BRPI0803375A2

BRPI0803375A2 - compostos derivados de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeìdo, processo de obtenção, composição farmacêutica, uso de um ou mais compostos

Info

Publication number: BRPI0803375A2
Application number: BRPI0803375-7A
Authority: BR
Inventors: Agustin Quincoces Suárez José; Augusto Maria Durvanei; Gonçales Rando Daniela; Galvonas Jasiulionis Miriam; Regina Machado Dos Santos Márcia; Pereira Santos Reginaldo; Celso Pardi Paulo; Justina Valduga Claudete
Original assignee: Universidade Federal De São Paulo - Unifesp
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2008-08-11
Publication date: 2010-06-15

Abstract

A presente invenção refere-se a compostos derivados da vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído) e seus métodos sintéticos de obtenção e purificação. Também são proporcionadas pela invenção composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos descritos na presente invenção. A invenção refere-se ainda ao uso destes compostos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:

"COMPOSTOS DERIVADOS DE 4-HIDROXI-3-METOXI-BENZALDEÍDO,PROCESSO DE OBTENÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM OUMAIS COMPOSTOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a compostos derivados davanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido) e seus métodossintéticos de obtenção e purificação.

A presente invenção refere-se também às aplicaçõesbiológicas in vitro e in vivo destes compostos como agentesantitumorais, antiparasitários e antioxidantes.

Em particular refere-se ao uso dos compostos para amanufatura medicamentos para uso no tratamento, profilaxiaou prevenção de doenças neoplásicas, lesões metastáticas,proliferativas e/ou degenerativas, de patologiasimunossupressoras, imunodeficientes e degenerativas e deparasitoses diversas em humanos e/ou animais além damanufatura de produtos cosméticos para uso no tratamentoe/ou prevenção do envelhecimento da pele.

Esta invenção refere-se ainda composiçõesfarmacêuticas contendo os ditos compostos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Dos Compostos

Na literatura aparecem diversos artigos e documentosde patente relacionados com o isolamento, sintese eaplicações biológicas diversas da curcumina (l,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) e seusderivados.

Toshiya Masuda et al. relatam, em seu artigo publicadona revista Phytochemistry, v.32 (6), pp. 1557-1560, 1993, oisolamento da curcumina e outros 5 compostos de estruturaanáloga a partir de Curcuma domestica, mostrando suaspropriedades antioxidativas e antiinflamatórias.

Van der Goot et al. descreve, em seu artigo publicadona revista Eur. J. Med. Chem. v. 32, pp. 625-630, 1997, aspropriedades antioxidantes de análogos cíclicos dacurcumina, as quais são comparáveis à atividade dacurcumina.

A curcumina também apresenta propriedades tais como ainibição da HlV-Integrase, conforme descrito nos artigos deÁrtico e colaboradores (J. Med. Chem., v.41, pp. 3948-3960,1998) e Mazumder e colaboradores (Biochem. Pharmacol.,v.49, pp. 1165-1170, 1995). Nestas publicações é descrita asintese da curcumina e derivados, de acordo com o métododescrito por Babu e Rajasekharan, mediante condensação doscorrespondentes arilaldeidos com acetilacetona e ácidobórico na presença de 1,2,3,4-tetrahidroquinolina,referindo-se a rendimentos baixos na ordem de 10 até 55 %(vide K.D.V. Babu e K.N. Rajasekharan OPPI Briefs, 26, 674-677, 1994).

Em 06 de abril de 1999, foi publicada a patenteamericana US 5,891,924, intitulada: "Curcumin(Diferuloylmethane) Inhibition of NFkB Activation". Nestainvenção é descrito um método para inibir a ativação dofator de transcrição NFkB em animais, através de uma dosefarmacologicamente efetiva de curcumina.

Além disso, na patente americana US 6,224,877 BI de 01de maio de 2001, intitulada: "Process for Extraction ofCurcuminoids from Curcuma species", foi também protegido ométodo de isolamento deste produto natural.

A potente ação antitumoral da curcumina foideterminada por Ramadasan et al., (Câncer Lett., v. 29(2),pp. 197-202, 1985). A curcumina e seus derivados mostrarampotente efeito de inibição da carcinogênese provocada pordiversos tipos de corantes químicos.

O mecanismo antioxidante da curcumina foi estudado porJovanovic et al. (J. Am. Chem. Soe. v. 121, pp. 9677-9681,1999) empregando os métodos de radiólise de pulso efotólise de flash-laser. O mecanismo antioxidante dacurcumina também foi objeto de estudo por parte de Barclaye Vinqvist, descrito conforme publicado na revista OrganicLetters, v. 2 (18), pp. 2841-2843, 2000. Neste artigoconcluiu-se que os derivados não-fenólicos da curcumina nãomostravam atividade antioxidante, destacando-se que acurcumina apresenta a propriedade de doar átomos dehidrogênio a partir do grupo fenólico e não do grupo CH2.

Na patente norteamericana número US 6,228,365 Bl, de08 de maio de 2001, foi descrita a ação inibitória dealguns compostos sintéticos e naturais da curcumina sobre acarcinogenese provocada por substâncias químicas.

So-Young Parle e Darrick Kim descobriram que várioscompostos naturais obtidos a partir da "Curcuma longa",testados com células PC12, protegiam as mesmas da ação daBeta-amilase, o que pode evitar doenças relacionadas comAlzheimer (J. Nat. Prod., v. 65 (9), pp. 1227-1231, 2002).

Foi descoberto que a curcumina e seus derivados protegem deforma mais efetiva as células PC12 (ED50 = 0.5-10 }ig/mL)que o Vermelho Congo (ED50 = 37-39 |ig/mL) .

J.K. Buolamwini e H. Assefa relataram a atividadeinibitória contra a HIV-Tntegrase da curcumina e de seusanálogos estruturais (J. Med. Chem., v. 45, pp. 841-852,2002).

No ano de 2002, o coletivo dirigido por Cheng-Bu Liu,(Organic Letters, v. 4 (17), pp. 2909-2911, 2002) confirmouo mecanismo antioxidante da curcumina e de seus derivadosmediante métodos sustentados na teoria da densidadefuncional. Neste caso, se chegou à conclusão de que tanto acurcumina, metilcurcumina e vanilidenacetona apresentamentalpias de dissociação da ligação 0-H similares,indicando que os grupos fenólicos são os responsáveis peladoação de átomos de hidrogênio, que também foi ratificadapor J. S. Wright em seu artigo "Predicting the antioxidantactivity of curcumin and curcuminoids" (J. MolecularStructure (THeochem), v. 59, pp. 207-217, 2002).

A síntese e avaliação biológica de novos análogos dacurcumina como anticancerigenos e agentes anti-angiogênicosfoi revelada por Mamoru Shoji et al. (Bioorg. Med. Chem.,v.12, pp. 3871-3883, 2004). Neste artigo concluiu-se que aatividade antitumoral in vivo da curcumina é limitada pelapobre absorção deste composto pelo organismo, o queexplicaria a baixa potência antitumoral exibida.

Em 2004, K. M. Youssef et al. descreveram a sintese deanálogos estruturais da curcumina os quais mostram forteatividade antioxidante com valores superiores a 90% deinibição de radicais livres (Arch. Pharm. Pharm. Med.Chem., v.337, pp. 42-54). A sintétise destes derivadosbaseia-se em reagir acetilacetona (0,01 mol) com osaldeidos correspondentes (0,02 mol), na presença dehidróxido de sódio alcoólico (50 mL, 10%), sob agitação àtemperatura ambiente por cerca de 10 minutos, separando-seos sólidos obtidos e recristalizando-os nos solventesadequados, obtendo-se rendimentos de 45 até 77%.

D. L. Vander Jagt et al.r (Bioorg. Med. Chem. v. 13,pp. 3811-3820, 2005) sintetizaram uma série de derivadosalquilados e de produtos de redução das duplas ligaçõesconjugadas da curcumina. Um destes derivados, a 1,7-Bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-heptano-3,5-diona exibiu umaatividade antioxidante superior à curcumina no ensaio TRAP("Total radical-trapping anti-oxidant parameter assay").

Assim, ao realizar um levantamento da literaturadisponível, podemos concluir que até a presente data nãofoi relatada a síntese de curcumina a partir da vanilina eacetilacetona em meio ácido, com o uso de ultrassom. Alémdisso, as propriedades antiproliferativas,

antiparasitárias, antioxidantes e antiinflamatórias dossais metálicos correspondentes da curcumina, tais como: 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l, 6-dienil]-2-metoxi-fenolato de sódio e do 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato de sódio) também não foram relatadas.Também não estão disponíveis informações sobre a existênciados derivados O-prenilados, acetilados e benzoilados dacurcumina.

A vanilidenacetona, também conhecida comodesidrozingerona, foi isolada a partir da Zingiberofficinale por M. De Bernardi, G. Vidari e P. Vita-Finzi,(Phytochemistry, v.15, pp. 1785-1786, 1976), e suaspropriedades antiinflamatórias, antioxidantes eantitumorais foram comprovadas por Motohashi ecolaboradores (Câncer Lett. v. 134, pp. 37-42, 1998).

A síntese da vanilidenacetona foi realizada com 65% derendimento por M. N. A. Rao e G. Elias, a partir devanilina e acetona em meio básico (NaOH) e publicada narevista Eur. J. Med. Chem., v.23, pp. 379-380, 1988. Nesteartigo, são ainda descritas as sínteses de vários derivadosarilicos substituídos, que exibem propriedadesantiinflamatórias. Destaca-se, ainda, que nenhum dosderivados obtidos chega a ter uma atividade similar aoibuprofeno no experimento de edema de pata.

H. G. Krishnamurty e S. Ghost (Ind. J. Chem., v.25 B,pp. 411-412, 1986) já haviam empregado derivados davanilidenacetona como intermediários sintéticos para aobtenção do produto natural diidrocurcumina, componente daCurcuma longa, mediante reação entre o cloreto do ácido 4-O-benzil-diidroferúlico e a 4-O-benzilvanilidenacetona empresença de hidreto de sódio em tetraidrofurano.

As propriedades antioxidantes da vanilidenacetonaforam comparadas com as exibidas pela curcumina e pelavitamina E, sendo a vanilidenacetona menos ativa que ambas(D.V. Rajakumar e M.N.A. Rao, Molecular and CellularBiochemistry, v.140, pp. 73-79, 1994).

Em outro trabalho similar desenvolvido por D.V.Rajakumar e M.N.A. Rao (Pharmazie, v. 49(7), pp. 516-519,1994), foram sintetizados derivados da vanilidenacetona,mostrando que a 5-nitro-vanilidenacetona possui umaatividade de inibição da peroxidação lipidica de 73,7% eIC50 igual a 2,1 |j.g/ml. Contudo, a vitamina E exibiu nesteexperimento uma inibição de 66,6% e IC50 de 52,0 fig/ml.

E. Caballero et al. (Tetrahedron, v. 54, pp. 6111-6122, 1998) publicaram os resultados da síntese de (±)-7-(3,4,5-Trimetoxifenil)-7-deoxidarubicinona, uma novafamília de antraciclinas potencialmente antitumorais apartir da 3,4,5-trimetoxi-vanilidenacetona.

Na revista Bioorg. Méd. Chem. Letters, v. 14, pp.1287-1289, 2004 foi descrito um trabalho de D. S. H. L. Kime J. Y. Kim sobre a sintese de derivados davanilidenacetona com potencial aplicação contra a doença deAlzheimer. Neste trabalho foi sintetizada a 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-butan-2-ona mediante a hidrogenação cataliticada vanilidenacetona em presença de Pd-C/EtOH, HOAc, a qualserve de matéria prima para a sintese de 1-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-oct-4-eno-3-ona e de análogos estruturais. 0produto 1-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hexadec-4-eno-3-ona nãomostrou nenhuma citotoxicidade contra as células PC12 eIMR32, exibindo uma proteção celular (ED50 0,2±0,1 uM paraPC12 e 0,5±0,2 uM) melhor que a curcumina 17,1±5,7 uM paraPC12 e 23,9±4,8 uM) .

G. L. Silva et al. determinaram a atividadeantioxidante e de captação de radicais livres davanilidenacetona e similares, não encontrando atividademuito destacada deste produto (Phytotherapy Research, v.19,pp. 1043-1047, 2005).

Vinte e oito compostos derivados da vanilidenacetona,isoeugenol e da 2-hidroxichalcona foram sintetizados pelaequipe de J. Tatsuzaki (J. Nat. Prod., v. 69, pp. 1445-1449, 2006), e sua atividade antiproliferativa foi avaliadain vitro contra três linhagens celulares (KB, KB-VCR eA549) . A vanilidenacetona mostrou valores de IC50superiores a 10 ug/mL contra as linhagens testadas,entretanto, a 4-(3-etoxi-2-hidroxi-fenil)-but-3-eno-2-onaexibiu valores de IC50 de 2,0, 1,9 e 2,3 ug/mL,respectivamente. Também neste trabalho, foi sintetizada avanilidenacetona O-prenilada, 4-[3-metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-fenil]-but-3-eno-2-ona, e sua atividadeantiproliferativa foi analisada, apresentando valores deIC50 iguais a 5,7, 3,5 e 3,8 ug/mL, respectivamente para aslinhagens testadas.

Pelo levantamento da literatura realizado, podemosconcluir que não está disponível nem a síntese nem tampoucoas propriedades antiproliferativas, antiparasitárias,antioxidantes e antiinflamatórias do sal sódicocorrespondente da vanilidenacetona, 2-metoxi-4-(3-oxo-but-1-enil)fenolato de sódio. Também não foram encontradasinformações sobre a existência de derivados acetilados ebenzoilados deste produto natural.

As cianoacetoidrazonas do benzaldeído,metoxibenzaldeído, salicilaldeído, p-dimetilamino-benzaldeído, furfural, crotonaldeído, acetacetato de etila,cicloexanona, aldeído cinâmico e vanilina, entre outros jáforam descritas por J. Klosa (Archiv der Pharmazie Bd.287/59, N°5, 302-304, 1954), mostrando as mesmaspropriedades tuberculostáticas. As isonicotinonoilidrazonasforam sintetizadas por D. Chakravarty, A. Bose e S. Bosecomprovando-se também as propriedades tuberculostáticasdestes compostos (J. Pharmaceutical Sciences, v. 53 (9),pp.1036-1039, 1964) .

J. Quincoces e K. Peseke empregaram ascianoacetoidrazonas do furfural e do acetofurano para obter1,2-diidro-piridinas (documento de patente alemão DE142549; 02 de julho del980; vide também artigo dos mesmosautores intitulado: "Synthese von substituierten l-[l-(Fur-2-yl)alkylidenamino]-1,2-dihydropyridin-3, 5-dicarbonitrilen", na revista Pharmazie, vol. 36, páginas534-535, 1981).

A cianoacetoidrazida foi usada pela equipe de J.Quincoces como ponto de partida para a síntese de compostosbioativos (documentos de patentes alemães DE 241 902"Procedimento para a obtenção de cianoacetoidrazidassubstituídas"; DE 272 838 "Procedimento para a obtenção deacrilidrazidas substituídas"; DE 273 059 "Procedimento paraa obtenção de acrilatos"; DE 294 936 "Procedimento para aobtenção de compostos policiânicos (N'-[Bis(metiltio)metilen]-2,6,6-triciano-3-metiltio-5-fenil-hexa-3,5-dien-hidrazidas)"; DE 294 938 "Procedimento para aobtenção de pirazolcarboidrazidas"; e DE 294 939"Procedimento para a obtenção de 1,3-Ditietanos").

A literatura consultada não revelou registros dasíntese e/ou as propriedades antiproliferativas,antiparasitárias, antioxidantes e antiinflamatórias do salsódico correspondente dã cianoacetoidrazona da vanilina, 4-[2-ciano-acetil)-hidrazonometil]-2-metoxi-fenolato desódio. Tampouco aparecem informações sobre a existência dosderivados prenilados, acetilados e benzoilados destecomposto, nem da 3-bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno-cianoacetoidrazida, 4-hidroxi-3-metoxi-5-nitro-benzilideno-cianoacetoidrazida nem de seus sais sódicoscorrespondentes. Não foi encontrada qualquer informaçãorelacionada com a síntese e as propriedades biológicas da2-ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida e seus derivados.

Foi realizada também a revisão de bibliografia para avanilina e derivados. Por meio desta busca, não foiencontrada nenhuma informação descrevendo ou relacionada àspropriedades antitumorais e antioxidantes deste grupo desubstâncias quimicas em quaisquer dos meios de divulgaçãoexistentes.

Do Câncer

Uma das mais importantes e promissoras formas detratamento de tumor consiste na quimioterapia, ou seja, autilização de agentes quimicos isolados ou em combinação,para o controle e remissão da proliferação destes tumoresmalignos. Esta forma de tratamento sistêmico da doença podeser associada a formas de tratamento mais antigas elocalizadas, como a cirurgia e a radioterapia. A associaçãoda quimioterapia a outras formas terapêuticas para otratamento de tumores é prática corrente. A sua utilizaçãopermite o sinergismo terapêutico das formas de tratamentodos tumores no pré e no pós-operatório ou na radioterapia,para promover a erradicação de metástases.

Desde o surgimento do emprego da quimioterapia para ocâncer (1940), foram identificados muitos de caminhos pelosquais as células cancerosas "escapam" do agente quimico. Nomomento em que as células desenvolvem resistência a umfármaco, elas podem também desenvolver resistência cruzadaa outros fármacos, quimica e mecanicisticamente nãorelacionados, em um fenômeno conhecido como resistênciamulti-droga (MDR).

Embora a terapia atual para o câncer dependaprincipalmente do uso de cirurgia, irradiação equimioterapia, a evolução na compreensão da biologia datransformação maligna e das diferenças no controle daproliferação da célula normal e cancerosa proporcionou adescoberta de novos alvos potenciais para o tratamento docâncer. É improvável que novas terapias venham a substituirtotalmente os fármacos existentes, uma vez que nos últimosanos, estes fármacos tornaram-se mais eficazes e suastoxicidades, mais tratáveis e previsíveis. No entanto, umacombinação de fármacos existentes, novas abordagensterapêuticas e a obtenção de um perfil molecular e genéticode cada tumor fariam com que todo paciente tivesse umtratamento individualizado e especifico para o seu caso,aumentando a eficácia do tratamento e diminuindo aincidência de efeitos colaterais.

Doença de Chagas

A doença de Chagas, causada pelo protozoárioTrypanosoma cruzi, encontra-se amplamente distribuída emzonas rurais da América Central e do Sul. Constitui um dosmaiores problemas de saúde pública das Américas, afetandocerca de 16 a 18 milhões de pessoas, sendo estimado quecerca de 100 milhões de pessoas ainda correm o risco decontrair esta doença. O ciclo de vida deste parasita écaracterizado pela presença de diferentes formasencontradas em dois hospedeiros, um vertebrado e outroinvertebrado. A forma epimastigota (E), encontrada nointerior do vetor "barbeiro" (insetos da familiaReduviidae) multiplica-se por divisão binaria e diferencia-se na forma tripomastigota metaciclica (TM).

Os fármacos antiparasitários usualmente utilizados,por exemplo, o nifurtimox, um derivado do nitrofurano(Bayer, anteriormente comercializado sob o nome de Lampit,recentemente descontinuado) , e o benzonidazol, um derivadodo nitroimidazol (Roche, comercializado sob o nome deRadanil, Rochagam ou Roganil), agem através da geração deradicais livres em seus metabolismos, sendo o T. cruzimuito suscetível aos danos causados por esses radicais.Acredita-se que ambos os fármacos matam ou inibem ocrescimento do parasita devido ao aumento de seu stressoxidativo. No entanto, estes fármacos causam também muitosefeitos colaterais nos pacientes em tratamento,principalmente devido à concentração (500 fiM) efetivautilizada (Maya et al, Comp. Biochem. Physiol. A Mol.Integr. Physiol, 2006). 0 nifurtimox e o benzonidazol atuamapenas na fase aguda e recente da infecção pelo T. cruzi eapresentam grandes limitações pelos seus efeitos colateraise pela necessidade do seu uso por pelo menos 60 dias. Poroutro lado, o alopurinol e os antifúngicos cetoconazol,fluconazol e itraconazol, em testes clinicos, mostraramresultados pobres, nulos ou controversos para o tratamentoda fase crônica da doença de Chagas.

Estudos recentes da bioquímica do T. cruzi têm levadoa pesquisas de novos fármacos e à compreensão dos seusmecanismos de ação, na tentiva de abolir o efeito tóxicosistêmico causado pelos fármacos usuais de tratamento. 0desenvolvimento de novos fármacos deve visar alvosespecíficos da estrutura e do metabolismo do parasita osquais devem ser estudados, inicialmente "in vitro". Deve-secorrelacionar o alvo a ser atingido com a atividadeantiparasitária do fármaco e/ou seus derivados,considerando o menor possível dano à célula hospedeira(Coura et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 97(1), pp. 3-24, 2002).

Por outro lado, estudando a expressão diferencial degenes nas diferentes cepas de T. cruzi expostas aconcentrações crescentes de benzonidazol, verificou-se aexistência de parasitas resistentes ao benzonidazol. Aemergente resistência de parasitas aos fármacos detratamento usuais apresenta-se como um problema adicional,porém importante. A associação de L-buthiona (S,R)-sulfoximina (BSO) com nifurtimox e benzonidazol provocou adiminuição das doses necessárias para obtenção do mesmoefeito clinico e, conseqüentemente, a minimização dosefeitos colaterais e/ou a duração da terapia. Ainda assim,faz-se necessário e urgente o desenvolvimento de novosfármacos, mais baratos e fáceis de administrar (Faundez etal., Antimicrob. Agents Chemother., v. 49(1), pp. 126-130, 2005).

Atividade antioxidante

Agentes antioxidantes são importantes para restringirreações oxidativas danosas às células, as quais podempredispor o desenvolvimento de condições clinicasimportantes como doenças cardíacas e câncer (Diplock etal., Br. J. Nutr. 80(1) pp. 77-112, 1998). Há evidênciascrescentes indicando que espécies reativas de oxigênio nãosão apenas tóxicas, mas também têm papel importante nasinalização celular e na regulação da expressão gênica.

Vários estímulos bioquímicos e fisiológicos, como aperturbação do estado redox, deprivação de glicose eglicosilação alterada, acúmulo de produtos de peroxidaçãode ácidos graxos poliinsaturados ou oxidação e decomposiçãode colesterol, podem romper a homeostasia redox e levar aoestresse, podendo resultar no acúmulo de proteínasmodificadas. Doenças como Alzheimer, Parkinson e Huntingtonsão desordens neurológicas importantes associadas com aprodução destas proteínas anormais.

A identificação de novos compostos com atividadeantioxidante potente pode ser extremamente útil não só parao desenvolvimento de agentes com propriedades anti-envelhecimento, mas também de agentes terapêuticos comaplicação em doenças neoplásicas e neurodegenerativas.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Em vista do exposto, tem a presente invenção oobjetivo de prover novos processos de obtenção de compostosderivados da vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido).

A presente invenção prove também novos compostosderivados da vanilina.

Constitui um outro objetivo da presente invenção provercomposições farmacêuticas que fazem uso dos compostosdescritos na presente invenção.

Constitui um outro objetivo da presente invenção o usodos compostos descritos na presente invenção para amanufatura de medicamentos para uso em doenças neoplásicas,lesões metastáticas, proliferativas e/ou degenerativas, depatologias imunossupressoras, imunodeficientes edegenerativas e de parasitoses diversas em humanos e/ouanimais.

Constitui um outro objetivo da presente invenção o usodos compostos descritos na presente invenção para amanufatura de produtos cosméticos para uso no tratamento e/ouprevenção do envelhecimento da pele.

Constitui um outro objetivo da presente invençãoprover métodos de tratamento e/ou prevenção de doençasneoplásicas, lesões metastáticas, proliferativas e/oudegenerativas, de patologias imunossupressoras,imunodeficientes e degenerativas e de parasitoses diversasem humanos e/ou animais fazendo uso dos compostos descritosna presente invenção.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a processos de obtenção dederivados de vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido).

Em particular esta invenção refere-se à preparação decurcumina (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) e seus derivados alquilados a partir de vanilina(4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido) ou vanilina substituída,acetilacetona e ácido clorídrico concentrado sob condições deirradiação ultrassônica.

Constitui um outro aspecto desta invenção o processode transformação de curcumina (1,7-bis-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) em sais metálicosatravés da adição de uma solução de alcóxido metálico e deseu álcool correspondente em relação molar 1:1 ou 2:1,seguido de evaporação do álcool a vácuo até à formação deuma sólido.

A presente invenção refere-se também a um processopara preparar fenolato metálico no qual vanilidenacetona ouuma vanilidenacetona substituída é colocada em contato comum alcóxido metálico e um álcool, em relação molar 1:1,seguido de evaporação do álcool a vácuo até à formação deum sal metálico no estado sólido.

A invenção refere-se também a um processo parapreparar um sal metálico de vanilina a partir de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido. Este processo compreende colocar emcontato 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, um alcóxidometálico (ROM) e um álcool(ROH) em relação molar 1:1seguido de evaporação do álcool a vácuo até à formação deum sal metálico no estado sólido.Esta invenção refere-se ainda a um processo parapreparar derivados acetilados de vanilina ou uma vanilinasubstituida que compreende misturar vanilina ou umavanilina substituida, anidrido acético e acetato de sódio.

A invenção refere-se também a um processo parapreparar 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeidomisturando 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, carbonato depotássio e dimetilformamida entre 15°C e 65°C por 10 a 90minutos, seguido da adição de brometo de prenila e agitaçãoentre 15°C e 60°C por 4 a 15 horas.

Esta invenção refere-se também a um processo parapreparar cianoacetoidrazonas e derivados a partir devanilinas substituídas em que as vanilinas substituídas sãomisturadas com cianoacetoidrazida na presença de um álcoole a mistura é aquecida até a formação de um precipitado.

A presente invenção refere-se também a um processopara preparar 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida a partir devanilina, 4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianoacetoidrazida, acetato de amônio e ácido acéticoglacial.

Esta invenção refere-se também a um processo parapreparar 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazidas substituídas ondecianoacetoidrazonas CH-ácidas substituídas reagem comcompostos carbonílicos em relação molar 1:1 sob ascondições de condensação Knoevenagel e irradiaçãoultrassônica na presença de acetato de amônio e ácidoacético.

Constitui um outro aspecto desta invenção, novoscompostos derivados de vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído).

Em particular esta invenção refere-se ao composto 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3, 5-diona, oucurcumina, obtida a partir de vanilina, acetilacetona eácido clorídrico sob condições de irradiação ultrassônica.

Esta invenção refere-se também aos compostos: 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil]-2-metoxi-fenolato de sódio; 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico; 2-metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato de sódio; 4-formil-2-metoxi-fenolato desódio; 4-formil-2-metoxi-acetato de fenila; 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeído; 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida; [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida; (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida e 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida.Constitui um outro aspecto desta invenção o uso doscompostos para a manufatura medicamentos para uso notratamento, profilaxia ou prevenção de doenças neoplásicas,lesões metastáticas, proliferativas e/ou degenerativas, depatologias imunossupressoras, imunodeficientes edegenerativas e de parasitoses diversas em humanos e/ouanimais além da manufatura de produtos cosméticos para usono tratamento e/ou prevenção do envelhecimento da pele.

Esta invenção refere-se ainda a composiçõesfarmacêuticas contendo os ditos compostos.

DEFINIÇÕES

No âmbito deste pedido de patente são utilizadas pordiversas vezes abreviaturas dos compostos aqui descritos.

Para facilitar a leitura do documento são apresentadasabaixo as definições das várias abreviaturas conformeempregues neste pedido.

DB2 refere-se ao composto 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona, ou também conhecidocomo curcumina.

DB3-A refere-se ao composto 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil]-2-metoxi-fenolato desódio.

DB3-B refere-se ao composto 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico.R-6 refere-se ao composto 4-(4-Hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona, também conhecido comovanilidenacetona.

R6-B refere-se ao composto 2-metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato de sódio.

RR-1 refere-se ao composto 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida.

VI refere-se ao composto 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeido.

V4 refere-se ao composto 4-formil-2-metoxi-acetato defenila.

V5 refere-se ao composto vanilina ou 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido.

V6 refere-se ao composto 4-formil-2-metoxi-fenolato desódio.

V10 refere-se ao composto 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida.

Vil refere-se ao composto [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida.

V12 refere-se ao composto (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras a seguir fazem parte do presente relatórioe estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinadosaspectos da invenção. 0 objeto da presente invenção podeser melhor entendido com referência a uma ou mais dessasfiguras, em combinação com a descrição detalhada damodalidade preferida aqui apresentada.

A Figura 1 mostra o efeito inibidor da proliferação decélulas de melanoma dos compostos V4 e V6. Os compostos V4e V6 em diferentes concentrações (5, 10, 20, 40 e 80 (j.g/ml)foram analisados quanto ao efeito na proliferação daslinhagens de melanócitos melan-a (ma) e de melanoma (Tm5)através do ensaio de MTT. O composto V4 mostrou efeitoinibidor dose dependente da proliferação de células ambasas linhagens. O composto V6 mostrou efeito inibidor dosedependente da proliferação de células de melanoma, mas nãode melanócitos.

A Figura 2 mostra curvas de regressão linear querepresentam a viabilidade de melanócitos melan-a (ma) e decélulas de melanoma (Tm5) murinos incubados por 48h comdiferentes doses dos compostos V4 e V6 pelo ensaio de MTT.Os gráficos mostram a capacidade dos compostos em inibir(reta descendente, V4 e V6) ou estimular (reta ascendente,V6) a proliferação celular, considerando o número inicialde células como 100%.

A Figura 3 mostra a potencialização do efeitocitotóxico da bleomicina pelo composto V6 em células demelanoma Tm. As céluals foram incubadas por 72h com: a)diluente (DMSO + tampão fosfato) (experimento controle), b)o composto V6 (40ug/mL), c) bleomicina (6mU/mL), e d) comuma combinação do composto V6 (40ug/mL) e bleomicina(6mU/ml). No caso da incubação com V6 e bleomicina, nasprimeiras 24h as células foram incubadas apenas com V6 e emseguida, foi adicionada a bleomicina e as células foramincubadas por mais 48h. 0 número relativo de células foiestimado por ensaio colorimétrico (MTT). Observa-se quehouve intensa potencialização do efeito citotóxico dableomicina pelo composto V6.

A Figura 4 mostra a potencialização do efeitocitotóxico da carboplatina pelo composto V6 em células demelanoma Tm. As céluals foram incubadas por 72h com: a)diluente (DMSO + tampão fosfato) , b) o composto V6(40ug/mL), c) carboplatina (25uM), e d) com uma combinaçãodo composto V6 (40ug/mL) e carboplatina (25uM) . No caso daincubação com V6 e carboplatina, nas primeiras 24h ascélulas foram incubadas apenas com V6 e em seguida, foiadicionada a bleomicina e as células foram incubadas pormais 48h. O número relativo de células foi estimado porensaio colorimétrico (MTT). Observa-se que houve intensapotencialização do efeito citotóxico da carboplatina pelocomposto V6.

A Figura 5 mostra o efeito dos compostos V4 e V6 sobreo crescimento do melanoma murino. Camundongos C57B1/6 foraminoculados subcutaneamente com 2 x IO5 células de melanomaTm5 e, em seguida, tratados com os compostos V4 ou V5 (1mg/dia, via subcutânea). 0 grupo controle recebeu injeçõesdiárias de tampão fosfato salina (PBS) por via subcutânea.

A Figura 5A mostra a evolução do crescimento domelanoma murino em animais tratados com PBS, V4 e V5,respectivamente. A Figura 5B mostra o peso do tumor aofinal do periodo de tratamento vom PBS, V4 e V5 onde seobserva uma significativa inibição do crescimento do tumor.

A Figura 6 mostra camundongos C57B1/6 inoculadossubcutaneamente com 2 x IO5 células de melanoma murino Tm5,tratados diariamente com lOOul de tampão fosfato salina(PBS) por via subcutânea) e sacrificados 16 dias após ainjeção de células tumorais. As setas vermelhas indicam apresença de tumores em 3 camundongos diferentes.

A Figura 7 mostra camundongos C57B1/6 inoculadossubcutaneamente com 2 x IO5 células de melanoma murino Tm5,tratados lmg/dia do composto V4 por via subcutânea, esacrificados 16 dias após a injeção de células tumorais. Assetas vermelhas indicam a região de inoculação das célulastumorais em 3 camundongos diferentes.A Figura 8 mostra camundongos C57B1/6 inoculadossubcutaneamente com 2 x IO5 células de melanoma murino Tm5,tratados com lmg/dia do composto V5 por via subcutânea, esacrificados 16 dias após a injeção de células tumorais. Assetas vermelhas indicam a região de inoculação das célulastumorais em 3 camundongos diferentes.

A Figura 9 mostra a atividade antioxidante doscompostos V4 e V6 em melanócitos e células de melanoma. Aslinhagens de melanócitos (melan-a; ma) e de melanoma (Tm5)foram tratadas ou não com os compostos V4 e V6 e analisadasquanto aos níveis intracelulares de ânion superóxido. Ascélulas tratadas ou não com os compostos foram incubadascom o fluoroforo DHE e a determinação do nível intracelularde ânion superóxido nas células melan-a e Tm5 foi estimadaapós análise em citômetro de fluxo (FacsCalibur; Becton &Dickinson).

A Figura 10 mostra experimentos de infecção de célulasVERO com Trypanosoma cruzi onde foi analisada A atividadeantiparasitaria dos compostos DB3A, V4, V6, V10 ebenzonidazol, sobre as formas amastigotas intracelulares doparasita.

A Figura 10A mostra uma célula VERO é infectada com aforma amastigota de Trypanosoma cruzi e sem tratamento(experimento controle). Observa-se a coloração do núcleo dacélula VERO e um grande numero de amastigotas de T.cruzidispostos no citoplasma ao redor do núcleo, com os núcleose cinetoplastos corados.

A Figura 10B mostra uma célula VERO infectada com aforma amastigota de Trypanosoma cruzi e tratada por 4 8 hcom 5 jxg/mL de benzonidazol, droga padrão de tratamento emuso atualmente. Observa-se ação antiparisitária eficaz.

A Figura 10C mostra uma célula VERO infectada com aforma amastigota de Trypanosoma cruzi e tratada por 48 hcom 10 fj.g/mL de DB3A. Observa-se ação antiparisitáriaeficaz semelhante àquela da droga padrão.

A Figura 10D mostra uma célula VERO infectada com aforma amastigota de Trypanosoma cruzi e tratada por 48 hcom 10 (ig/mL de V4.

A Figura 10E mostra uma célula VERO infectada com aforma amastigota de Trypanosoma cruzi e tratada por 4 8 hcom 10 (i.g/mL de V6.

A Figura 10F mostra mostra uma célula VERO infectadacom a forma amastigota de Trypanosoma cruzi e tratada por48 h com 5 (xg/mL de V10.

A Figura 11 mostra experimentos in vivo de infecção decamundongos com Trypanosoma cruzi onde foi analisada Aatividade antiparasitaria dos compostos DB3A ebenzonidazol. Os gráficos mostram o perfil isolado daparasitemia (parasitas/mL de sangue) nos animais, durante18 dias. (A) controle (não-tratados); (B) tratamento combenzonidazol; (C) tratamento com DB3A. H significa cabeça,B significa corpo, T significa cauda, HB significa cabeça ecorpo e HBT significa cabeça corpo e cauda. Estas são asidentificações feitas para analisar os camundongosisoladamente no grupo.

A Figura 12 mostra a média da parasitemia(parasitas/mL de sangue) após infecção in vivo comTrypanosoma cruzi em camundongos não tratados (controle) etratados com benzonidazol ou DB3A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Dos processos de obtenção

Em particular esta invenção refere-se à preparação decurcumina (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) e seus derivados alquilados de estrutura I:

<formula>formula see original document page 30</formula>em que

R1, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;

R2, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila.em que

R3, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; C0CH3 ou COPh.

em que

Z, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;

em que

US é irradiação ultrassônica.

Neste processo, a curcumina (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) e seus derivadosalquilados são obtidos a partir de vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido) ou vanilina substituída, acetilacetonae ácido clorídrico concentrado sob condições de irradiaçãoultrassônica, conforme apresentado na reação acima eenvolve as seguintes etapas:

a) Colocar em contato vanilina, ou vanilinasubstituida; acetilacetona ou derivados alquilados daacetilacetona; e ácido clorídrico sob condições deirradiação ultrassônica;

b) Deixar a mistura reacional em repouso;

c) Realizar uma extração usando uma solução dehidróxido de sódio ou hidróxido de potássio;

d) Filtrar a mistura reacional a vacúo;

e) Acidificar o filtrado obtido com ácido clorídricoou ácido sulfúrico com a conseqüente formação de umprecipitado;

f) Filtração e lavagem do precipitado com águadestilada;

g) secagem do produto sólido.

Preferencialmente a irradiação ultrassônica érealizada em uma faixa de 25 a 40 KHz durante um período detempo que varia de 1 a 8 horas. A mistura reacional épreferencialmente deixada em repouso por um periodo de 8 a24 horas em uma faixa de temperatura compreendida entre 10a 60°C.

Esta invenção também se refere ao processo de obtençãode sais metálicos de curcumina ou seus derivados(1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) deestruturas II e III:<formula>formula see original document page 33</formula>

em que

R1, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;em que

R2, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;em que

R3, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; CPCH3 ou COPh;

M, em cada ocorrência separada, é um cátion metálico;em que

R, em cada ocorrência separada, é CH3 ou CH3CH2Neste processo, um composto de estrutura I é colocadona presença de uma solução de alcoxido metálico (ROM) e deseu álcool correspondente (ROH) em relação molar 1:1 ou 2:1conforme apresentado nas reações acima e envolve asseguintes etapas:a) colocar um composto de estrutura I na presença deuma solução de alcóxido metálico (ROM) e de seu álcoolcorrespondente (ROH) em relação molar 1:1 ou 2:1;

b) evaporar o álcool a vácuo até à formação de um salmetálico no estado sólido;

c) passagem do sal metálico obtido por tamis de formaobter um pó fino facilmente solubilizável.

Quando a relação molar entre o alcóxido metálico (ROM)e de seu álcool correspondente (ROH) é de 1:1 obtém-se umsal mono-metálico. Quando a relação molar entre o alcóxidometálico (ROM) e de seu álcool correspondente (ROH) é de2:1 obtém-se um sal di-metálico conforme a reação acima.

Preferencialmente poderá ser utilizada uma soluçãoetanólica de etóxido de sódio ou uma solução metanólica demetóxido de sódio de forma a se obter 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil]-2-metoxi-fenolatode sódio ou 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico.

A presente invenção refere-se também a um processopreparar fenolato metálico da vanilidenacetona de estruturaV:em que

R1 é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;

M, é em cada ocorrência separada, é um cátion metálicoestabilizante do composto sob a forma de ion fenóxido.

Neste processo vanilidenacetona ou umavanilidenacetona substituída de estrutura geral IV, écolocada em contato com um alcóxido metálico (ROM) e umálcool(ROH), em relação molar 1:1. 0 processo envolve asseguintes etapas:

a) colocar em contato vanilidenacetona ou umavanilidenacetona de estrutura geral IV, com alcóxidometálico (ROM) e um álcool(ROH) em relação molar 1:1;

Preferencialmente pode utilizar-se a vanilidenacetonasubstituída 4-(4-Hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona,colocando-a contato com um alcóxido metálico (ROM) e umálcool(ROH), em relação molar 1:1, de forma a obter ofenolato metálico da vanilidenacetona, 2-Metoxi-4-(3-oxo-but-1-enil)fenolato de sódio.

Preferencialmente poderá ser utilizada uma soluçãoetanólica de etóxido de sódio ou uma solução metanólica demetóxido de sódio.

A invenção refere-se ainda a um processo para prepararum sal metálico de vanilina de estrutura VI, a partir de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido

<formula>formula see original document page 36</formula>

R, é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;

M, é em cada ocorrência separada, é um cátion metálicoestabilizante do composto sob a forma de ion fenoxido;

Este processo compreende colocar em contato 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, um alcóxido metálico (ROM) e umálcool(ROH) em relação molar 1:1 e envolve as seguintesetapas:

a) colocar em contato 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido,um alcóxido metálico (ROM) e um álcool(ROH) em relaçãomolar 1:1.

Preferencialmente pode utilizar-se 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido de forma a se obter o sal metálico de vanilina4-formil-2-metoxi-fenolato de sódio.

Preferencialmente poderá ser utilizada uma soluçãoetanólica de etóxido de sódio ou uma solução metanolica demetóxido de sódio.

Esta invenção refere-se ainda a um processo parapreparar derivados acetilados de vanilina ou uma vanilinasubstituída de estrutura VII

<formula>formula see original document page 37</formula>

Estrutura VII

em que

R é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino.

Este processo compreende misturar vanilina ou umavanilina substituída, anidrido acético e acetato de sódio eenvolve as seguintes etapas:

a) misturar vanilina ou uma vanilina substituída,anidrido acético e acetato de sódio.

b) aquecer esta mistura a uma temperatura entre 80°C e14 0°C sob agitação e refluxo por um intervalo de tempo de 1a 10 horas;

c) verter mistura obtida o em água com gelo obtendo-seum precipitado.

Preferencialmente a mistura deve ser aquecida aaproximadamente 120°C, sob agitação e refluxo, por 2 horase 30 minutos.

Preferencialmente pode misturar-se 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído, anidrido acético e acetato de sódio para obtero composto 4-formil-2-metoxi-acetato de fenila.

A invenção refere-se também a um processo parapreparar 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeído, deestrutura VIII

<formula>formula see original document page 38</formula>

que compreende as seguintes etapas:

a) misturar 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído, carbonatode potássio e dimetilformamida entre 15°C e 65°C por 10 a 90 minutos;

b) adicionar brometo de prenila e agitar a mistura dareação entre 15°C a 60°C por 4 a 15 horas;

c) verter a mistura obtida em água com gelo obtendo-seum precipitado branco.

d) filtrar o precipitado obtido

Preferencialmente deve ser usado 0,01 mol (l,52g) de4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido (V5) com 0,03 mol (4,14g) decarbonato de potássio e 10 ml de dimetilf ormamida a umatemperatura constante de 40°C por 30 minutos.

Preferencialmente deve ser adicionado 0,02 mol (2,98g; 2,32 mL) de brometo de prenila e a mistura da reaçãodeve agitar-se por 8 horas a 40°C.

Esta invenção refere-se também a um processo parapreparar cianoacetoidrazonas e derivados de estrutura X apartir de vanilinas substituídas de estrutura IX

Estrutura IX Estrutura X

<formula>formula see original document page 39</formula>

em que

R é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; C0CH3 ou COPh.em que

R1 é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;que compreende as seguintes etapas:

a) misturar vanilinas substituidas de estrutura IX ecianoacetoidrazida na presença de um álcool ROH;

b) aquecer a mistura até a formação de um precipitado.Preferencialmente, pode misturar-se vanilina e

cianoacetoidrazida na presença de etanol para obter 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida.

Preferencialmente, pode misturar-se 3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)benzaldeido e cianoacetoidrazida napresença de etanol para obter [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida.

Preferencialmente, pode ainda misturar-se 3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzaldeido e cianoacetoidrazida napresença de etanol para obter (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida.

Esta invenção refere-se também a um processo parapreparar 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazidas substituidas deestrutura XI<formula>formula see original document page 41</formula>

em que

Z é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um cátion metálico; COMe; COC6H5;

CH2CH=C(CH3)2; grupo metila; grupo alquila.

em que

X é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;

em que

Y é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;

que compreende reagir cianoacetoidrazonas CH-ácidassubstituídas com compostos carbonilicos em relação molar1:1 sob as condições de condensação Knoevenagel eirradiação ultrasônica na presença de acetato de amônio eácido acético.Preferencialmente, a irradiação ultrassônica ocorre emuma faixa de 25 a 4 0 KHz durante um período de tempo quevaria de 1 a 8 horas.

Preferencialmente, a reação ocorre em uma faixa detemperatura entre 20 e 60°C.

A presente invenção refere-se também a um processopara preparar 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida que compreendeas seguintes etapas:

a) misturar vanilina, 4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianoacetoidrazida, acetato de amônio e ácidoacético glacial;

b) deixar a mistura sob radiação ultrassônica por umintervalo de 5 a 80 horas;

c) verter a mistura obtida em água com gelo obtendo-se um precipitado amarelo;

d) filtrar o precipitado.

Preferencialmente a mistura é deixada sob radiçãoultrassônica por 30 horas.Dos compostos:

Esta invenção refere-se a novos compostos derivados devanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido).

Em particular esta invenção refere-se ao composto 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-dionaobtida a partir de vanilina, acetilacetona e ácidocloridrico sob condições de irradiação ultrassônica.

Esta invenção refere-se também aos compostos: 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil] -2-metoxi-fenolato de sódio; 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico; 2-metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato de sódio; 4-formil-2-metoxi-fenolato desódio; 4-formil-2-metoxi-acetato de fenila; 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeido; 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida; [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida; (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida e 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida.

Propriedades e usos dos compostos derivados de vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido):

Os compostos da presente invenção apresentam o efeitotécnico inesperado de apresentarem atividades antitumorais,antioxidantes e antiparasitárias significativas quepossibilitam o seu uso em inúmeras aplicações biológicas,farmacêuticas e terapêuticas relevantes,

a) Atividade antitumoralÉ importante notar que os compostos descritos napresente invenção apresentam atividade antitumoralsignificativa.

Nomeadamente, os compostos da presente invençãoinduzem uma resposta inflamatória especifica nos tumoresprimários humanos e animais in vivo, impedindo seucrescimento e disseminação.

Desta forma, os compostos aqui descritos impedem adisseminação e migração das células tumorais para órgãosinternos, assim como formação de tumores secundários oumetástases.

Em particular, os compostos V4 e V6, inibiemseletivamente a proliferação de células tumorais e odesenvolvimento de tumores.

Por outro lado os compostos DB2, DB3A, DB3B, V4 e V6exibem maior efeito citotóxico especifico contra asdiversas linhagens tumorais humanas e animais, in vivo, eapresentam valores de concentração inibitória 50% (IC50)menores que os demais compostos testados.

Os compostos aqui descritos apresentam também acapacidade de induzir a morte celular programada (apoptose,anoikis) de doenças proliferativas humanas e animais eportanto de inibir o crescimento e impedir a migração detumores humanos e animais.Desta forma constitui um outro aspecto desta invençãoo uso dos compostos desta invenção para tratar ou prevenirou para manufaturar medicamentos para uso no tratamento,profilaxia ou prevenção de doenças neoplásicas, lesõesmetastáticas, proliferativas e/ou degenerativas. Emparticular, os compostos aqui descritos podem ser usadospara tratar ou prevenir ou para manufaturar medicamentospara uso no tratamento, profilaxia ou prevenção de doençasneoplásicas provocadas por câncer de pulmão, carcinoma demama e mama resistente a múltiplas drogas, cânceres de pelenão melanoma e melanomas, leucemias linfóides, mielóidesagudas e crônicas, eritroleucemia, mielodisplasias,cânceres de cólon, ovário, útero, rim, pâncreas, próstata,sarcomas de tecido mole, hepatocarcinomas, osteosarcomas,sistema nervoso central, neuroblastomas, astrocitomas,orofaringe, tireóide, gástrico, próstata e anexos doaparelho reprodutor masculino.

b) Efeito co-adjuvante no tratamento com quimioterapicos

Os compostos da presente invenção apresentam tambémimportantes propriedades como co-adjuvantes no tratamentocom quimioterapicos.

Baixas doses dos compostos da pressente invençãoquando associados a baixas doses de bleomicina oucarboplatina em uma relação molar adequada inibemsignificativamente a proliferação de células tumorais. Ouseja, os compostos da presente invenção potencializam osefeitos antitumorais da bleomicina ou carboplatina paratratar ou prevenir ou para manufaturar medicamentos parauso no tratamento, profilaxia ou prevenção de doençasneoplásicas, lesões metastáticas, proliferativas e/oudegenerativas.

Desta forma, constitui um outro aspecto desta invençãouma composição farmacêutica compreendendo um composto oumais compostos desta invenção e bleomicina ou carboplatina.

Constitui ainda um outro aspecto desta invenção o usodos compostos desta invenção em associação com bleomicinaou carboplatina para tratar ou prevenir ou para manufaturarmedicamentos para uso no tratamento, profilaxia ouprevenção de doenças neoplásicas provocadas por câncer depulmão, carcinoma de mama e mama resistente a múltiplasdrogas, cânceres de pele não melanoma e melanomas,leucemias linfóides, mielóides agudas e crônicas,eritroleucemia, mielodisplasias, cânceres de cólon, ovário,útero, rim, pâncreas, próstata, sarcomas de tecido mole,hepatocarcinomas, osteosarcomas, sistema nervoso central,neuroblastomas, astrocitomas, orofaringe, tireóide,gástrico, próstata e anexos do aparelho reprodutormasculino.Além disso, os compostos V4 e V6 inibiem a produção deânion superóxido, tornando as células tumorais maissusceptíveis à morte celular por agentes quimioterápicose/ou radição ionizante.

c) Efeito imunoestimulante

Os compostos aqui descritos atuam também como agentesimmunoestimulantes específicos. Desta forma constitui umoutro aspecto desta invenção o uso dos compostos aquidescritos para tratar ou prevenir ou para manufaturarmedicamentos para uso no tratamento, profilaxia ouprevenção de patologias imunossupressoras, imunodeficientese degenerativas humanas e animais. Em particular oscompostos da presente invenção podem ser utilizados paratratar ou prevenir ou para manufaturar medicamentos parauso no tratamento, profilaxia ou prevenção de doençasneurodegenerativas tais como a Doença de Alzheimer.

d) Atividade antioxidante

Os compostos V4 e V6 descritos nesta invençãoapresentam potente atividade antioxidante.

Desta forma consitutui um outro aspecto desta invençãoo uso dos compostos aqui descritos para tratar ou prevenirou para manufaturar medicamentos para uso no tratamento,profilaxia ou prevenção de doenças neoplásicas, lesõesmetastáticas, proliferativas e/ou degenerativas, depatologias imunossupressoras, imunodeficientes edegenerativas e de parasitoses diversas em humanos e/ouanimais além da manufatura de produtos cosméticos para usono tratamento e/ou prevenção do envelhecimento da pele.

e) Atividade antiparasitária

Os compostos da presente invenção exibem ação sobre aproliferação de formas epimastigotas e tripomastigotasmetaciclicas de Trypanosoma cruzi em meio de cultivo LIT esobre Trypanosoma cruzi parasita causador do Mal de Chagas,determinado pelo método de MTT.

Além disso, os compostos aqui descritos, DB2, DB3A,V4, V6, V10 exibem ação sobre a viabilidade de formastripomastigotas sangüíneas e amastigotas intracelulares deTrypanosoma cruzi, em meio RPMI.

Por outro lado, os compostos exibem a sua ação sobreas formas amastigotas intracelulares de Trypanosoma cruzi,induzindo apoptose com morte do parasita sem afetar acélula hospedeira, fato importante para o tratamento dafase crônica da doença de Chagas não exibindo efeitostóxicos indesejáveis como acontece na utilização deNifurtimox e Benzonidazol.

Desta forma, constitui um outro aspecto desta invençãoo uso dos compostos aqui - descritos para tratar ou prevenirou para manufaturar medicamentos para uso no tratamento,profilaxia ou prevenção de parasitoses.

EXEMPLOS

Para permitir uma melhor compreensão da presenteinvenção e demonstrar claramente os avanços técnicosobtidos são agora apresentados como exemplos os resultadosdos diferentes ensaios efetuados com relação a estainvenção.

Parte 1: Síntese, isolamento e caracterização dos compostosEXEMPLO 1: Obtenção de curcumina ou 1,7-bis (4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-l,6-dieno-3,5-diona (DB2)

<formula>formula see original document page 49</formula>

0,01 mol de vanilina (4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido)(1,52 g) e 2 mL de ácido clorídrico concentrado (38%) foramcolocados sob as condições de ultrassom a 28 KHz.

Posteriormente, foram adicionados 0,005 mol deacetilacetona e, então, a mistura foi submetida àirradiação ultrassônica a 28 KHz por 1 hora. A mistura foientão deixada em repouso por 24 horas à temperatura de30°C. Subseqüentemente foi realizada uma extração comsolução de hidróxido de sódio ou de potássio e umaposterior filtração a vácuo. Em seguida, a mistura foiacidificada com ácido clorídrico ou sulfúrico, observando-se a formação de precipitado o qual foi filtrado e lavadocom água destilada. 0 produto sólido foi seco à temperaturaambiente e apresentou coloração marrom esverdeada.

Fórmula geral: C21H20O6.Massa Molecular: 368Ponto de fusão: 165-170°CRendimento: 2g (78%)

Os resultados da caracterização estrutural do compostoisolado são os seguintes:

XH NMR (300 MHz, DMSO) : ô = 9,65 (s, 1H, OH-enólico) ; 8,27(s, 1H, OH-fenólico) ; 7,63 (d, 1H, H-l) ; 7,34 (s, 1H, H-2'); 7,19, (d, 1H, H-6); 6,82 (d, 1H, H-7); 7,17 (m, 2H, H-5 7H-6'); 3, 883 (s, 3H, CH30) .

13C NMR (75 MHz, DMSO): ô = 188,10 (C=0) ; 149, 45 (C-3');148, 02 (C-4'); 142, 83 (OI); 126, 39 (OI'); 123, 40 (C-2);123,05 (C-6'); 115,71 (C-5'); 111,43 (C-2'); 79,18 (C-4);55,76 (CH30).

DEPT (DMSO): ô = 143,25 (OI); 123, 82 (C-2); 123, 46 (C-6');116,13 (C-5'); 111,84 (C-2'); 56,18 (CH30).

EXEMPLO 2: Obtenção de sais metálicos de curcumina

2a) Obtenção de 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-1,6-dienil]-2-metoxi-fenolato de sódio (DB3-A)

A obtenção do sal sódico, 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil]-2-metoxi-fenolato desódio, deu-se a partir da 1,7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1,6-dien-3,5-diona na presença de metóxido desódio e metanol em uma relação molar de 1:1.

1, 7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1,6-dien-3,5-diona foi colocada em contato com uma solução de metóxidode sódio em uma relação molar de 1:1 em metanol e,posteriormente, o solvente foi evaporado a vácuo até aobtenção de um sólido. O sal foi obtido com alto rendimento(94%). Uma vez obtido, o fenolato foi passado por tamispara assim, obter um pó fino mais facilmente solubilizadoem água. 0 produto obtido possui coloração vermelha.

Fórmula geral: C21H1906Na.

Massa Molecular: 390

Rendimento: 3,46g (94%)

UV-VIS: Absorbância = 0,962 (máximo de absorção é X 395 nmem água)

Mediante a acidificação com ácido clorídrico, o saltransforma-se na correspondente 1,7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1,6-dien-3,5-diona que é extraída cométer etilico, clorofórmio ou acetato de etila. Osresultados da caracterização estrutural do composto isoladosão os seguintes:

1H NMR (300 MHz, DMSO) : ô = 9,65 (s, 1H, OH-enólico) ; 8,27(s, 1H, OH-fenólico) ; 7,63 (d, 1H, H-l); 7,34 (s, 1H, H-2'); 7,19, (d, 1H, H-6); 6,82 (d, 1H, H-7); 7,17 (m, 2H, H-5 7H-6'); 3, 883 (s, 3H, CH30) .

13C NMR (75 MHz, DMSO): ô = 188,10 (C=0) ; 149, 45 (C-3');148,02 (C-4'); 142,83 (C-l); 126,39 (C-l'); 123,40 (C-2);123,05 (C-6'); 115,71 (C-5'); 111,43 (C-2'); 79,18 (C-4);55,76 (CH30).

DEPT (DMSO): ô = 143,25 (C-l); 123,82 (C-2); 123,46 (C-6');116,13 (C-5'); 111,84 (C-2'); 56,18 (CH30) .

2b) Obtenção de 3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis (2-metoxi-fenolato) dissódico (DB3-B)

<formula>formula see original document page 52</formula>

A obtenção do sal sódico, 3,5-dioxo-hepta-l, 6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico, deu-se a partir da 1,7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1,6-dien-3,5-diona empresença de metóxido de sódio e metanol em relação molar 1:2.

1, 7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1,6-dien-3, 5-diona foi colocada em contato com uma solução de metóxidode sódio em metanol em relação molar 1:2 e, a seguir, osolvente foi evaporado a vácuo até a formação de um sólido.0 sal foi obtido com alto rendimento (93%). Uma vez obtido,o fenolato foi passado por tamis para assim, obter um pófino mais facilmente solubilizado em água. 0 produto obtidopossui coloração vermelha.

Fórmula geral: C21H1806Na2

Massa Molecular: 412

Rendimento: 3,83g (93%)

UV-VIS: Absorbância = 0,141 (máximo de absorção é Xmax. =450 nm em água)

XH NMR (300 MHz, DMSO) : ô = 9,65 (s, 1H, OH-enólico) ; 8,27(s, 1H, OH-fenólico) ; 7,63 (d, 1H, H-l); 7,34 (s, 1H, H-2'); 7,19, (d, 1H, H-6); 6,82 (d, 1H, H-7); 7,17 (m, 2H, H-5 7H-6'); 3, 883 (s, 3H, CH30) .

13C NMR (75 MHz, DMSO) : ô = 188,10 (C=0) ; 149, 45 (C-3');148,02 (C-4'); 142,83 (C-l); 126,39 (C-l'); 123,40 (C-2);123,05 (C-6'); 115,71 (G-5'); 111,43 (C-2'); 79,18 (C-4);55,76 (CH30).

DEPT (DMSO): 8 = 143,25 (C-l); 123,82 (C-2); 123,46 (C-6');116,13 (C-5'); 111,84 (C-2'); 56,18 (CH30).

EXEMPLO 3: Obtenção de derivados da vanilidenacetona

3a) Obtenção de 4-(4-Hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona(R-6)

<formula>formula see original document page 54</formula>

A obtenção de 4-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona, deu-se a partir de 0,01 mol (l,52g) de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, dissolvido em uma soluçãohidroalcoólica (136 ml, 50% v/v), e da subseqüente adiçãode 0,051 mol (3,6 ml) de acetona e 0,03 mol (12,0 ml) deuma solução 10% de hidróxido de sódio. Esta reação foideixada sob agitação constante à temperatura ambiente porcinco dias. Entretanto, a cada 24 horas, foi adicionado0,03 mol (12,0 ml) de uma solução 10% de hidróxido desódio.

A mistura foi vertida em água destilada e gelo. Aseguir, foi realizada uma extração com éter etilico,seguido de lavagem com água. A fase orgânica foi seca comsulfato de sódio anidro, e finalmente o solvente foievaporado a vácuo.

Para purificação do composto obtido foi utilizada umacoluna cromatográfica recheada com sílica gel, eluindo-secom mistura de tolueno/acetato de etila (7:3).

Rf do produto R-6 = 0,36 (Eluentes: tolueno, acetatode etila em relação 7:3)

Rf da matéria-prima = 0,45 (Eluentes: tolueno, acetatode etila em relação 7:3)

Fórmula geral: C11H1203.Massa Molecular: 192Rendimento: l,15g (60%)

XH NMR (300 MHz, CDC13): ô = 7,451 (H-4, 1H, d), 6,587 (H-3, 1H, d), prótons aromáticos: 6,933 (H-5', 1H, m), 7,056(H-6', 1H, m) , 7,111 (H-2', 1H, m) , 5, 938 (OH, 1H, s) ,3,938 (MeO, 3H, s), 2,367 (MeCO, 3H, s).

3b) Obtenção de 2-Metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato desódio (R6-B)

<formula>formula see original document page 56</formula>

A obtenção do sal sódico deu-se a partir de 4-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona em presença demetóxido de sódio e metanol em uma relação molar de 1:1.

4-(4-Hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-onacolocada em contato com uma solução de metóxido de sódio emmetanol e, a seguir, o solvente foi evaporado a vácuo até aformação de um sólido. 0 sal foi obtido com alto rendimento(93%). Uma vez obtido, o fenolato foi passado por tamispara assim, obter um pó fino mais facilmente solubilizadoem água. 0 produto obtido possui coloração vermelha.

Fórmula geral: CllH1103Na.

Massa Molecular: 214

Rendimento: l,99g (93%)

Mediante a acidificação com ácido clorídrico o saltransforma-se na correspondente vanilidenacetona que éextraída com éter etílico, clorofórmio ou acetato de etila.

Os resultados da caracterização estrutural deste compostocoincidem com os dados já conhecidos da matéria prima.

EXEMPLO 4: Obtenção de derivados do 4-Hidroxi-3-metoxi-benzaldeido

4a) Obtenção do 4-Formil-2-metoxi-fenolato de sódio (V6)

<formula>formula see original document page 57</formula>

A obtenção deste sal sódico deu-se a partir do 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido (V5) em presença de metóxidode sódio e metanol em uma relação molar de 1:1.

4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido foi colocado em contatocom uma de metóxido de sódio em metanol e, a seguir, osolvente foi evaporado a vácuo até a formação de um sólido.0 sal foi obtido com alto rendimento (78%). Uma vez obtido,o fenolato foi passado por tamis para assim, obter um pófino mais facilmente solubilizado em água. 0 produto obtidopossui coloração amarela.

Fórmula geral: C8H703Na.

Massa Molecular: 174

Rendimento: 1,36 g (78 %)

Mediante a acidificação com ácido clorídrico, o saltransforma-se no correspondente 4-Hidroxi-3-metoxi-benzaldeido (V5), que é extraído com éter etilico,clorofórmio ou acetato de etila. Os resultados dacaracterização estrutural deste composto isolado estão deacordo com a sua estrutura.4b) Obtenção de 4-Formil-2-metoxi-acetato de fenila (V4)

A reação realizada foi a de acetilação, que consistena mistura de 0,0062 mol (1,0 g) de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, 0,2 mol (20,4 g) de anidrido acético e 0,012mol (1,0 g) de acetato de sódio. Esta mistura foi aquecidaa aproximadamente 120°C, sob agitação e refluxo, por 2horas e 30 minutos. O produto obtido foi vertido em águacom gelo, formando um precipitado alaranjado.

Fórmula geral: C10H10O4

Massa Molecular: 194

Rendimento = 88%

1H-RMN (CDC13) : 9,8 (s, 1H, CHO) ; 7,30 (d, 2H, H-6) ; 7,18(s,lH, H2); 7,05 (dd, 1H, H5); 3,71 (s, 3H, MeO); 1,98 (s,3H, CH3) ppm.

13C-RMN (CDC13) : 190,6 (CHO); 168,0 (C=0) ; 151,6 (C-3) ;144,6 (C-4); 134,9 (C-l); 124,5 (C-5); 123,2 (C-6); 110,6(C-2); 56,0 (CH30); 20,6 (CH3) ppm.

MS (70 eV) : 195 (M++ +H) ; 43 (M+ - 152,1), quecorresponde ao grupamento C0CH3; 31 (152,1 -121,2), quecorresponde ao grupamento metoxi.

4c) Obtenção de 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeido (VI)

<formula>formula see original document page 59</formula>

Foi misturado 0,01 mol (l,52g) de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido (V5) com 0,03 mol (4,14g) de carbonato depotássio e 10 ml de dimetilformamida a uma temperaturaconstante de 40°C por 30 minutos. A seguir, 0,02 mol (2,98g; 2,32 mL) de brometo de prenila foi adicionado gota agota. A mistura da reação foi agitada por 8 horas a 40°C e,logo após seu término, a mistura é vertida em água geladae, então, esperou-se até o dia seguinte até obtenção de umsólido branco, que foi filtrado e deixado secarnaturalmente.

Fórmula geral: C13H1603

Massa Molecular: 220

Rendimento: 95%

1H-RMN (CDC13) : 9,8 (s, 1H, CHO); 7,45 (d, 2H, H-6) ; 7,22(s,lH, H2); 6,90 (dd, 1H, H5) ; 5,51 (m, 1H, H2'.); 4,42 (d,2H, Hl'); 3,91 (s, 3H, MeO); 1,80 (s, 6H, CH3, C4').13C-RMN (CDC13) : 190,9 (CHO) ; 153,8 (C-4); 149,7 (C-3);138,7 (C-3'); 129,9 (C-l); 126,7 (C-6); 118,8 (C-2'); 111,5(C-2); 109,0 (C-5); 76,5 (C-l'); 56,0 (CH30); 25,8 (C-4');18,3 (CH3) ppm.

RMN-DEPT (CDC13): 190,95 (CHO); 126,79 (C-6); 118,90 (C-2'); 111,58 (C-2); 109,01 (C-5); 65,94 (C-l'); 56,00 (MeO);25,87 (CH3) ppm.

IV (Nujol) : em 3076 (C sp2 H) ; 2933, 2858 (C sp3 H) ;1681 (C=0); 1585 (C=C) ; 1265 (C-O) cm-1.

EXEMPLO 5: Obtenção de cianoacetoidrazonas e derivados

<formula>formula see original document page 60</formula>

Técnica geral:

Dissolve-se 0,01 mol de vanilina ou uma vanilinasubstítuida correspondente em 5 mL de etanol, e 0,01 mol decianoacetoidrazida (0,99 g) em 5 mL de etanol. Ambas asmisturas são aquecidas sob refluxo durante 0,5-10 horas atéa formação de um precipitado.

5a) Obtenção de 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida (V10)

<formula>formula see original document page 61</formula>

Dissolveu-se 0,01 mol de vanilina em 5 mL de etanol, e0,01 mol de cianoacetoidrazida (0,99 g) em 5 mL de etanol.Ambas as misturas foram aquecidas sob refluxo durante 3,5horas até a formação de um precipitado.Ponto de fusão: 197-200°CRendimento: 1,7 9 g (77%)

XH NMR (300 MHz, DMSO): ô = 11,59 (s, 1H, OH); 9,52 (s, 1H,NH) ; 7,86 (s, 1H, CH=N) ; 7,27 (s,lH, H-2' ) ; 7,06 (m, 1H,H6'); 6,82 (m, 1H, H-5'); 4,16 (s, 2H, CH2); 3,79 (s, 3H,CH30).

13C NMR (75 MHz, DMSO): 8 = 164, 90 (C=0) ; 158, 94 (C-3');149,68 (C-4'); 149,68 (CH=N); 125,69 (C-6'); 122,09 (C-5');116,31 (C-2'); 110,02 (CN); 56,06 (CH30); 24,72 (CH2).DEPT (DMSO): 8 = 145,22 (CH=N); 122,09 (C-6'); 115,87 (C-5'); 109,92 (C-2'); 56,02 (CH30); 24,75 (CH2).

5b) Obtenção de [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida (Vil)

<formula>formula see original document page 62</formula>

Dissolveu-se 0,01 mol de 3-metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzaldeído em 5 mL de etanol, e 0,01 mol decianoacetoidrazida (0,99 g) em 5 mL de etanol. Ambas asmisturas foram aquecidas sob refluxo durante 10 horas até aformação de um precipitado.

Ponto de fusão: 167-173°CRendimento: 1,54 g (51,5 %)

XH NMR (300 MHz, DIVISO) : ô = 8,05 (s, 1H, NH) ; 7,89 (s, 1H,CH=N) ; 7,30 (s,lH, H-6'); 7,27 (m, 1H, H2') ; 7,15 (m, 1H,H-5'); 5,72 (=CH-prenila) ; 4,53 (d, 2H, CH2-prenila) ; 4,18(CH2CN) ; 3,77 (s, 3H, CH30) ; 1,72 (s, 3H, CH3-prenila) ;1,68 (s, 3H, CH3-prenila).

13C NMR (75 MHz, DMSO) : ô = 165, 02 (C=0) ; 150, 55 (C-4');150,31 (C-3'); 144,93 (CH=N); 137,93 (=C(CH3)2); 126,92 (C-1'); 122,42 (=CH-prenila); 121,89 (C-6'); 116,65 (CN) ;113,14 (C-2'); 109,23 (C-5'); 65,37 (prenila-0CH2); 55,91(CH30); 25,89 (CH3-prenila); 24,75 (CH2CN); 18,46 (CH3-prenila).

DEPT (DMSO): ô = 144,91 (CH=N); 121,90 (=CH-prenila);120,14 (C-6'); 113,04 (C-2'); 109,10 (C-5'); 65,32 (CH20-prenila); 56,50 (CH30); 25,91 (CH3-prenila); 25,23 (CH2CN);18,47 (CH3-prenila) .

5c) Obtenção de (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida (V12)

<formula>formula see original document page 63</formula>

Dissolveu-se 0,01 mol de 3-bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzaldeido em 5 mL de etanol, e 0,01 mol decianoacetoidrazida (0,99 g) em 5 mL de etanol. Ambas asmisturas foram aquecidas sob refluxo durante 0,5 horas atéa formação de um precipitado.

Ponto de fusão: 222-226°C

Rendimento: 2,34 g (75 %)

XH NMR (300 MHz, DMSO): ô = 11,73 (s, 1H, OH) ; 9,99 (s, 1H,NH) ; 8,04 (s, 1H, CH=N) ; 7,41 (s, 1H, H-2' ) ; 7,28 (s, 1H,H6'); 4,19 (CH2CN); 3,78 (s, 3H, CH30).

13C NMR (75 MHz, DMSO) : Ô = 165,17 (C=0) ; 159,21 (C-5');149,03 (C-4'); 143,77 (CH=N); 126,58 (C-l'); 124,24 (C-2');116,70 (CN); 109,41 (C-6'); 109,71 (C-3'); 56,73 (CH30);24,83 (CH2CN).

DEPT (DMSO): 8 = 143,77 (CH=N); 124,24 (C-2'); 109,41 (C-6'); 56,72 (CH30) ; 24, 83 (CH2CN).

EXEMPLO 6: Obtenção de derivados da 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida.

6a) Obtenção de 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida (RR-1)

Em um balão de uma boca, adicionou-se 0,01 mol (1,52g) de vanilina; 0,01 mol (2,33g) de 4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianoacetoidrazida; 0,05 mol (3,85g) de acetatode amônio e 0,174 mol (10,49g) (10 ml) de ácido acéticoglacial. A mistura foi deixada sob radiação ultrassônica(28 kHz) por 30 horas. Após este periodo, verteu-se asolução em água com gelo até a formação de um preciptadosólido amarelo, e então o sólido foi filtrado.

Fórmula geral: C19H17N3O5Massa Molecular: 367Rendimento =80%

IV (Nujol) : 3260 (OH);3050 (C sp2 H) ; 2925, 2850 (C sp3 H) ;2210 (CN) ; 1661 (C=0) ; 1580 (C=C) ; 1260 (C-O) cm"1.

XH NMR (300 MHz, DMSO) : ô = 11,73 (s, 1H, OH) ; 11,69 (s,1H, OH); 9,97 (s, 1H, NH); 8,00 (s, 1H, CH=N); 7,99 (s, 1H,H-3); 7,96 (s, 1H, CH=N); 7,03 (s, 1H, H-2" ) ; 6,99 (s, m,H-6"); 6,72 (m, 1H, H-5"); 6,69 (m, 1H, H-6'); 6,64 (m,1H, H-2'); 6,57 (m, 1H, H-5'); 3,80 (s, 3H, CH30); 3,78 (s,3H, CH30).

Parte 2: Análise da atividade antitumoral, antiparasitáriae antioxidante dos compostos.

Parte 2a: Atividade Antitumoral e ensaios pré-clinicos

Cultivo celular. As linhagens celulares demelanócitos, melan-a (Bennet et al., Int. J. Câncer,v.39(3), pp. 414-418, 1987), e de melanoma murino, Tm5(Oba-Shinjo et al., Neoplasia. v. 8(3), pp. 231-41, 2006;Corrêa et al., Int. J. Câncer, v.H4(3), pp. 356-363,2005), são cultivadas em meio RPMI, pH 6,9, contendo 5% desoro fetal bovino inativado pelo calor (Gibco BRL) ematmosfera úmida com 5% C02 a 37°C. 0 meio de culturautilizado no cultivo dos melanocitos é acrescido de 200 nMde forbol-miristato acetato (PMA). Ao atingirsubconfluência, as células são removidas das garrafas decultura pela adição de tripsina 0,2% em tampão fosfatosalina (PBS), pH 7,3, por poucos segundos, seguindo-se obloqueio da ação proteolítica pela adição de meio decultura suplementado com soro fetal bovino.

Animais. Camundongos C57BL/6 são mantidos em ambienteadequado, sem restrições alimentares e com ciclos de sono-vigilia de 12 horas. Nos experimentos de tumorigenicidadesão utilizados camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas.

Diluição dos compostos. Os compostos estudados sãoinicialmente dissolvidos em DMSO em uma concentração de 0,1g/mL e então diluídos em PBS nas concentrações a seremtestadas nos ensaios in vitro e in vivo.

Ensaio de proliferação in vitro. A proliferaçãocelular na presença ou ausência dos compostos V4 e V6 foideterminada utilizando-se o protocolo padrão de brometo de3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-dimetiltetrazólio (MTT;

Amresco). Células da linhagem de melanocitos murinos melan-a e de melanoma Tm5 foram plaqueadas em placas de 96 poços(2 xlO3 células/poço/100 fil) em meio RPMI contendo 5% desoro fetal bovino. Após adesão, foram adicionados oscompostos a serem testados em diferentes concentrações (100ui/poço; 5, 10, 20, 40 e 80 p.g/mL) . Após 0, 24, 48h e 72hde incubação, 20 \iL de MTT 5 mg/mL foram adicionados porpoço e incubados por lh a 37°C em estufa com 5% de C02. 0meio foi removido e 100 \iL de isopropanol absoluto foramadicionados por poço e incubados por 15 minutos atemperatura ambiente. A absorbância da solução foideterminada em espectrômetro de placa a 570 nm.

Efeito adjuvante no tratamento com quimioterápicos.

Células de melanoma Tm5 foram plaqueadas em placas de 96poços (2 xlO5 células/poço/100 . Depois de aderidas, ascélulas foram tratadas ou não com os compostos por 24hantes do tratamento com os quimioterápicos bleomicina ecarboplatina por 48h em diferentes concentrações(100(j,L/poço) . Após o tratamento, foram adicionados 20 |J,L deMTT 5 mg/mL por poço. Após lh a 37 °C, o meio de culturafoi removido e foram adicionados 100uL de isopropanol emcada poço, seguido de incubação por 15 minutos àtemperatura ambiente. A absorbância da solução foideterminada em espectrômetro de placa a 570 nm. Asporcentagens de inibição foram calculadas em relação aosvalores obtidos nos controles não tratados.Atividade antitumoral In vivo. Camundongos combackground C57BL/6 são mantidos no biotério da Disciplinade Imunologia do Departamento de Microbiologia e Imunologiada UNIFESP em ambiente adequado, sem restrições alimentarese com ciclos de vigilia-sono de 12 horas. Nos experimentosde tumorigenicidade foram utilizados camundongos fêmeas de6 a 8 semanas. Camundongos foram inoculados subcutaneamentecom 2 xlO5 células de melanoma Tm5 singenêicas em um volumede 100 fiL. O tratamento com os compostos foi iniciado nodia da inoculação das células tumorais. Os camundongosreceberam injeções diárias dos compostos na dose delmg/camundongo/dia durante 16 dias. Os camundongos foramobservados diariamente quanto ao aparecimento de tumorespalpáveis e as medidas de maior e menor diâmetros foramtomadas utilizando-se um paquimetro. O volume tumoral foicalculado pela fórmula: menor diâmetro2 x maior diâmetro/2.Quando os tumores atingem cerca de 100 mm de diâmetro, osanimais são sacrificados e os pesos dos tumores sãodeterminados após sua remoção cirúrgica.

Resultados

Inicialmente foram avaliados os efeitos dos compostosV4 e V6 na proliferação de melanócitos não tumorigênicosmelan-a (ma) e de células de melanoma (Tm5), utilizando oreagente MTT. Como mostrado na Figura 1, as células foramtratadas com os compostos por diferentes tempos (24, 48,72h e 96h) nas seguintes concentrações (0, 5, 10, 20, 40 e80(j.g/mL) . Após este periodo, as mesmas foram incubadas comMTT, seguido de análise por espectofotômetro. Todos osquatro compostos apresentaram significativa atividade anti-proliferativa, sendo que os mesmos inibirampreferencialmente a proliferação de células de melanoma. Oefeito inibitório da proliferação de células de melanomafoi dose-dependente. Após 48 horas de cultura na presençados compostos V4 ou V6 nas diversas concentrações, foramcalculadas a equação da reta e a curva de regressão linearcom o auxilio do programa Graph Pad Prisma (Figura 2) . Ocomposto V4 apresentou IC50 de 150)j,g/mL para melanócitosmelan-a e IC50 de 96|0.g/mL para células de melanoma Tm5. Ocomposto V6 apresentou IC50 de 85|xg/mL para células demelanoma Tm5 e induziu a proliferação de melanócitos melan-a (TABELA 1).

TABELA 1: Valores de IC50 (yig/mL) dos compostos analisados

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* O composto V6 estimulou a proliferação dos melanócitosmelan-aDados da literatura mostram que a vanilina é capaz depotencializar a citotoxicidade de alguns agentes que lesamo DNA (Tamai et al., Mutat. Res. v.268, pp. 231-237, 1992;Imanishi et al., Mutat. Res. v. 243, pp. 151-158, 1990),sendo que concentrações subtóxicas de vanilina resultam nasensibilização dose-dependente de linhagens tumoraishumanas à cisplatina (Durant et al., Nucl. Acids Res. v.31(19), pp. 5510-5512, 2003). Desta forma, analisamos acapacidade do composto V6, derivado da vanilina, empotencializar o efeito citotóxico de dois agentesquimioterápicos utilizados na clinica: bleomicina ecarboplatina. Para isso, células de melanoma murino foramtratadas com o composto V6 (40 ng/mL) por 24h, seguido dotratamento com o quimioterápico por 48h. O número decélulas viáveis foi estimado pelo ensaio de MTT e comparadoao número de células viáveis nos grupos controle nãotratado, tratado por 24h somente com V6 e tratado por 48hsomente com o quimioterápico. As Figuras 3 e 4 mostram queo composto V6 é capaz de potencializar de forma bastanteeficiente o efeito citotóxico tanto do quimioterápicobleomicina como da carboplatina, respectivamente. Valeressaltar, por exemplo, que o tratamento das células demelanoma com V6 e bleomicina elimina quase a totalidade dascélulas tumorais (cerca de 90%), o que não acontece quandoestas células são tratadas somente com o quimioterápico(induziu a morte de cerca de 20% das células).

Para a análise do efeito antitumoral in vivo doscompostos V4 e V6, derivados da vanilina, camundongosC57BL/6 fêmeas foram inoculados com células de melanoma ((2x IO5 células; via subcutânea) e tratados diariamente comos compostos V4 e V6 (lmg/dia; via subcutânea) . A Figura 5mostra uma inibição média de 90% no peso de tumores nosanimais tratados com o composto V4 e de 67% nos animaistratados com V6 após 16 dias da inoculação com as célulastumorais e do inicio do tratamento. A obtenção das medidasde maior e menor diâmetro dos tumores foi feita diariamenteapós o surgimento dos mesmos nos animais. Podemos constatarna Figura 5 uma inibição significativa no volume dostumores ao longo do tempo, tanto nos animais tratados com ocomposto V4 quanto com o composto V6, comparado com o grupocontrole (não tratado). 0 volume tumoral foi calculado pelafórmula: d2xD/2. Após a última medida, os animais foramsacrificados, os tumores retirados e seus pesosdeterminados.

As Figuras 6, 7 e 8 mostram fotos tiradas dos animaisapós 16 dias de tratamento, onde pode-se observarnitidamente a redução no tamanho dos tumores, nos animaistratados com os compostos V4 e V6 (Figuras 7 e 8) comparadoao grupo controle não tratado (Figura 6).

Resultados da Avaliação da Atividade Citotóxica em CélulasTumorais e em Fibroblastos Humanos Normais

Cultura das Linhagens Tumorais de melanoma B16F10

A linhagem tumoral de melanoma murino B16F10 foicedida pelo Instituto Ludwig da Suiça. As suspensõescelulares aderentes das células B16F10 foram obtidas paratodos os procedimentos experimentais pelo tratamento dosfrascos de cultura com tripsina 0,2% por 5 minutos einativadas com 10% soro fetal bovino. As célulasdesprendidas foram centrifugadas duas vezes, ressuspendidasem meio RPMI-1640 suplementado com 10 % de soro fetalbovino e 7ug de Polimixina-B (Sigma Chemical. Company, StLouis Mo-USA). A contagem do número de células foirealizada em câmara de Malassez, e a concentração celularfoi ajustada em 5xl05 células/mL.

A viabilidade celular foi determinada pelo teste deexclusão do Azul de Tripan, sendo que 95% das células eramviáveis. As células foram cultivadas em placas de 96 poçosde fundo chato (Corning) , na concentração de 2 x IO5células, mantidas por 24 horas em estufa de C02, à 37°C.

Após este periodo, as placas foram centrifugadas por 5minutos, a 2000 rpm a 4°C, o sobrenadante desprezado eforam adicionadas diferentes concentrações dos compostos V4e V6, os quais foram diluídos em meio de cultura RPMI-1640suplementado e acrescido de 7ug de Polimixina-B (SigmaChemical Company). Após a incubação com os diversoscompostos diluídos em meio de cultura completo, as célulasforam incubadas com 0,5 mg/mL de reativo MTT brometo de 3-(4,5-di-metilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio.

Obtenção e cultura e de fibroblastos humanos normais dePele

Fragmentos de biopsias cutâneas foram obtidos deprocedimentos de diagnósticos de rotina de pacientes doServiço de Dermatologia do Hospital das Clinicas daFaculdade de Medicina da USP. Parte da borda do retalhocirúrgico foi imerso em meio de cultura de Eagle modificadopor Dulbecco's (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA) acrescido de 10% soro fetal bovino (Cultilab Ltda.,Campinas - SP) , 125 mg/mL ampicilina G e 50 ng/mLanfotericina B à 4°C, e mantidos a 4°C por 16 horas, nomáximo.

Os fragmentos foram lavados três vezes na mesmasolução, reduzidos em fragmentos de aproximadamente 1 mm3 etransferidos para frascos de cultura de 25 cm2, mantidos àtemperatura de 37°C, atmosfera úmida contendo 5% C02. Ocrescimento celular foi monitorado diariamente,fotodocumentado em microscopia de inversão e o meio decultura trocado a cada 2 ou 3 dias, de acordo com ometabolismo celular.

Após 7 dias, foi realizada a primeira mudança de meiode cultivo dos frascos. Uma vez iniciado o crescimentocelular, o meio de cultivo foi renovado a cada três dias.Foram utilizados frascos plásticos para cultivo de 25 cm2de área cultivável, onde foram adicionados mais 3 mL demeio DME contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de soluçãoantibiótica-antimicótica.

Ensaio colorimétrico para a determinação da viabilidadecelular (MTT)

O ensaio de viabilidade celular foi realizado paraverificar o efeito dos diversos compostos nas diversasconcentrações previamente estabelecidas: nas linhagens decélulas tumorais B16F10 e fibroblastos humanos normais. Ométodo MTT consiste em um ensaio de viabilidade celular quemede a atividade da desidrogenase mitocondrial. 0 MTT é ummétodo colorimétrico baseado na capacidade das célulasvivas de reduzirem o brometo de 3-(4,5-di-metilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium no produto formazana (Mosmann,1983). Após o plaqueamento das células (concentração delxlO4 por cada poço da placa de cultura) em meio RPMI-1640e 10% de SFB, as placas foram mantidas a 37°C por períodosde 24, 48, 72 e 96 horas. Quatro horas antes de terminar otempo estabelecido, foram adicionados 20uL de MTT (Sigma)(concentração final de 10 ug/mL). As placas foram mantidasna estufa por mais 4 horas. Após o tempo estipulado, foramretirados 180uL do sobrenadante de cada poço e depoisadicionados 150uL de dimetilsulfoxido (Sigma). A misturafoi homogeneizada para a completa dissolução dos cristaisde sal formados pelo metabolismo mitocondrial, resultando,assim, em uma coloração violeta.

A placa de 96 poços foi lida pelo espectrofotômetro(Spectra MAX - 190) utilizando o comprimento de onda de570nm. Os resultados foram analisados através daabsorbância de cada poço. O percentual de viabilidade foiobtido através da seguinte fórmula: [(Absorbância dascélulas tratadas / Absorbância das células não tratadas) x 100]. Os experimentos foram realizados em quadruplicatas.

Diluição das amostras

As amostras dos compostos obtidos sinteticamente foramdiluídas em solução de 10% de DMSO em em meio de culturaRPMI-1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino, nasconcentrações de 250 a 2,5 ug/mL.

O composto V12 apresentou atividade citotóxica emcélulas de melanoma B16F10. Após 24 horas de cultura napresença e ausência do composto nas diversas concentrações,foram calculadas a equação da reta e a curva de regressãolinear no programa Graph Pad Prism Instat. 0 composto V12apresentou IC50 de 138,90 ng/mL e alta especificidade (r2=0,92) em células de melanoma B16F10 (Figura 9).

TABELA 2: Atividade citotóxica de alguns dos compostossintetizados em células de Melanoma B16F10

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TABELA 3: Atividade citotóxica de alguns compostossintetizados em células de Fibroblastos Humanos Normais.

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Os compostos com potencial citotóxico elevado eseletivos para induzir toxicidade e inibir a proliferaçãodas células tumorais e não agredir células normais foram emordem crescente respectivamente: DB-3A; DB-3B; R6-B.

PARTE 2b: Avaliação da Atividade Antioxidante Metodologia:

Os niveis intracelulares de espécies reativas deoxigênio nos melanócitos melan-a e nas células de melanomaTm5 foram estimados utilizando-se o composto diidroetídio(DHE) que fluoresce na presença de ânion superóxido nointerior da célula. As células foram cultivadas em placasde cultura e tratadas por 24h com 40|4.g/ml dos compostos aserem analisados. Depois de lavadas com PBS, as célulasforam incubadas por 30 minutos com 25ng/ml DHE a 37°C. Ascélulas, depois de lavadas em PBS, foram analisadas porcitometria de fluxo.

Resultados:

A atividade antioxidante dos compostos V4 e V6 foiverificada utilizando-se um composto que fluoresce napresença de ânion superóxido. Os niveis intracelulares deânion superóxido foram determinados nas linhagens melan-a eTm5 tratadas ou não com os compostos V4 e V6 (40|a,g/ml)através do fluoróforo DHE. A linhagem de melanoma (Tm5)apresenta niveis intracelulares elevados de ânionsuperóxido comparado à linhagem não tumorigênica demelanócitos (melan-a) (Figura 10, superior; C) . Otratamento com o composto V6, mas não V4, resultou numaredução significativa dos niveis intracelulares de ânionsuperóxido tanto na linhagem de melanócitos quanto na demelanoma. Dados da literatura mostram que niveisintracelulares de ânion superóxido podem contribuir com aresistência das células à apoptose, portanto, suadiminuição em células de melanoma (como mostrado na Figura10, V6) poderia torná-las mais suscetíveis à morte. Nestecaso, este poderia ser um dos mecanismos pelo qual ocomposto V6 sensibiliza as células de melanoma aos efeitoscitotóxicos dos quimioterápicos bleomicina e carboplatina.

Os resultados obtidos indicam uma importantecapacidade antitumoral destes compostos derivados davanilina. Tendo em vista a grande capacidade metastática einvasiva do melanoma e a sua tolerância aos tratamentosquimio- e radioterápicos, ambos os compostos podem serpromissores para utilização em terapias tendo em vista suabaixa toxicidade.

PARTE 2c: Resultados dos ensaios antiparasitários

i) Avaliação da atividade contra tripanossomas

Avaliação da atividade citotóxica em células VERO e anti-Txypanosoma cruzi dos compostos sintetizados.

É de suma importância a escolha de modelosexperimentais para a padronização de protocolos para o usode novos compostos potencialmente terapêuticos em relação àdoença de Chagas. Em testes in vitro, é fundamental o usode formas infectivas tripomastigotas sangüíneas, em testesa 4°C (profilaxia) e em testes a 37°C (terapêuticos), emcomparação com o cristal violeta e o efeito sobre as formasamastigotas intracelular, usando células hospedeiras deescolha, em comparação com ação do benzonidazol enifurtimox. As formas epimastigotas são utilizadas emtestes iniciais de toxicidade e sensibilidade aos fármacos.

Em relação aos protótipos in vivo na padronização demodelos para a fase aguda e crônica da doença, omonitoramento de toxicidade e cura são muito importantesCoura et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 97(1), pp. 3-24,2002). Assim, a atividade antiparasitária de substânciassintéticas foi avaliada em formas amastigotasintracelulares e tripomastigotas obtidas de culturas decélulas VERO infectadas com tripomastigotas metaciclicos,forma oriunda do hospedeiro invertebrado barbeiro einfectivas para o hospedeiro vertebrado humano (Pisco etal., Eur. J. Med. Chem., v.41(3), pp. 401-407, 2006). Destaforma, a concentração de compostos sintéticos (Pisco etal., Eur. J. Med. Chem., v.41(3), pp. 401-407, 2006)capazes de provocar lise em 50% das células/ parasitas(IC50) sobre células VERO e formas epimastigotas de T.cruzi, bem como a atividade antiparasitária sobre formasamastigotas intracelulares e tripomastigotas sangüíneas,hospedeiras do homem, foram determinadas.

Análises in vivo foram elaboradas através daadministração de compostos com potencial açãoantiparasitária selecionados preliminarmente em testes invitro, administrados por via oral a camundongos infectadosexperimentalmente com T. cruzi. Os resultados sãodeterminados pela análise da parasitemia e taxa de sobrevida.

Para os ensaios pré-clinicos os modelos utilizadosconsistem, inicialmente, de células VERO (VERO Africangreen monkey kidney cells-fibroblastos) - ensaios decitotoxicidade), formas epimastigotas, amastigotas etripomastigotas sangüíneas (ensaios de atividadeantiparasitária), testados em um screening com os compostossintéticos e com bezonidazol. Em seguida, são utilizados,como modelos in vivo, camundongos infectadosexperimentalmente com T. cruzi e tratados com os compostosselecionados in vitro que mostrarem potenciais para estudosterapêuticos.

Metodologia

Este trabalho aborda a análise da atividade citotóxicae antiparasitária in vitro de quatro compostos de origemsintética (DB3A, V4, V6 e V10) em diferentes concentrações.

A atividade citotóxica foi analisada em células VERO eanti-Trypanosoma cruzi, cepa CL, para os compostos DB3, V4,V6, V10 e benzonidazol nas concentrações 5, e 10 ug/ mL,anteriormente definidas.

Cultura de células VERO

lxlO6 células foram colocadas em uma garrafa de 25 cm3com DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium -GibcoInvitrogen) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino(SFB). Esta cultura foi mantida em estufa a 37°C com 5 % deC02 até semiconfluência das células (aproximadamente 24 a36 h) . O meio foi retirado e, subseqüentemente, foiadicionado 1,5 mL de tripsina (0,25%) e a cultura foiincubada até o descolamento das células. A seguir, foramadicionados 3,5 mL de meio DMEM, e as células foramtransferidas para um tubo estéril (tipo Falcon). Emseguida, foi efetuada uma centrifugação a 3500 rpm por 5minutos e o sobrenadante foi descartado. As células foramressuspensas em DMEM e contadas em câmara hemocitométrica(de Neubauer) , acertando a concentração para 106/mL. Foramtransferidas IO5 células/poço nas placas de 24 poços numvolume final de 1 mL.

Tratamento das células VERO com os compostos sintéticos

Soluções estoque de 2-5 mg/mL dos compostos DB3A, VA,V6 e V10 foram diluidos em água, DMSO ou etanol, de acordocom sua solubilidade. Concentrações crescentes doscompostos (10, 25, 50, 100, 200 e 250 ug/mL) foramadicionadas aos respectivos poços da placa de cultura eincubados por 24 a 96 h a 37°C com 5 % de C02.

Atividade antiparasitária In vitro em culturas das formasepimastigotas de T. cruz!

Em testes iniciais de toxicidade e sensibilidade aoscompostos, foram utilizadas as formas epimastigotas de T.cruzi, cepa CL, cultivadas em meio LIT (triptose maisinfusão de figado) , suplementado com 10% de SFB por 24-48h. Em seguida, 1 mL contendo IO6 parasitas foi colocado emplacas de 24 poços, e foram adicionadas diferentesconcentrações (0,5 a 250 |j.g/mL) do composto aos respectivospoços, e as placas foram mantidas em cultura por 96 h a28°C. A atividade antiparasitária foi avaliada pelacontagem do número de parasitas em câmara hemocitométrica.Dois experimentos foram ..realizados em diferentes ocasiõescom duplicatas.

Cultura de T. cruzi formas Tripomastigotas metaciclicos

As formas tripomastigotas metaciclicos (infectivas)são obtidas em culturas no meio LIT com 5% de SFB eenvelhecidas por 11 a 15 dias. Essas formas são utilizadaspara infecção de cultura de células VERO e inoculação emcamundongos nos testes in vivo.

Obtenção das formas Amastigotas Intracelulares e tratamentocom os compostos

Células VERO foram diluídas na concentração de 103/mlem meio DMEM com 10 % de SFB, e incubadas em frascos decultura a 37 °C por 24-48h com 5 % de C02, permitindo queespraiem até atingirem um crescimento semiconfluente. Emseguida, são infectadas com IO3 tripomastigotasmetaciclicos de Trypanosoma cruzi da cepa CL. Após aincubação de 24 h para permitir a invasão das células pelostripomastigotas, o meio foi trocado e as células infectadasincubadas por 3-4 dias para ocorrer a diferenciação emultiplicação de amastigotas intracelulares. Nesse momento,as células foram tratadas com meio contendo 0,25% detripsina, recolhidas em tubo e IO3 células/mL, colocadassobre laminulas de 13 mm em placas de 24 poços, ecultivadas por 24 h a 37 °C com 5 % de C02. Em seguida,foram adicionadas à cultura diferentes concentrações dassubstâncias teste. Após 24 e 48 h de incubação, as culturasforam observadas em microscópio invertido, para avaliaçãodo efeito da concentração do composto sobre células eparasitas. Em seguida as laminulas foram lavadas com PBS,fixadas com metanol, coradas em Giembsa e montadas com colaEntelan (Invitrogen) sobre lâminas de microscopia.

Análise da atividade dos compostos

As laminulas (em duplicatas) foram analisadas emmicroscópio ótico e a atividade do composto medidaconsiderando-se: o número de células VERO, células VEROinfectadas, n° de amastigotas intra e extra-celulares etripomastigotas intra e extra-celulares. 0 Índice deInfecção foi determinado da seguinte forma: % célulasinfectadas X n° amastigotas intracelular / n° célulasinfectadas. Esses dados foram plotados em gráficos.

Atividade in vivo em camundongos

Após a análise da ativade in vitro foram selecionadosos compostos V4, V6 e V10 para realização de testes invivo, uma vez que apresentaram os melhores resultados. Paraeste modelo foram utilizados camundongos Albinos infectadoscom as formas tripomastigotas metaciclicos, que foramtratados com concentrações pré-determinadas em experimentosin vitro. Para cada experimento foram utilizados grupos decinco animais que foram tratados diariamente com DB3A oubenzonidazol, por via oral. Após 7 dias, a parasitemia foiconfirmada com pesquisa em lamina do sangue da cauda doanimal para contagem do número de parasitas. A parasitemiafoi avaliada a partir do 8o dia em dias alternados durante60 dias.

Controles. Todos os procedimentos realizados "invitro" e "in vivo" para avaliar a atividade citotóxica eantiparasitária das substâncias sintéticas foram comparadascom controles sem tratamento e com tratamento combenzonidazol, a droga de tratamento atualmente utilizadasem T. cruzi.

Testes in vitro:

Experimento 1: Células VERO infectadas com T. crazi

Controle sem droga:

Controle com droga de tratamento usual:Benzonidazol nas concentrações 5, 10, 25 e 50 ug/mL

Compostos testados:

DB3A (diluido em H20) nas concentrações 5, 10, 25 e 50ug/mL

V4 (diluido em DMSO) nas concentrações 5, 10, 25 e 50 ug/mL

V6 (diluido em H20) nas concentrações 5, 10, 25 e 50 ug/mLV10 (diluído em DMSO) nas concentrações 5, 10, 25 e 50ug/mL

Todos os experimentos foram realizados em duplicatas.

Experimento 2: Células VERO infectadas com T. cruzi

■ Controle sem droga:

■ Controle com droga de tratamento usual:Benzonidazol nas concentrações 5 e 10 ug/mL

■ Compostos testados:

DB3A (diluído em DMSO) nas concentrações 5, 7,5, 10 e 15ug/mL

V4 (diluído em DMSO) nas concentrações 5, 10, 25 e 50 ug/mLV6 (diluído em H20) nas concentrações 5, 10, 25, 50, 100 e200 ug/mL

V10 (diluído em DMSO) nas concentrações 5, 10, 25 e 50ug/mL

A tabela a seguir representa o resumo dos experimentosdescritos acima.

TABELA 4: Células VERO infectadas com T. cruzi e tratadascom diferentes concentrações dos compostos por 24 e 48horas.

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Todos os experimentos foram realizados em duplicatas.

Foram elaboradas fotos das células para documentaçãohistológica da ação citotóxica e antiparasitária obtidascom os compostos testados, as quais estão representadas naFigura 11 (A, B, C, D, E, F).

Os resultados dos experimentos in vitro tanto emanálise visual da cultura identificando as formastripomastigotas e amastigotas extracelular, bem comoanálise histológica das células VERO e formas amastigotasmostram que:

1) O composto DB3A, na concentração de 10 jag/mL temação anti- amastigota de T. cruzi semelhante à droga detratamento Benzonidazol, seguida pelos compostos V4 e V10,e o composto V6 nessa concentração não tem atividadeantiparasitária.

2) O composto DB3A tem atividade citotóxica paracélulas VERO em concentração maior que 25 jxg/mL e atividadeanti-tripomastigotas extracelulares com 10 [j,g/mL.3) O composto V6 é citotóxico em concentrações de 50jag/mL para as células VERO, mostrando evidências discretasda diminuição do número de células infectadas em culturasde células infectadas com T. cruzi. O composto V6 inibe adiferenciação das formas amastigotas intracelular emtripomastigotas, na concentração de 25 p.g/mL.

4) O composto V10 não tem atividade citotóxica nasconcentrações utilizadas nos experimentos. Em concentraçõesmaiores que 5 jxg/mL parece induzir a diferenciação dasformas amastigotas intracelulares em tripomastigotas.

5) O composto V4 em concentrações maiores que 5 |j,g/mLinduz à diferenciação das formas amastigotas intracelularesem tripomastigotas, sem atingir a células VERO.

Testes in vivo:

O composto DB3A foi utilizadoa para realização deestudos in vivo. Camundongos albinos, em grupos de 5animais, foram tratados com duas doses no Io e 4o dia apósa infecção, com benzonidazol ou DB3A, pela técnica degavagem.

As concentrações de DB3A e benzonidazol foramcalculadas pela relação: dose in vitro |j.g/mL X 10 X peso emKg do camundongo. Este cálculo determinou as concentraçõesde 2 mg, 2 mg e 4 mg por animal/dose, para benzonidazol eDB3A, respectivamente. A parasitemia foi avaliada nos dias11, 13, 15 e 18. Os gráficos representados na Figura 12mostram o perfil isolado da parasitemia dos animais frenteao tratamento realizado.

Conclusões:

Os dados de tratamento com o composto DB3A por viaoral foram similares aos do tratamento com benzonidazol, noentanto, os mesmos apresentam menor toxicidade.

Os animais não tiveram qualquer alteração quanto à suahigidez durante os procedimentos.

Finalmente podemos concluir que os compostosutilizados têm boa atividade anti-Trypanosoma cruzi e que ocomposto DB3A tem uma evidente eficiência contra as formasextracelulares do parasita, sendo um potencial fármaco paratratamento da fase aguda da doença de Chagas.

Claims

1. Processo de obtenção curcumina (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3,5-diona) ou seus derivadosalquilados de estrutura I:<formula>formula see original document page 90</formula>em queR1, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;R2, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila.em queR3, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; C0CH3 ou COPhA.em queZ, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;em queUS é irradiação ultrassônica.caracterizado por compreender colocar em contato vanilina,ou vanilina substituida ou derivados alquilados daacetilacetona e ácido clorídrico sob condições deirradiação ultrasônica.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) colocar em contato vanilina, ou vanilina prenilada,ou vanilina acetilada ou vanilina benzoilada; acetilacetonaou derivados alquilados da acetilacetona; e ácidoclorídrico sob condições de irradiação ultrassônica;b) deixar a mistura reacional em repouso;c) realizar uma extração usando uma solução dehidróxido de sódio ou hidróxido de potássio;d) Filtrar a mistura reacional a vacúo;d) Acidificar o filtrado obtido com ácido clorídricoou ácido sulfúrico com a conseqüente formação de umprecipitado;e) Filtração e lavagem do precipitado com águadestilada;f) secagem do produto sólido.

3. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que airradiação ultrassônica é realizada em uma faixa de 25 a 40KHz.

4. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que airradiação ultrassônica é realizada durante um periodo detempo que varia de 1 a 8 horas.

5. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que amistura reacional é deixada em repouso por um periodo de 8a 24 horas.

6. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que amistura reacional é deixada em repouso em uma faixa detemperatura compreendida entre 10 a 60°C.

7. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender colocarem contato vanilina, acetilacetona e ácido cloridrico sobcondições de irradiação ultrasônica para se obter 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-hepta-1,6-dieno-3, 5-diona.

8. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender colocarem contato vanilina, 0,0005 a 0,05 mol de acetilacetona e-0,02 a 20 mL de ácido cloridrico concentrado (10 A 60%) sobcondições de irradiação ultrassônica.

9. Processo de obtenção de sais metálicos de curcuminaou seus derivados de estruturas II ou III:<formula>formula see original document page 93</formula>em queR1, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;em queR2, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio ou um grupo alquila;em queZ, em cada ocorrência separada, é um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; C0CH3 ou COPh;M, em cada ocorrência separada, é um cátion metálico;em queR, em cada ocorrência separada, é CH3 ou CH3CH2caracterizado por compreender colocar um composto deestrutura I na presença de uma solução de alcóxido metálico(ROM) e de seu álcool correspondente (ROH) em relação molar1:1 ou 2:1.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) colocar um composto de estrutura I na presença deuma solução de alcóxido metálico (ROM) e de seu álcoolcorrespondente (ROH) em relação molar 1:1 ou 2:1;b) evaporar o álcool a vácuo até a formação de um salmetálico no estado sólido;c) passagem do sal metálico obtido por tamis de formaobter um pó fino facilmente solubilizável.

11. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 ou 10, caracterizado por ser utilizada umasolução metanólica de metóxido de sódio.

12. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 a 11, caracterizado por compreendercolocar 1,7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1, 6-dien-3,5-diona na presença de metóxido de sódio e metanol em umarelação molar de 1:1 de forma a se obter o sal sódico, 4-[7-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l, 6-dienil]-2-metoxi-fenolato de sódio.

13. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 a 11, caracterizado por compreendercolocar 1,7-Bis-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)hepta-1, 6-dien-3,5-diona na presença de metóxido de sódio e metanol em umarelação molar de 1:2 de forma a se obter o sal sódico,-3, 5-dioxo-hepta-l,6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato)dissódico.

14. Processo de obtenção de fenolato metálico davanilidenacetona de estrutura V: <formula>formula see original document page 95</formula> em queR1 é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;M, é em cada ocorrência separada, é um cátion metálicoestabilizante do composto sob a forma de ion fenóxido;caracterizado por compreender colocar em contatovanilidenacetona ou uma vanilidenacetona substituida deestrutura geral IV, com um alcóxido metálico (ROM) e umálcool(ROH), em relação molar 1:1.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) colocar em contato vanilidenacetona ou umavanilidenacetona de estrutura geral IV, com alcóxidometálico (ROM) e um álcool (ROH) em relação molar 1:1;b) evaporar o álcool a vácuo até a formação de um salmetálico no estado sólido;c) passagem do sal metálico obtido por tamis de formaobter um pó fino facilmente solubilizável.

16. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 ou 15, caracterizado por ser utilizadauma solução metanolica de metóxido de sódio.

17. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 a 16, caracterizado por compreendercolocar em contato 4-(4-Hidroxi-3-metoxi-fenil)-but-3-en-2-ona com metóxido de sódio e metanol em uma relação molar de-1:1 de forma a se obter 2-Metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato de sódio.

18. Processo de obtenção de um sal metálico devanilina de estrutura VI, a partir de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido <formula>formula see original document page 45</formula> em queR, é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;M, é em cada ocorrência separada, é um cátion metálicoestabilizante do composto sob a forma de íon fenóxido;caracterizado por compreender colocar em contato 4-hidroxi--3-metoxi-benzaldeído, um alcóxido metálico (ROM) e umálcool(ROH) em relação molar 1:1.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) colocar em contato 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido,um alcóxido metálico (ROM) e um álcool(ROH) em relaçãomolar 1:1.b) evaporar o álcool a vácuo até à formação de um salmetálico no estado sólido;c) passagem do sal metálico obtido por tamis de formaobter um pó fino facilmente solubilizável.

20. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 ou 19, caracterizado por ser utilizadauma solução metanolica de metóxido de sódio.

21. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 a 20, caracterizado por compreendercolocar em contato 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido commetóxido de sódio e metanol em uma relação molar de 1:1 deforma a se obter 4-formil-2-metoxi-fenolato de sódio.

22. Processo de obtenção de derivados acetilados devanilina ou uma vanilina substituída de estrutura VII<formula>formula see original document page 98</formula> Estrutura VIIem queR é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;caracterizado por compreender misturar vanilina ou umavanilina substituída, anidrido acético e acetato de sódio.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) misturar vanilina ou uma vanilina substituída,anidrido acético e acetato de sódio.b) aquecer esta mistura a uma temperatura entre 80°C e-140°C sob agitação e refluxo por um intervalo de tempo de 1a 10 horas;c) verter mistura obtida o em água com gelo obtendo-seum precipitado.

24. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 22 ou 23, caracterizado por compreendermisturar 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, anidrido acético eacetato de sódio para obter 4-formil-2-metoxi-acetato defenila.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado por compreender misturar 0,0006 a 0,06 mol de-4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, 0,02 a 2 mol de anidridoacético e 0,0012 a 0,12 mol de acetato de sódio.

26. Processo para preparar 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeido, de estrutura VIII <formula>formula see original document page 99</formula> caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) misturar 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido, carbonatode potássio e dimetilformamida entre 15°C e 65°C por 10 a-90 minutos;b) adicionar brometo de prenila e agitar a mistura dareação entre 15°C a 60°C por 4 a 15 horas;c) verter a mistura obtida em água com gelo obtendo-seum precipitado branco.d) filtrar o precipitado obtido

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado por compreender utilizar-se 0,001 a 0,1 molde- 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido com 0,003 a 0,3 mol decarbonato de potássio, 1 a 100 mL de dimetilf ormamida e-0,002 a 0,2 mol de brometo de prenila.

28. Processo para preparar cianoacetoidrazonas ederivados de estrutura X a partir de vanilina ou umavanilina substituida de estrutura IX <formula>formula see original document page 100</formula> em queR é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; CH2CH=C(CH3)2; COCH3 ou COPh.em queR1 é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) misturar vanilina ou uma vanilina substituídas deestrutura X e cianoacetoidrazida na presença de um álcoolROH;b) aquecer a mistura até a formação de um precipitado.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado por compreender misturar vanilina ecianoacetoidrazida na presença de etanol para obter 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado por compreender misturar 0,001 a 0,1 mol devanilina em 0,5 a 50 mL de etanol, e 0,001 a 0,1 mol decianoacetoidrazida em 0,5 a 50 mL de etanol.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado por misturar 3-metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzaldeido e cianoacetoidrazida na presença deetanol para obter [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado por compreender misturar 0,001 a 0,1 mol de-3-metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzaldeido em 0,5 a 50mL de etanol, e 0,001 a 0,1 mol de cianoacetoidrazida em-0,5 a 50 mL de etanol.

33. Processo, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado por compreender misturar 3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzaldeido e cianoacetoidrazida na presença deetanol para obter 3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado por compreender misturar 0,001 a 0,1 mol de-3-bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzaldeido em 0,5 a 50 mL deetanol, e 0,001 a 0,1 mol de cianoacetoidrazida em 0,5 a 50mL de etanol.

35. Processo para preparar 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazidas substituídas de estrutura XI <formula>formula see original document page 102</formula> em queZ é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um cátion metálico; COMe; COC6H5;CH2CH=C(CH3)2; grupo metila; grupo alquila.em queX é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;em queY é, em cada ocorrência separada, um átomo dehidrogênio; um átomo de bromo, um grupo nitro; um grupoamino; ou um grupo acetilamino;caracterizado pelo fato de que cianoacetoidrazonas CH-ácidas substituídas reagem com compostos carbonilicos emrelação molar 1:1 sob as condições de condensaçãoKnoevenagel e irradiação ultrasônica na presença de acetatode amônio e ácido acético.

36. Processo, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que a irradiação ultrassônicaocorre em uma faixa de 25 a 40 KHz durante um periodo detempo que varia de 5 a 80 horas.

37. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 35 ou 36, caracterizado pelo fato de quea reação ocorre em uma faixa de temperatura entre 20 e-60°C.

38. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 a 37, caracterizado por compreendermisturar 0,001 a 0,1 mol de vanilina, 0,001 a 0,1 mol de 4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianoacetoidrazida, 0,005 a-0,5 mol de acetato de amônio e 0,01 a 1 mol de ácidoacético glacial.

39. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 4-[7-(4-hidroxi--3-metoxi-fenil)-3,5-dioxo-hepta-l,6-dienil]-2-metoxi-fenolato de sódio.

40. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 3,5-dioxo-hepta--1, 6-dienil-bis(2-metoxi-fenolato) dissódico.

41. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi- benzaldeído caracterizado pelo fato de ser 2-metoxi-4-(3-oxo-but-l-enil)fenolato de sódio.

42. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 4-formil-2-metoxi-fenolato de sódio.

43. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 4-formil-2-metoxi-acetato de fenila.

44. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 3-metoxi-4-(3-metil-but-2-eniloxi)benzaldeido.

45. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser 4-Hidroxi-3-metoxi-benzilideno-cianacetoidrazida.

46. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido caracterizado pelo fato de ser [3-Metoxi-4-(3-metilbut-2-eniloxi)-benzilideno]-cianacetoidrazida.

47. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeido derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeidocaracterizado pelo fato de ser (3-Bromo-4-hidroxi-5-metoxi-benzilideno)-cianacetoidrazida

48. Composto derivado de 4-hidroxi-3-metoxi-benzaldeído caracterizado pelo fato de ser 2-Ciano-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)-(4-hidroxi-3-metoxi-benzilideno)-acrilidrazida.

49. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um ou mais compostos obtidos pelos processosconforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1a 38 e/ou conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 39 a 48, e um ou mais dentre um veiculo,excipiente, diluente ou solvente fisiologicamenteaceitáveis.

50. Uso de um ou mais compostos obtidos pelosprocessos conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 38 e/ou conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 39 a 48, caracterizado pelo fatode é para a manufatura de um medicamento.

51. Uso, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que é para a manufatura de ummedicamento para uso no tratamento, profilaxia ou prevençãode doenças neoplásicas, lesões metastáticas, proliferativase/ou degenerativas, de patologias imunossupressoras,imunodeficientes e degenerativas e de parasitoses diversasem humanos e/ou animais.

52. Uso, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento ouprevenção de doenças neoplásicas, prevenção de lesõesmetastáticas, proliferativas e/ou degenerativas.

53. Uso, de acordo com a reivindicação 52,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção de doenças neoplásicas provocadaspor câncer de pulmão, carcinoma de mama e mama resistente amúltiplas drogas, cânceres de pele não melanoma emelanomas, leucemias linfóides, mielóides agudas ecrônicas, eritroleucemia, mielodisplasias, cânceres decólon, ovário, útero, rim, pâncreas, próstata, sarcomas detecido mole, hepatocarcinomas, osteosarcomas, sistemanervoso central, neuroblastomas, astrocitomas, orofaringe,tireóide, gástrico, próstata e anexos do aparelhoreprodutor masculino.

54. Uso, de acordo com a reivindicação 51,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção de patologias imunossupressoras,imunodeficientes e degenerativas.

55. Uso, de acordo com a reivindicação 54,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção de doenças neurodegenerativas.

56. Uso, de acordo com a reivindicação 55,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção da Doença de Alzheimer.

57. Uso, de acordo com a reivindicação 54,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção de parasitoses diversas.

58. Uso, de acordo com a reivindicação 57,caracterizado pelo fato de que é para o tratamento,profilaxia ou prevenção de parasitoses humanas e/ou animaisprovocadas por protozoários nas formas teciduais esangüíneas e protozoários intestinais, dos gênerosLeishmania, Plasmodium, Trypanosoma, Toxoplasma, Giardia,Entamoeba, bem como helmintos pertencentes aos gênerosTaenia, Schistosoma, Ancylostoma, Necator, Ascaris,Enterobius, Wuchereria, em suas diferentes manifestaçõesclinicas.

59. Uso de um ou mais compostos obtidos pelosprocessos conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 38 e/ou conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 39 a 48, caracterizado pelo fatode que é para aplicações como agentes anti-oxidantes ecaptadores de radicais livres.

60. Uso de um ou mais compostos obtidos pelosprocessos conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 38 e/ou conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 39 a 48 caracterizado pelo fatode que é para a manufatura de um produto cosmético para usono tratamento e/ou prevenção do envelhecimento da pele.

61. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um ou mais compostos obtidos pelos processosconforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1a 38 e/ou conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 39 a 58, e carboplatina, e um ou maisdentre um veiculo, excipiente, diluente ou solventefisiologicamente aceitáveis.

62. Uso de um ou mais compostos obtidos pelosprocessos conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 38 e/ou conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 39 a 48 caracterizado pelo fatode que é para potencializar os efeitos antimurais decarboplatina.

63. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender um ou mais compostos obtidos pelos processosconforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1a 38 e/ou conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 39 a 48, e bleomicina, e um ou maisdentre um veiculo, excipiente, diluente ou solventefisiologicamente aceitáveis.

64. Uso de um ou mais compostos obtidos pelosprocessos conforme definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 38 e/ou conforme definido em qualqueruma das reivindicações de 39 a 48 caracterizado pelo fatode que é para potencializar os efeitos antimurais debleomicina.