BRPI0721254A2

BRPI0721254A2 - medicamento para a profilaxia, supressço ou eliminaÇço de reaÇÕes alÉrgicas, medicamento para a troca de balanÇo th1-th2 no corpo humano em direÇço a uma aumento de th1 e/ou a reduÇço de th2, mÉtodo para o preparo de um medicamento para a profilaxia, supressço ou eliminaÇço de reaÇÕes alÉrgicas em humanos, mÉtodo para a produÇço de um medicamento para a troca de balanÇo th1-th2 no corpo humano em direÇço a um aumento de th1 e/ou a uma reduÇço de th2, uso de bactÉria gram-positiva, probiàtica tais como, lactobacilos e bifidobactÈria, e alimento ou suplemento de alimento

Info

Publication number: BRPI0721254A2
Application number: BRPI0721254-2A
Authority: BR
Inventors: Juergen Schrezenmeir
Original assignee: Juergen Schrezenmeir
Priority date: 2007-02-22
Filing date: 2007-02-22
Publication date: 2013-01-15
Also published as: AU2007347318A1; KR20100014523A; EP2117567A1; DE112007003464A5; EP2117567B1; CN101678052A; WO2008101450A1; US20110020283A1

Abstract

MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSçO OU ELIMINAÇçO DE REAÇÕES ALÉRGICAS, MEDICAMENTO PARA A TROCA DE BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EM DIREÇçO A UM AUMENTO DE TH1 E/OU A REDUÇçO DE TH2, MÉTODO PARA O PREPARO DE UM MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSçO OU ELIMINAÇçO DE REAÇÕES ALÉRGICAS EM HUMANOS, MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE UM MEDICAMENTO PARA A TROCA DO BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EM DIREÇçO A UM AUMENTO DE TH1 E/OU A UMA REDUÇçO DE TH2, USO DE BACTÉRIA GRAM-POSITIVA, PROBIàTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E BIFIDOBACTÉRIA, E ALIMENTO OU SUPLEMENTO DE ALIMENTO. O medicamento para a profilaxia, supressão ou eliminação de reações alérgicas em humanos no qual a bactéria gram-positiva, probiôtica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, está presente como o princípio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genâmico dele.

Description

"MEDICAMENTO PARA A

PROFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS, MEDICAMENTO PARA A TROCA DE BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EMi DIREÇÃO A "UM AUMENTO DE THÍ E/0'U A REDUÇÃO DE TH2, MÉTODO PARA O PREPARO DE UM MEDICAMENTO PARA A PRÓFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS EM HUMANOS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE' UM MEDICAMENTO PARA A ' TROCA DO BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EM DIREÇÃO A UM AUMENTO DE ThI E/OU A UMA REDUÇÃO DE TH2, USO DE BACTÉRIA GRAM-' POSITIVA, PRÓBIÓTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E

t ι

BIFIDÒBACTÉRIA, E ALIMENTO OU SUPLEMENTO DE ALIMENTO".

A invenção relata um

medicamento para a profilaxia, supressão, ou eliminação de reações alérgicas em humanos. As reações alérgicas à

substâncias tais como pólens (febre do feno) ou outros componentes de plantas, pele de gato e pêlos de outros animais, poeira incluindo a queda de ácaros que a poeira de casa contém, veneno de inseto, alimentos tais como leite ou nozes, ou perfumes e outros componentes de cosméticos são bem conhecidos e um problema em crescimento para o número crescente de pessoas.

A causa disto é que o sistema imune do próprio corpo reage às referidas substâncias como se elas fossem realmente invasoras nocivas, tais como os parasitas. Além disso, a extensão da reação é excessiva.

No decorrer da resposta auto- imune, os glóbulos brancos, os linfócitos, desempenham um papel importante. Uma forma de linfócitos são os linfócitos T ou células de ajuda (células TH) , que secretam vários mediadores, citocinas, para o controle de respostas imunes. Existem - primeiramente - citocinas que reduzem ou previnem as reações alérgicas e - secundariamente - outras citocinas que causam reações inflamatórias, ou seja o mesmo que alérgico, ao apresentarem um efeito estimulante como moderadores em células autoras tais como as células mastro. De acordo com este efeito, todas as células TH são classificadas em dois grupos, nomeadas células ThI e TH2. As células ThI incluem citocinas antialérgicas, tais como y- interferona (IFN-γ) ou interleucina-2 (IL-2). As células TH2 abrangem mediadores que causam reações alérgicas, tais como interleucinas IL-3, IL-4, IL-5 e IL-IO. A Interleucina-4 estimula as células mastro a formarem o anticorpo imunoglobulina tipo E (IgE), que está presente em grandes quantidades nas alergias.

A relação entre o número de células ThI e células TH2 é crucial para a resposta imune do corpo para a patogenia invadida. Isto é significativamente menor em pacientes com uma reação alérgica do que em pessoas saudáveis. É conhecido que recém-nascidos ou bebês prematuros também possuem um valor muito baixo de modo que o organismo da mãe não ataca erradamente as células da criança.

0 balanço TH1-TH2 é

conseqüentemente uma característica importante de cada ser humano e isto também é de modo crescente bem sabido por um público maior.

É geralmente suposto que as alterações na flora intestinal e/ou a falta de estimulação bacteriana bem cedo na infância, como um resultado de higiene excessiva e uma redução nas doenças infecciosas, cria a predisposição para uma divergência do valor do balanço, e, portanto dá origem à ultra-sensibilidade alérgica.

Mesmo na infância,

conseqüentemente, a invasão de alérgenos pode causar reações inflamatórias, tais como coriza e mucosa inchada, e até aumento da temperatura do corpo.

Numerosos medicamentos são conhecidos para combater ou suprimir os sintomas que ocorrem. Eles têm a desvantagem que são freqüentemente muito caros, causam um número de efeitos colaterais indesejáveis e devem ser continuamente usados pelo paciente.

Contra este histórico, este é o objeto da invenção para identificar um principio ativo que já é conhecido e pode ser produzido em uma escala industrial, este é então rapidamente disponível e processável, que gera baixos custos, que já ocorrem em quantias marginais mesmo no âmbito de pessoas saudáveis, e é conseqüentemente compatível com o organismo humano em certos limites, e que não ataca as reações alérgicas em determinado nível de sintomas porém em um estágio da causa por meio de mediadores.

Para alcançar este objetivo, a invenção propõe um medicamento em que a bactéria probiótica gram-positiva, por exemplo Lactobacilos e Bifidobactéria estão presentes assim como o principio ativo, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou DNA genômico dele.

O atributo "probiótico" é explicado em Brockhaus como a coexistência de dois organismos para o beneficio de um parceiro sem danificar o outro. No caso desta invenção, um segundo organismo, a saber a bactéria, é de uso ao organismo humano. A bactéria por si só não é nociva, e conseqüentemente permanece viável. Inclui aquele fato que, com administração oral, tantas bactérias quanto possível passam ilesas através do estômago com os seus ácidos, enzimas e outros agentes digestivos. O termo "probiótico" também

implica que os efeitos desvantajosos no ser humano são desprezíveis ou pelo menos muito pequenos, e que os efeitos que ocorrem predominantemente são classificados como úteis.

O termo "probióticos"

significa preparações de microorganismos que possuem efeito favorecedor à saúde no organismo hospedeiro quando consumidos em quantias suficientes. A bactéria ácida láctica probiótica (Lactobacilos) tem sido utilizada por tempo mais longo. Os probióticos podem ser administrados como alimentos especialmente preparados ou na forma de medicamentos.

Os efeitos favorecedores à saúde de probióticos possuem força específica em cada caso. As bacterianas forças bacterianas probióticas são conhecidas como, de acordo com a medicina com base na evidência, demonstravelmente promovem a digestão de lactose, eliminam microorganismos patogênicos no intestino e limitam ou eliminam a diarréia.

Outras forças bacterianas

aumentam a proteção contra a infecção, diminuem o nivel de colesterol e reduzem o risco de câncer no cólon.

Estes efeitos têm sido demonstrados com sucesso in vitro antes de sua aplicação comum. É, portanto, legitimado para validar o efeito favorecedor à saúde deste invenção com uma série de experimentos laboratoriais.

Por meio dos experimentos descritos abaixo, foi medido que as citocinas de uma fração de células sangüíneas humanas (PBMC - células mononucleares sangüíneas periféricas) são liberadas mediante condições particulares. Para uma série de experimentos, estas células sangüíneas foram isoladas do sangue de humanos saudáveis e para uma segunda série de experimentos do sangue de pacientes alérgicos que eram alérgicos à poeira de casa.

Para estimulação, enterotoxina estafilocócicas tipo A (SEA) e em outras séries Dermatofagóides (Dpt) foram acrescidos pelo fato de que quem sofre alergia à poeira de casa normalmente também é alérgico a estes. A invasão de uma substância alergênica é estimulada por meio disso.

A γ-interferona foi medida como uma substituta para a reação ThI . 0 modelo TH2 foi registrado por meio de interleucinas secretadas 4 e 5 (IL-4 e IL-5) .

Os fatores que podem estar envolvidos no aumento da difusão de doença alérgica são considerados para abranger a modificação da flora intestinal ou a falta de estimulação bacteriana durante a infância. As citocinas TH2 aumentam a produção de IgE e estimulam as células mastro. Por outro lado, γ-interferona (IFN-γ), uma citocina TH1, contribui para a eliminação da síntese IgE. Desta maneira, o desequilíbrio na expressão "TH1 para TH2" pode contribuir para a causa e manutenção de doenças alérgicas. A bactéria lactobacilos, que forma parte da microflora natural dentro do intestino é considerada como possibilidade para reduzir a freqüência e a gravidade de manifestações alérgicas e modular a resposta TH1/TH2. 0 mecanismo funcional ainda não está esclarecido.

Meta: Nossa meta

experimentosal era determinar a influência da bactéria probiótica na produção de citocinas do tipo ThI e TH2 de humanos saudáveis e pacientes com alergias a ácaros da poeira de casa e explicar a base molecular dos efeitos do DNA genômico bacteriano na resposta TH1/TH2 para a enterotoxina estafilocócica A (SEA) e Dermatofagóide pteronissinus (Dpt) e compará-los com os efeitos da bactéria existente. Métodos: PBMCs de pacientes com alergias a ácaros da poeira de casa comparados com aquelas de doadores saudáveis foram incubadas por 24 e 48 horas com ou sem SEA e alérgenos Dpt. 0 efeito da pré-incubação com bactéria probiótica existente, assim como a influência de seu DNA genômico, que foi simultaneamente acrescido ao em cultura e incubado por 24 horas, foi avaliado pela medida da produção de citocina Th 1/Th2 .

Resultados

A bactéria probiótica gram- positiva testada e viável e seu DNA genômico mostram que eles eliminaram SEA e a secreção estimulada Dpt de citocinas Th2 (EL4 e EL5) e estenderam a estimulação de IFN-γ. Este efeito dependeu tanto da dosagem quanto da força bacteriana escolhida. Nenhuma inibição significativa foi causada pelo controle de Escherichia coli TGl gram-negativa. A bactéria probiótica reduziu a produção de citocinas IL-4 de PBMCs alérgicas, particularmente após a nova estimulação com SEA e Dpt, ainda mais efetiva do que em humanos saudáveis. Por outro lado, a inibição IL-5 em indivíduos saudáveis foi mais claramente manifestada. O DNA bacteriano também eliminou a liberação de IL-4 e IL-5, mas apenas para algo de menor extensão. A inibição de EL4 foi mais pronunciada no caso de PBMCs de indivíduos alérgicos do que para indivíduos saudáveis, embora este fosse o caso para EL5. Resumo:

A resposta TH1/TH2 para alérgenos, modulada pela bactéria probiótica testada, bem como seu DNA genômico, mostrou uma atividade anti-TH2. Consequentemente várias forças de bactéria probiótica e seu DNA genômico podem ser úteis na prevenção de doenças alérgicas. 1. Introdução

0 preceito das causas de doenças alérgicas permanece incerto, ainda que estudos experimentos humanos mostrem que as condições genéticas contribuem para a resposta imune da mucosa intestinal e a bactéria da enterite contribui para a patogênese de doenças alérgicas. Alguns estudos propõem que as citocinas TH2 citocinas, particularmente IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, desempenhem papéis essenciais na patogênese através do regulamento da produção de IgE e estimulação de células mastro. A produção de IL-4, IL-5, IL-9 ou IL-13 pelos linfócitos Th2 em um alto nivel pode desempenhar um papel decisivo no desenvolvimento e progresso de respostas alérgicas; em contrapartida, a IFN-γ, uma citocina então chamada de ThI , possui a capacidade de eliminar a síntese IgE. Expressões IFN-γ defeituosas são freqüentemente vinculadas a alergias mediadas por IgE. 0 desregulamento no balanço de citocinas TH1/TH2 pode a uma vasta extensão ser o responsável pela causa e manutenção de processos inflamatórios alérgicos em doenças tais como asma bronquial ou dermatite atópica.

Tinha sido proposto que, particularmente, o perfil da citocina TH2 de bebês recém- nascidos; crescidos, que normalmente reduz o balanço Th1/Th2; regulamentos de higiene moderna; esterilização intensiva de alimentos e/ou alterações na flora intestinal de bebês recém-nascidos causadas pela alimentação em formulação artificial desempenha papéis maiores nas alterações no balanço TH1/TH2. 0 conhecimento adquirido neste campo preparou a área para um número de novas terapias. Uma vez que a abordagem é simplesmente para usar a bactéria probiótica para reproduzir aquelas citocinas que não estão sendo formadas em quantias suficientes ou para reduzir aquelas citocinas que estão sendo formadas em uma escala muito gree por causa da bactéria probiótica há modulação do balanço TH1/TH2.

Bactérias probióticas são normalmente classificadas como seguras e têm sido consumidas por humanos e animais. As bactérias Lactobacilos e Bifiobactéria são os microorganismos mais comuns no trato gastrointestinal humano. 0 interesse está crescendo no efeito estimulante imune de bactéria probiótica, particularmente seu efeito antialergênico. 0 importante papel da bactéria em doenças alérgicas aumenta a possibilidade de prevenção ou tratamento destes desvios por meio da modificação da microflora intestinal através de tratamento probiótico. A bactéria probiótica pode agir diretamente ou indiretamente pela modulação da flora endógena do sistema imune. Propôs-se o uso da nova expressão "imunobióticos" para bactérias que promovem a saúde por meio do sistema imune da mucosa, ao contrário daquelas com apenas um efeito local. Várias respostas imunes a probióticos têm sido relatadas, tais como a secreção de citocinas promovendo inflamação, a reprodução de linfócitos e a formação de óxidos de nitrogênio. Além disso, tem sido apresentado que células inteiras, alguns componentes solúveis que foram secretados por LGG ou DNA de LGG, componentes da parede da célula tais como peptidoglican ou ácidos lipoteiquiônicos de Lactobacilos causam respostas imunes inflamatórias e atividades imunobióticas. Foi demonstrado que não apenas a bactéria existente, que é administrada no trato intestinal, mas também o DNA probiótico isolado é ativo, mesmo se for injetado subcutaneamente.

Tem sido relatado que temas CpG desnaturados em DNA bacteriano são mitogênicos para células B de camundongos e causam a produção de citocinas inflamatórias por macrófagos e células dendróides (DC). E os oligodeoxinucleotideos CpG (ODNs) e DNA bacteriano causam a produção de interleucina 6 (IL-6), interleucina 12 (IL-12) e interferona-γ (IFN-γ) por linfócitos B e células naturais matadoras de camundongos. Além disso, o DNA CpG induz a propagação de células Bea divisão de células T não influenciadas e ativadas em células de ajuda Tl e 2. ODNs CpG específicos (tipo D) são particularmente eficientes ao ativar células NK e a produção de α-interferona (IFN-α) por meio de células dendróides plasmacitóides, enquanto outros ODNs (tipo K) são particularmente efetivos ativadores de células B. Recentemente descobriu-se que o receptor como uma badalada 9 (TLR9) desempenha um papel crítico na ativação celular da causa por DNA CpG. Os experimentos que são

realizados em camundongos que foram sensibilizados à ovalbumina mostraram que, após a administração de bactéria ácida lática no estômago, o dependente do perfil de IgE e Th2 particular, respostas inflamatórias foram suprimidas. Além disso, os relatórios mais recentes propõem que os lactobacilos Ramnáceas GG podem reduzir os sintomas de doenças alérgicas em indivíduos humanos, de maneira semelhante a como isto pode causar respostas imunes congênitas pela ativação de fatores de transcrição, que estão integrados na função de sinalização de citocinas. A administração desta força bacteriana a mães em período de amamentação e bebês recém-nascidos induzem à supressão do risco de eczema atópico em bebês. Experimentos in vitro têm mostrado que o estímulo de PBMCs ou monócitos de doadores saudáveis por uma variedade de bactérias ácidas láticas induzem a secreção de IL-12, que é uma pró-citocina ThI essencial e está envolvida no controle do desenvolvimento de doenças alérgicas. Os mecanismos funcionais pelos quais o LAB influencia a produção de citocinas TH2, que são responsáveis pelo início do desenvolvimento de doenças alérgicas, continuam a ser identificados. Considerando a presença de seqüências de DNA desnaturados (temas CpG) nos cromossomos do DNA de Bifidobactéria e Lactobacilos, nós decidimos neste estudo examinar o efeito de quatro forças da bactérias Lactobacilos e Bifidobactéria, bem como seu DNA cromossômico na produção de IL-4, IL-5 e IFN-γ por PBMCs estimuladas por SEA e Dpt de indivíduos saudáveis e indivíduos teste alérgicos. As bactérias Lactobacilos e Bifiobactéria investigadas mostram atividades anti-TH2 e a pró-citocina TH1, IFN-γ. 2. Métodos e Material 2.1. Cultura bacteriana

Neste estudo, as seguintes forças bacterianas foram usadas:

Lactobacilos ramnáceas GG (92164), Lactobacilos gasseri (PA 16/8), Bifidobactéria ■bifidum (MG 20/5), Bifidobactéria longum (SP 07/3) e LgsB.bB.I (uma mistura de Lactobacilos gasseri, Bifidobactéria bifidum e Bifidobactéria longum). As forças de Bifidobactéria e Lactobacilos foram utilizadas (um inoculador de forças de 0,02% que tinha sido armazenado anaerobicamente a 80°C negativos em 30% de glicerol) (sistema anaeróbixo, MACS -VA500 Estação de trabalho com câmara de vácuo e câmara de vácuo Don Whitley Scientific Limited UK em um meio MRS (MRS; Merck, Darmstadt, Alemanha), suplementado com 0,05% de cisteina L a 37°C por 16 horas. Antes de colher e lavar em PBS, soluções consecutivas de culturas preparadas recentemente foram aplicadas a placas contendo meio ágar MRS e cultivadas para contagem. A contagem das unidades formando colônias (CFU ml"1) dos grupos de bactéria probiótica foi derivado pela aplicação repetida de soluções por 10 vezes para as placas. As placas foram incubadas anaerobicamente a 37 0C por 24-48 horas. As bactérias foram então lavadas três vezes com PBS e ajustadas a concentrações finais de IO10, IO7 e IO1 CFU ml"1. A

o

suspensão bacteriana foi armazenada a -80 C em uma solução MRS contendo 30% de glicerol. Para todas as bacterianas forças bacterianas, curvas normais de crescimento foram preparadas pelo registro de QD600 vs contagens de placa de ágar de culturas dissolvidas repetidamente e recentemente preparadas. Para calcular a soma de bactérias viáveis em culturas preparadas recentemente, as curvas foram ajustadas com listagens de computador logaritmicas que obtiveram todos os valores acima de 98,5% (dados não apresentados). E. coli gram-negativo TGl (número do produto BU-00035) foi adquirido de Maxim Biothec Inc. e cresceu em meio LB por 18 horas a 370C e foi colhido conforme indicado acima. 2.2. Preparação de DNA genômico de bactérias 0 DNA genômico de culturas

puras de bactérias probiótica foi purificado pela extração com álcool fenol/clorofórmio/isoamíIico (25:24:1). Para obter rompimento celular completo, o método foi levemente modificado ao estender lises enzimáticas de 2 a 7 horas. Subseqüentemente o DNA foi precipitado, esterilizado com etanol frio (-20°C) de 95% e dissolvido em água duplamente destilada (ddH20) . A concentração e pureza de todas as preparações de DNA derivaram a partir da medida da absorção OD26O ou razões OD26o/2so e OD26o/23o· Somente DNAs com razão OD26o/28o >1,8 e OD260/23o >2 foram utilizados. Os DNAs foram purificados a partir da endotoxina com TritonX-114D e também investigados por seu conteúdo de lipopolisacarideos (LPS) usando teste dos amebócitos de limulo (QCL-1000, CAMBREX, Alemanha) . 0 conteúdo de LPS foi menor do que 0,01 U da endotoxina pg"1.

Para determinar a bioatividade de LPS ou outros contaminantes bacterianos nas preparações do DNA, o DNA foi degradado com DNase I (Sigma) . Não houve supressão demonstrável de citocinas pelas PBMCs abaixo do nível da base quando o DNA degradado com uma concentração de 75μΐΐΐ1_1 foi adicionado (medido antes do tratamento de rompimento de DANN).

2.3. Isolamento e cultura de PBMC

2.3.1. Pré-incubação de PBMCs com bactérias probióticas e outro estímulo com SEA e Dpt

Oito pacientes alérgicos e oito doadores saudáveis foram recrutados para o estudo. Todos os indivíduos teste submetidos a contratos verbais e escritos antes do registro para este estudo, conforme solicitado pela comissão de ética da Universidade de Kiel sobre o uso de indivíduos humanos em testes na pesquisa. 0 sangue venoso foi direcionado dos doadores em Vacuteineres heparinizados e diluídos 1:1 com 0,9% NaCl. Então as células mononucleares sangüíneas periféricas frescas (PBMCs) de sangue diluído heparinizado foram isoladas pela centrifugação de acordo com o aumento da densidade (1,077 g ml"1) (Lymphoprep, AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Noruega). As células foram emulsifiçadas em meio de cultura RPMI-1640 (Sigma, Munique, Alemanha), suplementadas com 10% (v/v) de soro bovino fetal ativado por calor (56°C, 1 hora), Gentamicina (50μg ml"1) (Sigma), penicilina estreptomicina (1%) e solução de piruvato de sódio (0,23mmol l"1) (Sigma) (ordenado como o meio completo) . Todos os componentes foram endotoxinas testadas adquiridas, conforme exigido por LAL. As células foram cultivadas em meio completo em uma concentração de células 2*106 ml"1 em veias com 24 fontes. Ao mesmo tempo, para estimulação, quatro forças de bactérias probióticas existentes e bactérias gram negativas (E. coli TGl) foram adicionadas às culturas. Conforme solicitado para contagens bacterianas, o probiótico e as outras bactérias eram viáveis no momento da adição às culturas. As células que foram cultivadas somente com o meio servido como um controle não-estimulado. Os testes de dependência na dosagem, realizados para IL-4 e IL-5 como culturas com um volume máximo de 200 μΐ/fonte, foram preparados em placas de microtitulação de 96 fontes fundas e planas (Nune, Roskilde, Dinamarca) com 2xl06 células mononucleares e 5xl04, 5xl05, 2x106, 5xl06, 2x107, e 5xl07 bactérias/ml correspondendo a 0,025, 0,25, 1, 2, 5, 10 e 25 bactérias por célula mononuclear. Elas indicam que a supressão máxima com 2xl07 CFU bactérias/ml, correspondendo a uma razão de 10:1 (bactérias para PBMC) foi observada. Esta concentração foi usada em outros experimentos. A razão máxima entre PBMC e bactérias (razão de bactérias para PMBC) foi 10:1 para doadores saudáveis e para pacientes alérgicos. Para tratamento de controle, apenas o meio de cultura foi acrescentado para a solução PBMC. Então, e após três horas de incubação a 37°C, PBMCs foram ainda estimuladas com SEA {2]xq ml"1) ou Dpt (2000SQ-E ml-1 equivalente a uma dose de 2}ig ml"1) e em 5% de incubadora umedecida de CO2 a 37 0C por 48 horas. Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Após incubação por 48 horas, o meio de cultura foi centrifugado a 4°C por 20 minutas a l.OOOxg. O sobrenadante livre de célula foi esterilizado ao passar através de um filtro com tamanho de poro de 0,2μιτι (Millipore, Alemanha) e armazenado a -80°C até o seu uso. A viabilidade das células foi determinada antes e após a incubação com bactérias por meio da exclusão por trypan blue.

2.3.2. Estimulo com SEA, LPS e DNA genômico

PBMCs frescas de sangue periférico heparinizado de doadores saudáveis foram isoladas pela centrifugação de acordo com o aumento da densidade (1, 077g ml"1) (Lymphoprep, AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Noruega). As células foram emulsifiçadas em meio de cultura RPMI-164 0 (Sigma, Munique, Alemanha) , suplementadas com 1.0% (v/v) de soro bovino fetal ativado por calor (56°C, 1 hora), Gentamicina (50pg ml"1) (Sigma), penicilina estreptomicina (1%) e solução de piruvato de sódio (0,23 mmol l"1) (Sigma) (meio completo). Todos os componentes foram endotoxinas testadas adquiridas. Todos os testes de dependência na dosagem, realizados para IL-4 e IL-5 como culturas com um volume máximo de 200μl/fonte, foram preparados em placas de microtitulação de 96 fontes fundas e planas (Nune, Roskilde, Dinamarca) com 2xl06 células mononucleares e 5, 10, 25, 50, 75 e IOOyg de DNA genômico por ml. Elas indicam que a supressão máxima com 75yg ml"1 de DNA poderia ser observada. Esta concentração foi usada em outros experimentos. As células foram cultivadas em um meio completo em uma concentração de células 2*106 ml"1 em uma placa com 24 fontes (Nune, Roskilde, Dinamarca) . Ao mesmo tempo em que o DNA genômico (75μg ml"1) de bactérias probióticas, o DNA genômico do bezerro (75μg ml"1 Sigma, Munique, Alemanha) SEA (2pg ml"1) e LPS de E. coli (20pg ml"1, Sigma, Munique, Alemanha) foram acrescentados à cultura e incubados a 37 0C, 5% de CO2 umedecido por 2 4 horas. Todos os experimentos foram realizados triplicamente. Após incubação de 24 horas, os sobrenadantes livres de célula foram coletados e centrifugados para IOOOxg por 20 minutos a 4°C, e esterilizados ao passar através de um filtro com 0,2μπι poros (Millipore, Alemanha) e armazenados a -80°C em alíquota até a sua análise. A viabilidade das células foi determinada antes e após a incubação com DNA genômico por exclusão por trypan blue. Em todos os experimentos 95 a 98% das PBMCs eram viáveis. Os experimentos de dependência na dosagem, que foram realizados por todas as citocinas indicadas em que a máxima supressão é observada a uma concentração de 75yg ml"1. Esta concentração foi utilizada em outros experimentos.

2.4. Investigação das citocinas por meio de análise imunoabsorvente ligada à enzima (ELISA)

A concentração de IL-4, IL-5 e IFN-γ foi quantificada em sobrenadantes livres de células por meio de ELISA especial (conjunto humano BD OptEiA™ IL-4, e IFN-γ, Heidelberg, Alemanha) . Os limites de descobrimento da investigação foram de 0,5pg ml"1 para IL-4, 0,5yg ml"1 para IL-5 e Ipg ml"1 para IFN-γ. Os valores da densidade ótica de amostras foram lidas a 450 e 570nm em um leitor de placa ELISA. Os experimentos foram repetidos pelo menos duas vezes e realizados por três vezes.

2.5. Análise estatística

Os dados experimentais do teste foram a produção por meio de ± S.E.M e uma análise estatística não-parametrizada com teste T foi realizada. Os valores P com menos de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados

Lactobacilos e Bifidobactéria suprimem IL-4 e IL-5 e causam produção de IFN-γ por intermédio de PBMCs estimulados por SEA ou Dpt de doadores saudáveis. Mostrou-se que superantigenos estreptocócicos causam uma alta concentração de IL-4 e IL-5 a partir das PBMCs de doadores saudáveis e as bactérias ácidas láticas matadoras a calor eram capazes de suprimir a secreção de um perfil de citocina do tipo 2. Além disso, um estudo apresentou que pacientes alérgicos tinham um conteúdo em aumentado de IL-4 e IL-5. Dermatofagóide pteronissinus, Dpt (a 83,8%) e Dermatofagóide farinae, Df (a 78,4%) são os alérgenos causativos mais comuns em pacientes com rinite alérgica. Agora confirmamos estas observações com outro superantigeno: enterotoxina estafilocócicas A (SEA) e Dpt. Quando as forças existentes

das bactérias Lactobacilos e Bifidobactéria forem pré- incubadas com PBMCs, a produção resultante de IL-4 por SEA e Dpt foi muito reduzida em comparação com aquela que foi causada pelo controle positivo (sem pré-incubação com os Lactobacilos e Bifidobactéria) . De maneira interessante, nenhuma supressão significativa foi observada quando as PBMCs foram pré-incubadas com forças de controle gram- negativas TGl (Figura 1) . Embora nem as quatro forças de Lactobacilos e Bifidobactéria nem a produção de IL-4 básica causada por TGl, todas as quatro forças induziram a produção de IFN-γ. Quando as PBMCs com SEA e Dpt foram estimuladas, a concentração das liberações de IFN-γ era, além disso, mais elevada. Um efeito sinergético foi observado não apenas com as bactérias Lactobacilos e Bifidobactéria mas também com TGl. Consequentemente os Lactobacilos e Bifidobactérias se mostram capazes de influenciar ambas as secreções das citocinas ThI e TH2 em direções opostas. A produção de citocinas

depende do tempo e da dosagem.

Outros experimentos realizados com quatro forças de Lactobacilos e Bifidobactérias mostram que a supressão de citocinas TH2 depende do tempo e da dosagem. Quando as PBMCs foram estimuladas com bactérias probióticas antes da adição de SEA, a influência inibidora do crescimento sobre a produção da citocina TH2 aumenta com a razão de bactérias para PBMC. O inibidor de crescimento máximo foi observado a bactérias 2xl07 CFU ml"1, correspondendo a uma razão de 10:1 (bactérias para BMC) (Figura 2, AeB).

Este efeito também foi observado para a produção de IL-4 e IL-5. Por exemplo, para forças L. gasseri, a porcentagem da inibição de crescimento da produção de IL-4 teve elevação de 40,19% ± 3% (razão 1:1) a 54,22% ± (razão 10:1) em resposta a SEA. A porcentagem da supressão da produção de IL-5 cresceu de 43,77% ±8% (razão 1:1) para 73,17% ± 5% (razão 10:1). Além disso, a porcentagem da inibição da produção de IL-4 em resposta a Dpt na PBMC de doadores saudáveis aumentou de 34,61% ± 4% (razão 1:1) para 47, 33% ± 5% (razão 10:1). A porcentagem da inibição de crescimento da produção de IL-5 cresceu de 45,72% ± 4% para 77,59% ± 6%. Ao contrário da citocina TH2, nossas forças testadas induziram uma produção básica de IFN- Y, que parece depender da razão bactérias/célula. É notável que seja possível mostrar que as bactérias probióticas influenciam muito a produção de IFN-γ como uma resposta para o estímulo com SEA (Figuras 1 e 2, C) .

Efeito de inibição de crescimento dependente do tempo de bactérias probióticas existentes na produção de IL-4 e IL-5

As PBMCs de doadores saudáveis (n= 4 a 2x106 ml"1) foram estimuladas com SEA (2ug/ml) . As células mononucleares eram pré-incubadas por 1,3 e 5 horas com forças L. GG (razão 10:1) antes da incubação antes do estímulo SEA ou elas eram simultaneamente estimuladas com forças L. GG e o superantígeno ou L. GG foi adicionado 1,3 e horas após o estímulo SEA, e as culturas de célula foram pré-incubadas além do período de 24, 48 e 72 horas. Nos períodos de tempo mencionados acima, os sobrenadantes livres de célula foram colhidos e depois centrifugados e armazenados para esterilização a -20°C. a concentração de IL-4 e IL-5 foi medida e mostrou que a supressão de crescimento máxima foi observada durante 3 horas de incubação de PBMCs com bactérias existentes antes da estimulação por SEA. Do mesmo modo, a inibição de crescimento máximo foi observada durante 48 horas de incubação (dados não apresentados). Este tempo de amplitude foi usado em outros experimentos.

Lactobacilos e Bifidobactérias suprimem a produção de citocinas TH2 a partir de PBMCs estimuladas por alergênicos de pacientes alérgicos.

A capacidade de Lactobacilos e Bifidobactérias corrigirem o desequilíbrio entre as citocinas ThI e TH2 foi então avaliada em até um modelo ainda relevante de estímulo por alergênicos. Quando as PBMCs de pacientes (alérgicos a D. pteronissinus) foram pré- incubadas com diversas forças viáveis de Lactobacilos e Bifidobactérias, a produção de IL-4 e IL-5 provocadas após estímulo específico com alergênicos D. pteronissinus foi muito reduzida, especialmente de modo dependente sobre a razão bactérias/célula. Este efeito sobre IL-5 foi independente do tipo de força de bactérias probióticas investigadas. A supressão de IL-5 correspondeu, por exemplo no caso de B.b., a 57,31% ± 4,52% e no caso de B.l. a 63,77% ± 5% (Figura 1). Além disso, efeitos semelhantes foram observados quando as PBMCs de pacientes alérgicos foram estimuladas com SEA. Neste caso, embora a produção de IL-4 e IL-5 fossem muito maior em comparação à produção que foi observada com D. pteronissinus (Figura 1), as bactérias probióticas testadas reduziram a secreção de IL-5 por 71,29% ±4,10% para L. GG e 77,63% ± 3,52% para L. gasseri (Figura. 1). Incubação concomitante com Lactobacilos e

Bifidobactérias aumentaram muito a produção de IFN-γ (Figura 1). Desta maneira, pela redução da produção de citocinas TH2 e pela intensificação da produção de IFN-γ das PBMCs de pacientes alérgicos, Lactobacilos e Bifidobactérias parecem mostrar atividade anti-TH2. Neste contexto, é interessante observar que o efeito inibidor de crescimento de Lactobacilos e Bifidobactérias na produção de IL-4 por PBMCs de indivíduos alérgicos do teste é maior do que os indivíduos saudáveis do teste. Ao contrário disto, o efeito inibidor de crescimento destas bactérias na produção de IL-5 por PBMC de doadores saudáveis é maior do que os indivíduos alérgicos do teste (Figura 1). Ao contrário disto, o efeito inibidor de crescimento de B.l e LgsBbBl na produção de IL-4 por PBMC estimulada por Dpt de indivíduos alérgicos do teste foi maior do que de indivíduos saudáveis do teste (p<0,05) e o efeito inibidor of L. GG, B.b. e B.l na produção de IL-4 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos alérgicos do teste foi maior do que para indivíduos saudáveis do teste (p<0,Ol) . Ao contrário disto, o efeito inibidor de crescimento de L. gasseri, B.b e B.l na produção de IL-5 por PBMC estimulada por Dpt de indivíduos saudáveis do teste foi maior do que para indivíduos alérgicos do teste (p<0,05) e a supressão do efeito de LgsBbBl na produção de IL-5 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos saudáveis do teste foi maior do que para pacientes alérgicos (p<0,01, Figura 1).

0 DNA genômico de bactérias probióticas inibe a produção de IL-4 e IL-5 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos saudáveis do teste dependendo do tempo e da dosagem.

Para estimar o efeito inibidor do crescimento de DNA bacteriano em comparação ao DNA e LPS de animais, as PBMCs de quatro indivíduos saudáveis do teste foram incubadas com DNA genômico a partir de quatro forças de bactérias probióticas, L. GG, L. gasseri, B.b, B.I e LgsBbBl (uma mistura de L-gasseri, B.b. e B.I), LPS e DNA animal (DNA do timo do bezerro) . A supressão das citocinas Th2 foi monitorada pela aplicação de conjuntos de teste BDoptEIA para demonstrar e quantificar a produção de citocinas. Conforme mostrado na Figura 4, o DNA de bactérias probióticas geralmente previne as PBMCs da produção de IL-4 e IL-5 como uma resposta à estimulação por SEA ou Dpt. Ao contrário disto, LPS não reduziu a produção de IL-4 e IL-5; do mesmo modo o DNA do timo de bezerro livre de LPS não reduziu a produção de IL-4 e IL-5 (dados não apresentados). Efeito de inibição de crescimento dependente do tempo de DNA bacteriano na produção de IL-4 e IL-5 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos saudáveis do teste

Alguns experimentos foram realizados para determinar o perfil de tempo da resposta para o DNA genômico. As PBMCs de doadores saudáveis (n = 4, a 2x106 ml"1) foram estimuladas com SEA (2μς ml"1) e foram pré-incubadas por uma, três e seis horas com DNA genômico de L. GG ou B.b. (30ug ml"1) antes do estímulo SEA, ou foram estimuladas simultaneamente com DNAs genômicos. 0 superantígeno ou DNA genômico foi acrescido 1, 3 e 6 horas após o estímulo SEA e as culturas de célula foram incubadas além de períodos de 24, 48 e 72 horas. 0 DNA genômico de L. GG e B.b. foi selecionado como representante para duas forças de Lactobacilos e Bifidobactérias. Nos períodos de tempo mencionados acima, os sobrenadantes livres de célula foram colhidos e, após centrifugados e esterilizados, foram armazenados a -80°C. as concentrações de IL-4 e IL-5 foram medidas e mostraram que a supressão máxima de crescimento foi observada a t0 horas da incubação de PBMCs com DNAs genômicos e SEA (dados não apresentados) , do mesmo modo a supressão máxima foi alcançada após incubação de 2 4 horas. Este período foi usado para outros experimentos. DNA genômico de B.b. foi confirmado como o inibidor mais efetivo de IL-4 do que DNA genômico de L. GG. Ao contrário disto, confirmou-se que o DNA genômico de L. GG era um inibidor mais efetivo de IL-5 do que DNA genômico de B.b. Efeito inibidor de crescimento dependente da dosagem de DNA bacteriano na produção de IL-4 e IL-5 a partir de PBMCs estimuladas por SEA de indivíduos saudáveis do teste

Para investigar o efeito inibidor do crescimento do DNA bacteriano na inibição de IL- 4 e IL-5 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos saudáveis do teste, o DNA genômico de cada força foi introduzido na cultura PBMC em diversas concentrações, especificamente na faixa de 5 a 105 μg ml"1 para determinar qual dosagem tem o efeito inibidor maior na produção de IL-4 e IL-5 (Figura 4). Esta faixa de dosagem foi escolhida com base nos resultados do teste descritos acima, que mostraram que a produção de citocinas por células imunes poderia ser demonstrada após a adição de pelo menos 3yg ml"1 de E. coli. 0 DNA e a estimulação ideal exigiram um DNA bacteriano em uma concentração de >50μς ml"1. Conforme apresentado na Figura 4, a inibição máxima de IL-4 e IL-5 foi observada quando o DNA genômico foi usado na concentração de 75pm gl"1. Três modelos diferentes de respostas de citocina poderiam ser claramente diferenciados.

DNA genômico: Todas as forças eliminaram a produção de IL-4 e IL-5 a uma concentração de 75yg ml"1 com exceção de B.b.-DNA e L. GG-DANN, que eliminaram a produção de EL-4 e EL-5 a uma concentração de 65μg ml"1.

Todos os DNAs genômico s suprimiram a produção de IL-4 e IL-5 para mais baixo, níveis de estado de equilíbrio quando eles eram adicionados em uma faixa de concentração de 5 a 45pg ml"1. Ao contrário disto, todos os DNA genômicos mostraram uma intensificação dependente da dosagem da produção de IL-4 e IL-5 quando elas foram usadas em uma faixa de concentração de 85 a 105yg ml"1. Comparando a outros DNA genômicos, DNAs B.b e L. GG parecem ser inibidores mais eficientes da produção de IL-4 e IL-5 em resposta ao estímulo SEA. Além disso, o DNA genômico de B.b mostrou a influência de inibição mais baixa na produção de IL-5 a uma concentração de 105μg ml"1.

Efeito inibidor do crescimento of DNA genômico de bactérias probióticas na produção de IL-4 e IL-5 por PBMC estimulada por SEA de indivíduos alérgicos do teste.

Para pesquisar o efeito inibidor do crescimento de DNA genômico de bactérias probióticas, PBMC (2 χ IO6 ml"1) a 75yg ml"1, de DNA L. GG, DNA Bl e LgsBbBl, ο DNA foi incubado por 2 4 horas. Três modelos diferentes de inibição da produção de IL-4 como resposta a um estimulo SEA poderia ser claramente distinguido: DNA genômico de L-GG e LgsBbBl mostraram o mais forte efeito de inibição, a saber 37,4% ± 4% e 39,56% ± 5,1% respectivamente. 0 DNA L. gasseri mostrou o efeito de inibição mais baixo (19,14% ± 2%) e B.b. B.l. mostrou modelo semelhante (24,47%± 3,28%). De modo inverso o DNA L. gasseri mostra o maior efeito inibidor do crescimento na produção de IL-5 como resposta ao estimulo SEA (61,41% ± 3,74%), o DNA LgsBbBl mostrou a supressão mais baixa (46,31 % ± 4%) e DNAs genômicos de L. GG, B.b. e B.i. apresentou modelo de supressão idêntico, (dados não apresentados). Além disso, nós comparamos o efeito inibidor de DNA genômico com bactérias existentes, bem como o efeito de supressão do DNA genômico na produção de IL-4 e IL-5 como uma resposta ao estimulo SEA entre indivíduos saudáveis e alérgicos do teste. O efeito inibidor do crescimento de bactérias existentes na produção de IL-4 por indivíduos saudáveis e alérgicos do teste é maior do que o seu DNA genômico. Ao contrário disto, o efeito inibidor do crescimento do DNA genômico em indivíduos alérgicos do teste é maior do que em indivíduos saudáveis do teste (com exceção de L. gasseri). Consequentemente, DNAs genômicos são mais efetivos na redução da produção de IL-4 como resposta ao estímulo SEA em indivíduos alérgicos do teste.

Resumindo, o efeito inibidor do crescimento de bactérias existentes na produção de IL-5 como resposta ao estímulo SEA nas PBMCs de pacientes saudáveis e alérgicos é o mesmo que o efeito na produção de IL-4 (por exemplo, o efeito de inibição de bactérias existentes era maior do que o seu DNA genômico em ambos os indivíduos saudáveis e alérgicos do teste) . Mas o efeito inibidor do crescimento de DNAs genômicos na produção de IL- em doadores saudáveis foi maior do que para indivíduos alérgicos do teste. Consequentemente, os DNAs genômicos são inibidores mais efetivos para IL-5 em doadores saudáveis. Com relação ao estímulo Dpt, o efeito inibidor do DNA genômico de L. GG e LgsBbBl na produção de IL-4 por PBMC estimulada por Dpt de indivíduos alérgicos do teste era maior do que no caso de indivíduos saudáveis do teste (p>0,05). Um modelo semelhante foi obtido para DNA genômico de L. gasseri B. b e Β. 1. Além disso, o efeito inibidor do DNA genômico de L. gasseri, B.b.B.l e LgsBbBl na produção de IL-5 de PBMC estimulada por Dpt de indivíduos saudáveis do teste foi maior do que no caso de indivíduos alérgicos do teste. Mas o efeito inibidor do crescimento do DNA L. GG na produção de IL-5 em indivíduos saudáveis do teste foi o mesmo que para indivíduos alérgicos do teste (Figura 3) . Consequentemente o DNA genômico de L. GG pode modular a produção de IL-5 PBMC estimulada por Dpt de indivíduos saudáveis e alérgicos do teste do mesmo modo. Discussão

Alergias são reações

hipersensíveis através do sistema imune para substâncias em particular, chamadas alérgenos (tais como pólen, insetos, veneno, medicamentos ou alimento). Alguns estudos experimentais mostram que as doenças alérgicas podem estar ligadas a um distúrbio do balanço da citocina TH1/TH2 com uma preponderância relativa de citocinas TH2 e uma falta de citocinas ThI . Na verdade, IL-4, IL-5, IL-3 e IL-9 estão envolvidas na causa e manutenção de reações alérgicas. Assumiu-se que as citocinas do tipo TH2 estão preferencialmente envolvidas em doenças alérgicas em virtude da troca de resposta imune TH2 para TH2 ser muito óbvia na maioria dos tipos de doenças alérgicas. Os resultados encorajadores obtidos no tratamento de pacientes alérgicos com bactérias probióticas de imediato nos esclareceu a interação entre citocinas e alergias TH1/TH2. Consequentemente, uma estratégia na terapia de alergias é alterar o balanço TH1/TH2 pela administração de bactérias probióticas para restabelecer o balanço Th 1/Th2 . De particular interesse são os resultados atinentes à capacidade de bactérias probióticas que matam ou existentes para a redução significativa da quantia de IL-4 e aumento da quantia de citocinas SFN-γ. Além disso, um estudo atual provou que o efeito protetor de bactérias probióticas pode ser mediado pela liberação de fatores solúveis que mudam a permeabilidade do epitélio e protegem contra invasões bacterianas patogênicas. Estes dados elevam a questão de se este fator solúvel ou outros componentes bacterianos citoplasmáticos diferentes, tal como DNA, pode ser envolvido na causa e modulação de citocinas. A partir deste ponto de vista, nós pesquisamos o efeito de bactérias existentes e DNA genômico puro de forças L. GG, L. gasseri, B. b, B.l e LgasBbBl (uma mistura de L-gasseri B.b. e B.l) na liberação de citocinas IL-4 e IL-5 usando um modelo de cultura humana. Os resultados mostram que forças diferentes de bactérias probióticas bem como seu DNA genômico causam alterações significativas no perfil de citocinas que são ativamente secretadas in vitro de PBMCs estimuladas por SEA ou Dpt. Além disso, elas podem modular o balanço TH1/TH2 pela redução da produção de citocinas TH2 e aumento da produção de citocinas ThI. Consequentemente tais bactérias probióticas podem exercer efeito útil em doenças alérgicas como resultado de seu efeito inibidor na produção de citocinas TH2.

Para investigar esse efeito, nós primeiro estimulamos a PBMC de indivíduos saudáveis e alérgicos do teste com SEA ou Dpt (como um modelo celular de produção de TH2 citocina). Numerosos investigadores relataram que as PBMCs secretam citocinas TH2 após o estímulo com superantígenos. Quando, neste estudo, PBMCs estimuladas por SEA ou Dpt foram pré-incubadas com bactérias probióticas existentes e seu DNA genômico, a produção de citocinas TH2 foi reduzida, mas não na presença de E. coli. Além disso, este efeito inibidor era dependente da dose, de modo que uma concentração de 2xl07 CFU ml-1 (correspondendo a uma razão de 10:1 bacteriana para PBMC), o efeito inibidor de bactérias existentes alcançou o seu máximo com relação à produção de IL-4 e IL-5. Tal efeito dependente da dosagem também é relatado in vitro para a produção de IL-IO e IL-12 por monócitos de indivíduos saudáveis do teste após incubação com algumas forças de bactérias gram-positivas. Este estudo também mostrou que não apenas bactérias probióticas existentes, como também seu DNA genômico pode inibir a produção de IL-4 e IL-5por PBMCs estimuladas por SEA ou Dpt. O ponto mais importante deste estudo é que, primeiramente, ele apresenta um efeito vantajoso do DNA genômico ou bactérias probióticas nas células de pacientes alérgicos que são sensibilizados para ácaros de poeira de casa; ou seja, dizer os organismos microscópicos que são encontrados em casa. Eles são a causa principal das alergias a poeira.

Outros relatórios são todos apenas relatados para efeitos vantajosos de bactérias probióticas que matam ou existentes nas doenças alérgicas causadas por alergias a alimentos ou aeroalergênicos. Nossos dados sugerem que as bactérias probióticas e seu DNA genômico agem por regulamento direto ou indireto de um caminho de sinal que é solicitado para a supressão de citocinas TH2, porque o efeito inibidor foi até observado quando as bactérias probióticas e seu DNA genômico foram adicionados antes ou simultaneamente (para DNA genômico) com estímulo SEA ou Dpt. Alguns estudos experimentais indicam que a modulação da produção de IL-4 e IL-5 é um processo multifatorial e algumas citocinas, tais como IFN-γ, são descritas como possíveis reguladores da produção de IL-4. Além disso, relata-se que a IL-12 é uma citocina auto- resistente na causa da produção de IFN-γ por PBMCs humanas. Em nosso estudo, as bactérias probióticas e seu DNA genômico são capazes de aumentar a produção de IL-12 por PBMC (dados não apresentados).

A este respeito, o DNA bacteriano foi acrescentado à cultura PBMC estimulada por SEA e, de modo interessante, estes experimentos mostraram produção de citocina variada IL-4 e IL-5 após estimulo com DNA bacteriano e tratamento SEA. 0 DNA bacteriano de bactérias probióticas reduzem a secreção IL-5 muito mais do que aquele da L-4. Nossos dados indicam que a produção de DNA genômico de bactérias probióticas podem agir como inibidores para a produção de IL-4 e IL-5 por PBMC estimulado por SEA e Dpt de indivíduos saudáveis e alérgicos do teste. Ademais, um estudo atual relata que as bactérias probióticas que matam com o calor reduzem a produção de IL-4 e IL-5 por PBMC estimulada por SEAs. Considerando que o processo de preparação, o trato gastrointestinal e altas temperaturas (70°C) influenciam a viabilidade das bactérias, os resultados destes estudos mostram um possível efeito inibidor de DNA genômico que é liberado por bactérias que matam com o calor e estão adicionados à PBMC. Vários artigos descrevem a resposta de diversas citocinas em temas CPG que estão presentes no DNA bacteriano, tal como o DNA genômico de L. GG. Seria interessante para saber se a liberação específica da força das citocinas, que foram demonstradas neste estudo, relata a seqüência genômica e os temas CPG de cada força.

Pelo que nos consta, este relatório é o primeiro que mostra os efeitos de modulação imunes de DNA genômico de bactérias probióticas de PBMCs estimuladas por SEA ou Dpt de indivíduos saudáveis e alérgicos. As diferenças observadas na velocidade e magnitude da inibição de IL-4 e IL-5 como resposta a DNAs bacterianos e estímulo por SEA ou Dpt são informações interessantes sobre a influência de bactérias probióticas existentes ou que matam e/ou componentes bacterianos sobre a resposta imune. 0 crescimento do conhecimento sobre probióticos é excitante, mas em um futuro próximo deve ser is apurado qual DNA probiótico (forças individuais ou uma combinação) tem efeito mais forte em doenças particulares. Estudos clínicos aleatórios bem organizados também são solicitados para definir o papel de DNA genômico de bactérias probióticas como agentes preventivos e terapêuticos no futuro.

Mais detalhes e

características da invenção são esclarecidos mais detalhadamente abaixo nos exemplos dos resultados da série de experimentos. No entanto, eles não tem a intenção de limitar a invenção mas somente explicá-la. A partir de uma visão esquemática,

a figura 1 modulação de citocina de PBMC sem (meio) ou com estímulo por SEA e Dpt; a figura 2 efeito inibidor dependente da dosagem de

bactérias probióticas existentes na produção de IL-4 (A), IL-5 (B) e (IFN - γ) por estímulo SEA da PBMC de indivíduos saudáveis do teste; a figura 3 cancelada;

a figura 4 efeito inibidor do crescimento of DNA genômico de bactérias probióticas na produção de IL - 4, IL -5 e IFN -γ por PBMC estimulada por SEA ou Dpt -de indivíduos saudáveis do teste (A, n=5)

e indivíduos alérgicos do teste (B, n=5); e a figura 5 efeito inibidor do crescimento dependente da dosagem de DNA genômico na produção de IL - 4 (A), IL -5 (B) e IFN -γ (C) por PBMC de indivíduos saudáveis do teste.

Detalhadamente, as figuras

mostram: Figura 1

Modulação de citocina de PBMC sem (meio) ou com estímulo por SEA e Dpt.

PBMCs de indivíduos saudáveis (A, n=8) e alérgicos (B, n=8) do teste foram pré-incubados por 3 horas (a 2 χ IO6 células/ml) com meio sem (PBMC) ou com quatro forças de bactérias probióticas, LgB.b.B.l (uma mistura de bactérias probióticas e o controle gram-negativo de bactérias (E-coli TGl) a uma razão de bactérias-para- célula de 10:1 antes também do estímulo com superantígeno SEA ^g ml"1), Dpt (2pg ml"1) ou não.

IL-4, IL-5 e IFN -γ foram quantificadas após horas de incubação em sobrenadantes por um estudo ELISA específico. Os asteriscos indicam supressão particular ou estimulação (*p<0.05, **p<0.01) da produção de citocina TH2 e THi em comparação ao controle. Figura 2

Efeito inibidor dependente da dosagem de bactérias probióticas existentes na produção de IL-4 (A), IL- 5 (B) e (IFN-γ) por estimulo SEA da PBMC de indivíduos saudáveis do teste. A PBMC se quatro doadores saudáveis (2 χ IO6 células ml"1) foi cultivada com quatro forças de bactérias probióticas, L. GG, L. gasseri, B.b., B. 1. em concentrações de 5 xlO4, 5 χ IO5, 2 χ IO5, 5 χ IO6, 2 χ IO7, 5 χ IO7 correspondendo a 0,025, 0, 25, 1, 2, 5, 5, 10 e 25 razões bactérias-para-célula por 3 horas antes da estimulação com 2 yg ml"1 de SEA. Após 48 horas de incubação, IL-4, IL-5 e IFN -γ foram medidas por ELISA específica. A barra de erro mostra erros orientados de meio. Figura 3

cancelada

Figura 4

Efeito inibidor do crescimento de DNA genômico de bactérias probióticas na produção de IL - 4, IL -5 e IFN -γ por PBMC estimulada por SEA ou Dpt de indivíduos saudáveis (A, n=5) e alérgicos (B, n=5) no teste.

PBMC de cinco indivíduos saudáveis e cinco alérgicos do teste foram incubados por 48 horas (a 2 χ IO6 células ml-1) com DNA genômico de 4 forças de bactérias probióticas, L. GG, L. gasseri, B.b., B.l. e LgBbBl (uma mistura de L. gasseri, B.b e Β. 1.). A uma concentração de 75 yg ml-1 antes do estímulo com SEA (2 yg ml"1) ou Dpt (2000 SQ - EML"1 correspondendo a uma administração de 2 yg ml"1) . O meio e LPS (100 ng ml"1) foram usados como controle. IL-4, IL-5 e IFN-γ foram quantificados após 24 horas de incubação em sobrenadantes por um estudo ELISA especifico. Os asteriscos indicam inibição de resistência (*p<0,05, **p<0,01) da produção de citocina em comparação ao controle (meio). Os dados são expressos como meio +/- SEM: Figura 5

Efeito inibidor do crescimento dependente de dosagem de DNA genômico na produção de IL-4 (A) , IL-5 (B) e IFN-γ (C) por PBMC de indivíduos saudáveis do teste.

A PBMC de 4 doadores saudáveis foi cultivada em diversas concentrações (5-105 mg ml"1) de DNA genômico bacteriano. A produção de IL-4 (A) e IL-5 (B) foi medida após 24 horas de incubação. Os dados são expressos como o meio +/- SEM.

Claims

1. "MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS", caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-positiva, probiótica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, está presente como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele.

2. "MEDICAMENTO PARA A TROCA DE BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EM DIREÇÃO A UM AUMENTO DE ThI E/OU A REDUÇÃO DE TH2", caracterizado pelo fato de que a bactéria gram-positiva, probiótica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, está presente como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele.

3. "MÉTODO PARA O PREPARO DE UM MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS EM HUMANOS", caracterizado pelo uso de bactéria gram-positiva, probiótica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele.

4. "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA A TROCA DO BALANÇO TH1-TH2 NO CORPO HUMANO EM DIREÇÃO A UM AUMENTO DE ThI E/OU A UMA REDUÇÃO DE Th2", caracterizado pelo uso de bactéria gram-positiva, probiótica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele.

5. "USO DE BACTÉRIA GRAM- POSITIVA, PROBIÓTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E BIFIDOBACTÉRIA", como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele, caracterizado por ser para a produção de um medicamento que sirva para a profilaxia, supressão ou eleiminação de alergias no ser humano.

6. "USO DE BACTÉRIA GRAM- POSITIVA, PROBIÓTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E BIFIDOBACTÉRIA", como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para a troca do balanço TH1-TH2 no corpo humano em direção a um aumento de ThI e/ou a uma redução de TH2.

7 . "USO DE BACTÉRIA GRAM- POSITIVA, PROBIÓTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E BIFIDOBACTÉRIA", como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele, caracterizado por ser para o tratamento e/ou prevenção e/ou redução do risco em reações alérgicas em humanos.

8. "USO DE BACTÉRIA GRAM- POSITIVA, PROBIÓTICA TAIS COMO, LACTOBACILOS E BIFIDOBACTÉRIA", como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele, caracterizado por ser para o tratamento de e/ou profilaxia e/ou troca de redução de risco do balanço TH1-TH2 no corpo humano em direção a um aumento de ThI e/ou a uma redução de TH2 .

9. "ALIMENTO OU SUPLEMENTO DE ALIMENTO", caracterizado pelo uso de bactéria gram-positiva, probiótica, tais como Lactobacilos e Bifidobactéria, como o principio ativo substancial, especificamente como bactéria viável e/ou bactéria inativa e/ou o DNA genômico dele

10. "MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele é preparado para uso oral e/ou para a administração como supositórios ou para injeção subcutânea ou para injeção intravenosa ou como um liquido para inalação.

11. "MEDICAMENTO PARA A PROFILAXIA, SUPRESSÃO OU ELIMINAÇÃO DE REAÇÕES ALÉRGICAS", de acordo com as reivindicações 1 e 10, caracterizado pelo fato de que as cepas bacterianas sejam Lactobacilos ramnáceas GG e/ou Lactobacilos gasseri e/ou Bifidobactéria bifidum e/ou Bifidobactéria longum.