BRPI0906770A2 - método e aprelho para análise de partículas em uma amostra líquida - Google Patents

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Abstract

MÉTODO E APARELHO PARA ANÁLISE DE PARTÍCULAS EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA. A presente invenção refere-se a um método para análise de partículas em uma amostra líquida, a amostra sendo retida em um dispositivo de retenção de amostra, o método compreendendo: adquirir, por meio de um dispositivo de aquisição de imagem, uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra; analisar as referidas imagens, por meio de um analisador de imagem, para identificar quais, se alguma, das partículas da amostra são imageadas em foco em cada uma das imagens, e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco; em que a referida pluralidade de imagens é adquirida em planos de foco diferentes, essencialmente paralelos, cujos planos são separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros. A presente invenção também refere-se a um aparelho adaptado para ser usado com o método da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO E APARELHO PARA ANÁLISE DE PARTÍCULAS EM UMA AMOSTRA LÍ- QUIDA". Campo Técnico 5 A presente invenção refere-se a um método e um aparelho para análise de imagem de partículas em uma amostra Iíquida retida em um dis- positivo,de retenção de amostra. /
Antece'dentes da lnvenção
Analisar partículas em uma amostra Iíquida, por exemplo, de- lO terminar a concentração e o tipo das partículas, é de grande importância em
. muitas diferentes áreas da indústria, tais como agricultura, medicina, etc. . O modo tradicional de estudar partículas em uma amostra líqui- da é visualmente, possivelmente com a ajuda de um microscópio se as par- tículas são pequenas.
A concentração das partículas é normalmente obtida 15 através de um procedimento manual ao microscopicamente visualizar a a- mostra em uma câmara de contagem especial, por exemplo, uma câmara de Bürker.
A câmara de contagem é proporcionada com uma grade dividindo a câmara em pequenos volumes bem definidos.
As partículas podem ser per- mitidas decantar no fundo da câmara de contagem de modo a permitir que o 20 microscópio focalize em todas as partículas na câmara e, assim, facilitar a contagem- Assim, a amostra precisa decantar por diversos minutos antes da contagem poder ser realizada.
A contagem de partícula pode então ser de- terminada pela contagem do número de partículas por caixa na grade.
A contagem de partícula é obtida manualmente por um analista, que precisa 25 ser experiente em realizar a análise de modo a ser capaz de realizar uma análise confiável.
A referida análise é demorada.
Ademais, uma vez que a mesma é realizada manualmente, os resultados da análise podem variar dependen- do da pessoa realizando a análise.
A análise é também imprecisa uma vez 30 que relativamente poucas partículas são contadas e os volumes de câmaras de contagem existentes são com frequência imprecisos.
Há poucos métodos de análise automatizada existentes para determinar a concentração das partículas em amostras líquidas.
A concen- tração e os tamanhos das partículas, especialmente para partículas biológi- cas, tais como células, podem ser determinados por meio do princípio de Coulter, que é baseado em sensoriamento de uma impedância.
Um método 5 para contagem de células sanguíneas brancas pelo princípio de Coulter é descrito em US 5.262.302. Um aparelho de medição de acordo com o prin- cÍpio de Coulter é dispendioso e é portanto um investimento considerável.
Assim, um hospital ou laboratório estará relutante em investir em mais do que um aparelho.
Isto implica em que a análise precisará ser reafizada em 10 um local centralizado e um paciente precisará aguardar para resultados da análise. . Em WO 98/50777, um método para avaliação do número de cé- . lulas somáticas no leite é descrito.
O método compreende aplicar um volume - de uma amostra no compartimento de amostra e transmitir sinais eletromag- 15 néticos, que passaram a partir de um compartimento de amostra, sobre uma estrutura de elementos de detecção.
As intensidades dos sinais eletromag- néticos detectados são processadas e os resultados são correlacionados ao número de células presentes na amostra.
O pedido internacional WO 2008/010761 descreve um aparelho 20 e um método para enumeração e tipagem de partículas na amostra.
O mé- todo compreende as etapas de adquirir pelo menos uma imagem digital am- pliada da amostra, identificar partículas as quais são imageadas em foco na imagem e determinar os tipos e números das referidas partículas.
Quando células animais são as partículas, o fenômeno ótico nas bordas das células 25 resultando a partir do citoplasma e membrana celular atuando como uma lente são usadas para identificar quais células são imageadas em foco.
É também descrito que imagens podem ser adquiridas em diferentes planos de foco na amostra.
Entretanto, não é mencionado o quão distante os referidos planos de foco devem ser. 30 É ainda desejado se acelerar e simplificar os métodos automati- zados existentes para a análise de partículas em uma amostra líquida, por exemplo, uma amostra biológica.
Seria particularmente vantajoso se propor-
cionar um método de análise relativamente econômico, rápido e simples de modo que a análise pode ser proporcionada em um ponto de cuidado.
Sumário da Invenção É um objetivo da invenção proporcionar uma análise simples 5 permitindo determinação de uma enumeração volumétrica de partículas, tais como células sanguíneas brancas, plaquetas ou bactérias na amostra, tais como uma amostra de sangue, e identificação das diferentes partículas.
Assim, é, de acordo com um aspecto da presente invenção, pro- porcionado um método para análise de partículas em uma amostra líquida, a 10 amostra sendo retida em um dispositivo de retenção de amostra, o método compreendendo: adquirir, por meio de um dispositivo de aquisição de ima- gem, uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes pIanos " de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra; e analisar as referidas imagens, por meio de um analisador de imagem, para identificar partículas 15 da amostra que são imageadas em foco em qualquer uma das imagens ana- lisadas, e para identificar, para cada uma das partículas identificadas, na qual as referidas imagens analisadas a partícula é identificada e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas usando imagem respectiva em 20 cuja partícula respectiva foi identificada como sendo imageada em foco; em que a referida pluralidade de imagens é adquirida em pIanos de foco diferen- tes, essencialmente paralelos, cujos pIanos são separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é al- 25 cançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; determinar a maior diferença em intensidade de luz entre uma área de uma imagem que é ocupada pela partícula e uma área de uma imagem onde nenhuma partícula é distinguível; determinar as diferen- ças correspondentes em intensidade de luz em outras imagens nas quais a 30 mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a diferença em intensidade de luz é a mais elevada; com o que a partícula é obsemada co- mo estando em foco naquela imagem identificada.
Ao adquirir uma pluralidade de imagens em diferentes planos de foco, um maior volume da amostra pode ser coberto, onde as partículas são ainda imageadas em foco.
Assim também um dispositivo de retenção de amostra maior pode ser usado, onde a profundidade da amostra, perpendi- 5 cular aos planos de foco, pode ser aumentada.
Se a análise inclui a determi- nação da concentração, isto pode ser alcançado também por partículas de uma concentração mais baixa, uma vez que o volume sendo analisado é maior.
Não há necessidade de aguardar para a amostra decantar antes 10 das imagens serem adquiridas.
A amostra pode ser imageada com as partí- culas em suspensão. . Ao adquirir uma pIuralidade de imagens em diferentes pIanos de . foco e determinar quais partículas são imageadas em foco em qual imagem, é também possÍvel se determinar o quão profundo na amostra cada uma das
. 15 partículas está.
Assim, por exemplo, é possÍvel se separar duas ou mais par- tículas sobrepostas uma a partir da outra uma vez que as mesmas estão presentes em diferentes profundidades na amostra.
Também, ao adquirir uma pluralidade de imagens em diferentes planos de foco e determinar quais partículas são imageadas em foco em 20 qual imagem pode ser possível se determinar as dimensões das partículas perpendiculares ao plano de foco, uma vez que será possÍvel contar em quantas imagens, obtidas em planos de foco diferentes mas adjacentes, ca- da partícula está em foco.
Entretanto, isto é evidentemente dependente das partículas serem suficientemente grandes em relação à distância entre os 25 planos de foco.
Uma menor distância entre os planos de foco implica em que as partículas podem ser imageadas em melhor foco, mesmo em ampliação mais alta.
Assim, também menores partículas podem ser imageadas para análise quando a distância entre os planos de foco é reduzida.
Também, as 30 partículas podem ser imageadas e analisadas em maiores detalhes como um benefício de adquirir uma pluralidade de imagens em diferentes planos de foco, discutido acima, são amplificadas com redução da distância.
Deslocar a partir de um plano de foco para outro pode ser alcan- çado, por exemplo, ao mover uma lente, ou outro refrator de luz, posicionado entre a amostra e o dispositivo de aquisição de imagem.
De modo a deslocar o plano de foco na referida pequena distância como de acordo com a pre- 5 sente invenção, por exemplo, um motor piezoelétrico deve ser usado para mover a lente.
O referido motor também apresenta as vantagens de ser ca- paz de mover a lente rapidamente e com alta precisão.
Os planos de foco são essencialmente paralelos um com relação ao outro e perpendiculares a um eixo ótico, o eixo se estendendo a partir de um dispositivo de aquisição de imagem e através de uma amostra.
Um analisador de imagem analisa a pluralidade de imagens de modo que partículas, tais como células, que são imageadas em foco são ' identificadas. lsto permite que uma imagem seja adquirida de uma amostra relativamente espessa, enquanto apenas as partículas que estão em foco são contadas ou de outro modo analisadas.
Ao garantir que apenas as partí- culas que estão em foco são contadas, isto é, quando as partículas são ima- geadas em detalhes suficientemente claros, a identificação dos tipos de par- tículas pode ser realizada na amostra que pode simultaneamente ser usada para determinar uma enumeração volumétrica estatisticamente confiável das partículas na amostra.
As vantagens de reduzir a distância entre os planos de foco são amplificadas ao reduzir a distância ainda ademais.
Assim a distância é prefe- rivelmente menos do que 5 micrômetros, mais preferivelmente menos do que 2 micrômetros, especialmente 1,8 micrômetros ou menos, especifica- mente 1,6 micrômetros ou menos.
Ao se identificar quais partículas são imageadas em foco em quais imagens, as diferentes imagens adquiridas em diferentes planos de foco são preferivelmente comparadas uma com a outra.
Uma partícula espe- cÍfica será tipicamente distinguível em diversas diferentes imagens dotadas de diferentes planos de foco, onde os planos de foco das referidas imagens são adjacentes um com relação ao outro (isto é, são separados por uma dis- tância de menos do que 10 micrômetros). De modo a identificar em qual i-
magem a referida partícula específica é imageada em melhor foco, o con- traste das imagens respectivas pode ser usado como um critério de seleção.
Assim, a maior diferença em intensidade de luz entre uma área de uma ima- gem ocupada pela partícula específica, e uma área da imagem onde ne- nhuma partícula é distinguível, isto é, fundo da imagem, é determinada.
Ou- tras imagens onde a mesma partícula é distinguível são estudadas da mes- ma maneira.
Assim, a imagem que exibe o maior contraste com relação a partícula específica pode ser identificada e a partícula é observada como estando em foco na referida imagem identificada.
O mesmo procedimento pode então ser repetido para todas as partículas distinguíveis em qualquer uma das imagens adquiridas.
Também, como um complemento ou uma alternativa, identificar quais partículas são imageadas em foco em qual das imagens adquiridas pode ser realizado baseado no pixel, ou variação da amostra.
A variação de pixel pode ser orientada (S2n) ou orientação corrigida (S2n-,). A variação de pixel de orientação corrigida é calculada de acordo com a fórmula a seguir:
s%-1=N!ú(xi-%' em que N é o número de pixels, x é a intensidade de luz de pixel i, e X é a intensidade de luz média.
Quando se usa a variação de pixel para identificar em qual das imagens adquiridas a partícula é imageada em foco, uma área compreen- dendo a partícula, assim como o ambiente mais próximo da partícula (fundo da imagem), é definida.
A variação de pixel é então determinada para aquela área definida.
A variação de pixel é também determinada para a área cor- respondente das outras imagens adquiridas.
A imagem que é identificada como dotada da mais elevada variação de pixel é a imagem na qual a partí- cula é observada como estando em foco.
O procedimento pode então ser repetido para outras partículas que são distinguíveis em qualquer uma das imagens adquiridas.
Assim, é, de acordo com um aspecto da presente invenção,
também proporcionado um método para a análise de partículas em uma a- mostra líquida, a amostra sendo retida em um dispositivo de retenção de amostra, o método compreendendo: adquirir, por meio de um dispositivo de aquisição de imagem, uma pluralidade de imagens da referida amostra em 5 diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra; e analisar as referidas imagens, por meio de um analisador de imagem, para identificar partículas da amostra que são imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas, e para identificar, para cada uma das partícu- las identificadas, em qual das referidas imagens analisadas a partícula é i- lO dentificada e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas usan- do a imagem respectiva na qual a partícula respectiva foi identificada como sendo imageada em foco; em que a referida pluralidade de imagens é adqui- rida em planos de foco diferentes, essencialmente paralelos, cujos planos são separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; definindo uma área daquela imagem encontrada, a referida área compreendendo a partícula e seu ambiente circunvizinho mais próximo; determinar a variação de pixel daquela área definida; determinar a variação de pixel da área corresponden- te de outras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a variação de pixel é a mais elevada; com o que a partícula é observada como estando em foco naquela imagem identificada.
A discussão acima com relação ao método da invenção o qual inclui determinar diferenças em intensidades de luz é também em partes a- plicáveis relevante ao método da invenção que inclui determinar variação de pixels.
Referência é feita àquela discussão.
A discussão abaixo se refere a características ótimas de ambos os métodos da invenção.
A partícula específica pode ser identificada como sendo a mes- ma partícula na pIuralidade de imagens ao ter essencialmente a mesma po- sição espacial em cada uma das imagens onde a referida partícula é distin-
guível, uma vez que as imagens são adquiridas com diferentes planos de foco ao longo de um eixo ótico a partir de um dispositivo de aquisição de imagem através da amostra, mas não são deslocados lateralmente.
Assim, as imagens são essencialmente da mesma área da amostra, mas em dife- 5 rentes profundidades na referida amostra.
Uma vez que as partículas são em uma amostra líquida, e assim devem se mover relativamente com o tem- po, é desejável de adquirir as imagens em um tempo relativamente curto.
Preferivelmente pelo menos duas imagens, mais preferivelmente pelo menos 5 imagens, e mais preferivelmente pelo menos 10 imagens, são adquiridas por segundo. lsto também acelera a análise como um todo.
Qualquer um dos métodos da invenção pode adicionalmente compreender superpor a pluralidade de imagens, deste modo obtendo uma imagem superposta contendo todas as partículas imageadas em foco nos diferentes pIanos de foco.
Assim, o voIume total analisado da amostra pode ser representado em uma única imagem bidimensional onde as partículas da amostra podem ser exibidas em foco, independente do quão profundo no volume da amostra cada uma delas realmente estava quando foram image- adas.
Preferivelmente, a pluralidade de imagens é adquirida em uma sequência de apenas uma imagem por plano de foco onde o plano de foco é movido uma distância específica, menos do que 10 micrômetros, entre cada imagem.
Este modo de adquirir as imagens é rápido e pode ser realizado por meio de um simples aparelho.
Um maior volume da amostra pode ser coberto se uma maior quantidade de imagens forem adquiridas.
Como mencionado acima, quanto maior o volume, mais precisa, por exemplo, a determinação da concentração pode ser, e também partículas de uma concentração mais baixa podem ter a concentração determinada.
Convenientemente pelo menos 10, preferivel- mente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 50, ainda mais pre- ferivelmente pelo menos 100, e mais preferivelmente pelo menos 200, ima- gens são adquiridas de acordo com a presente invenção.
Também, de modo a ser capaz de analisar um grande voIume de uma amostra, o dispositivo de retenção de amostra pode ser capaz de apresentar a amostra Iíquida para imagear de modo que a amostra seja do- tada de uma profundidade, perpendicular aos planos de foco, que seja sufi- cientemente grande.
A referida profundidade é preferivelmente pelo menos 5 100 micrômetros, mais preferivelmente pelo menos 200 micrômetros e ainda mais preferivelmente pelo menos 500 micrômetros.
Convenientemente, o dispositivo de retenção de amostra é ar- ranjado para apresentar a amostra para imagear de modo que a profundida- de da amostra seja 1 milímetro ou menos. lsto implica em que o dispositivo de retenção de amostra pode ser dotado de uma câmara a qual é dotada de uma dimensão que é 1 milímetro ou menos, com o que a amostra líquida pode ser introduzida na câmara através de ação capilar.
A amostra líquida pode assim ser sugada diretamente dentro da câmara através de uma en- trada, comunicando a câmara com o lado de fora do dispositivo, eliminando a necessidade de pipetas, bombas ou tais equipamentos.
Mais especifica- mente, sangue pode mesmo ser sugado para dentro da câmara diretamente a partir do dedo picado de um paciente.
Evidentemente, as outras dimen- sões da câmara podem ser maiores, e, dependendo do quão grande é a á- rea da amostra sendo imageada por um dispositivo de aquisição de ima- gem, deve de fato ser desejado que as outras dimensões sejam maiores.
A presente invenção é particularmente interessante para análise biológica.
A amostra líquida pode assim ser uma amostra biológica, tais co- mo Ieite, urina, fluido espinhal ou, particularmente, sangue, por exemplo, sangue total ou plasma.
As partículas podem também ser biológicas, tais como células eucarióticas, preferivelmente células de mamíferos, mais preferivelmente células humanas tais como células humanas sanguíneas brancas.
Entretan- to, uma vez que mesmo as menores partículas podem ser suficientemente analisadas de acordo com a presente invenção em virtude da distância entre os diferentes planos de foco ser tão pequena, as partículas podem, como uma alternativa, serem dotadas de um diâmetro máximo de menos do que 20, convenientemente menos do que 10, preferivelmente menos do que 5, e mais preferivelmente menos do que 2, micrômetros.
Exemplos das referidas pequenas partículas biológicas que são de grande interesse para análise por meio da presente invenção são, por exemplo, bactérias, vírus e plaquetas.
Como mencionado acima, como um exemplo de uma análise, o 5 método da invenção pode ser usado para determinar a concentração de par- tículas na amostra.
O número de partículas identificadas é então posto em relação ao volume da amostra que é imageada.
O referido volume é definido pela área imageada da amostra multiplicada com a profund idade imageada da amostra.
A área imageada é determinada pela escolha do dispositivo de aquisição de imagem, em combinação com qualquer ampliação ou redução.
A profundidade imageada é uma função do número de imagens e da distân- cia entre cada imagem.
A referida análise pode evidentemente ser depen- dente da distância sendo suficientemente pequena, ou das partículas sendo suficientemente grande, para todas as partículas, a serem enumeradas no volume imageado, a serem imageadas em foco em pelo menos uma das imagens.
Outra análise que pode ser permitida pela presente invenção é determinar os diferentes tipos de partículas.
Os diferentes tipos de partículas podem ser determinados por suas respectivas características físicas.
As re- feridas características podem, por exemplo, ser o tamanho, cor, opalescên- cia e/ou formato das partículas.
Preferivelmente, a análise das partículas de acordo com a presente invenção inclui determinar os tipos e quantidades das partículas de modo que as proporções dos diferentes tipos de partículas na amostra podem ser determinadas.
A análise das referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco pode assim compreen- der determinar os tipos e as quantidades das partículas, os tipos sendo dis- tinguidos pelas características físicas das partículas, com as quais as pro- porções de diferentes tipos de partículas na amostra são determinadas.
As partículas a serem analisadas podem ter sido coIoridas por meio de um agente de coloração antes das imagens serem adquiridas. lsto implica em que as partículas podem ser mais facilmente distinguíveis do IÍ- quido ao fundo da imagem.
Se por exemplo, as partículas são células euca- rióticas, um agente de coloração seletivamente colorindo o núcleo da célula pode ser empregado.
De modo a adicionalmente aprimorar a capacidade de distinguir as imagens adquiridas, a amostra pode então ser irradiada com luz de um comprimento de onda específico que é absorvido pelo agente de colo- ração, com o que o núcleo da célula será claramente imageado como áreas 5 escuras ou pontos contra um fundo mais claro.
Alternativamente, o agente de coIoração pode, por exemplo, ser um corante fluorescente, ou um anti- corpo marcado por fluorescência, ou fragmento de anticorpo, que se liga es- pecificamente às partículas a serem analisadas.
A amostra pode então ser irradiada com um comprimento de onda eletromagnética que é absorvida pelo fluoróforo do corante ou anticorpo, e um dispositivo de aquisição de j- magem pode ser adaptado para especificamente detectar o comprimento de onda eletromagnética subsequentemente emitida pelo fluoróforo, com o que as partículas coIoridas serão imageadas como áreas ou pontos de luz contra um fundo mais escuro.
O agente de coloração pode estar presente na forma seca den- tro do dispositivo de retenção de amostra antes da amostra líquida ser intro- duzida no dispositivo de retenção de amostra.
Assim, o agente de coloração pode ser incluído no dispositivo de retenção de amostra durante a sua pro- dução.
O agente de coloração pode, por exemplo, ser seco sobre a parede da câmara do dispositivo, dentro de cuja câmara a amostra líquida é posteri- ormente introduzida, dissoivendo o agente de coloração, antes das imagens serem adquiridas da amostra na câmara do dispositivo de retenção de a- mostra de acordo com a presente invenção.
Também outros reagentes ou agentes químicos podem ser incluídos no dispositivo de retenção de amos- tra, em vez de, ou em adição a, um agente de coloração, tal como um agen- te de hemodiálise, para ocasionar a lise das células sanguíneas vermelhas na amostra de sangue total, ou um agente umectante, por exemplo, para facilitar a amostra líquida ser sugada para dentro do dispositivo de retenção de amostra por ação capilar.
Ao se incluir todos os agentes químicos neces- sários para uma análise pelo método da invenção, o dispositivo de retenção de amostra proporciona uma possibilidade de diretamente obter a amostra dentro da câmara do dispositivo e proporcionar a mesma para análise.
Não há necessidade de preparação da amostra.
De fato, se a câmara é capilar como discutido acima, uma amostra de sangue pode ser sugada para dentro da câmara diretamente a partir de um dedo furado de um paciente, ou qual- quer amostra pode ser sugada para dentro da câmara diretamente a partir de um tubo ou cavidade ou de qualquer outro tipo de recipiente.
Proporcio- nar o dispositivo de retenção de amostra com um reagente permite uma rea- ção dentro do dispositivo de retenção de amostra o que torna a amostra pronta para análise.
A reação é iniciada quando a amostra entra em contato com o reagente.
Assim, não há necessidade de manualmente preparar a amostra, o que torna a análise especialmente adequada de ser realizada diretamente em uma sala de exames, por exemplo, enquanto um paciente está aguardando.
Uma vez que o reagente é proporcionado na forma seca, o dis- positivo de retenção de amostra pode ser um kit pronto para uso o quaf pode ser transportado e armazenado por longo tempo sem afetar a capacidade de uso do dispositivo de retenção de amostra.
Assim, o dispositivo de retenção de amostra com o reagente pode ser fabricado e preparado bem antes de implementar a análise da amostra.
O dispositivo de retenção de amostra pode ser descartado, isto é, o mesmo é arranjado para ser usado apenas uma vez.
Se o dispositivo de retenção de amostra é adaptado para uso apenas uma vez, pode ser forma- do sem considerar qualquer possibilidade de limpar o dispositivo de retenção de amostra e possivelmente reaplicar um reagente.
Também, o dispositivo de retenção de amostra pode ser moldado em um material plástico e deste modo ser fabricado em um baixo custo.
Assim, o mesmo pode ainda ser e- conômico de usar um dispositivo de retenção de amostra descartável.
Um dispositivo de aquisição de imagem pode ser uma câmera digital.
O referido dispositivo de aquisição de imagem permite que toda a área de uma imagem a ser adquirida seja imageada simultaneamente, após o que a imagem pode ser diretamente apresentada a um analisador de ima- gem para análise da imagem digital.
A câmera pode, por exemplo, ser do tipo CCD ou CMOS.
Dependendo, por exemplo, dos tamanhos das partículas image- adas e da resolução de um dispositivo de aquisição de imagem, pode ser
P vantajoso se adquirir as imagens ou de uma ampliação ou de uma redução da amostra líquida. A ampliação ou redução pode ser alcançada por meio de -Y 5 um refrator de luz, tal como uma lente, que é posicionada de modo que a mesma intersecta o eixo ótico entre a amostra e um dispositivo de aquisição de imagem. Convenientemente, a ampliação é usada, tal como a ampliação de 2-50x, preferivelmente 2-30x, mais preferivelmente 2-20x, mais preferi- velmente 3-1OX. Entretanto, se partículas muito pequenas, tais como bacté- lO rias, vírus ou pIaquetas, devem ser analisadas, ampliações ainda maiores devem ser preferidas; tais como 10-50x, mais preferivelmente 10-35x, mais preferivelmente 10-20X. Embora uma alta ampliação seja usada, um volume . suficientemente grande pode ainda ser coberto pelas imagens uma vez que muitas imagens são adquiridas em diferentes planos de foco na amostra. 15 Um volume da amostra imageada pode assim ser definido por uma área i- mageada da amostra multiplicada com a profundidade da amostra coberta pela pluralidade das imagens. Como mencionado acima, a ampliação, ou redução ótica, usada está ligada à resolução de um dispositivo de aquisição de imagem. A referi- 20 da resolução é convenientemente pelo menos 3 Mpixel, preferivelmente pelo menos 5 Mpixel, especificamente 6 Mpixel ou mais. De acordo com outro aspecto da presente invenção, é propor- cionado um aparelho de medição para análise de partículas em uma amos- tra líquida, o aparelho compreendendo um dispositivo de aquisição de ima- 25 gem, um analisador de imagem, um suporte arranjado para suportar um dis- positivo de retenção de amostra retendo a amostra líquida, e um refrator de luz posicionado entre o referido dispositivo de aquisição de imagem e o refe- rido suporte; em que um plano de foco é móvel em etapas dentro do disposi- tivo de retenção de amostra quando o mesmo é mantido pelo suporte, com o 30 que um dispositivo de aquisição de imagem é adaptado para adquirir uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra, os diferentes pIanos de foco sendo essencialmente paralelos um com relação ao outro e sendo separa- dos um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que um analisador de imagem é arranjado para analisar pelo menos uma imagem adquirida para identificar quais das partículas são imageadas em foco, e analisar as referidas partículas que foram identifica- das como sendo imageadas em foco; em que a referida identificação de par- tículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partícu- las: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; determinar a maior diferença em intensidade de luz entre uma área de uma imagem que é ocupada pela partícula e uma área de uma imagem onde nenhuma partí- cula é distinguível; determinar as diferenças correspondentes em intensida- de de Iuz em outras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a diferença em intensidade de luz é a mais eleva- da; com o que a partícula é observada como estando em foco naquela ima- gem identificada.
Alternativamente, a presente invenção proporciona um aparelho de medição para análise de partículas em uma amostra líquida, o aparelho compreendendo um dispositivo de aquisição de imagem, um analisador de imagem, um suporte arranjado para suportar um dispositivo de retenção de amostra retendo a amostra líquida, e um refrator de luz posicionado entre o referido dispositivo de aquisição de imagem e o referido suporte; em que um plano de foco é móvel em etapas dentro do dispositivo de retenção de amos- tra quando o mesmo é mantido pelo suporte, com o que um dispositivo de aquisição de imagem é adaptado para adquirir uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra, os diferentes pIanos de foco sendo essencialmente paralelos um com relação ao outro e sendo separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que um analisador de imagem é arranjado to analisar pelo menos uma imagem adquirida para identificar quais das partículas são imageadas em foco, e a- nalisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imagea- das em foco; em que a referida identificação de partículas que são imagea-
= das em foco é alcançada, para cada uma das particulas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distingulvel; definindo uma área daquela ima-
T gem encontrada, a referida área compreendendo a partícula e seu ambiente circunvizinho mais próximo; determinar a variação de pixel daquela área de- : 5 finida; determinar a variação de pixel da área correspondente de outras i- magens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a variação de pixel é a mais elevada: com o que a partícula é observa- da como estando em foco naquela imagem identificada. A discussão abaixo se refere a ambos os aparelhos de medição 10 alternativos. O aparelho compreende um suporte, que é arranjado para rece- ber um dispositivo de retenção de amostra, descrito acima em relação ao método da invenção, que suporta a amostra Iiquida a partir das quais ima- . gens são adquiridas de acordo com a presente invenção. 15 O pIano de foco pode ser movido em etapas através da amostra líquida ao longo do eixo ótico do aparelho, o referido eixo percorrendo a par- tir de um dispositivo de aquisição de imagem e através do suporte, de modo ' que cada etapa é menos do que 10 micrômetros, permitindo que uma ima- gem seja adquirida após cada etapa. 20 O pIano de foco pode ser movido, por exemplo, ao mover o re- frator de luz, por exemplo, uma lente, ao longo do eixo ótico do aparelho en- quanto o suporte e um dispositivo de aquisição de imagem permanecem i- móveis. Para mover o plano de foco na referida pequena distância de acordo com a presente invenção, assim como suficientemente rápido e com sufici- 25 ente precisão, capacidade de reprodução e estabilidade, é preferido se usar um motor piezoelétrico para mover o refrator de Iuz. Qualquer dos aparelhos pode adicionalmente compreender uma fonte de radiação eletromagnética, que é arranjada para irradiar a amostra retida no dispositivo de retenção de amostra. Qualquer fonte de radiação 30 convencional pode ser usada, tal como um diodo emissor de luz, um laser ou uma lâmpada brilhante. A fonte de luz permite que as partículas da amostra sejam mais facilmente distinguíveis nas imagens. Se for desejável se irradiar a amostra com um comprimento de onda específico, isto pode ser alcançado por meios convencionais, tais como ao empregar um laser, ou um filtro cro- mático em combinação com a fonte de Iuz.
A discussão acima com relação aos métodos da invenção é 5 também em partes aplicáveis relevantes aos aparelhos da presente inven- ção.
Referência é feita àquela discussão.
Os aparelhos e métodos da invenção proporcionam, a partir da perspectiva do usuário, uma análise bastante simples de uma amostra líqui- da, tal como sangue total.
A análise não necessita de um aparelho de medi- lO ção complicado ou de etapas avançadas a serem realizadas por um opera- dor.
Portanto, pode ser realizada em conexão direta, por exemplo, com o exame de um paciente, sem a necessidade de técnicos qualificados.
É me- ramente necessário que a amostra a ser analisada seja introduzida em, e retida pelo dispositivo de retenção de amostra.
Então, a amostra pode ser analisada de acordo com o método da invenção, preferivelmente pelo apare- lho da presente invenção em um modo automatizado e, em resposta direta com o mesmo, o aparelho pode apresentar um resultado da análise.
Breve Descrição dos Desenhos A presente invenção será agora descrita em detalhes adicionais apenas como exemplo com referência aos desenhos anexos.
A figura 1 é uma vista esquemática de um aparelho de acordo com a presente invenção.
A figura 2 é um gráfico de fluxo de um método de acordo com a presente invenção.
A figura 3 é uma vista em perspectiva esquemática de um motor piezoelétrico que pode ser usado em modalidades preferidas do método ou aparelho da invenção.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas Com referência à figura 1, um aparelho da presente invenção compreende uma fonte de luz 434, um dispositivo de retenção de amostra 410, um sistema ótico 438 (com um fator de ampliação de 5x, um dispositivo de aquisição de imagem com uma resolução de 6 Mpixel, e uma capacidade de mover o plano de foco), e um diafragma 450 direcionando a luz a um dis- positivo de aquisição de imagem 440. O aparelho é arranjado para adquirir diversas imagens digitais da amostra usando diferentes ajustes óticos. Por exemplo, as diversas imagens digitais podem imagear dez diferentes 720 a-j 5 da amostra 710. Com referência à figura 2, um método para enumeração volumé- trica de células sanguíneas brancas será descrito. O método compreende adquirir uma amostra de sangue dentro de um dispositivo de retenção de amostra, etapa 102. Uma amostra de sangue total não diluída é adquirida dentro do dispositivo de retenção de amostra. A amostra pode ser adquirida a partir de sangue capilar ou sangue venoso. A amostra de sangue capilar pode ser arrastada para dentro da câmara do dispositivo de retenção de amostra diretamente a partir de um dedo furado de um paciente. A amostra de sangue faz contato com um reagente seco, compreendendo um agente de hemodiálise e um agente de coIoração, dentro do dispositivo de retenção de amostra, iniciando a reação. As células sanguíneas vermelhas serão lisa- das e o agente de coloração é acumulado nos núcleos das células sanguí- neas brancas da amostra. Dentro de poucos minutos a partir da aquisição da amostra de sangue, a amostra está pronta para ser analisada. Alternativa- mente, uma amostra de sangue é adquirida e misturada com um agente de hemodiálise e um agente de coloração antes de ser introduzida no dispositi- vo de retenção de amostra. O dispositivo de retenção de amostra é então disposto em um aparelho da invenção, etapa 104. Uma análise pode ser ini- ciada ao pressionar um botão do aparelho. Alternativamente, a análise é au- tomaticamente iniciada pelo aparelho detectando a presença do dispositivo de retenção de amostra. A amostra é irradiada, etapa 106, e uma pIuralidade de imagens digitais, com uma resolução de 6 Mpixel, é adquirida em diferentes camadas da amostra, isto é, em diferentes planos de foco, a uma distância de 1.6 mi- crômetros uma a partir da outra e com uma ampliação ótica de 5x, etapa
108. A amostra está sendo irradiada com radiação eletromagnética de um comprimento de onda correspondendo a um pico de absorção do agente de coloração. lsto implica em que as imagens digitais conterão pontos pretos ou mais escuros nas posições dos núcleos das células sanguíneas brancas.
As imagens digitais adquiridas são transferidas a um analisador de imagem, o qual realiza a análise da imagem de uma pluralidade de ima- 5 gens digitais, etapa 110. O analisador de imagem determina a concentração de células sanguíneas brancas pela contagem de pontos pretos, identifica quais células estão em foco em qual imagem e analisa o tamanho e o forma- to de um determinado número das células em foco de modo a cIassificar as células sanguíneas brancas e obter uma proporção de diferentes tipos de 10 células sanguíneas brancas na amostra de sangue.
Com referência à figura 3, um motor piezoelétrico 1 compreende um estator de formato circular 3 e um rotor de formato circular 2, cujo rotor 2 . é pressionado sobre a superfície do estator 3, deste modo permitindo uma saída mecânica.
Durante a operação do motor uma onda progressiva é ge- 15 rada sobre a superfície do estator 3, na direção indicada pela seta 6, a refe- rida superfície se comporta como um anel flexível, e produz movimento elíp- tico na interface do rotor.
O referido movimento elíptico da superfície de con- tato impele o rotor 2 na direção indicada pela seta 7, e deste modo permitin- do o movimento de um eixo de direcionamento conectado ao mesmo.
As 20 direções indicadas pela seta 6 e a seta 7 podem, como é facilmente realiza- do, ser o inverso do que é indicado na figura 3. Dentes fixados ao estator 3 podem ser usados para aumentar a velocidade rotacional.
O rendimento do motor depende, por exemplo, da fricção na interface entre o rotor móvel e o estator, e da amplitude e de outras características da onda progressiva no 25 estator 3. Deve ser enfatizado que as modalidades preferidas descritas aqui não são de modo algum Iimitantes e que muitas modalidades alternati- vas são possíveis dentro do âmbito de proteção como definido pelas reivin- dicações anexas.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para análise de partículas em uma amostra Iíquida, a amostra sendo retida em um dispositivo de retenção de amostra, o método compreendendo: 5 adquirir, por meio de um dispositivo de aquisição de imagem, uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra; e analisar as referidas imagens, por meio de um analisador de i- magem, para identificar partículas da amostra que são imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas, e para identificar, para cada uma das partículas identificadas, em qual das referidas imagens analisadas a par- tícula é identificada e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas usando imagem respectiva na qual a partícula respectiva foi identificada co- mo sendo imageadas em foco; em que a referida pluralidade de imagens é adquirida em planos de foco diferentes, essencialmente paralelos, cujos planos são separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; determinar a maior diferença em intensidade de luz entre uma área de uma imagem que é ocupada pela partícula e uma área de uma ima- gem onde nenhuma partícula é distinguível; determinar as diferenças correspondentes em intensidade de Iuz em outras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a diferença em intensidade de luz é a mais elevada; com o que a partícula é observada como estando em foco na- quela imagem identificada.
2. Método para análise de partículas em uma amostra líquida, a amostra sendo retida em um dispositivo de retenção de amostra, o método compreendendo: adquirir, por meio de um dispositivo de aquisição de imagem, uma pIuralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de 5 foco dentro do dispositivo de retenção de amostra; e analisar as referidas imagens, por meio de um analisador de i- magem, para identificar partículas da amostra que são imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas, e para identificar, para cada uma das partículas identificadas, em qual das referidas imagens analisadas a par- lO tícula é identificada e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco em qualquer uma das imagens analisadas usando imagem respectiva na qual a partícula respectiva foi identificada co- mo sendo imageadas em foco; em que a referida pIuralidade de imagens é adquirida em planos de foco diferentes, essencialmente paralelos, cujos planos são separados um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; definir uma área daquela imagem encontrada, a referida área compreendendo a partícula e seu ambiente circunvizinho mais próximo; determinar a variação de pixel daquela área definida; determinar a variação de pixel da área correspondente de ou- tras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a variação de pixel é a mais elevada; com o que a partícula é observada como estando em foco na- quela imagem identificada.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dis- tância é menos do que 5 micrômetros, preferivelmente menos do que 2 mi- crômetros.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
3, em que o método adicionalmente compreende superpor a pluralidade de imagens, deste modo obtendo uma imagem superposta contendo todas as partículas imageadas em foco nos diferentes pIanos de foco.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 4, em que apenas uma imagem por plano de foco é adquirida.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 100, e mais preferi- velmente pelo menos 200, imagens são adquiridas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 6, em que o dispositivo de retenção de amostra é arranjado para apresentar a amostra líquida para imagear de modo que a amostra é dotada de uma profundidade, perpendicular aos planos de foco, de pelo menos 100 micrô- . metros, preferivelmente pelo menos 200 micrômetros, mais preferivelmente pelo menos 500 micrômetros. 15
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o dispositivo de retenção de amostra é arranjado para apresentar a amostra Iíquida para imagear de modo que a amostra é dotada de uma profundidade, perpendicular aos planos de foco, de 1 milímetro ou menos.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 8, em que a amostra líquida é uma amostra biológica.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a amostra líquida é uma amostra de sangue.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as partículas são células eucarióticas, preferivelmente células de 25 mamíferos, mais preferivelmente células humanas.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as partículas são bactérias, vÍrus ou pIaquetas.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as partículas são dotadas de um diâmetro máximo de menos do 30 que 20, preferivelmente menos do que 10, mais preferivelmente menos do que 2, micrômetros.
14 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a análise das referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco compreende determinar os tipos e quantidades das partículas, os tipos sendo distinguidos pelas características físicas das partículas, com o que as proporções de diferente tipos de partículas na a- 5 mostra são determinadas.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que as partículas a serem analisadas foram coIoridas, por meio de um agente de coloração, antes das imagens serem adquiridas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a amos- lO tra Iíquida é contactada com o agente de coloração, o agente de coloração sendo na forma seca, dentro do dispositivo de retenção de amostra, com o que o agente de coloração é dissolvido na amostra.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que o agente de coloração é um agente de coloração fluorescente.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivind icações 1 a 17, em que um dispositivo de aquisição de imagem é uma câmera digital.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que as imagens, adquiridas por meio de um dispositivo de aquisição de imagem, são adquiridas de uma ampliação da amostra líquida, a referida ampliação sendo alcançada por meio de um refrator de luz, tal como uma lente.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que um voIume da amostra imageada é definido por uma área ima- geada da amostra multiplicada com a profundidade da amostra coberta pela pluralidade de imagens.
21. Aparelho de medição para análise de partículas em uma amostra líquida, o aparelho compreendendo um dispositivo de aquisição de ( imagem, um analisador de imagem, um suporte arranjado para suportar um dispositivo de retenção de amostra retendo a amostra líquida, e um refrator de luz posicionado entre o referido dispositivo de aquisição de imagem e o referido suporte; em que um pIano de foco é móvel em etapas dentro do dispositi-
vo de retenção de amostra quando o mesmo é mantido pelo suporte, com o que um dispositivo de aquisição de imagem é adaptado para adquirir uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra, os diferentes planos de foco 5 sendo essencialmente paralelos um com relação ao outro e sendo separa- dos um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 10 micrômetros; em que um analisador de imagem é arranjado para analisar pelo menos uma imagem adquirida para identificar quais das partículas são ima- lO geadas em foco, e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; determinar a maior diferença em intensidade de luz entre uma área de uma imagem que é ocupada pela partícula e uma área de uma ima- gem onde nenhuma partlcula é distinguível; determinar as diferenças correspondentes em intensidade de Iuz em outras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a diferença em intensidade de Iuz é a mais elevada; com o que a partícula é observada como estando em foco na- quela imagem identificada.
22. Aparelho de medição para análise de partículas em uma amostra líquida, o aparelho compreendendo um dispositivo de aquisição de imagem, um analisador de imagem, um suporte arranjado para suportar um dispositivo de retenção de amostra retendo a amostra líquida, e um refrator de luz posicionado entre o referido dispositivo de aquisição de imagem e o referido suporte; em que um plano de foco é móvel em etapas dentro do dispositi- vo de retenção de amostra quando o mesmo é mantido pelo suporte, com o que um dispositivo de aquisição de imagem é adaptado para adquirir uma pluralidade de imagens da referida amostra em diferentes planos de foco dentro do dispositivo de retenção de amostra, os diferentes planos de foco sendo essencialmente paralelos um com relação ao outro e sendo separa- dos um do outro por uma distância, a referida distância sendo menos do que 5 10 micrômetros; em que um analisador de imagem é arranjado para analisar pelo menos uma imagem adquirida para identificar quais das partículas são ima- geadas em foco, e analisar as referidas partículas que foram identificadas como sendo imageadas em foco; em que a referida identificação de partículas que são imageadas em foco é alcançada, para cada uma das partículas: ao encontrar uma imagem na qual a partícula é distinguível; definir uma área daquela imagem encontrada, a referida área compreendendo a partícula e seu ambiente circunvizinho mais próximo; determinar a variação de pixel daquela área definida; determinar a variação de pixel da área correspondente de ou- tras imagens nas quais a mesma partícula é distinguível; e identificar a imagem onde a variação de pixel é a mais elevada; com o que a partícula é observada como estando em foco na- quela imagem identificada.
23. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, em que a distância é menos do que 5 micrômetros, preferivelmente menos do que 2 micrômetros.
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