreendendo adição de plantas ou partes de plantas transformadas, ou derivados das mesmas fornecido pela invenção para ingredientes iniciais de alimento ou ração para produzir o alimento ou ração. Em certas modalidades, o método é ainda definido como um método de fabricação de alimento e/ou ração. A invenção também fornece alimento ou ração feito pelo método.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00020] Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste pedido.

[00021] A figura 1 ilustra um alinhamento de aminoácido Δ5 dessaturases de Hemiselmis rufescens HrD5D (SEQ ID NO: 4), Hemiselmis virescens HvD5D (SEQ ID NO: 2), Pythium irregulare PiD5D (SEQ ID NO: 10), Mortierella alpina D5D (SEQ ID NO: 11), Thalassiosira pseudonana TpD5D (SEQ ID NO: 13), Peridinium sp. CCMP626 PD5D (SEQ ID NO: 14), e Δ6 dessaturase de Mortierella alpina D6D (SEQ ID NO: 12).

[00022] A figura 2 ilustra um mapa do vetor plasmidial pMON67056.

[00023] A figura 3 ilustra um mapa do vetor plasmidial pMON104220.

[00024] A figura 4 ilustra um diagrama da via de biossíntese de PUFA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00025] A invenção supera as limitações da técnica prévia fornecendo métodos e composições para criação de plantas com conteúdo de PUFA aumentado. A modificação do conteúdo de ácido graxo de um organismo, tal como uma planta, apresenta muitas vantagens, incluindo nutrição melhorada e benefícios de saúde para consumo humano e/ou animal. Modificação do conteúdo de ácido graxo pode ser usada para alcançar níveis benéficos ou perfis de PUFA's desejados em plantas, partes vegetais, e produtos vegetais, incluindo óleos de semente vegetais. Por exemplo, quando os PUFA's desejados são produzidos no tecido da semente de uma planta, o óleo pode ser isolado das sementes que tipicamente resultam em um óleo rico em PUFAs desejados ou um óleo que tem um conteúdo ou perfil de ácido graxo desejado, que pode ser por sua vez usado para fornecer características benéficas em gêneros alimentícios e outros produtos.

[00026] Vários aspectos da invenção incluem métodos e composições para modificação do conteúdo de PUFA de uma célula, por exemplo, modificação do conteúdo de PUFA de uma célula(s) vegetal. Composições relacionadas à invenção incluem novas sequências polinucleotídicas isoladas, construtos de polinucleotídeos e plantas e/ou partes de plantas transformadas por polinucleotídeos da invenção. De acordo com a corrente invenção, o polinucleotídeo isolado pode codificar uma Δ5 dessaturase de Hemiselmis ssp. Células hospedeiras podem ser manipuladas para expressar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo(s) de delta 5 dessaturase que catalisa(m) dessaturação de um ácido(s) graxos(s).

[00027] As seguintes definições são fornecidas como um auxílio para entender esta invenção. As frases "sequência de DNA", "sequência de ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "segmento de ácido nucleico" se referem a uma estrutura física compreendendo um arranjo ordenado de nucleotídeos. O segmento de DNA, sequência ou sequência nucleotídica podem estar contidos dentro de uma molécula maior de nucleotídeo, vetor ou similares. Além disso, o arranjo ordenado de ácidos nucleicos nestas sequências pode ser representado na forma de uma listagem de sequência, figura, tabela, meio eletrônico ou similares.

[00028] As frases "codificação de sequência", "região de codificação", "sequência estrutural " e "sequência de ácido nucleico estrutural" se referem a todas ou um segmento de uma sequência de DNA, sequência de ácido nucleico, molécula de ácido nucleico na qual os nucleotídeos são arranjados em uma série de tripletos que cada um forma um códon. Cada códon codifica um aminoácido específico. Dessa forma, a sequência de codificação, região de codificação, sequência estrutural e sequência de ácido nucleico estrutural codifica uma série de aminoácidos que formam uma proteína, polipeptídeo, motivo ou sequência peptídica. A sequência de codificação, região de codificação, sequência estrutural e sequência de ácido nucleico estrutural pode estar contida dentro de uma molécula maior de ácido nucleico, vetor ou similares. Além disso, o arranjo de nucleotídeos nestas sequências pode ser representado na forma de uma listagem de sequência, figura, tabela, meio eletrônico ou similares.

[00029] O termo "cDNA" refere-se a DNA de fita dupla que é complementar e derivado de mRNA.

[00030] "Dessaturase" refere-se a um polipeptídeo que pode dessaturar ou catalisar a formação de uma ligação dupla entre carbonos consecutivos de um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo mono- ou poli-insaturado ou um precursor do mesmo. De interesse particular são polipeptídeos que podem catalisar a conversão de DGLA a ARA ou ETA a EPA por dessaturação no 5° carbono da extremidade carboxila de um ácido graxo. Considerações para escolha de um polipeptídeo específico tendo atividade de dessaturase incluem, mas não são limitadas à condição favorável de pH do polipeptídeo, se o polipeptídeo é uma enzima limitante por taxa ou um componente da mesma, se a dessaturase usada é essencial para a síntese de um PUFA desejado, e/ou se um cofator é requerido pelo polipeptídeo. O polipeptídeo expresso preferencialmente tem características que são compatíveis com o ambiente bioquímico da sua posição na célula hospedeira. Por exemplo, o polipeptídeo deveria competir pelo substrato(s).

[00031] "Elongase" refere-se a um polipeptídeo que alonga ácidos graxos adicionando dois átomos de carbono à extremidade de ácido carboxílico do ácido graxo. Considerações para escolha de um polipeptídeo específico tendo atividade de elongase incluem, mas não são limitadas à condição favorável de pH do polipeptídeo, se o polipeptídeo é uma enzima limitante por taxa ou um componente da mesma, se a elongase usada é essencial para a síntese de um PUFA desejado, e/ou se um cofator é requerido pelo polipeptídeo. O polipeptídeo expresso preferencialmente tem características que são compatíveis com o ambiente bioquímico da sua posição na célula hospedeira. Por exemplo, o polipeptídeo deveria competir pelo substrato(s).

[00032] "Expressão" refere-se ao processo pelo qual uma informação codificada do gene é convertida nas estruturas presentes e operando na célula. Genes expressos incluem aqueles que são transcritos em RNA e em seguida traduzidos em proteína e aqueles que são transcritos em RNA mas não traduzidos em proteína (por exemplo, RNA de transferência e RNA ribossomal).

[00033] Como usado neste pedido, "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulatórias precedendo (sequências de não codificação 5') e seguindo (sequências de não codificação 3') a sequência de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com suas próprias sequências regulatórias. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo sequências regulatórias e de codificação que não são encontradas em conjunto na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências regulatórias e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de uma maneira diferente do que aquelas encontradas na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua posição natural no genoma de um organismo. Um gene "exógeno" ou "transgene" refere- se a um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. Um transgene inclui DNA genômico introduzido por um procedimento de transformação (por exemplo, DNA genômico ligado ao seu promotor ativo).

[00034] "Heterólogo" refere-se à relação entre 2 ou mais sequências de ácidos nucleicos ou proteínas que são derivadas de fontes diferentes. Por exemplo, um promotor é heterólogo com respeito a uma sequência de codificação se tal combinação não for normalmente encontrada na natureza. Além disso, uma sequência particular de ácido nucleico pode ser "heteróloga" com respeito a uma célula ou organismo no qual é inserida se não ocorrer naturalmente naquela célula ou organismo particular.

[00035] "Similaridade de sequência" refere-se ao nível da similaridade entre 2 ou mais ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos em termos de porcentagem de identidade posicional. O termo "homologia" é usado para referir-se ao conceito de propriedades funcionais similares entre ácidos nucleicos ou proteínas diferentes, por exemplo, devido à origem evolutiva compartilhada.

[00036] "Hibridização" refere-se à capacidade de uma primeira fita de ácido nucleico de juntar-se a uma segunda fita via pareamento de base por ligação de hidrogênio quando as fitas de ácidos nucleicos têm a complementaridade de sequência suficiente. Como usado neste pedido, uma molécula de ácido nucleico é dita ser "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se exibir complementaridade completa. Como usado neste pedido, moléculas exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é dita ser complementar a um nucleotídeo da outra. Dessa forma, duas fitas de ácidos nucleicos são ditas ter complementaridade suficiente quando podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permiti-las permanecer aneladas entre si sob condições apropriadas.

[00037] O termo "hibridização" refere-se geralmente à capacidade de moléculas de ácidos nucleicos de juntarem-se através do pareamento de fita de base complementar. Tal hibridização pode ocorrer quando as moléculas de ácidos nucleicos são contatadas sob condições apropriadas. "Hibridiza especificamente" refere-se à capacidade de duas moléculas de ácidos nucleicos de formar uma estrutura de fita dupla antiparalela de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico é dita ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se exibirem "complementaridade completa", isto é, cada nucleotídeo em uma molécula é complementar ao seu nucleotídeo de parceiro de pareamento de base em outra molécula. Duas moléculas são ditas ser "minimamente complementares" se puderem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permiti-las permanecer aneladas entre si pelo menos sob condições convencionais de "baixa estringência". Similarmente, as moléculas são ditas ser "complementares" se puderem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permiti-las permanecer aneladas entre si sob condições convencionais de "alta estringência".

[00038] "Estringência de hibridização" refere-se a condições para ligação de hidrogênio entre moléculas de ácidos nucleicos. "Condições altamente estringentes" toleram pouca incompatibilidade entre um ácido nucleico e uma fita alvo. Tais condições são bem conhecidas por aqueles versados ordinários na técnica, e são preferenciais para aplicações que requerem alta seletividade. Condições estringentes médias podem compreender condições salinas relativamente baixas e/ou de temperatura relativamente altas, tal como aproximadamente SSC 1X e 65°C. Alta estringência pode ser, por exemplo, definida como NaCI 0,02M a 0,10M e 50°C a 70°C; SSC 5X, formamida 50% e 42°C; ou SSC 0,2X e 65°C. Exemplos específicos de tais condições incluem NaCI 0,02M e 50°C; NaCI 0,02M e 60°C; e NaCI 0,02M e 70°C. Moléculas de ácidos nucleicos que hibridizam a outras moléculas de ácidos nucIeicos, por exemplo, peIo menos sob condições de baixa estringência são ditas ser "cognatos hibridizáveis" de outras moIécuIas de ácidos nucIeicos. Condições de baixa estringência e aIta estringência convencionais são descritas neste pedido e por Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989) neste pedido referido como Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., 1985). Afastamentos de compIementaridade compIeta são permissíveis, enquanto tais afastamentos não impedem compIetamente a capacidade das moIécuIas de formar uma estrutura de fita dupla.

[00039] Condições de baixa estringência podem ser usadas para selecionar sequências de ácidos nucleicos com identidade de sequência mais baixa a uma sequência de ácido nucleico alvo. Pode-se desejar empregar condições, tais como cloreto de sódio de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, em temperaturas variando de aproximadamente 20°C a aproximadamente 55°C. Condições de alta estringência podem ser usadas para selecionar para sequências de ácidos nucleicos com graus mais altos de identidade às sequências de ácidos nucleicos descritas (Sambrook et al., 1989). Condições de alta estringência tipicamente envolvem a hibridização de ácido nucleico em SSC de aproximadamente 2X a aproximadamente 10X (diluído de uma solução 20X de estoque de SSC contendo cloreto de sódio 3 M e citrato de sódio 0,3 M, pH 7,0 em água destilada), solução de Denhardt de aproximadamente 2,5X a aproximadamente 5X (diluída de uma solução de estoque 50X contendo albumina sérica bovina 1% (p/v), Ficoll 1% (p/v) e polivinilpirrolidona 1% (p/v) em água destilada), DNA de esperma de peixe aproximadamente de 10 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, e SDS de aproximadamente 0,02% (p/v) a aproximadamente 0,1% (p/v), com uma incubação a aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C por várias horas durante a noite. Hibridização é geralmente seguida por várias etapas de lavagem. As composições de lavagem geralmente compreendem SSC 0,5X a aproximadamente 10X, e SDS 0,01% (p/v) a aproximadamente 0,5% (p/v) com uma incubação de 15 minutos a aproximadamente 20°C a aproximadamente 70°C. Preferencialmente, os segmentos de ácidos nucleicos permanecem hibridizados após lavagem pelo menos uma vez em SSC 0,1X a 65°C.

[00040] A frase "isolado" significa que foram removidos do seu ambiente natural, apesar de sua disposição eventual. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico "isolada" do arroz, tal como pela clonagem de uma célula de arroz, permanece "isolada" quando é inserida no genoma de uma célula de milho.

[00041] A frase "operacionalmente ligada" refere-se ao arranjo espacial de duas ou mais regiões de ácidos nucleicos ou sequências de ácidos nucleicos de forma que exerçam seus efeitos apropriados com relação ao outro. Por exemplo, uma região promotora pode ser posicionada em relação a uma sequência de ácido nucleico tal que a transcrição da sequência de ácido nucleico seja dirigida pela região promotora. A região promotora e a sequência de ácido nucleico são "operacionalmente ligadas".

[00042] "A montante" e "a jusante" são termos posicionais usados com referência à posição de uma sequência nucleotídica e a direção da transcrição ou tradução de sequências de codificação, que normalmente prossegue na direção 5' a 3'.

[00043] Os termos "promotor" ou "região promotora" referem-se a uma sequência de ácido nucleico, normalmente encontrada a montante (5') para uma sequência de codificação, capaz de dirigir a transcrição de uma sequência de ácido nucleico em uma molécula de RNA. O promotor ou região promotora tipicamente fornece um sítio de reconhecimento de RNA polimerase e outros fatores necessários para início da própria da transcrição. Como contemplado neste pedido, um promotor ou região promotora inclui variações de promotores derivados por inserção ou deleção de regiões reguladoras, submetendo o promotor à mutagênese randômica ou sítio-dirigida e similares. A atividade ou força de um promotor podem ser medidas em termos de quantidades de RNA que ele produz, ou a quantidade do acúmulo proteico em uma célula ou tecido, em relação a um segundo promotor que é medido similarmente.

[00044] A frase "sequências de não codificação 3'" refere-se a sequências nucleotídicas localizadas a jusante de uma sequência de codificação e inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão gênica. Estes são comumente referidos como regiões não traduzidas 3' ou 3'-UTRs. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado afetando a adição de intervalos de ácidos poliadenílico à extremidade 3' do precursor mRNA. O uso de sequências de não codificação 3' diferentes é exemplificado por Ingelbrecht et al. (1989).

[00045] "Sequência líder de tradução" ou "região não traduzida 5'" ou "5'-UTR" todas referem-se a uma sequência nucleotídica localizada entre a sequência de promotor de um gene e a sequência de codificação. As 5'-UTR estão presentes no mRNA totalmente processado a montante da sequência de partida de tradução. As 5'-UTR podem afetar o processamento do transcrito primário a mRNA, estabilidade de mRNA ou eficiência de tradução. Exemplos de sequências líder de tradução foram descritos (Turner and Foster, 1995).

[00046] "Transcrito de RNA" refere-se ao produto que resulta de transcrição catalisada por RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, é referido como o transcrito primário. Uma sequência de RNA derivada do processamento pós-transcricional do transcrito primário é referida como RNA maduro. "RNA mensageiro" (mRNA) refere-se ao RNA que é sem íntrons e que pode ser traduzido dentro do polipeptídeo pela célula.

[00047] "Construto de DNA" refere-se aos elementos genéticos heterólogos operacionalmente ligados entre que compõe uma molécula de DNA recombinante e podem compreender elementos que fornecem a expressão de uma molécula de polinucleotídeo de DNA em uma célula hospedeira e elementos que fornecem a manutenção do construto. Um cassete de expressão vegetal compreende a ligação operável de elementos genéticos que quando transferidos para uma célula vegetal fornece expressão de um produto gênico desejável.

[00048] "Vetor recombinante" refere-se a qualquer agente ou no qual um ácido nucleico de interesse é amplificado, expresso, ou armazenado, tais como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, sequência de replicação autônoma, fago, ou sequência nucleotídica de DNA ou RNA de fita simples linear, fita simples circular,fita dupla linear ou fita dupla circular. O vetor recombinante pode ser sintetizado ou derivado de qualquer fonte e é capaz de integração genômica ou replicação autônoma.

[00049] "Sequência reguladora" refere-se a uma sequência nucleotídica localizada a montante (5'), dentro, ou a jusante (3') com respeito a uma sequência de codificação, ou íntron, cuja presença ou ausência afetam transcrição e expressão da sequência de codificação.

[00050] "Substancialmente homólogo" refere-se a duas sequências que são pelo menos aproximadamente 90% idênticas em sequência, como medido pelo algoritmo CLUSTAL W em, por exemplo, DNAStar (DNAStar, Madison, WI).

[00051] "Substancialmente purificado" refere-se a uma molécula separada de substancialmente todas outras moléculas normalmente associadas a ela em seu estado nativo. Mais preferencialmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais que aproximadamente 60% livre, preferencialmente aproximadamente 75% livre, mais preferencialmente aproximadamente 90% livre, e ainda mais preferencialmente aproximadamente 95% livre de outras moléculas (exclusivo do solvente) presentes na mistura natural. A frase "substancialmente purificada" não é destinada a englobar moléculas presentes em seu estado nativo. Preferencialmente, as moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos desta invenção são substancialmente purificados.

[00052] O termo "transformação" refere-se à introdução de ácido nucleico em um hospedeiro recipiente. O termo "hospedeiro" refere-se a células de bactérias, fungos, animais ou células animais, vegetais ou sementes, ou qualquer parte ou tecidos vegetais incluindo células vegetais, protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, troncos, folhas, mudas, embriões e pólen.

[00053] Como usado neste pedido, uma "planta transgênica" é uma planta que tem introduzido estavelmente em seu genoma, por exemplo, os genomas nucleares ou genomas de plastídeo, um ácido nucleico exógeno.

[00054] O termo "isogênico" como um termo comparativo entre plantas ou linhagens vegetais tendo ou sem um transgene significa plantas ou linhagens tendo os mesmos contextos genéticos ou similares, com a exceção do transgene em questão. Por exemplo, as assim chamadas linhagens irmãs que representam seleções fenotipicamente similares ou idênticas da mesma população de parental F2 são consideradas sendo "isogênicas". Quando a progênie de uma planta transformante estável é cruzada e retrocruzada com plantas da linhagem parental não transformada de 3 a 6 gerações (ou mais) usando parental não transformado como o parental recorrente enquanto seleção para tipo (genótipo pela análise de marcador molecular, fenótipo pela observação de campo ou ambos) e para o transgene, considera-se que a linha transgênica resultante é "altamente isogênica" à sua linha parental não transformada.

[00055] Os termos "sementes" "núcleos" e "grão" são entendidos ser equivalentes no significado. O termo núcleo é frequentemente usado na descrição da semente de uma planta de arroz ou milho. Em todas as plantas, a semente é o óvulo maduro composto de um revestimento de semente, embrião, aleurona e um endosperma.

Ácidos nucleicos que codificam delta 5 dessaturases

[00056] A invenção fornece, em uma modalidade, novos ácidos nucleicos que codificam delta 5 dessaturases de Hemiselmis spp. Em uma modalidade particular, os ácidos nucleicos são isolados da cepa CCMP442 de Hemiselmis virescens e da cepa CCMP439 de Hemiselmis rufescens (disponível em CCMP; Center for Culture of Marine Phytoplankton; West Boothbay Harbor, Maine,U.S.A). Em certas modalidades, os ácidos nucleicos compreendem a SEQ ID NOs:1 ou 3. A invenção também fornece métodos de uso de tais ácidos nucleicos, incluindo SEQ ID NOs:1 e 3. Em uma modalidade, estas moléculas de ácidos nucleicos são usadas no contexto desta invenção para alterar a composição de óleo de uma semente de uma planta.

[00057] Tal ácido nucleico pode ser amplificado usando cDNA, mRNA ou DNA genômico como um molde e iniciadores oligonucleotídicos apropriados de acordo com técnicas de amplificação de PCR™ padrão. Alternativamente, podem ser sintetizados usando técnicas sintéticas padrão, tais como um sintetizador de DNA automatizado. Polinucleotídeos que codificam delta 5 dessaturases desejadas podem ser identificados em uma variedade de meios. Como um exemplo, uma fonte das delta 5 dessaturases desejadas, por exemplo, uma biblioteca de uma espécie Hemiselmis, é rastreada com sondas detectáveis sintetizadas enzimaticamente ou quimicamente, que podem ser feitas de DNA, RNA, ou nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou misturas dos mesmos. Sondas podem ser enzimaticamente sintetizadas a partir de polinucleotídeos de delta 5 dessaturases conhecidas para métodos de hibridização normais ou de estringência reduzida. Sondas oligonucleotídicas também podem ser usadas para rastrear fontes e podem ser baseadas em sequências de delta 5 dessaturases conhecidas, incluindo sequências conservadas entre delta 5 dessaturases conhecidas, ou em sequências peptídicas obtidas da proteína purificada desejada. Sondas de oligonucleotídeo baseadas em sequências de aminoácidos podem ser degeneradas para englobar a degeneração do código genético, ou podem ser influenciadas a favor dos códons preferenciais do organismo fonte. Oligonucleotídeos também podem ser usados como iniciadores de PCR™ do mRNA transcrito reverso a partir de uma fonte conhecida ou suspeita; o produto de PCR™ pode ser o cDNA completo ou pode ser usado para gerar uma sonda para obter o cDNA completo desejado. Alternativamente, uma proteína desejada pode ser inteiramente sequenciada e a síntese total de DNA que codifica aquele polipeptídeo, realizada.

[00058] Uma vez que o genômico desejado ou cDNA foi isolado, pode ser sequenciado por métodos conhecidos. É reconhecido na técnica que tais métodos são sujeitos a erros, tais que sequenciamento múltiplo da mesma região é rotina e ainda é esperado levar a taxas mensuráveis de erros na sequência deduzida resultante, particularmente em regiões tendo domínios repetidos, estrutura secundária extensa, ou composições de bases excepcionais, tais como regiões com alto conteúdo de base GC. Quando discrepâncias surgem, ressequenciamento pode ser feito e pode empregar métodos especiais. Métodos especiais podem incluir condições de sequenciamento alteradas usando: temperaturas diferentes; enzimas diferentes; proteínas que alteram a capacidade de oligonucleotídeos de formar estruturas de ordem mais alta; nucleotídeos alterados, tais como ITP ou dGTP metilado; composições de gel diferentes, por exemplo, adição de formamida; iniciadores diferentes ou iniciadores localizados em distâncias diferentes da região problema; ou moldes diferentes, tais como DNAs de fita única. O sequenciamento de mRNA também pode ser empregado.

[00059] Se desejado, as sequências de ácidos nucleicos que codificam para delta 5 dessaturases podem ser modificadas sem modificar a sequência de aminoácidos resultante da proteína expressa para que as sequências sejam mais acessíveis à expressão em hospedeiros vegetais ou outras células hospedeiras. Uma sequência de codificação pode ser DNA artificial. Um DNA artificial, como usado neste pedido significa uma molécula de polinucleotídeo de DNA que é de ocorrência não natural. Moléculas de DNA artificial podem ser desenhadas por uma variedade de métodos, tais como, métodos conhecidos na técnica que são baseados em substituição do códon(s) de um primeiro polinucleotídeo para criar uma equivalente, ou até melhorada, segunda geração de polinucleotídeo artificial, onde este novo polinucleotídeo artificial é útil para a expressão aumentada em plantas transgênicas. O aspecto de desenho muitas vezes emprega um arranjo de uso de códon produzido pela compilação da frequência de ocorrência de códons em uma coleção de sequências de codificação isoladas de uma planta, tipo de planta, família ou gênero. Outros aspectos de desenho incluem a redução da ocorrência de sinais de poliadenilação, sítios de junção de íntron, ou trechos AT ou GC longos da sequência (Patente U.S. 5.500.365). Sequências de codificação completas ou fragmentos das mesmas podem ser produzida usando métodos de DNA artificial conhecidos pelos versados na técnica. Modificações das sequências nucleotídicas ou elementos regulatórios descritos neste pedido que mantêm as funções contempladas neste pedido estão dentro do escopo desta invenção. Tais modificações incluem inserções, substituições e deleções, e especificamente substituições que refletem a degeneração do código genético.

[00060] Os inventores isolaram sequências de DNA de Hemiselmis spp que produzem polipeptídeos com atividade de delta 5 dessaturase. As sequências que codificam as delta 5 dessaturases podem ser expressas em plantas transgênicas, micro-organismos ou animais para modificar conteúdo de ácido graxo. Outros polinucleotídeos que são substancialmente idênticos a polinucleotídeos de delta 5 dessaturase fornecidos neste pedido, ou que codificam polipeptídeos que são substancialmente idênticos a polipeptídeos de delta 5 dessaturase, também podem ser usados. "Substancialmente idêntico" refere a uma sequência de aminoácidos ou exposição de sequência de ácidos nucleicos em ordem crescente de preferência de identidade de pelo menos 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 98 ou 99% à sequência polipeptídica de delta 5 dessaturase na SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 ou sequências que codificam estes polipeptídeos. Comparações de polipeptídeo ou de polinucleotídeo podem ser realizadas usando programa de análise de sequência, por exemplo, o pacote de programas Sequence Analysis do GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA) e MEGAlign (DNAStar, Inc, 1228 S. Park St, Madison, Wis. 53715). Tal programa combina sequências similares pela estimativa dos graus de similaridade ou identidade.

Construtos de DNA

[00061] A invenção fornece construtos de DNA compreendendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um ácido nucleico descrito neste pedido. A seleção de promotores, por exemplo, promotores que podem ser descritos como fortemente expressos, fracamente expressos, induzivelmente expressos, expresso potencializado pelo tecido (isto é, especificamente ou preferencialmente expresso em um tecido), expresso potencializado pelo órgão (isto é, especificamente ou preferencialmente expresso em um órgão) e expresso potencializado por desenvolvimento (isto é, especificamente ou preferencialmente expresso durante um estágio(s) particular do desenvolvimento), está dentro do versado na técnica. Similarmente, a combinação de uma molécula de ácido nucleico como descrito acima com um promotor está também dentro da habilidade na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001).

[00062] Promotores para uso com a invenção incluem, mas não são limitados a, promotores que funcionam em bactérias, bacteriófagos, fungos ou células vegetais. Promotores úteis para expressão bacteriana são os promotores lacZ, Sp6, T7, T5 ou glgC de E. coli. Promotores úteis para fungos incluem gal1 de Saccharomyces cerevisiae (West et al., 1984), nmt1 de Saccharomyces pombe (Maundrell, 1990), ccg-1 de Neurospora crassa (Freitag and Selker, 2005) e AUG1 de Pichia methanolica (Invitrogen). Promotores úteis para células vegetais incluem o promotor gama zein Z27 (ver, por exemplo, Prem Das et al., 1991), promotor L3 oleosina (Patente U.S. No. 6.433.252, Kriz et al.), promotor PER1 de cevada (Stacey et al., 1996), promotor CaMV 35S (Patente U.S. No. 5.530.196 (Fraley et al.)) ), promotor nos (Ebert et al., 1987), promotor de actina de arroz (Patente U.S. No. 5,641,876) e promotor PEPCase (Hudspeth et al., 1989). O promotor do Vírus de Mosaico Figwort (FMV) (Patente U.S. No. 6.051.753 (Comai et al.)), promotores de arcelina, tomato E8, patatina, ubiquitina, manopina sintase (mas) e tubulina são outros exemplos de promotores úteis.

[00063] Há uma larga variedade de sequências promotoras vegetais que podem ser usadas para dirigir a expressão tecido-específica de polinucleotídeos que codificam delta 5 dessaturases e outras dessaturases em plantas transgênicas. De fato, em modalidades particulares da invenção, o promotor usado é um promotor potencializado por semente. Exemplos de tais promotores incluem as regiões reguladoras 5' de tais genes como napina (Kridl et al., 1991), faseolina (Bustos et al., 1989), subunidade a' de soja de Δ-conglicinina (P-Gm7S alfa', vide por exemplo, Chen et al., 1986), Vicia faba USP (P- Vf.Usp, vide, por exemplo, SEQ ID NOs:1, 2, e 3 da Publicação de Patente U.S. 20030229918), o promotor de globulina (vide por exemplo, Belanger and Kriz, 1991), e a subunidade de alfa de soja de Δ- conglicinina (7S alfa) (Publicação Patente U.S. 20030093828, incorporado por referência).

[00064] Outros promotores potencializados de expressão de semente conhecidos para funcionar no milho e em outras plantas incluem os promotores dos seguintes genes: Waxy (amido sintase ligada a grânulo), Brittle and Shrunken 2 (ADP glicose pirofosforilase), Shrunken 1 (sacarose sintase), enzimas ramificadoras I e II, amido sintases, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas, e Betl1 (camada de transferência de endosperma basal). Outros promotores úteis na prática da invenção que são conhecidos por um versado na técnica também são contemplados pela invenção.

[00065] Além disso, potencializadores de transcrição ou duplicações de potencializadores podem ser usados para aumentar a expressão de um promotor particular. Exemplos de tais potencializadores incluem, mas não são limitados ao Adh íntron1 (Callis et al., 1987), um íntron de actina de arroz (McElroy et al., 1991, Patente U.S No. 5.641.876), íntron de sacarose sintase (Vasil et al., 1989), um íntron de milho HSP70 (também referido como Zm.DnaK) (Patente U.S 5.424.412, Brown et al.) um elemento omega TMV (Gallie et al., 1999), o potencializador CaMV 35S (Patente U.S 5.359.142 & 5.196.525, McPherson et al.) ou um potencializador de octopina sintase (Patente U.S. 5.290.924, Last et al.). Como a sequência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o início da sequência de codificação, isto é, sequência líder não traduzida, pode influenciar na expressão gênica, pode-se desejar também empregar uma sequência líder particular. Qualquer sequência líder disponível para um versado na técnica pode ser empregada. Sequências líder preferenciais direcionam níveis ótimos de expressão do gene ligado, por exemplo, pelo aumento ou manutenção de estabilidade mRNA e/ou pela prevenção de início impróprio de tradução (Joshi, 1987). A escolha de tais sequências é à discrição daqueles versados na técnica.

[00066] Construtos de DNA da invenção podem incluir uma sequência próxima da extremidade 3' do cassete que atua como um sinal de terminação da transcrição de um ácido nucleico heterólogo e que dirige a poliadenilação do mRNA resultante. Estes são comumente referidos como regiões não traduzidas 3' ou 3'- UTRs. Alguns elementos 3' que podem atuar como sinais de terminação de transcrição incluem aqueles do gene de nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), uma região não traduzida 3' de napina (Kridl et al., 1991), uma região não traduzida de 3' globulina (Belanger e Kriz, 1991), uma região não traduzida de 3' do gene Adr12 de soja (auxina regulada para baixo) (Wang et al., Publicação PCT WO200250295) ou um a partir de um gene zein, tal como Z27 (Lopes et al., 1995). Outros elementos reguladores 3' conhecidos na técnica também podem ser usados nos vetores da invenção.

[00067] Uma molécula de ácido nucleico como descrita neste pedido pode ser clonada em qualquer vetor adequado e pode ser usada para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. A seleção de vetores e métodos para construi-las é comumente conhecida na técnica e é descrita em referências técnicas gerais (vide, em geral, Recombinant DNA Part D; Meth. Enzymol. 153:1-622, 1987). O vetor compreenderá preferencialmente sequências regulatórias, tais como transcrição e iniciação de tradução e códons de terminação, que são específicos para o tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo ou planta) no qual o vetor deve ser introduzido, como apropriado e tomar em consideração se o vetor é DNA ou RNA.

[00068] Vetores que são circulares ou lineares podem ser preparados para conter uma sequência de ácido nucleico inteira como descrito acima ou uma porção da mesma ligada a um sistema de replicação funcional em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Os sistemas de replicação podem ser derivados de ColE1, plasmídeo 2 mμ, fago À, fago filamentoso f1, espécies de Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens e A. rhizogenes) e similares.

[00069] Além do sistema de replicação e a sequência de ácido nucleico inserida, o vetor pode incluir um ou mais genes marcadores que permitem a seleção de hospedeiros transformados ou transfectados. Genes marcadores incluem resistência à biocida, tal como resistência a antibióticos, metais pesados, herbicidas, etc., complementação em um hospedeiro auxotrófico para fornecer prototrofia e similares.

[00070] A invenção fornece células hospedeiras compreendendo uma molécula de ácido nucleico descrita neste pedido, opcionalmente na forma de um vetor. Hospedeiros adequados incluem células vegetais, bacterianas e fúngicas, incluindo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobacterium tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae e Neurospora crassa. Os hospedeiros de E. coli incluem TB-1, TG-2, DH5α, XL-Blue MRF' (Stratagene, Austin, TX), SA2821, Y1090 e TG02. Células vegetais incluem, mas não limitadas a, soja, Brassica campestris, canola, oilseed rape, rapeseed, crambe, mostarda, mamona, amendoim, sésamo, algodão, linhaça, cártamo, palmeira de óleo, linho, girassol, alfafa, milho, trigo, cevada, aveia, centeio, painço, sorgo e arroz.

[00071] A expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada de uma maneira transiente ou estável. Expressão transiente pode ocorrer a partir de construtos introduzidos que contêm sinais de expressão funcionais na célula hospedeira, mas que os construtos não replicam e raramente se integram na célula hospedeira, ou onde a célula hospedeira não está proliferando. Expressão transiente também pode ser realizada pela indução da atividade de um promotor regulável operacionalmente ligado ao gene de interesse, embora tais sistemas induzíveis frequentemente exibam um baixo nível basal de expressão. Expressão estável pode ser alcançada pela introdução de um construto que pode integrar-se no genoma do hospedeiro ou que se replica autonomamente na célula hospedeira. Expressão estável do gene de interesse pode ser selecionada para pelo uso de um marcador selecionável localizado ou transfectado com o construto de expressão, seguido pela seleção para células expressando o marcador. Quando a expressão estável resulta da integração, integração de construtos pode ocorrer randomicamente dentro do genoma do hospedeiro ou pode ser visada pelo uso de construtos contendo regiões da homologia com o genoma do hospedeiro suficiente para visar a recombinação com os locus do hospedeiro. Onde os construtos são visados a locus endógenos, todas ou algumas regiões regulatórias transcricionais e traducionais podem ser fornecidos pelos locus endógenos.

[00072] Expressão em uma célula hospedeira pode envolver técnicas de fermentação conhecidas por um versado na técnica. A célula hospedeira fermentada pode ser um procarioto, tal como Escherichia coli, ou eucarioto, tal como a levedura Saccharomyces cerevisiae ou Neurospora crassa, fungos filamentosos. Exemplos de produção de PUFA por fermentação incluem Mortierella (Patente U.S. 6.319.698) e Thraustrochytriales (Patente U.S. 6.451.567).

[00073] É contemplado que mais de um gene pode ser introduzido e propagado em uma célula hospedeira através do uso de vetores de expressão epissomais ou integrados. Onde dois ou mais genes são expressos a partir de vetores de replicação separados, é desejável que cada vetor tenha um meio diferente da replicação. Cada construto introduzido, ou integrado ou não, deve ter um meio diferente da seleção e não deve ter homologia a outros construtos para manter a expressão estável e prevenir o reordenamento de elementos entre construtos. Escolhas judiciosas de regiões reguladoras, meios de seleção e método da propagação do construto introduzido podem ser determinadas experimentalmente para que todos os polinucleotídeos introduzidos sejam expressos nos níveis necessários para fornecer a síntese dos produtos desejados.

Polipeptídeos

[00074] A invenção fornece delta 5 dessaturases codificadas por moléculas de ácidos nucleicos descritas neste pedido. Delta 5 dessaturases são enzimas que podem dessaturar ou catalisar a formação de uma ligação dupla entre carbonos consecutivos na posição 5 de um ou mais ácidos graxos para produzir um ácido graxo mono- ou poli-insaturado ou um precursor do mesmo. O polipeptídeo pode compreender D-aminoácidos, L-aminoácidos ou uma mistura de D- e L- aminoácidos.

[00075] Alterações da sequência de aminoácidos nativa para produzir polipeptídeos variantes podem ser preparadas por uma variedade de meios conhecidos pelos versados ordinariamente na técnica. Por exemplo, substituições de aminoácido podem ser convenientemente introduzidas nos polipeptídeos pela modificação da sequência da molécula de ácido nucleico no momento da síntese. Mutações sítio-específicas também podem ser introduzidas pela ligação em um vetor de expressão um oligonucleotídeo sintetizado compreendendo a sequência modificada. Alternadamente, procedimentos de mutagênese oligonucleotídeo-direcionada, sítio- específica podem ser usados, tais como descritos em Walder et al. (1986); Bauer et al. (1985); e Patente U.S. 4.518.584 e 4.737.462.

[00076] Está dentro da habilidade do versado ordinário selecionar aminoácidos sintéticos e de ocorrência natural que efetuam substituições conservativas ou neutras de qualquer aminoácido particular de ocorrência natural. O versado ordinariamente desejavelmente considerará o contexto no qual qualquer particular substituição de aminoácido é feita, além da consideração de hidrofobicidade ou polaridade da cadeia lateral, o tamanho geral da cadeia lateral e o valor de pK das cadeias laterais com caráter acídico ou básico sob condições fisiológicas. Por exemplo, lisina, arginina e histidina muitas vezes são apropriadamente substituídas uma por outra, e mais muitas vezes arginina e histidina. Como é conhecido na técnica, isto é porque os três aminoácidos têm cadeias laterais básicas, ao passo que os valores de pK para as cadeias laterais de lisina e arginina são muito mais próximos entre si (aproximadamente 10 e 12) do que à histidina (aproximadamente 6). Similarmente, glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina muitas vezes são apropriadamente substituídas uma por outra, com a ressalva que glicina não seja frequentemente substituída apropriadamente por outros membros do grupo. Isto é porque cada um destes aminoácidos é relativamente hidrofóbico quando incorporado em um polipeptídeo, mas glicinas sem um carbono α permite aos ângulos phi e psi de rotação (em torno do carbono α) tanta liberdade conformacional que resíduos glicinila podem provocar modificações em conformação ou estrutura secundária que muitas vezes não ocorrem quando outros aminoácidos são substituídos entre si. Outros grupos de aminoácidos frequentemente substituídos apropriadamente entre si incluem, mas não são limitados ao grupo consistindo em ácidos glutâmico e aspártico; o grupo consistindo em fenilalanina, tirosina e triptofano; e o grupo consistindo em serina, treonina e, opcionalmente, tirosina. Adicionalmente, o versado ordinariamente pode agrupar prontamente aminoácidos sintéticos com aminoácidos de ocorrência natural.

[00077] Se desejado, os polipeptídeos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação, ou pela criação de sais de adição ácida, amidas, ésteres, em particular, ésteres C-terminais, e derivados N-acila dos polipeptídeos da invenção. Os polipeptídeos também podem ser modificados para criar derivados proteicos formando complexos covalentes ou não covalentes com outras porções conforme métodos conhecidos na técnica. Complexos ligados covalentemente podem ser preparados pela ligação das porções químicas a grupos funcionais das cadeias laterais de aminoácidos compreendendo os polipeptídeos, ou no N- ou C-terminal. Desejavelmente, tais modificações e conjugações não afetam adversamente a atividade dos polipeptídeos (e variantes dos mesmos). Enquanto tais modificações e conjugações podem ter maior ou menor atividade, a atividade desejavelmente não é negada e é característica do polipeptídeo inalterado.

[00078] Os polipeptídeos (e fragmentos, variantes e proteínas de fusão) podem ser preparados por qualquer uma de diversas técnicas convencionais. O polipeptídeo pode ser isolado ou substancialmente purificado de uma fonte de ocorrência natural ou de uma fonte recombinante. Por exemplo, em caso de proteínas recombinantes, um fragmento de DNA que codifica uma proteína desejada pode ser subclonado em um vetor apropriado usando técnicas de genética molecular bem conhecidas (vide, por exemplo, Maniatis et al., 1989 e outras referências citadas neste pedido sob "EXEMPLOS"). O fragmento pode ser transcrito e a proteína posteriormente traduzida in vitro. Conjuntos comercialmente disponíveis também podem ser empregados (por exemplo, tal como produzido por Clontech, Mountain View, CA; Amersham Life Sciences, Inc, Arlington Heights, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA e similares). A reação de polimerase em cadeia opcionalmente pode ser empregada na manipulação de ácidos nucleicos.

[00079] Polipeptídeos podem ser sintetizados usando um sintetizador de peptídeo automatizado conforme métodos conhecidos na técnica. Alternadamente, o polipeptídeo (e fragmentos, variantes e proteínas de fusão) pode ser sintetizado usando técnicas de síntese peptídica padrão bem conhecidas por aqueles versados ordinários na técnica (por exemplo, como resumido em Bodanszky, 1984). Em particular, o polipeptídeo pode ser sintetizado usando o procedimento de síntese em fase sólida (vide, por exemplo, Merrifield, 1963; Barany et al., 1987 e Patente U.S. 5.424.398). Se desejado, isto pode ser feito usando um sintetizador de peptídeo automatizado. Remoção de grupos de bloqueio de aminoácido t-butiloxicarbonila (t-BOC) ou 9- fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) e separação da proteína da resina pode ser realizada, por exemplo, por tratamento ácido em temperatura reduzida. A mistura contendo polipeptídeo então pode ser extraída, por exemplo, com dietil éter, para remover compostos orgânicos não peptídicos, e a proteína sintetizada pode ser extraída do pó de resina (por exemplo, com ácido acético aproximadamente 25% p/v). Seguinte à síntese do polipeptídeo, purificação adicional (por exemplo, usando HPLC) opcionalmente pode ser feita a fim de eliminar qualquer proteína incompleta, polipeptídeos, peptídeos ou aminoácidos livres. Análise de aminoácido e/ou HPLC pode ser realizada no polipeptídeo sintetizado para validar sua identidade. Para outras aplicações de acordo com a invenção, pode ser preferencial produzir o polipeptídeo como parte de uma proteína de fusão maior, por conjugação química, ou através de meios genéticos conhecidos na técnica. Neste sentido, esta invenção também fornece uma proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo (ou fragmento do mesmo) ou variante do mesmo e um ou mais polipeptídeos/proteína(s) tendo algumas propriedades desejadas ou funções efetoras.

[00080] Ensaios para a produção e identificação de proteínas específicas são baseados em várias propriedades, físico-químicas, estruturais, funcionais ou outras das proteínas. Propriedades físico- químicas ou estruturais únicas permitem às proteínas serem separadas e identificadas por procedimentos eletroforéticos, tais como eletroforese em gel nativa ou desnaturante ou focagem isoelétrica, ou por técnicas cromatográficas, tais como cromatografia de troca iônica ou por exclusão em gel. As estruturas únicas de proteínas individuais oferecem oportunidades para o uso de anticorpos específicos para detectar sua presença em formatos, tais como um ensaio de ELISA. Combinações de abordagens podem ser usadas para alcançar a especificidade ainda maior, tais como western blotting no qual os anticorpos são usados para localizar produtos gênicos individuais que foram separados por técnicas eletroforéticas. Técnicas adicionais podem ser usadas para confirmar absolutamente a identidade do produto de interesse, tal como avaliação pelo sequenciamento de aminoácidos após purificação. Embora estes estejam entre os mais comuns, outros procedimentos também podem ser usados.

[00081] Procedimentos de ensaio podem identificar a expressão de proteínas por sua funcionalidade, particularmente onde a proteína expressa é uma enzima capaz de catálise de reações químicas que envolvem substratos e produtos específicos. Por exemplo, em extratos vegetais estas reações podem ser medidas pelo fornecimento e quantificação da perda de substratos ou geração de produtos das reações por procedimentos físicos e/ou químicos.

[00082] Em muitos casos, a expressão de um produto gênico é determinada por avaliação dos resultados fenotípicos de sua expressão. Tais avaliações podem ser simplesmente como observação visual, ou podem envolver ensaios. Tais ensaios podem tomar muitas formas, tais como análise de modificações na composição química, morfologia ou propriedades fisiológicas da planta. Composição química pode ser alterada pela expressão de genes que codificam enzimas ou proteínas de armazenamento que modificam a composição de aminoácido e estas modificações podem ser detectadas pela análise de aminoácido, ou por enzimas que modificam a quantidade de amido, que pode ser analisada por espectrometria de reflectância de infravermelho próximo ou por enzimas que modificam a composição de óleo, que pode ser detectada por cromatografia gasosa. Modificações morfológicas podem incluir maior estatura ou caules mais espessos.

[00083] As moléculas de ácidos nucleicos, construtos de DNA e polipeptídeos desta invenção podem ser usados em métodos agrícolas e vários ensaios de rastreamento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode ser usada para expressar uma delta 5 dessaturase através de um vetor em uma célula hospedeira, para detectar transcritos de mRNA que codificam delta 5 dessaturases em uma amostra biológica, para detectar uma alteração genética em um gene que codifica delta 5 dessaturase através de um Southern blot, para suprimir delta 5 dessaturases ou para regular para cima delta 5 dessaturases. Os polipeptídeos podem ser usados para compensar por deficiências em delta 5 dessaturases ou pela presença de delta 5 dessaturases mutadas tendo reduzida ou nenhuma atividade em uma planta, ou para tratar níveis excessivos de substratos, se direto ou indireto, para delta 5 dessaturases em uma planta. Alternativamente, os polipeptídeos podem ser usados por agentes de rastreamento para a capacidade de modular sua atividade. Os anticorpos podem ser usados para detectar e isolar os respectivos polipeptídeos bem como reduzir a disponibilidade de tais polipeptídeos in vivo.

Transformação Vegetal

[00084] Em uma modalidade preferencial da invenção, uma planta transgênica expressando a proteína ou proteínas desejadas é produzida. Vários métodos para a introdução de uma sequência polinucleotídica desejada que codifica a proteína desejada em células vegetais são conhecidos à técnica, incluindo: (1) métodos físicos, tais como microinjeção, eletroporação, e entrega mediada por micropartícula (biolística ou tecnologia de arma gênica); (2) entrega mediada por vírus; ou (3) transformação mediada por Rhizobia, tal como mediada por Agrobacterium.

[00085] Os métodos ainda mais comumente usados para transformação de células vegetais são o processo de transferência de DNA mediada por Agrobacterium e o biolística ou processo mediado por bombardeio de micropartícula de microprojétil. Tipicamente, transformação nuclear é desejada, mas onde é desejável transformar especificamente plastídeos, tais como cloroplastos ou amoloplastos, plastídeos vegetais podem ser transformados utilizando uma entrega mediada por micropartícula do polinucleotídeo desejado.

[00086] Uma transformação mediada por Agrobacterium é alcançada através do uso de uma bactéria de solo geneticamente engendrada que pertence ao gênero Agrobacterium. Diversas cepas selvagens e desarmadas de Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes abrigando plasmídeos Ti ou Ri podem ser usadas para a transferência gênica em plantas. Transferência gênica é feita através da transferência de DNA específico conhecido como "T-DNA" que pode ser geneticamente engendrado para transportar qualquer parte desejada de DNA em muitas espécies vegetais, como elaborado ainda, por exemplo, na Patente U.S. 6.265.638 por Bidney et al., as revelações das quais são por meio deste incorporadas neste pedido por referência.

[00087] Uma transformação genética mediada por Agrobacterium de plantas envolve várias etapas. A primeira etapa, na qual o Agrobacterium virulento e células vegetais são primeiro trazidos pra contato um com outro, é geralmente chamada de "inoculação". Inoculação é preferencialmente acompanhada por algum método de injúria a algumas células vegetais, que liberam constituintes celulares vegetais, tais como cumaril álcool, sinapinato (que é reduzido a acetoseringona), sinapil álcool e coniferil álcool, que ativam fatores de virulência em Agrobacterium. Seguinte à inoculação, permite-se que o Agrobacterium e células/tecidos vegetais crescem em conjunto durante um período de várias horas a vários dias ou mais sob condições adequadas para transferência de T-DNA e crescimento. Esta etapa é denominada "cocultura". Seguinte à cocultura e entrega de T-DNA, células vegetais são tratadas com agentes bactericidas ou bacteriostáticos para eliminar Agrobacterium que permanece em contato com o explante e/ou no vaso contendo explante. Se isto for feito na ausência de qualquer agente seletivo para promover o crescimento preferencial de células vegetais transgênicas versus não transgênicas, então isto é tipicamente referido como a etapa de "retardamento". Se feito na presença dr pressão seletiva que favorece células vegetais transgênicas, então é referido como uma etapa de "seleção". Quando um "retardamento" é usado, é tipicamente seguido por uma ou mais etapas de "seleção".

[00088] Com respeito a bombardeio de micropartícula (Patente U.S. 5.550.318 (Adams et al.); Patente U.S. 5.538.880 (Lundquist e. al.), Patente U.S. 5.610.042 (Chang et al.); e PCT WO 95/06128 (Adams et al.); cada uma das quais é especificamente incorporada neste pedido por referência em sua totalidade), partículas microscópicas são recobertas com ácidos nucleicos e entregues em células por uma força de propulsão. Partículas exemplares incluem aquelas compreendidas de tungstênio, platina, e preferencialmente, ouro.

[00089] Uma modalidade ilustrativa de um método para entregar DNA em células vegetais por aceleração é o Sistema de Entrega de Partícula Biolistics® (BioRad, Hercules, CA), que pode ser usado para propelir partículas recobertas com DNA ou células através de uma tela, tais como um tela de aço inoxidável ou NYTEX, em uma superfície de filtro recoberta com células vegetais monocotildôneas cultivadas em suspensão.

[00090] Técnicas de bombardeio de micropartícula são largamente aplicáveis, e podem ser usadas para virtualmente transformar qualquer espécie vegetal. Exemplos de espécies que foram transformadas pelo bombardeio de micropartícula incluem espécies monocotilédones, tais como milho (Publicação Internacional No. WO 95/06128 (Adams et al.)), cevada, trigo (Patente U.S. 5.563.055 (Townsend et al.)) incorporadas neste pedido por referência em sua totalidade), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar, e sorgo; bem como diversas dicotiledôneas incluindo tabaco, soja (Patente U.S. 5.322.783 (Tomes et al.)), incorporada neste pedido por referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, tomate, e legumes em geral (Patente U.S. 5.563.055 (Townsend et al.)) incorporada neste pedido por referência em sua totalidade).

[00091] Para selecionar ou marcar para células vegetais transformadas apesar da metodologia de transformação, DNA introduzido na célula contém um gene que funciona em um tecido vegetal regenerável para produzir um composto que confere resistência de tecido vegetal a um composto tóxico de outra maneira. Genes de interesse para uso como um marcador selecionável, rastreável, ou marcável incluiriam mas não são limitados a β-glicuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), luciferase (LUX), genes de tolerância a antibiótico ou a herbicida. Exemplos de genes de resistência a antibióticos incluem penicilinas, canamicina (e neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (e trimetoprim); cloranfenicol; canamicina e tetraciclina. Moléculas de polinucleotídeo que codificam proteínas envolvidas na tolerância a herbicida são conhecidas na técnica, e incluem, mas não são limitadas a uma molécula de polinucleotídeo que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) descrito na Patente U.S. 5.627.061 (Barry, et al.), Patente U.S. 5.633.435 (Barry, et al.) e Patente U.S. 6.040.497 (Spencer, et al.) e aroA descrito na Patente U.S. 5.094.945 (Comai) para tolerância a glifosato; uma molécula de polinucleotídeo que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn) descrita na Patente U.S. 4.810.648 (Duerrschnabel, et al.) para tolerância a Bromoxinil; uma molécula de polinucleotídeo que codifica fitoeno dessaturase (crtI) descrito em Misawa et al. (1993); Misawa et al. (1994) para tolerância a norflurazon; uma molécula de polinucleotídeo que codifica acetohidroxiácido sintase (AHAS, também conhecido como ALS) descrito em Sathasiivan et al. (1990) para tolerância a herbicidas sulfonilureia; e tanto para o gene pat descrito em Wohlleben et al., (1988) quanto o gene bar descrito em DeBlock et al. (1987), cada um dos quais fornece tolerância a bialafos e a glufosinato.

[00092] A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas de vários explantes transformados são bem documentados na técnica. Este processo de crescimento e regeneração tipicamente inclui etapas de seleção de células transformadas e cultivo daquelas células individualizadas através de estágios habituais do desenvolvimento embrionário através do estágio de muda enraizada. Embriões e sementes transgênicos são similarmente regenerados. Os brotos transgênicos resultantes enraizados são após disso plantados em um meio de crescimento vegetal apropriado, tal como solo. Células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram marcadas positivas em um ensaio de rastreamento, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Mudas de desenvolvimento são transferidas para mistura de crescimento vegetal com menos terra, e endurecidas, antes de transferência para uma estufa ou câmara de crescimento para maturação.

[00093] Esta invenção pode ser usada com qualquer célula ou tecido transformável. Por transformável como usado neste pedido entende-se uma célula ou tecido que é capaz da propagação adicional para dar origem a uma planta. Aqueles versados na técnica reconhecem que diversas células ou tecidos vegetais são transformáveis nos quais após inserção de DNA exógeno e condições de cultura apropriadas as células vegetais ou os tecidos podem formar em uma planta diferenciada. Tecido adequado para estes fins pode incluir mas não é limitado a embriões imaturos, tecido escutelar, culturas de célula de suspensão, inflorescência imatura, meristema de broto, explantes nodais, tecido de calo, tecido hipocotilédone, cotilédones, raízes e folhas. Tomes et al. patente 5.322.783, citada acima, descreve um método do tratamento com um citocinina seguido pela incubação por um período suficiente para permitir células não diferenciadas no tecido de nodo cotiledonário diferenciar-se em células meristemáticas e permitir às células introduzirem as fases entre as fases G1 e de divisão do desenvolvimento, que é afirmado para melhorar a suscetibilidade da transformação.

[00094] De acordo com a corrente invenção, qualquer meio de cultura vegetal adequado pode ser usado. Meios adequados incluem mas não são limitados a meios baseados em MS (Murashige and Skoog, 1962) ou meios baseados em N6 (Chu et al., 1975) suplementado com reguladores de crescimento vegetal adicionais incluindo mas não limitado a auxinas, citocininas, ABA e giberelinas. Aqueles versados na técnica são familiares com a variedade de meios de culturas teciduais, que quando suplementados apropriadamente, suporta o crescimento e desenvolvimento de tecido vegetal e são adequados para transformação e regeneração vegetal. Estes meios de culturas de tecido podem ser comprados como uma preparação comercial, ou personalizados preparados e modificados. Aqueles versados na técnica estão cientes que meios e suplementos de meios, tais como nutrientes e reguladores de crescimento para uso em transformação e regeneração e outras condições de cultura, tais como intensidade de luz durante incubação, pH, e temperaturas de incubação que podem ser otimizadas para a variedade particular de interesse.

[00095] Após um construto de DNA ser estavelmente incorporado em plantas transgênicas e confirmado ser operável, pode ser introduzido em outras plantas do mesmas espécies ou outras sexualmente compatíveis por cruzamento sexual. Algumas das diversas técnicas de melhoramento padrão podem ser usadas, dependendo das espécies a serem cruzadas. Por isso, a corrente invenção não somente engloba uma planta diretamente transformada ou regenerada de células que foram transformadas conforme a corrente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Como usado neste pedido, o termo "progênie" denota a descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada conforme a invenção imediada, em que a progênie compreende um construto de DNA selecionado preparado conforme a invenção. "Cruzamento" de uma planta para fornecer uma linhagem vegetal que acrescenta um ou mais transgenes ou alelos em relação a uma linhagem vegetal inicial, como revelada neste pedido, são definidos como técnicas que resultam em uma sequência particular que é introduzida em uma linhagem vegetal pelo cruzamento de uma linhagem inicial com uma linhagem da planta doadora que compreende um transgene ou alelo da invenção. Para alcançar este, por exemplo, pode- se realizar as seguintes etapas: (a) sementes vegetais da primeira (linhagem inicial) e segunda (linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo desejado) planta parental (b) cultivo das sementes da primeira e segunda planta parental nas plantas que carregam flores; (c) polinização de uma flor da primeira planta parental com o pólen da segunda planta parental; e (d) coleta de sementes produzidas na planta parental carregando a flor fertilizada.

[00096] Retrocruzamento é neste pedido definido como o processo incluindo as etapas de: (a) cruzamento de uma planta de um primeiro genótipo contendo um gene, sequência de DNA ou elemento desejados a uma planta de uma segunda sem o dito genótipo do gene, sequência de DNA ou elemento desejados; (b) seleção de uma ou mais plantas de progênie contendo o gene, sequência de DNA ou elemento desejados; (c) cruzamento da planta de progênie com uma planta do segundo genótipo; e (d) repetição das etapas (b) e (c) com o objetivo de transferir uma sequência de DNA desejada de uma planta de um primeiro genótipo a uma planta de um segundo genótipo.

[00097] Introgressão de um elemento de DNA em um genótipo vegetal é definida como o resultado do processo da conversão de retrocruzamento. Um genótipo vegetal no qual uma sequência de DNA sofreu introgressão pode ser referida como o genótipo convertido de um retrocruzamento, linhagem, melhoramento ou híbrido. Similarmente, um genótipo vegetal sem a sequência de DNA desejada pode ser referido como um genótipo, linhagem, melhoramento ou híbrido não convertidos.

Sementes, Farelo, Óleo e Produtos Compreendendo Sementes, Farelo e Óleo

[00098] Esta invenção também fornece um recipiente de mais de aproximadamente 1000, mais preferencialmente aproximadamente 20.000, e ainda mais preferencialmente aproximadamente 40.000 sementes de mais de aproximadamente 10%, mais preferencialmente aproximadamente 25%, mais preferencialmente aproximadamente 50%, e ainda mais preferencialmente aproximadamente 75% ou mais preferencialmente aproximadamente 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta desta invenção.

[00099] Esta invenção também fornece um recipiente de mais de aproximadamente 10 kg, mais preferencialmente aproximadamente 25 kg, e ainda mais preferencialmente sementes de aproximadamente 50 kg de mais de aproximadamente 10%, mais preferencialmente aproximadamente 25%, mais preferencialmente aproximadamente 50%, e ainda mais preferencialmente aproximadamente 75% ou mais preferencialmente aproximadamente 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta desta invenção.

[000100] Qualquer uma das plantas ou partes das mesmas desta invenção pode ser coletada e, opcionalmente, processada para produzir uma preparação de ração, farinha ou óleo. Uma parte vegetal particularmente preferencial para esta finalidade é semente coletada, mas outras partes vegetais podem ser coletadas e usadas para palha ou ensilagem. Métodos para produção de preparações de ração, farinha e óleo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente U.S. 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227. O grão ou a farinha desta invenção podem ser misturados com outros grãos ou farinhas.

Métodos

[000101] A presente invenção fornece um método para fornecimento de plantas transgênicas com um conteúdo aumentado de EPA ou ARA. Este método pode incluir, por exemplo, introdução de DNA que codifica um delta 5 dessaturase e opcionalmente pelo menos uma dessaturase adicional em células vegetais e regeneração de plantas com conteúdo de EPA ou ARA aumentado das células transgênicas.

[000102] Mais especificamente, a invenção fornece um método de produção de alimento ou ração, compreendendo as etapas de (a) obtenção da planta transgênica da invenção; e (b) produção do alimento ou ração. O alimento ou ração pode ser óleo, ensilagem, farelo, grão, amido, farinha ou proteína. A composição de alimento ou ração é definida como compreendendo uma sequência polinucleotídica detectável ou polipeptídeo detectável fornecido pela invenção. Adicionalmente, a invenção fornece composições de ração animal e de alimento humano compreendendo EPA ou ARA.

[000103] Para suplemento dietético, os PUFAs purificados, plantas transformadas ou partes vegetais, ou derivados das mesmas, podem ser incorporadas na óleos, gorduras ou margarinas de cozinha formuladas de forma que em uso normal o recipiente recebesse a quantidade desejada. Os PUFAs também podem ser incorporados em fórmulas infantis, suplementos nutritivos ou outros produtos de alimento, e pode encontrar uso como agentes anti-inflamatórios ou de redução de colesterol.

[000104] Como usado neste pedido, "composição comestível" é definida como composições que podem ser ingeridas por um mamífero, tais como gêneros alimentícios, substâncias nutritivas e composições farmacêuticas. Como usado neste pedido, "gêneros alimentícios" referem-se a substâncias que podem ser usadas ou preparadas para uso como alimento de um mamífero e incluir substâncias que podem ser usadas na preparação do alimento (tais como óleos de fritura) ou aditivos alimentícios. Por exemplo, gêneros alimentícios incluem animais usados para o consumo humano ou qualquer produto deles, tais como, por exemplo, ovos. Gêneros alimentícios típicos incluem mas não são limitados a bebidas, (por exemplo, refrigerantes, bebidas carbonatadas, bebidas prontas para misturar), fórmula infantil, alimentos infundidos (por exemplo, frutas e verduras), molhos, condimentos, molhos de salada, sucos de fruta, xaropes, sobremesas (por exemplo, pudins, gelatina, glacês e recheios, mercadorias assadas e sobremesas congeladas, tais como sorvetes e sorbets), produtos congelados leves (por exemplo, cremes congelados leves, sorvetes congelados leves e iogurtes, coberturas congeladas leves tais como coberturas batidas lácteas ou não lácteas), óleos e produtos emulsionados (por exemplo, gordura vegetal, margarina, maionese, manteiga, óleo de cozinha e molhos de salada) e alimentos de umidade intermediária (por exemplo, arroz e alimentos para cães).

[000105] Além disso, composições comestíveis descritas neste pedido também podem ser ingeridas como um aditivo ou suplemento contido em alimentos e bebidas. Estes podem ser formulados em conjunto com uma substância nutritiva, tal como várias vitaminas e minerais e incorporados em composições substancialmente líquidas, tais como bebidas nutritivas, leites de soja e sopas; composições substancialmente sólidas; e gelatina ou usadas na forma de um pó a ser incorporado em vários alimentos. O conteúdo do ingrediente eficaz em tal alimento alimento funcional ou saudável pode ser similar à dose contida em um agente farmacêutico típico.

[000106] Os PUFAs purificados, plantas transformadas ou partes vegetais também podem ser incorporados em ração animal, particularmente gado. Deste modo, os próprios animais podem beneficiar-se de uma dieta rica em PUFA, enquanto os consumidores humanos de produtos de alimento produzidos de tal gado podem beneficiar-se também.

[000107] Para uso farmacêutico (humano ou veterinário), as composições podem ser geralmente administradas oralmente mas podem ser administradas por qualquer via pela qual possam ser com sucesso absorvidas, por exemplo, parenteralmente (isto é, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente), retalmente, vaginalmente ou topicamente, por exemplo, como uma pomada ou loção cutânea. Os PUFAs, plantas transformadas ou partes vegetais da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Onde disponível, cápsulas de gelatina são a forma preferencial para administração oral. Suplemento dietético como apresentado acima também pode fornecer uma via oral de administração. Os ácidos insaturados da presente invenção podem ser administrados em formas conjugadas, ou como sais, ésteres, amidas ou profármacos dos ácidos graxos. Qualquer sal farmaceuticamente aceitável é englobado pela presente invenção; especialmente preferencial são os sais de sódio, potássio ou lítio. Também são englobados os sais N-alquilpoli-hidroxamina, tais como N-metil glucamina, encontrado na publicação PCT WO 96/33155. Ésteres preferenciais são os ésteres de etila. Como sais sólidos, os PUFAs também podem ser administrados na forma de comprimido. Para administração intravenosa, os PUFAs ou derivados dos mesmos podem ser incorporados em formulações comerciais, tal como Intralipids (Pharmacia-Upjohn, Peapack, N.J.).

EXEMPLOS

[000108] Os seguintes exemplos estão incluídos para ilustrar modalidades da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para operar bem na prática da invenção. Entretanto, aqueles versados na técnica, à luz da presente descrição, devem apreciar que muitas modificações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado parecido ou similar sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão tanto quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste pedido enquanto os mesmos resultados ou similares seriam alcançados. Considera-se que todos tais substitutos similares e modificações aparentes para os versados na técnica estão dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações acrescentadas.

Exemplo 1 Clonagem de Sequências Δ5 Dessaturase de Hemiselmis

[000109] As Δ5 dessaturases da corrente invenção foram clonadas de Hemiselmis virescens e Hemiselmis rufescens. Para clonar a Δ5 dessaturase de Hemiselmis virescens (HvD5D), RNA foi isolado de H. virescens CCMP442 (CCMP, West Boothbay Harbor, ME, USA) seguido pela construção de uma biblioteca de cDNA. Aproximadamente 20.000 clones independentes foram sequenciados. Busca de sequências relacionadas a dessaturase produziu clone que codifica Δ5 dessaturase putativo, LIB5446-048-A1-M1-G2.

[000110] A sequência de DNA do inserto clonado para LIB5446-048- A1-M1-G2 (SEQ ID NO: 5) tem 1613 bp de comprimento e continha uma região de leitura aberta (ORF) de 1326 bp (SEQ ID NO: 1), codificando uma sequência de aminoácido deduzida de 441 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). O tamanho calculado da proteína é 48,9 Kdal com um pi estimada de 7,1. A ORF, referida como HvD5D, continha a sequência de aminoácido conservada HPGG (SEQ ID NO: 24), que é parte do domínio de citocromo b5 (cytb5) fusionado ao N-terminal das dessaturases da extremidade inicial. Todas as dessaturases da extremidade inicial caracterizadas, incluindo Δ4-, Δ5-, Δ6- e Δ8-dessaturases tem este domínio N-terminal do cytb5. Além disso, a sequência de aminoácido deduzida de LIB5446-048-A1-M1-G2 tem três caixas de histidina conservadas; ainda mais notavelmente uma sequência QXXHH (SEQ ID NO: 25), que é encontrada na terceira caixa de histidina e é também diagnóstico das dessaturases da extremidade inicial (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling and Heinz, 2001). Três caixas de histidina conservadas são parte do sítio ativo e imagina- se que são necessárias para ligar um cofator diférrico requerido para a atividade.

[000111] A região de 1326 bp contendo a região de codificação de Δ5 dessaturase putativa de LIB5446-048-A1-M1-G2 foi amplificada por PCR e ligada no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad CA), fornecendo pMON67056 (figura 2). Os iniciadores usados para a amplificação são mostrados abaixo: Hv D5 M1G2 F1: 5'-GTCGACAAACAATGCCTCCCAACAGTGGCG-3' (SEQ ID NO: 6) Hv D5 M1G2 R1: 5'-CCTGCAGGTCAGGCCGCCTTGACCCTC-3' (SEQ ID NO: 7)

[000112] Um sítio de restrição SalI e uma sequência Kozak foram adicionados à extremidade 5' do oligonucleotídeo Hv D5 M1G2 F1 e um sítio de restrição Sse8387I foi adicionado à extremidade 5' do oligonucleotídeo Hv D5 M1G2 R1.

[000113] Para clonar a Δ5 dessaturase de Hemiselmis rufescens (HrD5D), RNA foi isolado de H. rufescens CCMP439 (CCMP, West Boothbay Harbor, ME, USA) seguido pela construção de uma biblioteca de cDNA. Uma biblioteca de EST composta de ~23.790 clones foi rastreada para sequências que continham a extremidade inicial de dessaturases consenso como descrito acima. Um clone parcial foi identificado, LIB5445-223-A1-M1-D4, que continha todas as sequências conservadas anteriormente descritas exceto a região cytb5 (HPGG). Uma reação RACE 5' foi utilizada para completar a ORF desta dessaturase da extremidade inicial putativa, que foi posteriormente ligada em pYES2.1/V5-His-TOPO ® (Invitrogen, Carlsbad, CA) para fornecer pMON104220 (figura 3). Os iniciadores usados para amplificar por PCR a ORF completa foram:H.ruf223 5'- CAGTCGACAAACAATGCCCCCCAACAGCGGCGCGGGAG-3' (SEQ ID NO: 8) e, 3'revH.Ruf223 5'-CACCTGCAGGTCAGTCGGCTTTGACCTTCCCTTCG- 3' (SEQ ID NO: 9).

[000114] A ORF para este clone foi 1323 bp (SEQ ID NO: 3; não incluindo o códon de parada) codificando uma sequência de aminoácido deduzida de 441 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Esta proteína tem um tamanho estimado de 49 Kdal e um pI de 8,2.

[000115] Um alinhamento aos pares das Δ5 dessaturases de Hemiselmis rufescens, Hemiselmis virescens, Pythium irregulare, Mortierella alpina, Thalassiosira pseudonanae Peridinium sp. CCMP626 bem como uma Δ6 dessaturase de Mortierella alpina é mostrado na Tabela 1. As duas Δ5 dessaturases de Hemiselmis são as mais similares mostrando identidade de 86,9%. Em comparação, a identidade para outras duas Δ5 dessaturases de fitoplâncton, Thalassiosira pseudonana e Peridinium sp. CCMP626 variou de 48,5% a 50,9%. As Δ5 dessaturases de Hemiselmis compartilham até menos identidade às Δ5 dessaturases de um mofo de água, P. irregulare (Oomycetes), e um fungo oleaginoso, M. alpina, com faixas de 21,9% a 23,4%. Os níveis mais altos de homologia são encontrados nas áreas em volta das duas caixas de histidina, a caixa O, e a caixa HPGG conservada do domínio cytb5 (figura 1).Tabela 1: identidades de porcentagem de alinhamento de pareamento para sequências de aminoácidos deduzidas de Δ5 e Δ6 dessaturases.

Δ5 dessaturase de P. irregulare (Acesso no GenBank AAL13311).Δ5 dessaturase de M. alpina (Acesso AAC72755).Δ6 dessaturase de M. alpina (Acesso AAF08685).Δ5 dessaturase de T. pseudonana (Acesso DJ418329).Δ5 dessaturase de Peridinium sp CCMP626 (US20070271632, SEQ ID NO: 2 da mesma).

Exemplo 2 Transformação e Expressão de Levedura

[000116] Os clones PYES2.1/V5-His-TOPO ® contendo HvD5D e HrD5D foram introduzidos na cepa hospedeira de Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (auxotrófico para a uracila) (Invitrogen) usando Conjunto de Transformação S.C. EasyComp™ (Invitrogen). Os transformantes foram selecionados em placas feitas de meios mínimos SC menos uracila com glicose 2%. Colônias de transformantes foram usadas para inocular 2 ml de meios mínimos SC menos uracila e glicose 2% cultivadas durante a noite a 30°C. Para indução, células de levedura de fase estacionária foram precipitadas e ressuspensas em 0,4 O.D. A600 em meios mínimos SC menos uracila suplementados com galactose 2% e ácidos graxos exógenos opcionais e cultivadas por 3 dias a 15°C. Quando os ácidos graxos exógenos foram fornecidos às culturas, qualquer DGLA 0,01% (18:2 Δ8,11,14) ou ETA 0,01% (20:4 Δ8,11,14,17) foi adicionado com 0,1% do emulsificador Tergitol. As culturas foram coletadas pela centrifugação após 3 dias da incubação com estes ácidos graxos. Péletes celulares foram lavados uma vez com o tampão TE estéril pH 7,5, para remover os meios, e liofilizado à secura. A cepa hospedeira transformada com o vetor vazio pYES2/CT foi usada como um controle negativo em todos os experimentos.

[000117] Lipídios foram extraídos de péletes de levedura liofilizados pela adição de 0,1 mL de tolueno e incubação durante a noite à temperatura ambiente. Lipídios extraídos foram convertidos em ésteres de metila de ácido graxo (FAMEs) in situ pela adição de 0,5 mL de metóxido de sódio 0,6N em metanol e incubação por 45 min à temperatura ambiente. Os FAMEs foram extraídos pela adição de 0,8 mL de NaCl 10% (p/v) e 0,15 mL de heptano. Após agitação vigorosa seguida por separação de fase, a camada de heptano contendo FAMEs foi removida e usada diretamente para cromatografia gasosa (GC). Os FAMEs foram identificados em uma Hewlett-Packard 5890 II Plus GC (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado com um detector de ionização de chama e uma coluna capilar (Omegawax 250TM; 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm i.d.; Supelco, Bellefonte, PA). O injetor foi mantido a 250°C e o detector de ionização de chama foi mantido a 270°C. A temperatura da coluna foi mantida a 180°C por 1,5 min após injeção, aumentada para 240°C a 40°C/min, e mantida a 245°C por 3,38 min.

[000118] Os resultados mostrados na Tabela 2 demonstram que os clones de Hemiselmis HvD5D e HrD5D exibem atividade de Δ5 dessaturase em um sistema de expressão de levedura. A atividade de enzima foi deduzida de um ensaio de indução de levedura, pelo qual as culturas de levedura induzidas a expressar dessaturase recombinante são alimentadas com DGLA ou ETA. A levedura incorpora estes ácidos graxos em suas membranas onde se tornam substratos da dessaturase recombinante. Os produtos de dessaturação de DGLA e ETA são ARA (20:4 Δ5,8,11,14) e EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), respectivamente. Duas colônias de levedura individuais foram selecionadas para cada vetor e cultivadas em triplicata. Os valores são mostrados como a média de 6 ensaios. Ambos os clones de Hemiselmis demonstraram atividade enzimática com ETA como DGLA.Tabela 2: Atividade de delta 5 dessaturase de Hemiselmis spp. HvD5D e HrD5D em um sistema de expressão de levedura.

Exemplo 3 Expressão de Δ5 dessaturases de Hemiselmis spp. em soja e canola

[000119] A atividade da Δ5 dessaturase de Hemiselmis virescens ou de Hemiselmis rufescens é avaliada na soja expressando-a no controle do promotor potencializado por semente em um contexto de soja que contém cassetes de expressão para outro ácido graxo dessaturases que produzem moléculas de ácido graxo de substrato de ácido di-homo-Y- linolênico (DGLA) e/ou ácido eicosatetraenoico (ETA) que Δ5 dessaturase transforma em ácido araquidônico (ARA) ou ácido eicosapentaenoico (EPA), respectivamente. A expressão potencializada por semente de transgenes em plantas em geral e em soja especificamente é bem estabelecida na técnica. Usando técnicas de clonagem molecular padrão, o gene de interesse é clonado como sequência selvagem ou como uma sequência potencializada por códon para expressão da planta de interesse a jusante de um promotor potencializado por semente. Exemplos de promotores potencializados por semente de plantas dicotiledôneas, tais como soja ou canola, são promotor 7Sα, promotor 7Sα', promotor Arcelina-5, promotor napina e promotor oleosina. Entre a sequência promotora e a região de codificação do gene de interesse, uma região não traduzida 5' (5'-UTR) é inserida para estabilizar o mRNA. Esta sequência tipicamente inclui o sítio de partida transcricional. A jusante do códon de parada de tradução, uma região não traduzida 3' (3'-UTR) é adicionada para estabilizar o mRNA e terminar a transcrição. Em plantas, os substratos de ETA ou DGLA para Δ5 dessaturase podem ser gerados através da via Δ6 ou através da via Δ8. Para gerar DGLA através da via Δ6, o contexto vegetal que é transformado com um cassete de expressão da Δ5 dessaturase de H. virescens ou H. rufescens deve conter cassetes de expressão potencializados por semente de uma Δ6 dessaturase, preferencialmente uma ômega 6 Δ6 dessaturase específica, tais como Δ6 dessaturase de T. suecica, ou Δ6 dessaturase de M. alpina e um Δ6 ou C18 elongase, tal como Δ6 elongase de M. alpina. Para a geração da ETA através da via Δ6, cassete de expressão de Δ6 dessaturase preferencialmente contém um gene que codifica uma enzima de ômega 3 de preferência, tal como Δ6 dessaturase de Primula juliae. Adicionalmente, o contexto vegetal preferencialmente também contém um cassete de expressão potencializado por semente de uma Δ15 dessaturase, tais como Δ15 dessaturase de Aspergillus nidulans, Δ12 / Δ 15 dessaturase de Fusarium moniliforme, Δ15 dessaturase de Arabidopsis thaliana ou Δ15 dessaturase de M. alpina. Os cassetes de expressão adicionais descritos como parte do contexto vegetal podem ser transformados separadamente e cruzados ou combinados com o gene de interesse pela retransformação de linhagens selecionadas, ou podem ser cotransformados com o gene de interesse em um cobombardeio, na cotransformação mediada por uma Agrobacterium como a parte de múltiplos T-DNAs ou em uma transformação em um construto de DNA único, por exemplo, via transformação mediada por Agrobacterium. Todos destes métodos são bem estabelecidos na técnica.

[000120] Para gerar substratos de DGLA ou ETA através das vias Δ8, construtos de expressão de Δ5 dessaturase têm que ser transformados em um contexto vegetal que contém um cassete de expressão potencializado por semente de uma Δ9 elongase, tais como Δ9 elongase de Euglena gracilis ou Δ9 elongase de Isochrysis galbana bem como um cassete de expressão potencializado por semente de uma Δ8 dessaturase, tais como Δ8 dessaturase de Pavlova sp., Δ8 dessaturase de Tetruepretia pomquetensis ou Δ8 dessaturase de Euglena gracilis. Para gerar predominantemente o substrato de ETA através da via Δ8, o contexto vegetal abrigando construto de expressão de Δ9 elongase e construto de expressão de Δ8 dessaturase também deve conter um construto de expressão potencializado por semente de uma Δ15 dessaturase, tais como Δ15 dessaturase de A. nidulans, Δ12/Δ15 dessaturase de F. moniliforme, Δ15 dessaturase de A. thaliana ou Δ15 dessaturase de M. alpina. Como uma alternativa para a inclusão do construto de expressão para a Δ15 dessaturase, um construto de expressão potencializado por semente para uma Δ17 dessaturase, tais como Δ17 dessaturase de S. diclina, pode ser utilizado. A última via gera ETA predominantemente através do intermediário DGLA, enquanto a via anterior pode ser desenhada para gerar ETA predominantemente através do ácido estearidônico (SDA) intermediário.

[000121] Quando a Δ5 dessaturase é expressa em um contexto vegetal que produz o substrato DGLA através de uma das vias descritas acima, ARA é gerado. Para gerar EPA, DPA (n-3), ou DHA, dessaturases e elongases adicionais são necessárias. A expressão suplementar de uma ômega 3 dessaturase, tal como uma Δ17 dessaturase, por exemplo, uma semente de Δ17 dessaturase de Saprolegnia diclina expressa converte especificamente DGLA em ETA e ARA em EPA.

[000122] Para gerar o substrato DGLA mantendo baixos níveis de ETA, expressão da delta-15 dessaturase celular podem ser reduzida ou completamente suprimida pela expressão potencializada por semente de um construto de RNAi enquanto ao mesmo tempo uma C18 elongase é coexpressa com uma delta-8 dessaturase. Em tal contexto, a expressão potencializada por semente de uma delta-5 dessaturase resulta na formação predominante de ARA.

[000123] Contextos vegetais que adicionalmente contêm um cassete de expressão potencializado por semente contendo uma C20 elongase, por exemplo, C20 elongase de Euglena gracilis, ou uma C20 elongase e um construto de expressão Δ-4 dessaturase acumulam DPA ou DPA/DHA, respectivamente. Um exemplo de uma Δ-4 dessaturase da invenção é a Δ4 dessaturase de Schizochytrium aggregatum.

[000124] Estratégias para expressar Δ5 dessaturase de H. virescens ou H. rufescens em canola são idênticas às estratégias na soja ou outras plantas dicotiledôneas.

[000125] Explantes dicotiledôneos transformados contendo construtos como descrito acima são obtidos através de transformação por Agrobacterium tumefaciens-mediada. Plantas são regeneradas do tecido transformado. As plantas cultivadas em estufa então são analisadas para composição de óleo.

[000126] Por exemplo, a atividade de Δ5 dessaturase de H. virescens ou H. rufescens foi determinada na soja também transformada com outros genes necessários para a produção de PUFA. Estes cassetes incluíram Δ15 dessaturase de Neurospora crassa dirigida pelo promotor USP88, Δ6 dessaturase de M. alpina dirigida pelo promotor 7Sα' e Δ6 elongase de M. alpina dirigida pelo promotor 7Sα. Plantas contendo os 3 cassetes descritos acima serão referidas como controle. Para comparação, as Δ5 dessaturases de Saprolegnia diclina e Isochrysis galbana também foram transformadas no mesmo contexto. Cada Δ5 dessaturase foi expressa sob controle do promotor USP88. Os explantes de soja transformados contendo construtos como descrito acima foram obtidos através de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Plantas foram regeneradas do tecido transformado. As plantas cultivadas em estufa então foram analisadas para composição de óleo. Múltiplos eventos de transformação são mostrados para cada Δ5 dessaturase e o controle. Tabela 3: Atividade de delta 5 dessaturase de Hemiselmis spp. HvD5D e HrD5D em soja (Ácidos graxos 18:1 até 18:2).

Tabela 4: Atividade de delta 5 dessaturase de Hemiselmis spp. HvD5D e HrD5D em soja (Ácidos graxos 18:3 e maiores).

Tabela 4 – continuação

[000127] As Δ5 dessaturases de H. virescens e de H. rufescens ambas produziram em média aproximadamente 3 vezes mais EPA do que AA indicando uma preferência de substrato ômega 3. Os ácidos graxos 18:2 D5,9 e 18:2D6,9 estavam em 0,5% ou abaixo. Ao contrário, Δ5 dessaturase de Isochrysis galbana produziu níveis levemente mais altos de AA em comparação com níveis de EPA, indicando uma leve preferência de ácidos graxos ômega 6. A Δ5 dessaturase de Saproligna diclina produziu 2,5% de 18:2D5,9 em média enquanto produzia menos de 1% de EPA em média.

Exemplo 4 Expressão das Δ5-dessaturases de Hemiselmis spp em milho

[000128] Em muitas plantas monocotiledôneas, tais como milho (Zea mays) a maioria do óleo é acumulada no germe. Biossíntese de ácido graxo poli-insaturado de engenharia nestas plantas, por isso, pode ser eficientemente alcançada expressando a Δ5 dessaturase, bem como dessaturases e elongases complementares (as enzimas de fundo) no controle de promotores específicos para o germe, tais como o promotor oleosina, o promotor glob, ou o promotor de Hordeum vulgare PER1. Além disso, os íntrons, tais como o íntron HSP70, ou o íntron actina de arroz são frequentemente adicionados em sequência 5'-UTR a fim de aumentar a expressão gênica em plantas monocotiledôneas. Além disso, a sequência Kozak pode ser levemente modificada para refletir preferências de expressão em plantas monocotiledôneas. Todos outros aspectos do contexto vegetal e o cassete de expressão de interesse permanecem equivalentes ao Exemplo 3.

[000129] Explantes de milho transformados contendo construtos como descrito acima são obtidos através de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Plantas são regeneradas do tecido transformado. As plantas cultivadas em estufa então são analisadas para composição de óleo.

[000130] Todas as composições e métodos descritos e reivindicados de acordo com a corrente invenção podem ser feitos e realizados sem experimentação excessiva à luz da presente descrição. Embora as composições e métodos desta invenção fossem descritos em termos de modalidades preferenciais, será evidente para aqueles versados na técnica de que variações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito neste pedido sem se afastar do conceito, espírito ou escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão tanto quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste pedido embora os mesmos resultados ou similares sejam alcançados. Considera-se que todos tais substitutos similares e modificações aparentes para os versados na técnica estão dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações acrescentadas.

REFERÊNCIAS

[000131] As referências listadas abaixo são incorporadas neste pedido por referência à extensão em que suplementam, explicam, fornecem um contexto, ou ensinam metodologia, técnicas, e/ou composições empregadas neste pedido.Patente U.S. 4.518.584; Patente U.S. 4.737.462; Patente U.S. 4.810.648; Patente U.S. 4.957.748; Patente U.S. 5.094.945; Patente U.S. 5.100.679; Patente U.S. 5.196.525; Patente U.S. 5.219.596; Patente U.S. 5.290.924; Patente U.S. 5.322.783; Patente U.S. 5.359.142; Patente U.S. 5.424.398; Patente U.S. 5.500.365; Patente U.S. 5.530.196 Patente U.S. 5.424.412; Patente U.S. 5.538.880; Patente U.S. 5.550.318; Patente U.S. 5.563.055; Patente U.S. 5.610.042; Patente U.S. 5.627.061; Patente U.S. 5.633.435; Patente U.S. 5.641.876; Patente U.S. 5.936.069; Patente U.S. 6.005.076; Patente U.S. 6.040.497; Patente U.S. 6.051.753; Patente U.S. 6.146.669; Patente U.S. 6.156.227; Patente U.S. 6.265.638; Patente U.S. 6.319.698; Patente U.S. 6.433.252; Patente U.S. 6.451.567. Publicação de Pedido de Patente U.S. 20030093828; Publicação de Pedido de Patente U.S. 20030229918; Publicação de Pedido de Patente U.S. 20070271632. Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739, 1987. Bauer et al., Gene, 37:73, 1985.Belanger and Kriz, Genetics, 129:863-872, 1991.Bevan et al., Nucleic Acids Res., 11:369-385, 1983.Bodanszky, In: Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.Bustos et al., Plant Cell, 1:839-853, 1989.Callis et al., Genes Dev., 1:1183-1200, 1987.Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8560-8564, 1986.Chu et al., Scientia Sinica, 18:659, 1975.DeBlock et al., EMBO J., 6:2513-2519, 1987.Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5745-5749, 1987.Freitag and Selker, Curr Opin Genet Dev. 15:191-9, 2005.Gallie et al., The Plant Cell, 1:301, 1999.Haymes et al., (Nucleic Acid Hybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, DC, 1985.Hudspeth et al., Plant Mol. Biol., 12:579, 1989.Ingelbrecht et al., Plant Cell, 1:671-680, 1989.Joshi, Nucleic Acids Res, 15:6643, 1987.Kridl et al., Seed Sci. Res., 1:209-219, 1991.Lopes et al., Mol. Gen. Genet., 247:603-613, 1995.Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.Maundrell, J. Biol. Chem., 265:10857-10864, 1990.McElroy et al., Mol Gen Genet 231:150-160, 1991.Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963.Misawa et al., Plant J., 6:481-489, 1994.Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962.Napier et al., Biochem. J., 328, 717-720, 1997. Napier et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 68:135-143, 2003.PCT Publications WO 02/050295; WO 95/06128; WO 96/33155Prem Das et al., NAR, 19:3325-3330, 1991.Recombinant DNA Part D, Methods in Enzymology, 153:1622, Wu and Grossman (Eds.), Academic Press, 1987.Sambrook et al., In: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.Sathasiivan et al., Nucl. Acids Res., 18:2188-2193, 1990.Sperling and Heinz, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 103:158-180, 2001.Stacey et al., Plant Mol. Biol., 31:1205-1216, 1996.Turner and Foster, Mol. Biotechnol., 3:225-36, 1995.Vasil et al., Plant Physiol., 91:1575-1579, 1989.Walder et al. Gene, 42:133, 1986. Wohlleben et al., Gene, 70:25-37, 1988.

Claims (6)

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, em que a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada a um promotor heterólogo.

2. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor heterólogo é um promotor potencializado por semente.

3. Produto comercial, caracterizado pelo fato de que compreende farinha que compreende o cassete de expressão como definido na reivindicação 1, em que o produto comercial compreende ainda EPA, ARA e/ou DHA.

4. Produto comercial de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o produto comercial é um alimento ou ração.

5. Método de produção de uma composição alimentar ou de ração, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: produção da dita composição alimentar ou de ração a partir da planta ou parte de planta transgênica que compreende o cassete de expressão como definido na reivindicação 1.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que alimento ou ração é óleo, ensilagem, farelo, grão, amido, farinha ou proteína.

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